Summary
Denne video vil illustrere en hurtig, effektiv metode til at methacrylatbaserede poly (ethylenglycol), så kæden polymeriseringer og hydrogel syntese. Det vil vise, hvordan man ligeledes indføre methacrylamid funktionaliteter i peptider, detalje fælles analysemetoder til vurdering funktionalisering effektivitet, give forslag til fejlfinding og avancerede ændringer, og demonstrere typiske hydrogel karakteriseringsteknikker.
Abstract
En af de vigtigste fordele ved at bruge poly (ethylenglycol) (PEG) makromerer i hydrogel dannelse er syntetisk alsidighed. Evnen til at trække fra en lang række af PEG-molekylvægte og konfigurationer (arm nummer, armlængde og forgrening mønster) giver forskere stram kontrol over resulterende hydrogel strukturer og egenskaber, herunder Youngs modul og maskestørrelse. Denne video vil illustrere en hurtig, effektiv, solvent-fri, mikrobølge-assisteret metode til at methacrylatbaserede PEG forstadier i poly (ethylenglycol) dimethacrylat (PEGDM). Dette syntetisk metode giver meget tiltrængte udgangsmaterialer til applikationer i drug delivery og regenerativ medicin. Påviste metode er overlegen i forhold til traditionelle methacrylation metoder, som det er væsentligt hurtigere og enklere, samt mere økonomisk og miljøvenlig, ved hjælp af mindre mængder af reagenser og opløsningsmidler. Vi vil også vise en tilpasning af denne teknik til on-harpiks methacrylamid funktionalisering af peptider. Dette om harpiks metode giver den N-terminale ende af peptider, som kan funktionaliseres med methacrylamid grupper før afbeskyttelse og spaltning fra harpiksen. Dette giver mulighed for selektiv tilsætning af methacrylamid grupper til N-terminalerne af peptider, mens aminosyrer med reaktive sidegrupper (fx primær amin af lysin, primær alkohol med serin, sekundære alkoholer med threonin, og phenol tyrosin) forbliver beskyttet, forhindrer funktionalisering på flere steder. Denne artikel vil detalje fælles analysemetoder (proton kernemagnetisk resonans spektroskopi (H-NMR) og Matrix Assisted Laser Desorption Ionisering Time of Flight massespektrometri (MALDI-TOF)) for at vurdere effektiviteten af de functionalizations. Almindelige faldgruber og foreslog fejlfinding metoder vil blive behandlet, som for at ændre den teknik, der kan bruges til yderligere at tune makromeren funktionalitet og deraf hydrogel fysiske og kemiskeegenskaber. Anvendelse af syntetiserede produkter til dannelse af hydrogeler for drug delivery og celle-materiale interaktion undersøgelser vil blive demonstreret, med særlig opmærksomhed at ændre hydrogelsammensætning at påvirke maskestørrelse, kontrollerende hydrogel stivhed og narkotika frigivelse.
Introduction
Poly (ethylenglycol) (PEG) hydrogeler er almindelige biomaterialer anvendes i regenerativ medicin og drug delivery applikationer 1-3. Disse hydrogeler har betydelige fordele i andre biomaterialer. PEG-hydrogeler er syntetiske, der tilbyder en høj grad af kontrol over tekniske egenskaber såsom elasticitetsmodul og nedbrydningshastighed i forhold til deres naturlige biomateriale modparter 1. Da de syntetisk er afledt, PEG har betydeligt mindre batch-til-batch variation versus naturligt afledte materialer 4. På grund af den kemiske sammensætning af PEG disse hydrogeler er meget hydrofile, modstandsdygtig over for proteinadsorption og biokompatible 3. Denne modstand mod proteinadsorption tillader PEG hydrogeler til at fungere som en "blank tavle", der gør det muligt for forskerne at afhøre og undersøge specifikke biologiske eller kemiske faktorer (narkotika, biomolekyler celleadhæsionsfaktorer peptider, etc.) samt de specifikke roller disse factors spille for at styre celle og / eller væv adfærd.
Klik her for at se større billede .
Figur 1: Eksempler på poly (ethylenglycol) (PEG) arkitekturer A) Lineær PEG B) 4-armet PEG med pentaerythritol kerne C) 8-armet PEG med hexaglycerol kerne D) 8-armet PEG med en.... tripentaerythritol kerne. n er antallet af PEG gentager på hver arm. Hver gentagelse har en molekylvægt på 44 g / mol, derfor kan n beregnes ud fra den samlede molekylvægt og struktur / arm #.
PEG-forstadier er tilgængelige med en række forskellige arkitekturer og molekylvægte (figur 1 ). Varierende arkitekturen (arm #) og ethylenglycol gentagelser (n) af PEG kan anvendes til at kontrollere egenskaberne af hydrogel net dannet ud fra disse makromere. Umodificeret PEG indeholder terminal hydroxylgrupper, som skal udskiftes med en alternativ funktionalitet til at lette kovalent tværbinding via polymerisationer, de mest almindeligt anvendte tværbindende strategi for PEG hydrogeler, før dannelsen af hydrogel netværk. Der er en række af kemiske grupper, der kan inkorporeres i PEG makromere at lette polymerisering og netværk tværbinding (acrylat, methacrylat, vinylether, norbornen, osv.). Trods de mange forskellige terminal funktionaliteter til rådighed til at lette tværbinding, er der kun to mekanismer, som polymerisering kan forekomme: trin-og kæde-vækst (eller en blanding af de to, mixed-mode).
g2.jpg "width =" 600px "/>
Klik her for at se større billede .
Figur 2:.. Teoretisk hydrogel netværk skematiske A) Traditionelle kæde vækst polymerisationsresultaterne i heterogene netværk, der indeholder tæt poly (methacrylat) tværbinding regioner og øget netværk nonidealities såsom løkker, reagerede forstadier, og permanente forviklinger B) Step-vækst polymerisationsresultaterne i betydeligt mere homogene netværksstrukturer (ikke målfast).
Funktionaliteter, som tværbinder via kæde-vækst polymerisering ikke kræver tilstedeværelsen af en ekstra tværbinder. Men kæde-polymeriseret hydrogeler producere heterogene netværk strukturer, der indeholder tætte tværbindingsbetingelser regioner (figur 2A) 1. I modsætning hertil trin vækst polymerisation vandskraveneres anvendelse af et tværbindingsmiddel eller co-monomer, der er reaktiv med de terminale funktionelle grupper i PEG makromere. Da de terminale funktionelle grupper på PEG kun kan reagere med tværbinderen og tværbinderen kan kun reagere med de terminale funktionelle grupper på PEG, resulterer dette i større netstruktur homogenitet (figur 2B) 1.. Trin-vækst polymerisationer også typisk medføre højere konvertering af funktionelle grupper, reducere mængden af ikke-reagerede forstadier og potentiale for immune / inflammatoriske reaktioner på grund af opløselige, personlige makromerer 1. Er også blevet udviklet mixed-mode polymerisationsmetoder der kombinerer både trin-og kæde-vækst polymerisering ved brug af makromerer der både kan selv reagerer (kæde-vækst) og reagerer med et tværbindingsmiddel (trin-vækst). Dette frembringer hydrogeler med karakteristika for hver polymerisation mekanisme, og kan anvendes til at fremstille mere komplekse, forskellige netværksstrukturer end entenstep-eller kæde vækst-netværk alene 1.
Mens der er et væld af funktionelle grupper, som kan bruges til at functionalize PEG og lette hydrogel dannelse, methacrylater og norbornener er nogle af de mest almindelige kæde-and trin-vækst polymerisationsprodukter grupper, hhv. Begge disse funktioner tilbyder fremragende Spatiotemporal kontrol over netværket polymerisation, og når de bruges til at indkapsle celler, disse netværk understøtter høj samlet celle overlevelsesevne 5-7. Dimethacrylat funktionaliserede PEG (PEGDM) crosslink via kædepolymerisation og giver mulighed for indarbejdelse af biomolekyler eller andre faktorer gennem samarbejde polymerisation med acrylat-, methacrylat-eller tilsvarende-funktionaliserede biomolekyler 5,6. PEGDM hydrogeler har betydelige fordele i forhold til alternative kæde vækst polymerisationssystemer såsom acrylat funktionaliseret PEG (PEGDA). Ved hjælp af traditionelle metoder, kan PEGDA syntetiseres hurtigere end PEGDM; however anvendelse mikrobølgeassisteret syntese PEGDM syntese er endnu mere effektiv. PEGDA ofte syntetiseres i dag til dag 8 eller 24 timer 9 reaktioner, men kan også syntetiseres fire timer ved forhøjede temperaturer 10. PEGDM er også traditionelt syntetiseres ved at omsætte natten over 11 eller i 24 timer 5, med nogle metoder med udvidelse af reaktionstiden til 4 dage 12. Ved hjælp af mikrobølge-assisteret fremgangsmåde demonstreret her, PEGDM fremstilles i en 5 minutters reaktion. Mens PEGDM har langsommere reaktionskinetik end PEGDA 13 tværbindingsreaktionen for PEGDM stadig hurtig, forekommer i få minutter, og opnår større makromeren konvertering end PEGDA den øgede hydrofobicitet methacrylatgruppe øger funktionel gruppe sammenlægning i opløsning, og derved øge sandsynligheden for radikal overførsel og methacrylat konvertering 14. PEGDM hydrogeler er også forbundet med øget cellulær levedygtighed og vækstsammenlignet med PEGDA hydrogeler, sandsynligvis på grund af fald i reaktionshastigheden på et givent tidspunkt, hvilket reducerer radikal koncentration og reagerede makromerer nuværende 14. Thiol-en polymerisationer, såsom dem, der bruger norbomen-funktionaliseret PEG (PEGN) danner hydrogeler via trin vækst polymerisation, og kræver anvendelse af PEGN og et tværbindingsmiddel, der indeholder et gennemsnit på mere end to funktionelle grupper. Da thiyl radikaler reagerer med norbomen carbon-carbon-dobbeltbindinger, multi-thiolholdige tværbinderne er almindeligt anvendt til at tværbinde PEGN hydrogeler, der giver mulighed for letkøbt inkorporering af peptider med cystein aminosyrer funktionaliteter 7. Mens der er mange andre kemier, som reagerer via trin vækst polymerisation (Michael-additionsreaktioner, såsom thiol-acrylat 15 og thiol-vinylsulfon 16, "Click" reaktioner såsom alkyn-azid 17 etc.), thiol-norbornen hydrogeler er meget almindelige, som stammen fraden norbomen ring øger reaktionshastigheden og nedsætter risikoen for, at norbornen dobbeltbinding undergår kædepolymerisation 7.
Beslutningen mellem methacrylat, norbornen, eller alternativ funktionalisering at lette hydrogel dannelse er i vid udstrækning baseret på den fremgangsmåde. For eksempel har kæden vækst polymeriseret PEGDM netværk blevet vist velegnet til at styre celle lokalisering i udviklingen af et væv-manipuleret periost 18,19. Trin-vækst polymeriseret PEG netværk er bedre egnet til inkorporering af peptid sekvenser for at lette enzymatisk lydhør hydrogel nedbrydning, på grund af den lette indarbejdelsen af Enzymsubstrat sekvenser ved hjælp af thiol (cystein), der indeholder peptider og norbornen funktionaliserede makromerer 20. Hvis forskningen spørgsmål vil være bedst løses ved brug af trin-vækst hydrogeler, Fairbanks et al. Giver en detaljeret beskrivelse af norbornene funktionalisering strategi for PEG 7. Dette dokument vil detaljer, hvordan PEG og peptid sekvenser kan funktionaliseres (med en methacrylat for PEG, og en methacrylamid for peptider) for kæde polymerisationsreaktioner.
Traditionelt er PEGDM fremstilles ved at omsætte PEG med methacryloylchlorid og triethylamin i dichlormethan. Reaktionen får lov til at udvikle sig ved stuetemperatur natten over 11 eller i 24 timer 5, med nogle metoder, der strækker reaktionstid 4 dage 12 før filtrering, udfældning i diethylether og samling. Mens mange variationer af denne fremgangsmåde findes, er alle tidskrævende, kræver en stor vifte af kemisk syntese-udstyr, og ikke er miljøvenlige, da de indebærer brug af relativt store mængder af høj renhed reagenser og opløsningsmiddel. For at omgå disse begrænsninger, Lin-Gibson et al. Udviklet en mikrobølgeovn-assisteret, solvent-fri metode til at functionalize PEG med te rminal methacrylatgrupper (figur 3A) 12.. I denne reaktion de terminale alkoholgrupper af PEG reagerer med én af carbonylgrupperne atomer af methacrylanhydrid til dannelse af en carboxylgruppe. Dette genererer PEGDM produkt, methacrylsyre som et biprodukt. Denne syntese har mange af de karakteristiske fordele ved mikrobølge-syntese, herunder reduceret reaktionstid og opløsningsmiddelfrie syntesemetoder 21. Mikrobølgeovnen syntese er at foretrække frem for de tidligere diskuterede metoder, da det er betydeligt hurtigere, kræver mindre omfattende syntese udstyr (f.eks glasvarer, modholdsplader), og bruger mindre samlet reagens og opløsningsmiddel mængder som opløsningsmidler kun kræves for produktrensning / indsamlingen og ikke for syntese, hvilket gør det mere økonomisk og miljøvenlig.
0px "/>
Klik her for at se større billede .
Figur 3:. Funktionalisering Skema A) poly (ethylenglycol) omsættes med 10x molært overskud methacrylanhydrid til at producere poly (ethylenglycol) methacrylat B) Samme metode kan anvendes til at funktionalisere den N-terminale ende af peptidsekvenser, der danner en. methacrylamid funktionaliseret peptid. Ved at udføre denne procedure før spaltning af peptidet fra harpiksen, kan selektiv funktionalisering af den N-terminale udføres som aminosyre sidegrupper forbliver beskyttet. n: antal af PEG gentager i makromer (n = 45,5, 227 og 455 for henholdsvis 2, 10 og 20 kDa lineær PEG). R1 til RN: aminosyre sidekæder. PG1 til PGN: sidekædebeskyttende grupper. TFA: trifluoreddikesyre. TIPS: triisopropylsilan. Dodt: 3,6-dioxa-1 ,8-octanedithiol. H2O: vand.
Mikrobølge-assisteret methacrylation metode er for nylig blevet tilpasset af vores gruppe at funktionalisere N-terminalen af peptider med methacrylamid grupper (figur 3B) for at lette peptid inkorporering i en lang række polymerer og polymere netværk. I denne reaktion, den primære amin med N-terminalen af peptidet reagerer med carbonyl-atomet på methacrylanhydrid til dannelse af et amid. Dette genererer methacrylamid funktionaliserede peptid, methacrylsyre fremstillet som et biprodukt. Ved anvendelse af denne fremgangsmåde til at funktionalisere den N-terminale ende af peptid-sekvenser, er det vigtigt, at aminosyrer, der indeholder reaktive sidekæder (primære aminer (lysin), alkoholer (serin, threonin) og phenoler (tyrosin)) beskyttes under funktionalisering og beskyttende grupper kun spaltes efter methacrylamide inkorporering.
Denne artikel vil vise begge disse microwave-støttede metoder til at syntetisere PEGDM og functionalize på harpiks-peptidsekvenser, fremhæve almindelige faldgruber og foreslå fejlfinding metoder. I denne artikel vil metoder til at udføre analytisk kemiske teknikker, der almindeligvis anvendes til at vurdere produktets funktionalisering være detaljeret, og forslag og ressourcer til at udføre mere avancerede ændringer vil blive givet. Typiske resultater vil blive demonstreret, som inkluderer brug af syntetiserede PEGDM at danne hydrogel netværk, udnytte de dannede hydrogeler at styre frigivelsen af en model lægemiddel, og beskæftiger funktionaliserede peptider til at lette celle-hydrogel interaktioner. Der vil blive lagt særlig vægt på at karakterisere hydrogel maskestørrelse og diskuterer, hvordan hydrogelsammensætning kan indstilles til at påvirke denne underliggende fysiske egenskab, som igen styrer løs materialeegenskaber såsom stivhed og medikamentfrigivelsesprofilen.
Protocol
1.. Microwave-assisteret Syntese af PEGDM
- For at forhindre forurening med vand, idet præ-tør hele glasvarer, der anvendes i en ovn (> 60 º C) i 1 time.
Bemærk: Nødvendig glasvarer indeholder: to 100 ml bægre, et 250 ml bægerglas, 3 spartler, en 250 ml Büchner kolbe, en 7 cm Büchnertragt, en 10 cm urglas. - Pre-chill 100-150 ml vandfri diethylether (74,12 g / mol) til fældning efterfølgende udføres på trin 1.6 ved at hælde det i et bæger, der dækker bægeret med et urglas, og anbringe bægerglasset i et omkrystallisering fad fyldt med is. Flyt mikroovn og hvirvelomrøreren ind i et stinkskab.
Bemærk: Diethylether kan også forud afkølet ved at anbringe bægerglasset på en kemisk fryser. Den lavere diethylether opnåede temperatur ved nedkøling i en fryser vil øge hastigheden og effektiviteten af nedbør. - I en lille vejer båd vejes 5 g poly (ethylenglycol) (PEG) i molekylærgenetiskeLAR vægten af din valg (1,000-100,000 Da).
- Hvis nuværende fjerne plastic stykke fra låget af scintillationsglas. Tara hætteglasset, og dispensere 10 molært overskud af methacrylanhydrid i hætteglasset (MA, 154,16 g / mol) pr ligning 1 i hætten. Læg PEG til scintillationshætteglas.
(1)
hvor
er massen af PEG i g, 
er molekylvægten af PEG i g / mol, 
er antallet af terminale OH-grupper på PEG og 
er molekylærgenetiskeLAR vægt MA i g / mol.
- Hvis nuværende fjerne plastic stykke fra låget af scintillationsglas. Tara hætteglasset, og dispensere 10 molært overskud af methacrylanhydrid i hætteglasset (MA, 154,16 g / mol) pr ligning 1 i hætten. Læg PEG til scintillationshætteglas.
- Løst vride hætten på scintillationsglas. Indstil mikrobølgeovnen til 5 min på maksimal effekt. Iført varmebestandige handsker Tag hætteglasset fra mikrobølgeovn hver 30 sek.
- Spænd hætten og vortex i 30 sek. Gentag, indtil opløsningen er microwaved for hele 5 min. Hætten kan være nødvendigt at blive udskiftet under proceduren på grund af revnedannelse.
- Med låget løsnet, lad PEGDM afkøles til stuetemperatur. Opløs PEGDM i en lille mængde (10-15 ml), dichlormethan (DCM, 84,93 g / mol).
Bemærk: Det anbefales, at PEGDM afkøle betydeligt (~ 5 min) før DCM Desuden, for at forhindre kogning af DCM (et mistænkt carcinogen) på grund af restvarme. Den PEGDM kan opdeles i små bidder ved hjælp af en spatel og vortexblandet at støtte i opløsning. - Fældes PEGDM i 10x overskydende iskold diethylether i 20 min.
Bemærk: Det kan være nødvendigt at scRatch bægerglasset side med en spatel til at indlede krystaldannelse at udfælde lavere molekylvægt PEG'er (2.500 Da), men vil PEG med en molekylvægt under 1000 Da ikke udfældes trods ridser. - Ved hjælp af en Buchner-tragt og kolbe indsamle PEGDM ved vakuumfiltrering. Filtrer ikke til tørhed, da dette vil fremme vand adsorption til PEGDM.
Bemærk: Hvis det er nødvendigt for den specifikke vakuumsystem i brug, kan et vakuum fælde placeres mellem filtrering setup og vakuum kilden for at beskytte vakuumpumpen mod beskadigelse af dampe. - Overfør den filtrerede PEGDM til et 50 ml konisk rør med en stor kanyle gennemborede hætten til ventilation. Opbevar natten over i et vakuumkammer for at tørre.
- Opløs igen PEGDM i DCM og genudfælde (som i 1,5-1,7 trin) som et sidste skridt for at fjerne uomsat MA. Tørres igen som i trin 1.8.
(1) 
er massen af PEG i g, 
er molekylvægten af PEG i g / mol, 
er molekylærgenetiskeLAR vægt MA i g / mol. 2. Karakterisering af PEGDM funktionalisering
- Brug af deutereret chloroform (120,38 g / mol) som opløsningsmiddel, forberede prøver til 1H-NMR. Placer en lille prøve af PEGDM (≈ 10 mg) i et scintillationshætteglas med en lille mængde af opløsningsmidlet (≈ 1,0 ml). Koncentrationen mål er 10 mg / ml.
- Når prøven er opløst, overføre det til en ren NMR-rør. Prøven skal udfylde de nederste 4-5 cm af NMR-røret.
- Saml proton-NMR-spektre. Opsamles Vores data ved hjælp af en 400 MHz spektrometer. Kør prøverne ved stuetemperatur i mindst 64 scanninger for at opnå tilstrækkelig data opløsning.
- Hvis NMR-analyse (Figur 4) viser PEGDM funktionalisering er mindre end 90%, skal methacrylation procedure gentages. Juster massen af MA anvendes til at tage højde for den reducerede mængde af ikke-funktionaliseret PEG.
Bemærk: Den procent af PEG funktionaliserede i PEGDM kan beregnes ud fra den observerede: teoretiske forhold mellem terminal methacrylate protoner (a, b og c) centrale PEG protoner (d) (figur 4). For lineære PEG, er det teoretiske antal centrale PEG protoner beregnet ved ligning 2:
(2)
hvor 
er molekylvægten af PEG i g / mol og 
er molekylvægten af en enkelt PEG-gentagelse (44 g / mol). For ikke-lineær PEG, skal denne ligning ændres for at afspejle den specifikke forgrening struktur (figur 1). Den procentvise funktionalisering kan derefter beregnes ved anvendelse af ligning 3: 
(3)
hvor er den observerede arealet under methacrylat proton toppe (a, δ = 1,94 ppm, b og c, δ = 5,57 og 6,12 ppm), og
er det teoretiske antal methacrylat protoner (a = 3 * 
, B = 1 * c = 1 * - 6, 2 og 2 henholdsvis lineær PEG). Funktionalisering Beregningen af procent skal udføres ved hjælp af toppene a, b og c hver for sig, og derefter averaged at få et samlet procent funktionalisering.
Bemærk: Tilstrækkeligt funktionaliseret PEGDM kan derefter dialyseres (i vand mod vand) og opsamlet ved lyofilisering for at fjerne resterende methacrylsyreanhydrid og methacrylsyre. Det endelige produkt skal blandes med en lille mængde (0,01 vægt%) af inhibitor, såsom citronsyre eller vitamin C og opbevaret med tørremiddel ved -20 ° C indtil brug. Det endelige PEGDM produkt kan bruges til at producere hydrogeler, som nærmere beskrevet i JOVE artiklen af Khetan og Burdick 22..
3. Microwave-assisteret Funktionalisering af On-harpiks Peptider
Bemærk: Vores syntetiseres peptider ved anvendelse af Fmoc-Gly-Wang-harpiks, under anvendelse af et automatiseret peptidsynteseapparat med UV-overvågning og 0,2 M aminosyreopløsninger i N-methylpyrrolidon (NMP, 99,1 g / mol). 5% piperazin (86,1 g / mol) i dimethylformamid (DMF, 73,1 g / mol) anvendes til afbeskyttelse 0,5 M O-benzotriazol-N, N, N ', N'-tetramethyl-uronium-hexafluoro-phosphat (HBTU, 379,3 g / mol) i DMF anvendes som aktivator, og 2 M diisopropylethylamin (DIEA, 129,3 g / mol) i NMP anvendes som aktivator base. Peptider kan også fås fra en kommerciel peptid leverandør. Ved anvendelse af kommercielle kilder er det afgørende, at peptider indkøbes på harpiksen med aminosyre sidekædebeskyttelsesgrupper intakte snarere end fuldt spaltede, som er standard.
Bemærk: Det er vigtigt, at alle aminosyrer med reaktive sidekæder er beskyttet, således at methacrylamid funktionalisering forekommer kun på den primære amin i N-terminalen af sekvensen. Se Tabel 1 for aminosyrer med reaktive sidegrupper, og typiske beskyttelsesgrupper. Aminosyrer med beskyttelsesgrupper inkorporeres i sekvensen under peptidsyntese på samme måde som nonprotected aminosyrer og er ofte tilgængelige fra den samme aminosyre leverandører.
| Aminosyre | Reaktiv gruppe | Beskyttelse af gruppe |
| Lysin | Primær amin | tert-butyloxycarbonyl (Boc) |
| Serin | Primær alkohol | tert-butyl (tBu) |
| Threonin | Sekundær alkohol | tBu |
| Tyrosin | Phenol | tBu |
Tabel 1: Reaktive aminosyrer og typiske beskyttelsesgrupper.
- Syntetisere peptider ved anvendelse af standard fastfase-peptidsyntese, og gemme på harpiks ved 4 ° C i DMF indtil den er klar til brug.
- Ved hjælp af en 7 cm Buchner-tragt med filtrerpapir og 250 ml kolbe, indsamle peptidharpiksen fra DMF via filtrering.
- Hvis foreliggende fjerne plastic stykke fra låget af scintillationshætteglas. Overfør harpiksen til scintillationshætteglas. Ved hjælp af en engangspipette, tilsættes lige nok MA at dække harpiksen i scintillationshætteglas.
- Løst placere hætten på scintillationsglas. Indstil mikrobølgeovnen til 3 min på maksimal effekt. Iført varmebestandige handsker Tag hætteglasset fra mikrobølgeovn hver 15-20 sek.
- Spænd hætten og vortex i 15 sek. Gentag, indtil opløsningen er microwaved for full 3 min.
- Med låget løsnet, lad peptidet opløsningen afkøles til stuetemperatur. Ved hjælp af en lille mængde DMF og en Buchner-tragt med filtrerpapir og kolbe, indsamle peptidharpiksen fra hætteglasset.
- Overfør peptidharpiksen til en frisk scintillationshætteglas og spalte og afbeskytte peptidet.
- Per 0,25 mmol harpiks, bruger vi en 2 timers stuetemperatur reaktion med rotation, ved hjælp af et spaltningssted cocktail af 18,5 ml trifluoreddikesyre (TFA, 114,02 g / mol) med 0,5 ml af hver af triisopropylsilan (TIPS, 158,36 g / mol), 3,6-dioxa-1 ,8-octanedithiol (Dodt, 182,30 g / mol) og deioniseret vand (18,02 g / mol).
Bemærk: Denne cocktail er tilstrækkelig for de fleste peptider, men vil ikke afbeskytte 2,2,4,6,7-pentamethyl-dihydrobenzofuran-5-sulfonyl (Pbf)-beskyttede aminosyrer (almindeligvis bruges til at beskytte arginin sidekæder). Sekvensen Hvis indeholder nogen Pbf-beskyttede grupper, bør 0,5 ml TFA erstattes med 0,5 ml thioanisol (124.20 g / mol) og spaltning tid steg til 4 timer.
Bemærk: Hvis en uklar, formularer krystallinsk stof i spaltning cocktail er peptidet sandsynligvis Crash ud af opløsning og mængden af spaltningen cocktail skal fordobles.
- Per 0,25 mmol harpiks, bruger vi en 2 timers stuetemperatur reaktion med rotation, ved hjælp af et spaltningssted cocktail af 18,5 ml trifluoreddikesyre (TFA, 114,02 g / mol) med 0,5 ml af hver af triisopropylsilan (TIPS, 158,36 g / mol), 3,6-dioxa-1 ,8-octanedithiol (Dodt, 182,30 g / mol) og deioniseret vand (18,02 g / mol).
- Chill 400 ml vandfri diethylether på is i et bæger dækket med urglas.
- Udfælde peptidet i 10x overskydende diethylether og opdele opløsningen jævnt blandt fire 50 ml koniske rør. Centrifuger ved 3.200 xg i 10 minutter for at opsamle peptidet.
- Afhældes ether, og resuspender peptid i 100 ml frisk diethylether opdelt mellem to 50 m koniske rør. Gentag centrifugering proces resuspendering i 50 ml frisk ether to gange for i alt 4 ether vaske.
Bemærk: Dette fjerner de kemikalier, der anvendes i spaltning cocktail og spaltes beskyttelsesgrupperne fra den faste peptid.
- Afhældes ether, og resuspender peptid i 100 ml frisk diethylether opdelt mellem to 50 m koniske rør. Gentag centrifugering proces resuspendering i 50 ml frisk ether to gange for i alt 4 ether vaske.
- Efter det sidste centrifugeringstrin, dekanteres affald ethende og tørre peptid natten over under vakuum.
4.. Karakterisering af peptid funktionalisering
- Brug 50:50 H2O: Acetonitril (41,05 g / mol) + 0,1% TFA som opløsningsmiddel til MALDI-TOF analyse af peptid-prøver. Placer en lille prøve (1 - 2 mg) af peptidet i et 1,5 ml Eppendorf-rør, og prøven opløses i 1 ml MALDI opløsningsmiddel.
- Forbered matrix løsning. En almindeligt anvendt matrix α-cyano-4-hydroxykanelsyre (CHCA, 189,2 g / mol) som matrix. Opløs 10 mg / ml matrix i MALDI opløsningsmiddel, der danner en bestand matrix løsning.
Bemærk: Matricen stamopløsning kan opbevares ved stuetemperatur i op til en uge for yderligere analyser. - Kombiner peptidet og matrix-opløsning i forholdet 1:1. Spot Denne kombinerede løsning på tre forskellige steder på MALDI prøve plade, tilføjer 1 gl / spot.
- Tør pletter, enten ved lufttørring eller ved hjælp af en varmepistol. Respot og tørre hverprøve.
Bemærk: Respotting giver en mere ensartet peptid / matrix prøve, og de hjælper med at opnå et klart signal. En standard peptid mix bør også kombineres med matrix-opløsning i forholdet 1:1 og plettet (kun én gang) på MALDI plade.
- Tør pletter, enten ved lufttørring eller ved hjælp af en varmepistol. Respot og tørre hverprøve.
- Saml MALDI-TOF-data. På grund af tilsætningen af methacrylamid gruppe til den N-terminale ende af peptidet, bør der være en 68 g / mol stigning i molekylvægt, der ligger over peptidet molekylvægt alene.
Bemærk: I modsætning til PEGDM syntese kan peptider ikke refunctionalized, som ved spaltning af de beskyttende grupper på aminosyrer med reaktive sidekæder er fjernet, og kan ikke længere sikres selektiv funktionalisering af N-terminalerne.- Hvis MALDI analyse (figur 5) viser, at peptidet var korrekt funktionaliseret, og alle beskyttelsesgrupper passende spaltet, kan peptidet dialyseres (i vand mod vand) og opsamlet ved lyofilisering at løsnee resterende forureninger (spaltning cocktail, ether, kløvet beskytte grupper osv.). Det faste peptid skal overføres til et lille Eppendorf-rør og opbevaret ved -20 ° C indtil brug.
Representative Results
Proton kernemagnetisk resonans er en af de mest almindelige analytiske teknikker til at vurdere effektiviteten af en kemisk reaktion, som området under hver spektre top er i forhold til de relative niveauer af denne proton i prøven, så bestemmelse af forholdet mellem produkt og reaktant i prøven. Til denne reaktion kan der anvendes 1H-NMR-analyse (fig. 4) for at beregne% funktionalisering fra overholdes: teoretisk forholdet terminale methacrylat protoner (a, b og c) centrale PEG protoner (d). Den i figur 4 viste PEGDM var 2.000 Da før funktionalisering og derfor n = 2.000 Da / (44 Da / PEG-gentagelse) = 45,5, så d = 4 * (n-1) = 178, hvilket gør proton NMR enhed forholdet 178 / 102,16 = 1,74. I dette tilfælde, toppe en der ikke kan anvendes til at vurdere% funktionalisering, som tilstedeværelsen af vand i prøven kunstigt forøger arealet af den top. Ved hjælp af peak B, den% funktionalisering er 1,00 * 1,74 / 2 * 100% = 87,1%; using peak c, den% funktionalisering er 1,08 * 1,74 / 2 * 100% = 94,1%. Derfor er den samlede% funktionalisering er 91%, og denne PEGDM er tilstrækkeligt funktionaliseret til anvendelse i hydrogel syntese. Typisk er cirka 90% funktionalisering opnås efter en enkelt runde af methacrylation.
På grund af den mangfoldighed af proton toppe, der opstår i 1H-NMR-analyse af peptider er peptid funktionalisering lettere undersøgt ved MALDI-TOF massespektrometri. Dette er demonstreret i figur 5, hvor peptidet GKRGDSG blev syntetiseret og underkastet methacrylamid funktionalisering. En lille del af peptidet blev spaltet til prefunctionalization molekylvægt vurdering (figur 5A), som viste den observerede molekylvægt top forekommer ved 676 g / mol, den forventede molekylvægt af peptidet, hvilket indikerer korrekt syntese af peptidsekvensen. Den resterende del af peptidet undergik methacrylamid funktionellening forud for spaltning. Da dette peptid indeholder Pbf beskyttet R aminosyrer blev spaltning udføres i en cocktail indeholdende thioanisol i 4 timer. Efter methacrylamid funktionalisering forekommer den observerede molekylvægt top ved 744 g / mol (figur 5B), den forventede vægt af methacrylamid funktionaliseret peptid (676 +68 g / mol) og ikke på den forventede molekylvægt af funktionaliseret peptid, hvilket indikerer korrekt funktionalisering.
For at påvise funktionalitet både PEG og methacrylamid funktionaliseret peptid blev PEGDM hydrogeler fremstillet med og uden 0,5 mM methacrylamid funktionaliseret GKRGDSG (figur 6). Hydrogeler blev fremstillet med 10 vægt% lineær 10 kDa PEGDM i PBS med 0,05 vægt% Lithium phenyl-2 ,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) som fotoinitiator. Hydrogelen forstadie opløsning blev sprøjtet ind mellem to glasplader adskilt af en glasplade afstandsstykke og holdt sammen med bindemiddel klip. Precursor opløsning blev derefter udsat for 365 nm UV-lys ved 2 mW / cm 2 i 10 minutter for at inducere tværbinding, hvorefter geler 8 mm i diameter blev opsamlet under anvendelse af en cylindrisk dorn. Geler blev skyllet i PBS og fik lov til at svulme i 2 dage for at sikre ligevægtskvældning betingelser blev opnået 16,20. Humane MSC'er (passage 3) blev dyrket til 80% konfluens og podet på hydrogeler på 15.000 celler / cm2. Cellerne fik lov til at holde sig i 48 timer, før de overføres til frisk medium indeholdende 0,5 ul / ml calcein AM og 2 ul / ml ethidiumhomodimer (LIVE / DEAD Viability kit fra Invitrogen) og filmede under fasekontrast og fluorescens ved 10X forstørrelse ved hjælp af en Nikon Eclipse Ti 2000. MSC var ude af stand til at overholde de funktionaliserede PEG-hydrogeler (figur 6A), men ved inddragelse af celleadhæsions peptid RGD de var i stand til at tilslutte sig og spredes på hydrogel overfladen (figur 6B). Live / dead billederpræsenteret repræsenterer ikke levedygtigheden af seedede MSC befolkning, som MSC er adhæsionsafhængige celler, der løsnes fra geloverfladen efter døden og vil blive fjernet i løbet af processen medieoverførsel, hvilket resulterer i en kunstig oppustning af seedede levedygtighed celle. Snarere er de fluorescerende billeder beregnet til at afgrænse mellem adhærente celler og små variationer i hydrogelen topologi, som kan være vanskelige under fasekontrast alene. Interessant seedede nonspread celler på PEG-only geler farvet positive for både calcein AM og ethidiumhomodimer, hvilket indikerer, at cellerne døde på tidspunktet for billeddannelse.
En af de mange fordele ved at PEG-hydrogeler er deres meget afstemmelige karakter. Ændring af specifik sammensætning af PEG-hydrogelen giver forskere en høj grad af kontrol over egenskaber, såsom elasticitetsmodul. Som illustreret i figur 7, både PEG molekylvægt (figur 7A) og vægtprocentdelen (
Hydrogeler indeholder indkapslet bovint serumalbumin (BSA) blev dannet ved anvendelse af varierende molecular vægt PEG (2, 10 og 20 kDa). Alle hydrogeler blev fremstillet med 10 vægt-% PEGDM i PBS indeholdende 50 ug / ml BSA, som beskrevet for fig. 6. Gelerne blev inkuberet i 1 ml PBS ved 37 ° C og overføres til frisk PBS ved hvert tidspunkt. Udgivet BSA blev kvantificeret ved hjælp af Bradford Assay fra Thermo Scientific. Hydrogel maskestørrelse blev bestemt som beskrevet for fig. 8. Som vist i figur 7A, BSA frigivelse sker hurtigere fra hydrogeler dannet ved anvendelse af højere molekylvægt PEGDM som følge af den større maskestørrelse i hydrogel (figur 10).
Figur 4.. Repræsentant 1H-NMR af 2 kDa lineær PEGDM funktionaliseret ved hjælp af mikrobølge-assisteret metode. Procent funktionalisering kan være calculated baseret på den observerede:. teoretisk forhold mellem terminal methacrylatbaserede protoner (a, b og c) til centrale PEG protoner (D) Klik her for at se større billede .
Figur 5. Repræsentative MALDI-TOF peptid GKRGDSG (A) før og (B) efter funktionalisering ved hjælp af mikrobølge-assisteret fremgangsmåde Bemærk, at den observerede molekylvægt højdepunkt efter funktionalisering sker på 744 g / mol. Den forventede vægt af methacrylamid funktionaliseret peptid (676 68 g / mol) og ikke på den forventede molekylvægt af FN-funktionaliserede peptid (676 g / mol). Klik her for at se større billede .
Figur 6. Repræsentant fasekontrast (venstre) og LIVE / DEAD (grøn / rød) fluorescerende billeder (højre) af MSC dyrket på A) PEG geler alene og B) PEG geler, der indeholder 0,5 mM methacrylamide funktionaliserede GKRGDSG. MSC er i stand til at tilslutte sig og spredes på de PEGDA geler alene, men ved inkorporering af celleadhæsions peptid RGD, er i stand til at tilslutte sig og spredes på hydrogel overfladen. Klik her for at se større billede .
Figur 7. A) PEG molekylvægt og B) vægtprocent PEG anvendes til dannelse af hydrogel net påvirker hydrogel maskestørrelse (_8 ;) og resulterende hydrogel stivhed og frigivelse sats på indkapslede stoffer. A) Stigende PEG molekylvægt (venstre til højre) ved konstant vægt procentvise stigninger hydrogel maskestørrelse, faldende hydrogel stivhed og øge antallet af narkotika udgivelse. B) Faldende vægten procentdel af PEG (venstre til højre), der anvendes til at danne hydrogeler øger hydrogel maskestørrelse, ligeledes faldende hydrogel stivhed og øge antallet af narkotika frigivelse (ikke at skalere). Klik her for at se større billede .
Figur 8. A) maskestørrelse stiger og B) hydrogel stivhed falder med stigende molekylvægt af PEG makromeren. N = 10, fejlsøjler = SEM, *** p &# 60, 0.001 af envejs ANOVA med Tukeys HSD post hoc test. Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af Prism 5.. Klik her for at se større billede .
Figur 9. A) maskestørrelse falder, og B) hydrogel stivhed stiger med stigende vægt% PEG. N = 9-10, fejlsøjler = SEM, ** p <0,01, *** p <0,001 ved envejs ANOVA med Tukeys HSD post- hoc test. Klik her for at se større billede .
Figur 10. Frigivelse af encapsulated model drug bovint serumalbumin (BSA) fra hydrogeler dannet ved anvendelse af 2 kDa, 10 kDa, 20 kDa molekylvægt PEG. BSA frigivelse sker hurtigere fra hydrogeler dannet ved anvendelse af højere molekylvægt PEGDM som følge af den større maskestørrelse i hydrogelen . n = 6, fejlsøjler = SEM. Den% BSA frigivet er signifikant forskellige (p <0,0001) mellem alle tre grupper på hver tidspunkt, bortset fra t = 1 og 2,5 time når frigivelsen fra de 2 og 10 kDa geler er tilsvarende ved to-vejs gentagne foranstaltninger ANOVA med Bonferroni post-hoc test. Klik her for at se større billede .
Discussion
De tidligere illustrerede metoder er uvurderlig for syntesen af PEGDM og methacrylamid funktionalisering af peptider eller andre aminholdige forbindelser. Disse materialer kan derefter anvendes til regenerativ medicin og drug delivery applikationer. På grund af den hydrofile natur af PEG hydrogeler dannet ud fra PEG makromere har et højt vandindhold ligner mange væv i legemet 2. Denne kvalitet gør PEG meget modstandsdygtig over for proteinadsorption og derfor inaktivt i kroppen 3. Den hygroskopiske natur af PEG kan imidlertid vise sig generende under funktionalisering. Hvis vandet er til stede i PEG prøven under methacrylation procedure vil methacrylsyreanhydrid reagerer fortrinsvis med vand til dannelse af methacrylsyre og dårlig funktionalisering af PEG vil medføre.
Derfor er et af de vigtigste skridt, der kan træffes for at sikre en vellykket methacrylation af PEG eller peptid er at opretholde vandfriRous reaktionsbetingelser. Den anbefalede trin til tørring alle glasvarer før brug til formål at forhindre vandforurening. Tilstedeværelsen af vand i prøven kan ses i NMR-analyse som en bred top ved 1,7 ppm (figur 4). Hvis der observeres dårlig methacrylation selv efter tørring alt glasudstyr kan kemikalier, tørres over natriumsulfat eller andre tørremidler (molekylsier osv.) inden brug. Destillation kan også anvendes til at fjerne vand og rense methacrylsyreanhydrid før brug, og azeotrop destillation kan bruges til at tørre PEG 23. I ekstreme tilfælde kan syntesen udføres i en handskekasse yderligere at sikre tilstrækkeligt vandfri betingelser. En anden runde af methacrylation, efter samme procedure, kan også udføres for at øge funktionalisering. Fordi der er altid en chance for, at yderligere runder af funktionalisering vil være påkrævet, bør der udvises forsigtighed i trin 1.7 og 1.9 til hurtigt at indsamle PEGDM ved vakuumfiltrering. Vakuumfiltrering længere end absolut nødvendige stigninger eksponering af PEG til luft, hvilket øger muligheden for vand adsorption.
Selvom procent overskud af methacrylanhydrid til hydroxyl funktionelle grupper er uændret, hvilket øger PEG funktionalisering (fx arm #) på PEG forstadiet er generelt forbundet med fald i procent funktionalisering opnået (upublicerede resultater, Benoit lab). Til forebyggende løse dette reduktion i funktionalisering effektivitet, eller hvis særlige vanskeligheder opleves opnå tilstrækkelig høj funktionalisering, varigheden af mikrobølge reaktion kan forøges, såfremt mikrobølgeovnen interval holdes på 30 sek. Mens 10 molært overskud er typisk tilstrækkelig, kan mængden af methacrylsyreanhydrid anvendt i reaktionen også øges for at øge procent funktionalisering opnås 12.
Det er vigtigt, atekstra nedbør trin (1,9) udføres for at opnå gode NMR-signaler. Selvom det er fristende at udføre den anden nedbør samme dag som syntese, tørring af prøven natten over før genudfældning har vist sig at hjælpe fjernelse af overskydende methacrylanhydrid og methacrylsyre. Prøveforberedelse er også vigtigt for at opnå ren NMR-spektre, og derfor bør prøverne forberedes ved hjælp af de anbefalede. Figur 4 viser repræsentative 1 H-NMR-resultaterne for korrekt funktionaliserede PEGDM. Ved at analysere forholdet mellem terminal methacrylatbaserede protoner til de centrale PEG protoner blev PEGDM fast besluttet på at være tilstrækkeligt funktionaliserede. MALDI prøveforberedelse er ligeledes vigtigt for at opnå en klar læsning. MALDI er særligt følsom over for tilstedeværelsen af salte og koncentrationer høj prøve. Hvis en klar MALDI læsning (en intensitet over 50 arbitrære enheder (AU) med et højt signal: støj-forhold) ikke kan opnås, er prøven solution skal fortyndes 1:100 i MALDI opløsningsmiddel, før de kombineres med matrix-løsning og analyseres igen. Figur 5. viser repræsentative MALDI-TOF resultat efter korrekt peptid funktionalisering, kavalergang og prøveforberedelse. Spaltning af en lille prøve af harpiks før funktionalisering (figur 5A) viser korrekt syntese af peptidet GKRGDSG, med korrekt methacrylamid funktionalisering af peptidet vist i figur 5B.
Mens funktionalisering af on-harpiks peptider er en relativt robust procedure, spaltningsbetingelserne betingelser for hver sekvens kræver ofte tuning. For lange sekvenser, hvor mange aminosyrer har beskyttet sidekæder (> 30 aminosyrer lange, eller> 15 aminosyrer med beskyttende grupper), bør varigheden af spaltning øges med en time. Men hvis spaltning er forlænget for meget, kan peptid-bindingsspaltning resultat på grund af langvarig sure eksponering. MALDI ana lysis kan være meget nyttige i at afsløre eventuelle fejl, som opstod i peptid-syntese eller spaltning. En observeret fald under de forventede molekylvægte kan indikere, at aminosyre (r) ikke ordentligt par, eller at peptid fraktionering opstod (se tabel 2 for kilder til almindeligt observerede ændringer i molekylvægt). Hvis den observerede molekylvægt er højere med vægten af en beskyttelsesgruppe anvendt end forventet, er det sandsynligt, at spaltning og afbeskyttelse var utilstrækkelig og peptidet bør recleaved for yderligere tid.
| Aminosyredeletion | MW ændring (g / mol) | Uspaltet Beskyttelse Grupper | x "> MW ændring (g / mol)Almindeligt Present Ioner | MW ændring (g / mol) | |
| Ala | -71 | Acetyl | +42 | Cl - | +35 |
| Arg | -158 | Allyl | +40 | K + | +39 |
| Asn | -114 | Alloc | +85 | Mg2 + | <td style = "width: 64px;"> +24|
| Asp | -115 | Boc | +100 | Na + | +23 |
| Cys | -103 | Fmoc | +223 | ||
| Gin | -128 | OtBu | +56 | ||
| Glu | -129 | Pbf | 252 | ||
| Gly | -57 | tBu | +56 | ||
| Hans | -137 | Trt | +242 | ||
| Ile | -113 | ||||
| Leu | DTH: 64px; "> -113|||||
| Lys | -128 | ||||
| Met | -131 | ||||
| Phe | -147 | ||||
| -97 | |||||
| Ser | -87 | ||||
| Thr | -101 | ||||
| Trp | -186 | ||||
| -147 | |||||
| Val | -99 |
Tabel 2. Almindeligt observerede ændringer i peptid molekylvægt.
Makromere fremstillet ved hjælp af mikrobølge-assisteret methacrylation metoder kan anvendes i en række af regenerativ medicin eller drug delivery applikationer. De funktionaliserede peptider og PEGDM syntetiseret her, kan også inkorporeres i polymerer ved hjælp nitroxid-medieret Polymerization (NMP), Atom Transfer radikalpolymerisering (ATRP) eller Vendbar Addition-Fragmentering Transfer (RAFT) metoder 24. Hydrogel net kan også fremstilles i nærværelse af celler, som tidligere demonstreret i JOVE artiklen af Khetan og Burdick 22. Dette kræver ofte indarbejdelse af celleadhæsionsprocesser peptider såsom RGD eller ekstracellulære matrix molekyler, da PEG alene ikke giver celle-materiale interaktioner kritisk for overlevelse og funktion af nogle celletyper 25. Peptider, for eksempel, kan syntetiseres ved hjælp af traditionel fast-fase peptidsyntese og funktionaliseret som beskrevet her for at muliggøre inkorporering i hydrogel net. Som det ses i figur 6, optagelse af methacrylamid-funktionaliserede celleadhæsion peptid GK RGDS G i hydrogeler (0,5 mM) letter adhæsion af humane mesenchymale stamceller (MSC'er) til PEG-hydrogel overflader, øge antallet af vedlagte og spreading-celler (figur 6B ) sammenlignet med PEG-hydrogeler uden celleadhæsion peptid (
Anvendelser af hydrogel netværk kræver stram kontrol over materialeegenskaber. En væsentlig fordel til PEG-hydrogeler er en høj grad af kontrol over disse egenskaber. For eksempel molekylvægt arm nummer og vægt% af PEG anvendes i dannelsen af hydrogel net kan ændres til fin-tune egenskaber til specifikke applikationer. Dette giver stram kontrol over hydrogel maskestørrelse (ξ), som styrer hydrogel kvældningsforhold (Q) og stivhed (elasticitetsmodul, E). Dette er illustreret i figur 7A og kvantificeret i figur 8, hvor den stigende PEG makromer molekylvægt resulterer i en stigning i hydrogel maskestørrelse (figur 8A) og et fald i hydrogel stivhed (figur 8B).
Den underliggende fysiske kendetegn, der styrer størstedelen adfærd i disse hydrogel netværk, maskestørrelse, der er beregnet ved hjælp af Flory-Rehner ligning 16. For at udføre denne beregning er den volumetriske kvældningsgraden (Q) beregnes først fra ligning 4: 
(4)
hvor ρ s er massefylden af vand (1 g / ml), ρ p er massefylden af PEG (1,12 g / ml), M s er opsvulmet masse af hydrogelen og M D tørvægt af hydrogel (ofte målt efter frysning og lyofilisering af hydrogeler). Molekylvægten mellem tværbindinger (M c, i g / mol) beregnes derefter fra ligning 5: 
(5)
hvor M N er antallet gennemsnittet MW PEG (ig / mol), 
er det specifikke volumen af polymeren 
V 1 er det molære volumen af vand (18 ml / mol), V 2 er ligevægten polymer volumenfraktion af hydrogelen
( 
), Og X1 16. Antallet af bindinger mellem tværbindinger (n) beregnes derefter ud fra ligning 6: 
(6)
hvor N b er antallet af bindinger i PEG-gentagelse (3) og M r er MW PEG gentagelse (44 g / mol) 27. Dette tillader root-mean-square ende-til-ende afstand af polymerkæden 
(I nm), der skal beregnes ud fra ligning 7: 
(7)
hvor L er den gennemsnitlige bond længde (0,146 nm, beregnet på grundlag af CC og CO obligation længder) og C n er det karakteristisk forhold mellem polymer (4,0 for PEG) 28. Fidelig, maskestørrelse hydrogelen kan beregnes ud fra ligning 8: 
(8)
Hydrogel egenskaber kan ligeledes indstilles ved at justere mængden af PEG anvendes i dannelsen af hydrogeler. Faldende vægtprocenten af PEG makromer resulterer i en stigning i hydrogel maskestørrelse, som efterfølgende reducerer hydrogel stivhed. 7B illustrerer og figur 9 kvantificerer hvor vægtprocenten af PEG anvendes i hydrogel formation kan anvendes til at styre maskestørrelse (figur 9A) og resulterende hydrogel stivhed (figur 9B). Som det er blevet vist substrat stivhed at påvirke celle adfærd, såsom stamcelle-differentiation 29, evnen til stramt at styre stivhed er en vigtig egenskab i hydrogel fabrikation.
Hydrogeler kan også anvendes til at control drug delivery. Som vist i figur 7A og demonstreret i figur 10, forøgelse af molekylvægten af PEG-makromerer øger maskestørrelse hydrogel netværket efterfølgende øge frigørelsen af indkapslet model drug, bovint serumalbumin (BSA). Mens hydrogel prøver i denne undersøgelse blev ødelagt ved t = 195 timer for at tillade måling af hydrogel våde og tørre masserne til beregninger maskestørrelse, er det vores erfaring, at fortsatte BSA frigivelse ville forekomme prøverne var blevet inkuberet i længere perioder. Den ufuldstændige frigivelse af BSA observeret i figur 10 er ikke uventet, da andre grupper har også rapporteret, at BSA er resistent over for diffusion inden PEG hydrogel netværk 30. Ufuldstændig frigivelse af indkapslet protein kan opstå på grund af hydrogenbinding mellem proteiner og PEG makromerer eller kovalent binding mellem methacrylatgruppe på PEG og primære aminogrupper på lysinrester i BSA 31 (figur 2A), er det også muligt, at en fraktion af det indkapslede BSA er indeholdt i områder af hydrogel, der har betydeligt mindre mesh størrelse end det samlede gennemsnit i gelen, hvilket forhindrer dets frigivelse. Mens ufuldstændig, nonFickian frigivelse (data ikke vist) af indkapslet BSA blev observeret i dette tilfælde styret Fick'sk frigivelse af talrige andre model narkotika, herunder insulin og ægalbumin, er blevet påvist ved brug lignende PEGDM hydrogelerne 30. Derudover Watkins og Anseth har brugt konfokal laser scanning mikroskopi at påvise, at frigivelsen af fluorescerende molekyler fra lignende hydrogeler er modelleret acceptabelt med Fick'sk diffusion migtoder 32..
Mens hydrogeler dannet i denne undersøgelse er nedbrydelige, nedbrydning netværk er en anden parameter, der kan inkorporeres i og tunet i disse net. Med styret hydrogel nedbrydning kan resultere i ændringer i celle adfærd 33, fremme af væv vækst eller vært vævsindvækst eller eliminering af behovet for explantation 34. Nedbrydelige PEG-hydrogeler er almindeligvis syntetiseret ved ringåbning hydrolytisk nedbrydelige d, l-lactid, glycolid, eller ε-caprolacton grupper på hydroxylgrupperne i PEG før methacrylation 35. Disse tre grupper nedbrydes ved hydrolyse af ester-funktionaliteter, med glycolid estere har den største følsomhed over for nedbrydning, efterfulgt af lactid og caprolacton ester, på grund af deres varierende hydrofobicitet. Efter inkorporering af hydrolytisk nedbrydelige grupper, kan PEG funktionaliseres yderligere ved hjælp af methacrylation procedure detailed i denne artikel, så dannelsen af hydrogel net via efterfølgende radikal-initieret kædepolymerisation 36,37. Nedbrydningshastigheden hydrogel netværk kan styres ved at variere identiteten af den hydrolytisk nedbrydelige gruppen (glycolid, lactid osv.), og ved at variere antallet af nedbrydelige gentagelser indarbejdet i strukturen 35,38.
Teoretisk set kunne metoderne demonstreret her, til acrylering af PEG og peptider ved at erstatte methacrylsyreanhydrid med acrylsyreanhydrid i trin 1.3 og 3.3 hhv. Men acrylsyreanhydrid er mere end 20 gange prisen på methacrylanhydrid 39,40, hvilket gør mikrobølge-assisteret acrylering betydeligt mindre attraktive end mikrobølge-assisteret methacrylation.
Vi har vist en enkel, hurtig metode til at functionalize PEG og peptider, hvordan at vurdere effektiviteten af denne procedure, og givet ressourcer til usynge syntetiserede materialer til at danne hydrogel netværk. Disse syntetiske værktøjer er meget alsidige i deres ansøgninger, og skulle vise sig et dagligt syn i et vilkårligt antal drug delivery og materialer forskningslaboratorier.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret delvist af en Howard Hughes Med-i-Grad stipendium (AVH) ved start-up midler, til Dr. Danielle Benoit fra University of Rochester og Ortopædisk Forsknings-og Education Foundation / Muskuloskeletal Transplant Foundation (oref / MTF). Forfatterne vil gerne takke Dr. James L. McGrath for brugen af hans udstyr.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3,6-Dioxa-1,8-octanedithiol | Tokyo Chemical Industry Co, LTD | D2649 | CAS 14970-87-7 |
| Acetonitrile | J.T. Baker | UN1648 | CAS 75-05-8 |
| Amino Acids | AAPPTech | Glycine: AFG101 | CAS 29022-11-5 |
| Arginine: AFR105 | CAS 154445-77-9 | ||
| Asparagine: AFD105 | CAS 71989-14-5 | ||
| Serine: AFS105 | CAS 71989-33-8 | ||
| Anhydrous diethyl ether | Fisher Scientific | UN1155 | CAS 60-29-7 |
| Citric acid | Sigma Aldrich | C1857 | CAS 77-92-9 |
| Deuterated chloroform | Cambridge Isotope Laboratories Inc. | DLM-7-100 | CAS 865-49-6 |
| Dichloromethane | Fisher Scientific | UN1593 | CAS 75-09-2 |
| Diisopropylethylamine | Alfa Aesar | A1181 | CAS 7087-68-5 |
| Dimethylformamide | Fisher Scientific | D119-4 | CAS 68-12-2 |
| Fmoc-Gly-Wang resin | Peptides International | RGF-1301-PI | 100-200 mesh size |
| Methacrylic anhydride | Alfa Aesar | L14357 | CAS 760-93-0 |
| N-Methylpyrrolidone | VWR | BDH1141-4LG | CAS 872-80-4 |
| On-resin peptides | Synthesized in-house | On-resin peptides can also be purchased from Peptides International, GenScript, AAPPTec, etc. | |
| O-Benzotriazole-N,N,N’,N’-tetramethyl-uronium-hexafluoro-phosphate | AnaSpec Inc | 510/791-9560 | CAS 94790-37-1 |
| Peptide Calibration Standard | Care | 206195 | |
| Piperazine | Alfa Aesar | A15019 | CAS 11-85-0 |
| Poly(ethylene glycol) 2 kDa linear | Alfa Aesar | B22181 | CAS 25322-68-3 |
| Poly(ethylene glycol) 10 kDa linear | Alfa Aesar | B21955 | |
| Poly(ethylene glycol) 20 kDa linear | Sigma Aldrich | 81300 | JenKem Technologies USA is an alternate supplier of linear and multi-arm PEG |
| Thioanisole | Alfa Aesar | L5464 | CAS 100-68-5 |
| Trifluoroacetic acid | Alfa Aesar | A12198 | CAS 76-05-1 |
| Triisopropylsilane | Alfa Aesar | L09585 | CAS 6485-79-6 |
| α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid | Tokyo Chemical Industry Co, LTD | C1768 | CAS 28166-41-8 |
References
- Lin, C. C., Anseth, K. S. PEG Hydrogels for the Controlled Release of Biomolecules in Regenerative Medicine. Pharm. Res. 26, 631-643 (2009).
- Ifkovits, J. L., Burdick, J. A. Review: Photopolymerizable and degradable biomaterials for tissue engineering applications. Tissue Eng. 13, 2369-2385 (2007).
- Peppas, N. A., Hilt, J. Z., Khademhosseini, A., Langer, R. Hydrogels in biology and medicine: From molecular principles to bionanotechnology. Adv. Mater. 18, 1345-1360 (2006).
- Lutolf, M. P., Hubbell, J. A. Synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments for morphogenesis in tissue engineering. Nat. Biotechnol. 23, 47-55 (2005).
- Benoit, D. S., Durney, A. R., Anseth, K. S. The effect of heparin-functionalized PEG hydrogels on three-dimensional human mesenchymal stem cell osteogenic differentiation. Biomaterials. 28, 66-77 (2007).
- Benoit, D. S., Collins, S. D., Anseth, K. S. Multifunctional hydrogels that promote osteogenic human mesenchymal stem cell differentiation through stimulation and sequestering of bone morphogenic protein 2. Adv. Funct. Mater. 17, 2085-2093 (2007).
- Fairbanks, B. D., et al. A Versatile Synthetic Extracellular Matrix Mimic via Thiol-Norbornene Photopolymerization. Adv. Mater. 21, 5005 (2009).
- Moon, J. J., Hahn, M. S., Kim, I., Nsiah, B. A., West, J. L. Micropatterning of Poly(Ethylene Glycol) Diacrylate Hydrogels with Biomolecules to Regulate and Guide Endothelial Morphogenesis. Tissue Eng. A. 15, 579-585 (2009).
- Burdick, J. A., Anseth, K. S. Photoencapsulation of osteoblasts in injectable RGD-modified PEG hydrogels for bone tissue engineering. Biomaterials. 23, 4315-4323 (2002).
- Yanez-Soto, B., Liliensiek, S. J., Murphy, C. J., Nealey, P. F. Biochemically and topographically engineered poly(ethylene glycol) diacrylate hydrogels with biomimetic characteristics as substrates for human corneal epithelial cells. J. Biomed. Mater. Res. A. 101A, 1184-1194 (2013).
- Benoit, D. S. W., Anseth, K. S. Heparin functionalized PEG gels that modulate protein adsorption for hMSC adhesion and differentiation. Acta Biomater. 1, 461-470 (2005).
- Lin-Gibson, S., et al. Synthesis and characterization of PEG dimethacrylates and their hydrogels. Biomacromolecules. 5, 1280-1287 (2004).
- Anseth, K. S., Wang, C. M., Bowman, C. N. Reaction Behavior and Kinetic Constants for Photopolymerizations of Multi(Meth)Acrylate Monomers. Polymer. 35 (94), 3243-3250 (1994).
- Bencherif, S. A., et al. End-group effects on the properties of PEG-co-PGA hydrogels. Acta Biomater. 5, 1872-1883 (1016).
- Rydholm, A. E., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Degradable thiol-acrylate photopolymers: polymerization and degradation behavior of an in situ forming biomaterial. Biomaterials. 26, 4495-4506 (2005).
- Zustiak, S. P., Leach, J. B. Hydrolytically Degradable Poly(Ethylene Glycol) Hydrogel Scaffolds with Tunable Degradation and Mechanical Properties. Biomacromolecules. 11, 1348-1357 (2010).
- Malkoch, M., et al. Synthesis of well-defined hydrogel networks using Click chemistry. Chem. Commun. , 2774-2776 (2006).
- Hoffman, M. D., Benoit, D. S. Emerging Ideas: Engineering the Periosteum: Revitalizing Allografts by Mimicking Autograft. , (2012).
- Hoffman, M. D., Xie, C., Zhang, X., Benoit, D. S. The effect of mesenchymal stem cells delivered via hydrogel-based tissue engineered periosteum on bone allograft healing. Biomaterials. , (2013).
- Hubbell, J. A., Lutolf, M. P., Raeber, G. P., Zisch, A. H., Tirelli, N. Cell-responsive synthetic hydrogels. Adv. Mater. 15, 888-892 (2003).
- Lidstrom, P., Tierney, J., Wathey, B., Westman, J. Microwave assisted organic synthesis - a review. Tetrahedron. 57, 9225-9283 (2001).
- Khetan, S., Burdick, J. Cellular encapsulation in 3D hydrogels for tissue engineering. J. Vis. Exp. (32), e1590 (2009).
- Antonios, M., Kurtis, K., Lucas, K. Drying poly(ethylene glycol). Nat. Protoc. Exchange. , (2012).
- Nicolas, J., Mantovani, G., Haddleton, D. M. Living radical polymerization as a tool for the synthesis of polymer-protein/peptide bioconjugates. Macromol. Rapid Comm. 28, 1083-1111 (2007).
- Nuttelman, C. R., Benoit, D. S. W., Tripodi, M. C., Anseth, K. S. The effect of ethylene glycol methacrylate phosphate in PEG hydrogels on mineralization and viability of encapsulated hMSCs. Biomaterials. 27, 1377-1386 (2006).
- Hern, D. L., Hubbell, J. A. Incorporation of adhesion peptides into nonadhesive hydrogels useful for tissue resurfacing. J. Biomed. Mater. Res. 39, 266-276 (1998).
- Andreopoulos, F. M., Beckman, E. J., Russell, A. J. Light-induced tailoring of PEG-hydrogel properties. Biomaterials. 19, 1343-1352 (1998).
- Merrill, E. W., Dennison, K. A., Sung, C. Partitioning and Diffusion of Solutes in Hydrogels of Poly(Ethylene Oxide). Biomaterials. 14, 1117-1126 (1993).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Weber, L. M., Lopez, C. G., Anseth, K. S. Effects of PEG hydrogel crosslinking density on protein diffusion and encapsulated islet survival and function. J. Biomed. Mater. Res. A. 90A, 720-729 (2009).
- Mellott, M. B., Searcy, K., Pishko, M. V. Release of protein from highly cross-linked hydrogels of poly(ethylene glycol) diacrylate fabricated by UV polymerization. Biomaterials. 22, 929-941 (2001).
- Watkins, A. W., Anseth, K. S. Investigation of molecular transport and distributions in poly(ethylene glycol) hydrogels with confocal laser scanning microscopy. Macromolecules. 38, 1326-1334 (2005).
- Anseth, K. S., Benoit, D. S. W., Durney, A. R. Manipulations in hydrogel degradation behavior enhance osteoblast function and mineralized tissue formation. Tissue Eng. 12, 1663-1673 (2006).
- Hillwest, J. L., et al. Prevention of Postoperative Adhesions in the Rat by in-Situ Photopolymerization of Bioresorbable Hydrogel Barriers. Obstet. Gynecol. 83, 59-64 (1994).
- Sawhney, A. S., Pathak, C. P., Hubbell, J. A. Bioerodible Hydrogels Based on Photopolymerized Poly(Ethylene Glycol)-Co-Poly(Alpha-Hydroxy Acid) Diacrylate Macromers. Macromolecules. 26, 581-587 (1993).
- Skaalure, S. C., Milligan, I. L., Bryant, S. J. Age impacts extracellular matrix metabolism in chondrocytes encapsulated in degradable hydrogels. Biomed. Mater. 7, 024111-0210 (2012).
- Hoffman, M. D., Benoit, D. S. Agonism of Wnt-beta-catenin signalling promotes mesenchymal stem cell (MSC) expansion. J. Tissue. Eng. Regen. Med. , (2013).
- Sawhney, A. S., Pathak, C. P., Vanrensburg, J. J., Dunn, R. C., Hubbell, J. A. Optimization of Photopolymerized Bioerodible Hydrogel Properties for Adhesion Prevention. J. Biomed. Mater. Res. 28, 831-838 (1994).
- Methacrylic Anhydride [Internet]. , Available from: https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=AAAL14357-18 (2013).
- Acrylic Anhydride [Internet]. , Available from: http://www.polysciences.com/Catalog/Department/Product/98/productid--40/ (2013).
