Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Mikrobølgeovn-assistert funksjon av Poly (etylenglykol) og On-resin Peptider for bruk i Chain polymerisasjoner og hydrogeldannelse

Published: October 29, 2013 doi: 10.3791/50890
Automatic Translation
1, 2, 1,2,3
1Department of Biomedical Engineering, University of Rochester, 2Department of Chemical Engineering, University of Rochester, 3Center for Musculoskeletal Research, University of Rochester Medical Center

Summary

Denne filmen vil illustrere en hurtig, effektiv metode for å metakrylat poly (etylenglykol), slik at kjede-polymeriseringer og hydrogel-syntese. Det vil vise hvordan man på samme måte introdusere methacrylamide funksjoner til peptider, detalj felles analysemetoder for å vurdere funksjon effektivitet, gi forslag til feilsøking og avanserte modifikasjoner, og demonstrere typiske hydrogel karakterisering teknikker.

Abstract

En av de viktigste fordelene med å bruke poly (etylenglykol) (PEG) makromerer i hydrogeldannelse er syntetisk allsidighet. Muligheten til å trekke fra et stort utvalg av PEG molekylære vekter og konfigurasjoner (arm nummer, armlengde, og forgrening mønster) gir forskerne stram kontroll over resulterende hydrogel strukturer og egenskaper, inkludert Youngs modulus og maskevidde. Denne videoen vil illustrere en rask, effektiv, løsemiddelfritt, mikrobølgeovn-assistert metode for å metakrylat PEG forløpere i poly (etylenglykol) dimethacrylate (PEGDM). Dette syntetiske metoden gir sårt tiltrengte utgangsmaterialer for applikasjoner i levering av legemidler og regenerativ medisin. Den viste metode er overlegen i forhold til tradisjonelle methacrylation metoder som det er vesentlig raskere og enklere, samt mer økonomisk og miljøvennlig, ved hjelp av mindre mengder av reagenser og løsningsmidler. Vi vil også demonstrere en tilpasning av denne teknikken for on-resin metakryloksyetyltrimetoksysilanylamide funksjonalisering av peptider. Denne mot-resin metoden tillater N-terminus av peptider til å bli funksjonalisert med metakrylamid grupper før avbeskyttelse og spalting fra harpiks. Dette gir mulighet for selektiv tilførsel av metakrylamid gruppene til N-termini av peptidene mens aminosyrer med reaktive sidegrupper (f.eks primært amin med lysin, primær alkohol med serin, sekundære alkoholer med treonin, og fenol av tyrosin) forblir beskyttet, hindrer funksjon på flere steder. Denne artikkelen vil detalj felles analysemetoder (proton NMR spektroskopi (H-NMR) og Matrix Assisted Laser desorpsjon ionisering Tid of Flight massespektrometri (MALDI-TOF)) for å vurdere effektiviteten av functionalizations. Vanlige fallgruver og antydet feilsøking metoder vil bli behandlet, slik det vil modifikasjoner av den teknikk som kan anvendes for ytterligere å tune makromer funksjonalitet og resulterende hydrogel fysiske og kjemiskeegenskaper. Bruk av syntetiske produkter for dannelsen av hydrogeler for levering av legemidler og cellemateriale interaksjonsstudier vil bli demonstrert, med spesiell oppmerksomhet på å endre hydrogelmaterialet å påvirke maskevidde, kontrollerende hydrogel stivhet og narkotika utgivelse.

Introduction

Poly (etylenglykol) (PEG) hydrogeler er vanlige biomaterialer som brukes i regenerativ medisin og medisinering programmer 1-3. Disse hydrogeler gir betydelige fordeler fremfor andre biomaterialer. PEG hydrogeler er syntetiske, med en høy grad av kontroll over tekniske egenskaper som elastisitetsmodul, og nedbrytningshastigheten i forhold til deres naturlige motstykker biomateriale en. Ettersom de er syntetisk avledet, har PEG betydelig mindre batch-til-batch variasjon versus naturlig avledede materialer fire. På grunn av den kjemiske sammensetningen av PEG, er disse hydrogeler er sterkt hydrofile, motstandsdyktig mot protein adsorpsjon, og biokompatibelt 3. Denne motstanden mot protein adsorpsjon tillater PEG hydrogeler å fungere som en "blank slate", slik at forskerne å forhøre og studere spesifikke biologiske eller kjemiske faktorer (narkotika, biomolekyler, celle adhesjon peptider, etc.) og de ​​spesifikke roller disse factors spiller i å kontrollere celle-og / eller vev oppførsel.

Figur 1
Klikk her for å se større bilde .

Figur 1: Eksempler på poly (etylenglykol) (PEG) arkitekturer A) Lineær PEG B) 4-arm PEG med en pentaerythritol kjerne C) 8-arm PEG med en heksaglycerol kjerne D) 8-arm PEG med en.... tripentaerythritol kjerne. n er antallet PEG gjentas på hver arm. Hver repetisjons har en molekylvekt på 44 g / mol, og derfor n kan beregnes ut fra den totale molekylvekt og struktur / arm #.

PEG forløpere er tilgjengelige med en rekke arkitekturer og molekylvekter (figur 1 ). Varierende arkitekturen (armen #) og etylenglykol gjentar (n) av PEG kan brukes for å kontrollere egenskapene til hydrogel-nettverk som dannes fra disse makromerer. Umodifisert PEG inneholder terminal hydroksylgrupper som må erstattes med en alternativ funksjonalitet for å legge til rette for kovalente kryssbinding via polymerisasjoner, den mest vanlig ansatt fornetning strategi for PEG hydrogeler, før dannelsen av hydrogel nettverk. Det finnes en rekke kjemiske grupper som kan bli innlemmet i PEG makromerer for å lette polymerisasjon og tverrbinding nettverk (akrylat, metakrylat, vinyl-eter, norbornen, etc.). Til tross for den rekke terminal funksjonalitet som er tilgjengelige for å lette tverrbinding, er det bare to mekanismer som polymerisasjonen kan oppstå: steg-og kjede-vekst (eller en blanding av de to, blandet modus).

g2.jpg "width =" 600px "/>
Klikk her for å se større bilde .

Figur 2:.. Teoretisk hydrogel nettverk skjematisk A) Tradisjonelle kjeden vekst Polymeriseringsresultatene i heterogene nettverk som inneholder tett poly (metylmetakrylat) kryssbinding av regioner og økt nettverks nonidealities som looper, ikke reagert forløpere, og permanente forviklinger B) Step-vekst Polymeriseringsresultatene i betydelig mer homogene nettverksstrukturer (ikke i målestokk).

Funksjonalitet som tverrbinde via kjedevekst polymerisering krever ikke tilstedeværelse av en ytterligere tverrbindingsmiddel. Imidlertid kjede-polymerisert hydrogeler gir heterogene nettverk strukturer inneholdende tverrbindings tette områder (figur 2A) 1. I kontrast, step-vekst polymerisasjon krav som stillesres bruk av et tverrbindingsmiddel eller ko-monomer som er reaktiv med de terminale funksjonelle grupper i den PEG makromerer. Ettersom de terminale funksjonelle grupper i den PEG bare kan reagere med tverrbindingsmiddel og tverrbindingsmiddelet bare kan reagere med de terminale funksjonelle grupper i den PEG, dette resulterer i større nettstruktur homogenitet (figur 2B) 1. Step-vekst polymerisasjoner også vanligvis føre til høyere konvertering av funksjonelle grupper, redusere mengden av ikke-reagerte forløpere og potensial for immun / inflammatoriske responser som følge av løselige, unincorporated makromerer en. Blandet modus polymerisasjons-metoder er også blitt utviklet som kombinerer både trinn-og kjede-vekst polymerisasjon ved bruk av makromerer som både kan selv-reagere (kjede-vekst), og reagere med et tverrbindingsmiddel (step-vekst). Dette gir hydrogeler med egenskapene i hver polymerisasjon mekanisme, og kan brukes til å produsere mer komplekse og varierte nettverkstrukturer enn entenstep-eller kjede-vekst nettverk alene en.

Mens det er et mangfold av funksjonelle grupper som kan brukes til å functionalize PEG og letter hydrogel formasjon, metakrylater og norbornenes er noen av de mest vanlige kjede-og trinn-vekst polymerisasjons-delene, henholdsvis. Begge disse funksjonene gir utmerket kontroll over tid og rom nettverks polymerisasjon, og når det brukes til å innkapsle celler, er disse nettverk støtter høye totale celleoverlevelses 5-7. Dimetakrylat funksjonalisert PEG (PEGDM) tverrbinding via kjede polymerisasjon og tillater inkorporering av biomolekyler eller andre faktorer ved ko-polymerisering med akrylat-, metakrylat-, eller tilsvarende-funksjon biomolekyler 5,6. PEGDM hydrogeler har betydelige fordeler fremfor alternative kjede-vekst-polymerisasjons-systemer, for eksempel akrylat-funksjonalisert PEG (PEGDA). Ved hjelp av tradisjonelle metoder, kan PEGDA syntetiseres raskere enn PEGDM; hoWever, ved hjelp av mikrobølgeovn-assistert syntese, er PEGDM syntese enda mer effektiv. PEGDA er ofte syntetiseres i over natten 8 eller 24-timers 9 reaksjoner, men kan også bli syntetisert i fire timer ved forhøyede temperaturer 10. PEGDM er også tradisjonelt syntetiseres ved omsetning over natten 11 eller i 24 timer 5 med noen metoder for å forlenge reaksjonstiden til 4 dager 12. Ved hjelp av mikrobølge-assistert metode vist her, kan PEGDM bli produsert i en 5 min reaksjon. Mens PEGDM har langsommere reaksjonskinetikk enn PEGDA 13, er tverrbindingsreaksjon for PEGDM fortsatt hurtig, som forekommer i løpet av minutter, og oppnår større makromer konvertering enn PEGDA som økt hydrofobitet av metakrylat-gruppen øker funksjonell gruppe aggregering i løsning, for derved å øke sannsynligheten for radikal overføring og metakrylat konvertering 14. PEGDM Hydrogelene også forbundet med økt cellulær levedyktighet og vekst somsammenlignet med PEGDA hydrogeler, sannsynligvis på grunn av reduksjon i reaksjonshastigheten til enhver tid, noe som reduserer radikal konsentrasjon og uomsatte makromerer stede 14.. Tiol-ene polymeriseringer slik som de som bruker norbornen-funksjonalisert PEG (PEGN) danner hydrogeler via trinnvekst polymerisering, og krever bruk av PEGN og et tverrbindingsmiddel som inneholder et gjennomsnitt på mer enn to funksjonelle grupper. Siden thiyl radikaler reagerer med norbornen karbon-karbon dobbeltbindinger, multi-tiol inneholder crosslinkers ofte brukes til cross PEGN hydrogeler, slik at for lettvinte inkorporering av peptider med cystein aminosyrer funksjonaliteter 7. Mens det er en rekke andre kjemikalier som reagerer via trinnvekst polymerisering (Michael-addisjonsreaksjoner som tiol-akrylat 15 og tiol-vinyl-sulfon 16, et "klikk" reaksjoner som alkynet-azid 17 etc.), tiol-norbornen hydrogelen svært vanlig, så belastningen fraden norbornen ringen betydelig øker reaksjonshastigheten og reduserer muligheten for at norbornen-dobbeltbindingen gjennomgår kjede polymerisasjon 7..

Beslutningen mellom metakrylat, norbornen, eller alternativ funksjon å lette hydrogeldannelse er i stor grad basert på tilnærming. For eksempel, har kjeden vekst polymerisert PEGDM nettverk blitt demonstrert så godt egnet til å kontrollere celle lokalisering i utviklingen av en vev-konstruert periosteum 18,19. Trinn-vekst polymerisert PEG nettverk er bedre egnet for inkorporering av peptidsekvenser for å lette enzymatisk-responsive hydrogel nedbrytning, på grunn av den enkle innarbeidelse av enzymsubstrat-sekvenser ved hjelp av tiol (cystein) inneholdende peptider og norbornen functionalized makromerer 20. Hvis problemstillingen vil være best løses ved bruk av trinn-vekst hydrogeler, Fairbanks et al. Gir en detaljert beskrivelse av norbornene funksjon strategi for PEG 7. Dette papiret vil detalj hvordan PEG-og peptid-sekvenser kan bli funksjonalisert (med et metakrylat for PEG og metakrylamid for peptider) for kjede polymeriseringsreaksjoner.

Tradisjonelt er PEGDM fremstilt ved omsetning av PEG med metakryloyl-klorid og trietylamin i diklormetan. Reaksjonsblandingen tillates å gå videre ved romtemperatur natten over 11 eller i 24 timer 5 med noen metoder som strekker reaksjonstid på 4 dager 12 før filtrering, utfelling i dietyleter, og innsamling. Mens mange variasjoner av denne fremgangsmåten finnes, alle er tidkrevende, krever et stort utvalg av kjemiske syntese av utstyr, og er ikke miljøvennlig, ettersom de innebærer bruk av relativt store mengder av høy renhet reagenser og løsningsmiddel. For å omgå disse begrensningene, Lin-Gibson et al. Utviklet en mikrobølgeovn-assistert, løsemiddelfri metode for å functionalize PEG med te rminal metakrylat grupper (figur 3A) 12. I denne reaksjon, de terminale alkoholgrupper i PEG reagere med en av de karbonyl-atomer av metakrylsyre-anhydrid for å danne en karboksylgruppe. Dette genererer PEGDM produkt, med metakrylsyre som et sideprodukt. Denne syntesen har mange av de karakteristiske fordeler ved mikrobølge-syntese, inkludert redusert reaksjonstid og løsningsmiddel-frie syntesemetoder 21. Mikrobølge syntese er å foretrekke fremfor de tidligere omtalte fremgangsmåter som det er betydelig raskere, krever mindre omfattende synteseutstyr (for eksempel glass, reaksjons-plater), og bruker mindre samlet reagens-og løsningsmiddelmengder som løsningsmidler er kun nødvendig for produktrensing / innsamling og ikke for syntese, noe som gjør det mer økonomisk og miljøvennlig.

0px "/>
Klikk her for å se større bilde .

Figur 3:. Funksjonalise skjema A) poly (etylenglykol) omsettes med 10 ganger molart overskudd metakrylsyre-anhydrid for å produsere poly (etylenglykol) metakrylat B) Den samme fremgangsmåte kan brukes for å functionalize N-enden av peptid-sekvenser, som danner en. methacrylamide funksjonalisert peptid. Ved å utføre denne fremgangsmåten før spalting av peptidet fra harpiksen, kan den selektive funksjonalisering av de N-terminale utføres som aminosyre-sidegruppene forblir beskyttet. n: antall PEG gjentas i makromer (n = 45.5, 227 og 455, henholdsvis for de to, 10 og 20 kDa lineære PEG benyttes). R1 til RN: aminosyre sidekjeder. PG1 til PGN: sidekjedebeskyttende grupper. TFA: trifluoreddiksyre. TIPS: triisopropylsilane. Dodt: 3,6-dioksa-1 ,8-octanedithiol. H 2 O: vann.

Mikrobølgeassistert methacrylation metode er nylig blitt bearbeidet av vår gruppe til functionalize N-terminus av peptider med metakrylamid grupper (Figur 3B) for å lette peptid inkorporering i en rekke polymerer og polymere nettverk. I denne reaksjon, er det primære amin med N-terminus av peptid reagerer med karbonyl-atom på metakrylsyre-anhydrid for å danne et amid. Dette genererer metakrylamid funksjonalisert peptid, med metakrylsyre fremstilt som et sideprodukt. Ved bruk av denne fremgangsmåten for å functionalize N-enden av peptid-sekvenser, er det viktig at aminosyrer som inneholder reaktive sidekjeder (primære aminer (lysin), alkoholer (serin, treonin), og fenoler (tyrosin)) er beskyttet ved funksjonalisering, og beskyttende grupper er bare spaltes etter metakrylamid inkorporering.

Denne artikkelen vil vise begge disse mikave-baserte metoder for å syntetisere PEGDM og functionalize på harpiks peptidsekvenser, fremhever vanlige fallgruver og foreslå feilsøking metoder. I denne artikkelen vil metoder for å utføre analytiske kjemiske teknikker som vanligvis benyttes for å vurdere produktet funksjon være detaljert, og forslag og ressurser til å utføre mer avanserte modifikasjoner vil bli gitt. Typiske resultater vil bli demonstrert, som inkluderer bruk av det syntetiserte PEGDM å danne hydrogel nettverk, å utnytte de dannede hydrogeler for å kontrollere frigjøring av en modell medikament, og anvendelse av funksjonalis peptider for å lette celle-hydrogel interaksjoner. Spesiell oppmerksomhet vil bli utbetalt til karakter hydrogel maskevidde og diskutere hvordan hydrogelmaterialet kan være innstilt til å påvirke denne underliggende fysiske eiendom, som i sin tur styrer bulk materialegenskaper som stivhet og narkotika frigjøringsprofil.

Protocol

En. Mikrobølgeovn-assistert Syntese av PEGDM

  1. For å unngå forurensning med vann, idet pre-tørr alt glassutstyr som brukes i en ovn (> 60 ° C) i 1 time.
    Merk: Påkrevd glass inkluderer: to 100 ml begerglass, en 250-ml begerglass, 3 spatler, en 250-ml Büchner kolbe, en 7-cm Büchner trakt, en 10-cm urglass.
  2. Pre-kulden 100-150 ml vannfri dietyl-eter (74,12 g / mol) for utfelling deretter foretatt ved trinn 1.6 ved å helle den inn i et begerglass, som dekker begerglasset med et urglass, og å plassere begeret i en omkrystallisasjon fatet fylt med is. Flytt mikrobølgeovn og vortex i avtrekksskap.
    Merk: Dietyleter kan også prechilled ved å plassere begeret i en kjemisk fryser. Den nedre dietyleter temperatur oppnås ved kjøling i en fryser vil øke hastigheten og effektiviteten av nedbør.
  3. I et lite veie båt, veie ut 5 g poly (etylenglykol) (PEG) av molecular vekten av ditt valg (1,000-100,000 Da).
    1. Hvis den finnes, fjern plastbiten fra lokket på scintillasjonskyvette. Kalibrer ampulle, og dispenser 10 molart overskudd av metakrylsyre-anhydrid inn i ampullen (MA, 154,16 g / mol) per ligning 1 i hetten. Legg PEG til scintillasjonskyvette.
      Ligning 1 (1)
      der Equation 1.1 er massen av PEG ig, Equation 1.2 er molekylvekten til PEG i g / mol, Equation 1.3 er antallet terminale OH-grupper på PEG, og Equation 1.4 er molecular vekten av MA i g / mol.
  4. Løst vri lokket på scintillasjonsflaske. Sett mikrobølgeovn til fem minutter på maksimal effekt. Iført varmebestandige hansker, fjerne glasset fra mikrobølgeovn hvert 30 sek.
    1. Stram hetten og vortex i 30 sek. Gjenta inntil oppløsningen er blitt mikrobølgebehandlet i hele 5 min. Hetten kan ha behov for å bli erstattet i løpet av fremgangsmåten på grunn av sprekkdannelse.
  5. Med lokket løsnet, la PEGDM avkjøles til romtemperatur. Oppløs PEGDM i en liten mengde (10-15 ml), diklormetan (DCM, 84,93 g / mol).
    Merk: Det er anbefalt at den PEGDM få lov til å kjøle seg signifikant (~ 5 min) før DCM tillegg, for å hindre koking av DCM (et mulig karsinogen) på grunn av restvarme. Den PEGDM kan brytes opp i små biter ved hjelp av en slikkepott og virvlet å hjelpe til med oppløsningen.
  6. Utfelle PEGDM i 10x skytende iskald dietyleter i 20 min.
    Merk: Det kan være nødvendig å scRatch begerglasset side med en spatel for å initiere krystalldannelse for å utfelle lavere molekylvekt tappene (2500 Da), men PEG med en molekylvekt under 1.000 Da vil ikke utfelles tross skrape.
  7. Ved hjelp av en Biichner-trakt og kolbe, samle PEGDM ved vakuumfiltrering. Ikke filtrer til fullstendig tørrhet, da dette vil fremme vann adsorpsjon til PEGDM.
    Merk: Om nødvendig for den bestemte vakuumsystemet er i bruk, kan en vakuumfelle plasseres mellom filtrerings-oppsett og vakuumkilden for å beskytte vakuumpumpen fra skade av løsemiddeldamp.
  8. Overfør den filtrerte PEGDM til et 50 ml konisk rør med en stor kanyle gjennomboret gjennom lokket for ventilasjon. Oppbevar over natten i et vakuum kammer for å tørke.
  9. Gjenoppløs PEGDM i DCM og reprecipitate (som i trinn 1.5 til 1.7) som et siste trinn for å fjerne ikke-reagert MA. Tørk igjen som i trinn 1.8.

2. Karakterisering av PEGDM funksjon

  1. Ved hjelp av deuterert kloroform (120,38 g / mol) som oppløsningsmiddel, tilberede prøver for 1H-NMR. Plasser en liten prøve av den PEGDM (≈ 10 mg) i en scintillasjonskyvette med en liten mengde av oppløsningsmidlet (≈ 1,0 ml). Den målkonsentrasjonen er 10 mg / ml.
    1. Når prøven er oppløst, overføre den til et rent NMR-røret. Prøven skal fylle de nederste 4-5 cm av NMR-røret.
  2. Samle proton NMR-spektra. Våre data samles inn ved hjelp av et 400 MHz spektrometer. Løpe prøvene ved romtemperatur i minst 64 skanner for å oppnå tilstrekkelig data oppløsning.
  3. Ved NMR-analyse (figur 4) viser PEGDM funksjonalisering er mindre enn 90%, bør methacrylation prosedyre gjentas. Juster massen av MA brukes til å redegjøre for den reduserte mengden av unfunctionalized PEG.

Merk: prosent av PEG funksjonalisert inn PEGDM kan beregnes fra den observerte: teoretisk forhold på terminal metakryloksyetyltrimetoksysilanylate protoner (a, b, og c) til sentrale PEG protoner (d) (fig. 4). For lineære PEG, er den teoretiske rekke sentral PEG protoner beregnet ved ligning 2:

Ligning 2 (2)
der Equation 2.1 er molekylvekten til PEG i g / mol og Equation 2.2 er molekylvekten av en enkelt PEG repeat (44 g / mol). For ikke-lineære PEG, må denne ligning bli modifisert for å reflektere den spesifikke forgrening struktur (fig. 1). Den prosentvise funksjonalisering kan da beregnes ved hjelp av ligning 3:
Ligning 3 (3)
der Equation 3.1 er det observerte området under metakrylat protontopper (a, δ = 1,94 ppm, b og c, δ = 5,57 og 6,12 ppm), og Equation 3.3 er den teoretiske antall metakrylat protoner (a = 3 * Equation 1.3 , B = 1 * Equation 1.3 og c = 1 * Equation 1.3 - Henholdsvis 6, 2 og 2 for lineære PEG). Den prosentvise funksjon beregningen skal utføres ved hjelp av toppene a, b og c hver for seg, og deretter gjenned å få en samlet prosent funksjonalisering.

Merk: Tilstrekkelig funksjonalisert PEGDM kan deretter dialysert (i vann, mot vann) og samlet opp ved frysetørking for å fjerne resterende metakryl-syreanhydrid og metakrylsyre. Sluttproduktet bør blandes med en liten mengde (0,01 vekt%) av inhibitor som for eksempel sitronsyre eller vitamin C og lagret med tørkemiddel ved -20 ° C inntil bruk. Den endelige PEGDM Produktet kan brukes til å produsere hydrogeler, som beskrevet i Jove artikkel av Khetan og Burdick 22..

Tre. Mikrobølgeovn-assistert funksjon av On-harpiks Peptider

Merk: Våre peptider blir syntetisert ved anvendelse av Fmoc-Gly-Wang-harpiks, ved hjelp av en automatisert peptid-synthesizer med UV-overvåkning, og 0,2 M aminosyreløsninger i N-metylpyrrolidon (NMP, 99.1 g / mol). 5% piperazin (86.1 g / mol) i dimetylformamid (DMF, 73,1 g / mol) brukes for avbeskyttelse, 0,5 M O benzotriazol-N, N, N ', N'-tetrametyl-uronium-hexafluoro-fosfat (HBTU, 379,3 g / mol) i DMF brukes som aktivator, og 2 M diisopropyletylamin (DIEA, 129,3 g / mol) i NMP benyttes som aktivator basen. Peptider kan også fås fra en kommersiell peptid leverandør. Ved bruk av kommersielle kilder er det kritisk at peptider er fremskaffet på-harpiks med aminosyre-sidekjedebeskyttende grupper intakte i stedet for helt spaltet, som er standard.

Merk: Det er viktig at eventuelle aminosyrer med reaktive sidekjeder beskyttes for å sikre at metakrylamid funksjon bare forekommer på det primære amin med N-terminus av sekvensen. Se tabell 1 for aminosyrer med reaktive sidegrupper og typiske beskyttende grupper. Aminosyrer med beskyttende grupper blir inkorporert i sekvensen under peptidsyntese på samme måte som ubeskyttede aminosyrer, og er ofte tilgjengelige fra de samme amino-syre leverandører.

Amino Acid Reaktiv gruppe Beskyttelsesgruppe
Lysin Primær Amine tert-butyloksykarbonyl (Boc)
Serine Primær Alkohol tert-butyl (tBu)
Threonine Sekundær Alkohol tBu
Tyrosin Fenol tBu

Tabell 1: Reaktiv aminosyrer og typiske beskyttende grupper.

  1. Syntetisere peptider under anvendelse av standard fastfase-peptidsyntese, og lagre på harpiks ved 4 ° C i DMF til den er klar for bruk.
  2. Ved hjelp av en 7 cm Buchner-trakt med filterpapir, og 250 ml kolbe, samle peptidet harpiks fra DMF via filtrering.
  3. Hvis nåværende fjerne plastbiten fra lokket på scintillasjonskyvette. Overfør harpiksen til scintillasjonsglass. Ved hjelp av en engangspipette, tilsett akkurat nok til å dekke MA harpiksen i scintillasjonsglass.
  4. Løst plassere lokket på scintillasjonsflaske. Sett mikrobølgeovn til tre minutter på maksimal effekt. Iført varmebestandige hansker, fjerne glasset fra mikrobølgeovn hvert 15-20 sek.
    1. Stram hetten og vortex i 15 sek. Gjenta helt til løsningen er varmes i mikrobølgeovn for full 3 min.
  5. Med lokket løsnet, la peptidet løsningen avkjøles til romtemperatur. Ved hjelp av en liten mengde DMF, og en Buchner-trakt med filterpapir og kolbe, samle peptid-harpiks fra ampullen.
  6. Overfør peptidharpiksen til en frisk scintillasjonskyvette og holde seg og avbeskytte peptid.
    1. Per 0,25 mmol av resin, bruker vi en 2 timers romtemperatur reaksjon med rotasjon, ved hjelp av et kutte cocktail av 18,5 ml trifluoreddiksyre (TFA, 114,02 g / mol) med 0,5 ml hver av triisopropylsilane (TIPS, 158,36 g / mol), 3,6-Dioxa-1 ,8-octanedithiol (Dodt, 182,30 g / mol) og avionisert vann (18,02 g / mol).
      Merk: Denne cocktailen er tilstrekkelig for de fleste peptider, men vil ikke avbeskytte 2,2,4,6,7-pentamethyl-dihydrobenzofuran-5-sulfonyl (Pbf)-beskyttede aminosyrer (som vanligvis brukes til å beskytte arginin sidekjeder). Hvis sekvensen inneholder noen Pbf-beskyttede grupper, bør 0,5 ml TFA erstattes med 0,5 ml tioanisol (124.20 g / mol) og spalting tiden økte til 4 timer.
      Merk: Hvis en uklar, krystallinsk substans former i spalting cocktail, blir peptidet sannsynlig bryter ut av løsningen og volumet av den spalting cocktail skal dobles.
  7. Chill 400 ml vannfri dietyleter på is i et beger dekket med urglass.
  8. Utfelle peptidet i 10 x overskudd dietyleter, og deler opp-løsning jevnt blant fire 50 ml koniske rør. Sentrifuger ved 3200 xg i 10 minutter for å samle peptid.
    1. Dekanter av eter og resuspender peptidet i 100 ml frisk dietyleter fordelt på to 50 m koniske rør. Gjenta sentrifugeringen prosessen, resuspendere i 50 ml frisk eter to ganger for totalt fire etervaskinger.
      Merk: Dette fjerner kjemikalier som brukes i cleavage cocktail og kløyvde beskyttelsesgrupper fra det solide peptid.
  9. Etter den siste sentrifugeringstrinnet, dekanter avfalls ethenne og tørk peptidet over natten under vakuum.

4. Karakterisering av Peptide funksjon

  1. Bruk 50:50 H2O: Acetonitril (41,05 g / mol) + 0,1% TFA som løsningsmiddel for MALDI-TOF-analyse av peptid prøver. Plasser en liten prøve (1-2 mg) av peptidet i et 1,5 ml Eppendorf-rør og oppløse prøven i 1 ml av MALDI løsningsmiddel.
  2. Forbered matrisen løsning. En vanlig anvendt matrisen α-cyano-4-hydroxycinnamic syre (CHCA, 189,2 g / mol) i grunnmassen. Oppløs 10 mg / ml matrise i MALDI oppløsningsmiddel, som danner en lagermatrise-løsning.
    Merk: Matrisen stamløsningen kan lagres ved romtemperatur i opptil en uke for ytterligere analyser.
  3. Kombiner peptidet og matriseløsning i en 1:1 ratio. Spot denne kombinerte løsningen på tre ulike steder på MALDI prøveskilt, og legger en mL / spot.
    1. Tørk flekker, enten ved lufttørking eller ved hjelp av en varmepistol. Respot og tørr hverprøven.
      Merk: Respotting produserer en mer ensartet peptid / matrise prøven, og bistår i å få et klart signal. En standard peptid-blanding bør også være kombinert med matriseoppløsning i forholdet 1:1 og flekket (bare en gang) på MALDI plate.
  4. Samle MALDI-TOF data. På grunn av tilsetningen av metakrylamid gruppe til N-enden av peptidet, bør det være en 68 g / mol økning i molekylvekt over den til peptidet molekylvekt alene.
    Merk: I motsetning til PEGDM syntese, kan peptidene ikke refunctionalized, som ved spalting av beskyttende grupper for aminosyrer med reaktive sidekjeder er fjernet, og den selektive funksjonalisering av N-termini kan ikke lenger være sikret.
    1. Dersom MALDI-analyse (Figur 5) viser at peptidet ble fullstendig funksjonalisert og alle beskyttende grupper hensiktsmessig spaltet, kan peptidet bli dialysert (i vann, mot vann) og oppsamlet ved lyofilisering til å løsnee gjenværende forurensninger (spalting cocktail, eter, spaltes beskyttelsesgrupper etc.). Det faste peptidet bør overføres til en liten Eppendorf rør og lagret ved -20 ° C inntil bruk.

Representative Results

Proton kjernemagnetisk resonans er en av de mest vanlige analytiske teknikker for å vurdere effektiviteten av en kjemisk reaksjon, som arealet under hver topp spektra er i forhold til de relative nivåer av det proton i prøven, som tillater bestemmelse av forholdene mellom produkt og reaktant i prøven. For denne reaksjonen, kan en H-NMR-analyse (figur 4) brukes til å beregne% funksjonalisering av den observerte: teoretisk forhold mellom terminal metakrylat protoner (a, b, og c) til sentrale PEG protoner (d). Den PEGDM vist i figur 4 var 2000 Da før funksjonalisering, og derfor n = 2,000 Da / (44 Da / PEG repeat) = 45.5, slik at d = 4 * (n-1) = 178, slik at proton: NMR enhet ratio 178 / 102,16 = 1,74. I dette tilfellet, en topp, kan ikke brukes for å vurdere% funksjonalisering, da nærvær av vann i prøven kunstig øker arealet under toppen. Ved hjelp av topp b, er den% funksjon 1,00 * 1,74 / 2 * 100% = 87,1%; using peak c, er den% funksjon 1,08 * 1,74 / 2 * 100% = 94,1%. Derfor er den totale% funksjonalisering på 91%, og dette PEGDM er tilstrekkelig funksjonalisert for bruk i hydrogel-syntese. Vanligvis er ca 90% funksjon oppnås etter en enkelt runde av methacrylation.

På grunn av mangfoldet av proton topper som oppstår i en H-NMR analyse av peptider, er peptid funksjon lettere undersøkt ved hjelp av MALDI-TOF massespektrometri. Dette er vist i figur 5, hvor peptidet GKRGDSG ble syntetisert og underkastet funksjonalisering metakrylamid. En liten brøkdel av peptidet ble spaltet for prefunctionalization molekylvekt vurdering (figur 5A), som viste den observerte molekylvekt topp opptrer ved 676 g / mol, den forventede molekylvekt for peptidet, som indikerer korrekt syntese av den peptid-sekvens. Resten av peptid gikk methacrylamide funksjonellization før cleavage. Ettersom dette peptidet inneholder Pbf beskyttet R-aminosyrer, ble spaltningen utført i en cocktail som inneholder tioanisol i 4 timer. Etter funksjonalisering metakrylamid, oppstår den observerte molekylvekt topp på 744 g / mol (figur 5B), er den forventede vekt av metakrylamid funksjonalisert peptid (676 68 g / mol) og ikke i den forventede molekylvekt for peptidet unfunctionalized, som indikerer korrekt funksjonalisering.

For å vise funksjonen av både PEG og metakrylamid funksjonalisert peptid, ble PEGDM hydrogeler fremstilt med og uten 0,5 mM metakrylamid funksjonalisert GKRGDSG (figur 6). Hydrogeler ble fremstilt med 10 vekt-% lineær 10 kDa PEGDM i PBS med 0,05 vekt-% litium fenyl-2 ,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) som fotoinitiator. Den hydrogel-forløper-oppløsningen ble injisert mellom to glassplater adskilt av en glass-slide avstandsstykke og som holdes sammen med binder klipp. Precursor-oppløsningen ble deretter eksponert for 365 nm UV-lys ved 2 mW / cm 2 i 10 minutter for å fremkalle tverrbinding, hvoretter 8 mm diameter geler ble oppsamlet ved hjelp av en sylindrisk dor. Geler ble skylt i PBS og tillatt å svelle i 2 dager for å sikre likevekt hevelse forhold ble oppnådd 16,20. Menneskelige MSCS (passasje 3) ble dyrket til 80% konfluens og sådd på hydrogeler på 15.000 celler / cm 2. Cellene fikk lov til å følge i 48 timer før han ble overført til nye medier som inneholder 0,5 mL / ml calcein AM og 2 mL / ml ethidium homodimer (LIVE / DEAD Livskraftig kit fra Invitrogen) og avbildes under fase kontrast og fluorescens på 10X forstørrelse ved hjelp av en Nikon Eclipse Ti 2000. MSC ikke var i stand til å overholde de unfunctionalized PEG hydrogel (Figur 6A), men ved inkludering av cellen vedheft peptid RGD var de i stand til å overholde og spre på hydrogel overflaten (figur 6B). LIVE / DEAD bilderfrem representerer ikke levedyktigheten av seeded MSC populasjonen, som MSCS er adhesjons-avhengige celler som løsner fra gelen overflaten ved død og vil bli fjernet i løpet av mediet overføringsprosessen, noe som resulterer i kunstig oppblåsing av utsådd celleviabilitet. Snarere er de fluoriserende bilde beregnet på å markere mellom adherente celler og små variasjoner i hydrogel topologi, noe som kan være vanskelig i henhold til fasekontrast alene. Interessant, nonspread celler utsådd på PEG-bare geler flekken positive for begge calcein AM og etidium homodimer, noe som indikerer at cellene var døde ved tidspunktet for avbildning.

En av de mange fordeler med å PEG hydrogeler er deres meget fleksibel natur. Modifisering av den spesifikke sammensetningen av den PEG hydrogel gir forskerne en høy grad av kontroll over egenskaper som elastisitetsmodul. Som illustrert på figur 7, både PEG molekylvekt (figur 7A), og vektprosentandel ( (figur 8). Alle hydrogeler ble fremstilt med 10 vekt-% lineær PEGDM i PBS, med 0,05 vekt% LAP som fotoinitiator. 40 pl av hydrogel-forløper-løsning ble i 1 ml sprøyter med spissene avskåret, og utsatt for 365 nm UV-lys ved 2 mW / cm 2 i 10 minutter for å danne hydrogeler, produsere sylindriske geometrier omtrent 5 mm i diameter og 2 mm i høyden . Gels fikk lov til å svelle i PBS for to dager før mekanisk testing. Hydrogel modulus ble bestemt ved hjelp av en MTS QT / 5 med en 5 N belastningscelle samtidig komprimere mellom 5 og 10% av opprinnelig høyde hydrogel med en hastighet på 0,1 mm / sek. Etter mekanisk testing var fullført, ble maskevidde bestemmes ved å måle hydrogel mass pre-(M s) og post-(M D) 24 hr av frysetørring via Flory-Rehner ligningen som beskrevet i diskusjonskapittelet, med beregninger utført i MATLAB. Som en teori, øker molekylvekten til PEG makromer forårsaket en økning i hydrogel maskevidde (figur 8A) og en reduksjon i hydrogel stivhet (figur 8B). Hydrogel maskevidde og den resulterende gel stivhet kan også styres ved å endre vektprosent PEG. Hydrogeler ble produsert med varierende vekt-% av den lineære 10 kDa PEGDM og hydrogel stivhet og maskestørrelse ble bestemt som tidligere beskrevet (figur 9). Som illustrert i figur 7B, øker vekt-% PEG fører til en betydelig reduksjon i maskestørrelse (figur 9A), og økning av hydrogel stivhet (figur 9B).

Hydrogeler inneholdende innkapslet bovint serumalbumin (BSA), ble dannet ved anvendelse av varierende molekylr vekt PEG (2, 10, og 20 kDa). Alle hydrogeler ble fremstilt med 10 vekt% PEGDM i PBS inneholdende 50 pg / ml BSA, som beskrevet for figur 6.. Geler ble inkubert i 1 ml PBS ved 37 ° C, og overført til frisk PBS ved hvert tidspunkt. Utgitt BSA ble kvantifisert ved hjelp av Bradford analysen fra Thermo Scientific. Hydrogel maskevidde ble bestemt som beskrevet for figur 8.. Som illustrert i figur 7A, oppstår BSA frigjøring raskere fra hydrogeler dannet ved hjelp av høyere molekylvekt PEGDM, som et resultat av den større maskestørrelse innenfor hydrogel (figur 10).

Figur 4
Figur 4. Representative 1H-NMR av 2 kDa lineær PEGDM funksjonalisert ved hjelp av mikrobølge-assistert metode. Prosent funksjonalisering kan være calculated basert på observert:. teoretiske forholdet mellom terminal metakrylat protoner (a, b og c) til sentrale PEG protoner (d) Klikk her for å se større bilde .

Figur 5
Figur 5. Representative MALDI-TOF peptid GKRGDSG (A) før og (B) etter funksjonalisering ved bruk av mikrobølge-assistert metode. Legg merke til at den observerte molekylvekt topp etter funksjonalisering skjer på 744 g / mol, den forventede vekt av metakrylamid funksjonalisert peptid (676 68 g / mol) og ikke i den forventede molekylvekt av den ikke-funksjonalis peptid (676 g / mol). for å vise større bilde .


Figur 6. Representant fase kontrast (til venstre) og LIVE / DEAD (grønn / rød) fluorescerende bilder (til høyre) av MSC dyrket på A) PEG gels alene og B) PEG gels som inneholder 0,5 mM methacrylamide funksjon GKRGDSG. MSC er ute av stand til å forholde seg til og spredt på de PEGDA gels alene, men ved innlemmelse av cellen vedheft peptid RGD, er i stand til å overholde og spre på hydrogel overflaten. Klikk her for å se større bilde .

Figur 7
Figur 7. A) PEG molekylvekt, og B) vektprosent PEG brukt til å danne hydrogelstrukturer nettverk påvirker hydrogel maskevidde (_8 ;) og resulterende hydrogel stivhet og frigjøringshastigheten av innkapslede legemidler. A) Økende PEG molekylvekt (fra venstre mot høyre) ved konstant vektprosent øker hydrogel maskevidde, mink hydrogel stivhet og å øke hastigheten av legemiddelfrigivelse. B) Reduksjon av vekten prosentandelen av PEG (venstre til høyre) som brukes til å danne hydrogeler øker hydrogel maskevidde, på samme måte avtagende hydrogel stivhet og å øke hastigheten av medikamentfrigjøring (ikke i målestokk). for å vise større bilde .

Figur 8
Figur 8. A) Mesh størrelse øker og B) hydrogel stivhet avtar med økende molekylvekt av PEG makromer. N = 10, feilfelt = SEM, *** p &# 60; 0.001 av enveis ANOVA med Tukey sin HSD post hoc-test. Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av Prism fem. Klikk her for å se større bilde .

Figur 9
Figur 9. A) maskevidde minker og B) hydrogel stivhet øker med økende vekt% PEG. N = 9-10, feilfelt = SEM, ** p <0.01, *** p <0,001 ved enveis ANOVA med Tukey sin HSD post- hoc test. Klikk her for å se større bilde .

Fig. 10
Figur 10. Offentliggjøring av encapsulated modell medikament bovint serum albumin (BSA) fra hydrogeler dannet ved hjelp av to kDa, 10 kDa, 20 kDa molekylvekt PEG. frigjøring BSA skjer raskere fra hydrogeler dannet ved bruk av høyere molekylvekt PEGDM, som et resultat av den større maskestørrelse innenfor hydrogel . n = 6, feilfelt = SEM. Det% BSA utgitt er signifikant forskjellige (p <0,0001) mellom alle de tre gruppene på hvert tidspunkt med unntak av t = 1, og 2,5 timer ved frigjøring fra 2 til 10 kDa-geler er tilsvarende, med to-veis vend-måler ANOVA med Bonferroni post-hoc test. Klikk her for å se større bilde .

Discussion

Metodene som tidligere illustrert er uvurderlig for syntesen av PEGDM og metakrylamid funksjonalisering av peptider eller andre amin-holdige forbindelser. Disse materialene kan deretter brukes for regenerativ medisin og for levering av legemidler anvendelser. På grunn av den hydrofile karakter av PEG, hydrogeler dannet fra PEG makromerer har et høyt vanninnhold som ligner på mange vev i legemet 2. Denne kvalitet gjør PEG meget motstandsdyktig mot protein adsorpsjon og derfor inert i legemet 3.. Imidlertid kan den hygroskopiske karakter av PEG vise seg problematisk i løpet av funksjonalisering. Hvis vann er tilstede i PEG prøven under methacrylation prosedyren, vil metakryl-syreanhydrid reagere preferensielt med vann for fremstilling av metakrylsyre og dårlig funksjonalisering av PEG vil resultere.

Derfor er en av de viktigste tiltak som kan iverksettes for å sikre en vellykket methacrylation av PEG eller peptid å opprettholde anhydRous reaksjonsforhold. Den anbefalte trinnet med å tørke alt glassutstyr før bruk er ment å hindre vannforurensning. Tilstedeværelsen av vann i prøven kan sees i NMR-analyse, som en bred topp ved 1,7 ppm (figur 4). Dersom dårlig methacrylation observeres selv etter tørking alt glassutstyr, kan kjemikalier tørkes over natriumsulfat, eller andre tørkemidler (molekylsikter etc.) før bruk. Destillasjon kan også brukes for å fjerne vann og rense metakrylsyre-anhydrid før bruk, og azeotrop destillasjon kan brukes til å tørk PEG 23. I ekstreme tilfeller kan syntesen utføres i en hanskerommet for ytterligere å sikre tilstrekkelig vannfrie betingelser. En andre runde med methacrylation ved å følge samme prosedyre, kan også utføres for å øke funksjonalisering. Fordi det er alltid en mulighet for at flere runder med funksjon vil være nødvendig, bør man være forsiktig i trinn 1,7 og 1,9 til raskt å samle PEGDM ved vakuumfiltrering. Vakuum-filtrering for lenger enn det som er absolutt nødvendig øker eksponeringen av PEG til luft, noe som øker muligheten for vannadsorpsjon.

Selv om den prosentvise overskudd av metakryl-syreanhydrid til hydroksyl funksjonelle grupper forblir uendret, noe som øker PEG funksjonalisering (f.eks arm #) i PEG-forløperen er vanligvis forbundet med en nedgang i prosent funksjonalisering oppnås (upubliserte resultater, Benoit lab). For å løse dette preemptively reduksjon av funksjonalise effektivitet, eller hvis spesielle vanskeligheter påtreffes oppnå tilstrekkelig høyt funksjonalisering, varigheten av mikrobølge reaksjonen kan økes, forutsatt at mikrobølgeintervall holdes ved 30 sek. Mens 10 molart overskudd er vanligvis tilstrekkelig, kan mengden av metakrylsyre-anhydrid anvendes i reaksjonen også økes for å øke den prosentvise funksjonalise oppnådde 12.

Det er viktig at denytterligere utfellingstrinn (1,9) bli utført for å oppnå gode NMR-signaler. Selv om det er fristende å utføre den andre ventet samme dag som syntese, tørking av prøven natten over før reprecipitating er funnet å hjelpe til med fjerning av overskudd av metakrylsyre og metakrylsyre-anhydrid. Prøveopparbeidelse er også viktig for å oppnå ren NMR spektra, og derfor prøver bør være forberedt på å bruke anbefalte forhold. Figur 4 viser representative 1 H-NMR resultatene for korrekt funksjon PEGDM. Ved å analysere forholdet mellom terminale metakrylat protoner til sentrale PEG protoner, ble PEGDM bestemt til å være tilstrekkelig funksjonalisert. MALDI prøveopparbeidelse er tilsvarende viktig for å oppnå et klart lesing. MALDI er spesielt følsomt for tilstedeværelsen av salter og høy prøvekonsentrasjoner. Dersom en klar MALDI teller (en intensitet over 50 vilkårlige enheter (AU) med et høyt signal: støy-forhold) ikke kan oppnås, prøven solution bør fortynnes 1:100 i MALDI løsemiddel før de blir kombinert med matrisen løsning og analyseres på nytt. Figur 5 viser representative MALDI-TOF resultater etter riktig peptid funksjon, cleavage, og prøveopparbeidelse. Spalting av en liten prøve av harpiks før funksjonalisering (figur 5A) viser korrekt syntese av peptidet GKRGDSG, med korrekt metakrylamid funksjonalisering av peptidet er vist i figur 5B.

Mens funksjonalisering av for-harpiks peptider er en relativt robust fremgangsmåte, spaltings-betingelsene som kreves for hver sekvens krever ofte justering. For lange sekvenser hvor mange aminosyrer har beskyttede sidekjeder (> 30 aminosyrer lange, eller> 15 aminosyrer med beskyttelsesgrupper), bør varigheten av spalting økes med en time. Imidlertid, hvis spalting tiden forlenges for mye, kan peptidbinding spalting føre på grunn av langvarig eksponering surt. MALDI ana lyse kan være svært nyttig i å avsløre eventuelle feil som oppstod i peptidsynteser eller spalting. En observert reduksjon under forventede molekylvekter kan indikere at aminosyre (r) ikke skikkelig par, eller at peptidet fraksjonering inntraff (se tabell 2 for kilder som vanligvis opptrer endringer i molekylvekt). Hvis den observerte molekylvekt er høyere enn forventet av vekten av en beskyttende gruppe som brukes, er det sannsynlig at spalting og avbeskyttelse var utilstrekkelig og peptidet bør recleaved for ekstra tid.

x "> MW endring (g / mol) <td style = "width: 64px;"> 24 DTH: 64px; "> -113 03px; "> Pro 20 "style =" height: 20px; width: 103px; "> Tyr
Amino Acid Sletting MW endring (g / mol) Uncleaved beskyttelsesgrupper Vanligvis Present Ioner MW endring (g / mol)
Ala -71 Acetyl 42 Cl - 35
Arg -158 Allyl 40 K + 39
Asn -114 Alloc 85 Mg 2 +
Asp -115 Boc 100 Na + 23
Cys -103 Fmoc 223
GLN -128 OtBu 56
Glu -129 Pbf 252
Gly -57 tBu 56
Hans -137 TRT 242
Ile -113
Leu
Lys -128
Møtte -131
Phe -147
-97
Ser -87
Thr -101
Trp -186
-147
Val -99

Tabell 2. Vanligvis observeres endringer i peptid molekylvekt.

Makromerer som produseres ved hjelp av mikrobølge-assistert methacrylation metoder kan anvendes i en rekke regenerativ medisin-eller medikamentavleverings anvendelser. Functionalized peptider og PEGDM syntetiserte her kan også bli innlemmet i polymerer som bruker Nitroxide-mediert Polymerisering (NMP), Atom Transfer radikalpolymerisasjon (ATRP) eller Vendbar Addisjon-Fragmentering Transfer (RAFT) metoder 24. Hydrogel-nett kan også fremstilles i nærvær av celler, som tidligere vist i Jove artikkel av Khetan og Burdick 22.. Dette krever ofte inkorporering av cellen vedheft peptider som RGD-eller ekstracellulære matriks-molekyler, da PEG alene ikke gir celle-materiale interaksjoner kritiske for overlevelse og funksjon av noen celletyper 25. Peptides, for eksempel, kan syntetiseres ved hjelp av tradisjonell fast-fase peptidsyntese, og funksjonalisert som beskrevet her for å muliggjøre inkorporering i hydrogel-nettverk. Som vist i figur 6, inkludering av metakrylamid-funksjonalisert celleadhesjon peptid GK RGDS G i hydrogeler (0,5 mM) muliggjør adhesjon av humane mesenchymale stamceller (MSCS) til PEG hydrogel flater, øker antallet festet og spre-celler (figur 6B ), sammenlignet med PEG hydrogeler uten celle adhesjon peptid ( 26 peptider. For å inkorporere PEG spacer og unngå ikke-spesifikke interaksjoner, kan peptidene være konjugert til PEG monofunctionalized via N-hydroksysuccinimidylester aktiverte estere, som beskrevet av Hern og Hubbell 26..

Anvendelser av hydrogel nettverk krever streng kontroll over materialegenskaper. En vesentlig fordel med PEG hydrogeler er en høy grad av kontroll over disse egenskaper. For eksempel er molekylvekten, arm-nummer, og vekt-% av PEG benyttet i dannelsen av hydrogel-nett kan endres for å fin-tune egenskaper for spesifikke applikasjoner. Dette gjør det mulig streng kontroll over hydrogel maskevidde (ξ), som styrer hydrogel svellende forholdet (Q) og stivhet (elastisitetsmodul, E). Dette er illustrert i figur 7A og kvantifisert i figur 8, hvor økende PEG makromer molekylvekt resulterer i en økning i hydrogel maskevidde (figur 8A) og en reduksjon i hydrogel stivhet (figur 8B).

Den underliggende fysiske kjennetegn som styrer bulk atferd i disse hydrogel nettverk, maskevidde, beregnes ved hjelp av Flory-Rehner ligning 16. For å utføre denne beregningen, er den volumetriske hevelse ratio (Q) først beregnes fra ligning 4:
Ligning 4 (4)

hvor ρ s er tettheten av vann (1 g / ml), er ρ p tettheten av PEG (1,12 g / ml), i M s hoven massen av hydrogel og M D er tørrvekt av hydrogel (ofte målt etter frysing og lyofilisering av hydrogeler). Den molekylvekt mellom tverrbindinger (M c, i g / mol) blir så beregnet fra ligning 5:
Ligning 5 (5)

hvor M N er antall-gjennomsnittlig MV på PEG (i g / mol), Ligning 5.05 er den spesifikke volum av polymeren Equation 5.1 , Er V 1 det molare volum av vann (18 ml / mol), V 2 er likevekts polymer volumfraksjon av hydrogel
( Equation 5.2 ), Og X 1 16. Antallet bindinger mellom tverrbindinger (n) blir så beregnet fra ligning 6:
Ligning 6 (6)

hvor N b er antall bånd i PEG repeat (3) og M r er MW av PEG repeat (44 g / mol) 27. Dette gjør at rot-middel-kvadrat-ende-til-ende avstand av polymerkjeden Equation 6.1 (I nm) som skal beregnes fra ligning 7:
Ligning 7 (7)

hvor l er den gjennomsnittlige forankringslengde (0.146 nm, beregnet på grunnlag av CC og CO bindingen lengder) og C-n er den karakteristiske forholdet for polymer (4.0 for PEG) 28. Finalt, maskevidde av hydrogel kan beregnes fra ligning 8:
Ligning 8 (8)

Hydrogel egenskaper kan likeledes innstilles ved å regulere mengden av PEG anvendes i dannelsen av hydrogeler. Reduksjon av vektprosentandelen av PEG makromer resulterer i en økning i hydrogel mesh størrelse, som deretter reduserer hydrogel stivhet. Figur 7B illustrerer og Figur 9 kvantifiserer hvor vektprosenten av PEG anvendes i hydrogel dannelse kan anvendes for å kontrollere maskestørrelse (figur 9A) og resulterende hydrogel stivhet (figur 9B). Som substrat stivhet har vist seg å påvirke celle-adferd som stamcelledifferensiering 29, er evnen til å tett kontroll stivhet en viktig egenskap i hydrogel fabrikasjon.

Hydrogeler kan også brukes til å kontrol levering av legemidler. Som illustrert i figur 7A, og vist i figur 10, øker molekylvekten av PEG makromerer, øker maskevidden av hydrogel-nettverk, deretter økende frigjøring av innkapslet legemiddel modell, bovint serumalbumin (BSA). Mens hydrogel prøver i denne studien ble ødelagt ved t = 195 timer for å tillate måling av hydrogel våte og tørre masser for beregninger maskevidde, er det vår erfaring at fortsatt BSA utgivelsen ville skje hadde prøvene blitt inkubert for lengre tidsperioder. Den ufullstendig frigjøring av BSA observert i figur 10 er ikke uventet, da andre grupper har også rapportert at BSA er motstandsdyktig mot diffusjon innenfor PEG hydrogel-nettverk 30. Ufullstendig frigjøring av innkapslede protein kan oppstå på grunn av hydrogenbinding mellom proteiner og PEG makromerer eller kovalent binding mellom det metakrylat-gruppen i PEG og primære amingrupper på lysinrester i BSA 31 (figur 2A), er det også mulig at en brøkdel av den innkapslede BSA er inneholdt i områdene av hydrogel som har betydelig mindre maske størrelse enn gjennomsnittet i gel, hindre utgivelsen. Selv om ufullstendig, nonFickian frigjøring (data ikke vist) av innkapslet BSA ble observert i dette tilfelle styrt Fickian frigjøring av en rekke andre modell legemidler, inkludert insulin og ovalbumin, har blitt demonstrert ved hjelp av tilsvarende PEGDM hydrogeler 30.. I tillegg, Watkins og Anseth har brukt konfokal laser scanning mikroskopi for å demonstrere at utgivelsen av fluorescerende molekyler fra lignende hydrogel er modellert velbehag, med Fickian diffusjon megdikk 32.

Mens de hydrogeler som dannes i denne studien er degraderbare, er nettverket nedbrytning annen parameter som kan bli innlemmet i og innstilt i disse nettene. Gir for kontrollert hydrogel nedbrytning kan resultere i forandringer i celle adferd 33, promotering av vev vekst eller verts innvekst av vev, eller eliminering av behovet for explantation 34.. Nedbrytbar PEG hydrogeler er vanligvis syntetisert ved ring-åpning hydrolytisk nedbrytbart d, l-laktid, glykolid, eller ε-kaprolakton grupper på hydroksyl-grupper i PEG før methacrylation 35.. Disse tre grupper nedbrytes ved hydrolyse av ester-funksjonalitet, med glykolid estere som har den største følsomhet overfor nedbrytning, etterfulgt av laktid, kaprolakton og ester, på grunn av deres varierende hydrofobisitet. Etter inkorporering av hydrolytisk nedbrytbart grupper kan være ytterligere funksjonalisert PEG ved hjelp av fremgangsmåten methacrylation detailed i denne artikkelen, slik at dannelsen av hydrogel nettverk gjennom påfølgende radikal-initierte kjeden polymerisasjon 36,37. Graden av nedbrytning av hydrogel-nett kan kontrolleres ved å variere identiteten til hydrolytisk nedbrytbart gruppen (glykolid, laktid, etc.) og ved å variere antallet nedbrytbare gjentar inkorporert i strukturen 35,38.

Teoretisk sett kan metodene vist her, brukes ved acrylation av PEG og peptider ved å erstatte metakryl-syreanhydrid med akrylsyreanhydrid i trinn 1.3 og 3.3, respektivt. Imidlertid er akrylsyreanhydrid mer enn 20 ganger kostnaden for metakrylsyreanhydrid 39,40, noe som gjør mikrobølgeovn-assistert acrylation betydelig mindre attraktive enn mikrobølgeovn-assistert methacrylation.

Vi har vist en enkel, rask metode for å functionalize PEG og peptider, hvordan å vurdere effektiviteten av denne prosedyren, og gitt ressurser for usynger de syntetiserte materialer for å danne hydrogel nettverk. Disse syntetiske verktøyene er svært allsidig i sine søknader, og skulle vise et fast innslag i en rekke levering av legemidler og materialer forskningslaboratorier.

Disclosures

Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble finansiert delvis av en Howard Hughes Med-inn-Grad fellesskap (AVH), ved oppstart midler gitt til Dr. Danielle Benoit fra University of Rochester og ortopedisk forskning og utdanning Foundation / Muskel Transplant Foundation (oref / MTF). Forfatterne ønsker å takke dr. James L. McGrath for bruk av utstyret sitt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3,6-Dioxa-1,8-octanedithiol Tokyo Chemical Industry Co, LTD D2649 CAS 14970-87-7
Acetonitrile J.T. Baker UN1648 CAS 75-05-8
Amino Acids AAPPTech Glycine: AFG101 CAS 29022-11-5
Arginine: AFR105 CAS 154445-77-9
Asparagine: AFD105 CAS 71989-14-5
Serine: AFS105 CAS 71989-33-8
Anhydrous diethyl ether Fisher Scientific UN1155 CAS 60-29-7
Citric acid Sigma Aldrich C1857 CAS 77-92-9
Deuterated chloroform Cambridge Isotope Laboratories Inc. DLM-7-100 CAS 865-49-6
Dichloromethane Fisher Scientific UN1593 CAS 75-09-2
Diisopropylethylamine Alfa Aesar A1181 CAS 7087-68-5
Dimethylformamide Fisher Scientific D119-4 CAS 68-12-2
Fmoc-Gly-Wang resin Peptides International RGF-1301-PI 100-200 mesh size
Methacrylic anhydride Alfa Aesar L14357 CAS 760-93-0
N-Methylpyrrolidone VWR BDH1141-4LG CAS 872-80-4
On-resin peptides Synthesized in-house On-resin peptides can also be purchased from Peptides International, GenScript, AAPPTec, etc.
O-Benzotriazole-N,N,N’,N’-tetramethyl-uronium-hexafluoro-phosphate AnaSpec Inc 510/791-9560 CAS 94790-37-1
Peptide Calibration Standard Care 206195
Piperazine Alfa Aesar A15019 CAS 11-85-0
Poly(ethylene glycol) 2 kDa linear Alfa Aesar B22181 CAS 25322-68-3
Poly(ethylene glycol) 10 kDa linear Alfa Aesar B21955
Poly(ethylene glycol) 20 kDa linear Sigma Aldrich 81300 JenKem Technologies USA is an alternate supplier of linear and multi-arm PEG
Thioanisole Alfa Aesar L5464 CAS 100-68-5
Trifluoroacetic acid Alfa Aesar A12198 CAS 76-05-1
Triisopropylsilane Alfa Aesar L09585 CAS 6485-79-6
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid Tokyo Chemical Industry Co, LTD C1768 CAS 28166-41-8

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lin, C. C., Anseth, K. S. PEG Hydrogels for the Controlled Release of Biomolecules in Regenerative Medicine. Pharm. Res. 26, 631-643 (2009).
  2. Ifkovits, J. L., Burdick, J. A. Review: Photopolymerizable and degradable biomaterials for tissue engineering applications. Tissue Eng. 13, 2369-2385 (2007).
  3. Peppas, N. A., Hilt, J. Z., Khademhosseini, A., Langer, R. Hydrogels in biology and medicine: From molecular principles to bionanotechnology. Adv. Mater. 18, 1345-1360 (2006).
  4. Lutolf, M. P., Hubbell, J. A. Synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments for morphogenesis in tissue engineering. Nat. Biotechnol. 23, 47-55 (2005).
  5. Benoit, D. S., Durney, A. R., Anseth, K. S. The effect of heparin-functionalized PEG hydrogels on three-dimensional human mesenchymal stem cell osteogenic differentiation. Biomaterials. 28, 66-77 (2007).
  6. Benoit, D. S., Collins, S. D., Anseth, K. S. Multifunctional hydrogels that promote osteogenic human mesenchymal stem cell differentiation through stimulation and sequestering of bone morphogenic protein 2. Adv. Funct. Mater. 17, 2085-2093 (2007).
  7. Fairbanks, B. D., et al. A Versatile Synthetic Extracellular Matrix Mimic via Thiol-Norbornene Photopolymerization. Adv. Mater. 21, 5005 (2009).
  8. Moon, J. J., Hahn, M. S., Kim, I., Nsiah, B. A., West, J. L. Micropatterning of Poly(Ethylene Glycol) Diacrylate Hydrogels with Biomolecules to Regulate and Guide Endothelial Morphogenesis. Tissue Eng. A. 15, 579-585 (2009).
  9. Burdick, J. A., Anseth, K. S. Photoencapsulation of osteoblasts in injectable RGD-modified PEG hydrogels for bone tissue engineering. Biomaterials. 23, 4315-4323 (2002).
  10. Yanez-Soto, B., Liliensiek, S. J., Murphy, C. J., Nealey, P. F. Biochemically and topographically engineered poly(ethylene glycol) diacrylate hydrogels with biomimetic characteristics as substrates for human corneal epithelial cells. J. Biomed. Mater. Res. A. 101A, 1184-1194 (2013).
  11. Benoit, D. S. W., Anseth, K. S. Heparin functionalized PEG gels that modulate protein adsorption for hMSC adhesion and differentiation. Acta Biomater. 1, 461-470 (2005).
  12. Lin-Gibson, S., et al. Synthesis and characterization of PEG dimethacrylates and their hydrogels. Biomacromolecules. 5, 1280-1287 (2004).
  13. Anseth, K. S., Wang, C. M., Bowman, C. N. Reaction Behavior and Kinetic Constants for Photopolymerizations of Multi(Meth)Acrylate Monomers. Polymer. 35 (94), 3243-3250 (1994).
  14. Bencherif, S. A., et al. End-group effects on the properties of PEG-co-PGA hydrogels. Acta Biomater. 5, 1872-1883 (1016).
  15. Rydholm, A. E., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Degradable thiol-acrylate photopolymers: polymerization and degradation behavior of an in situ forming biomaterial. Biomaterials. 26, 4495-4506 (2005).
  16. Zustiak, S. P., Leach, J. B. Hydrolytically Degradable Poly(Ethylene Glycol) Hydrogel Scaffolds with Tunable Degradation and Mechanical Properties. Biomacromolecules. 11, 1348-1357 (2010).
  17. Malkoch, M., et al. Synthesis of well-defined hydrogel networks using Click chemistry. Chem. Commun. , 2774-2776 (2006).
  18. Hoffman, M. D., Benoit, D. S. Emerging Ideas: Engineering the Periosteum: Revitalizing Allografts by Mimicking Autograft. , (2012).
  19. Hoffman, M. D., Xie, C., Zhang, X., Benoit, D. S. The effect of mesenchymal stem cells delivered via hydrogel-based tissue engineered periosteum on bone allograft healing. Biomaterials. , (2013).
  20. Hubbell, J. A., Lutolf, M. P., Raeber, G. P., Zisch, A. H., Tirelli, N. Cell-responsive synthetic hydrogels. Adv. Mater. 15, 888-892 (2003).
  21. Lidstrom, P., Tierney, J., Wathey, B., Westman, J. Microwave assisted organic synthesis - a review. Tetrahedron. 57, 9225-9283 (2001).
  22. Khetan, S., Burdick, J. Cellular encapsulation in 3D hydrogels for tissue engineering. J. Vis. Exp. (32), e1590 (2009).
  23. Antonios, M., Kurtis, K., Lucas, K. Drying poly(ethylene glycol). Nat. Protoc. Exchange. , (2012).
  24. Nicolas, J., Mantovani, G., Haddleton, D. M. Living radical polymerization as a tool for the synthesis of polymer-protein/peptide bioconjugates. Macromol. Rapid Comm. 28, 1083-1111 (2007).
  25. Nuttelman, C. R., Benoit, D. S. W., Tripodi, M. C., Anseth, K. S. The effect of ethylene glycol methacrylate phosphate in PEG hydrogels on mineralization and viability of encapsulated hMSCs. Biomaterials. 27, 1377-1386 (2006).
  26. Hern, D. L., Hubbell, J. A. Incorporation of adhesion peptides into nonadhesive hydrogels useful for tissue resurfacing. J. Biomed. Mater. Res. 39, 266-276 (1998).
  27. Andreopoulos, F. M., Beckman, E. J., Russell, A. J. Light-induced tailoring of PEG-hydrogel properties. Biomaterials. 19, 1343-1352 (1998).
  28. Merrill, E. W., Dennison, K. A., Sung, C. Partitioning and Diffusion of Solutes in Hydrogels of Poly(Ethylene Oxide). Biomaterials. 14, 1117-1126 (1993).
  29. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
  30. Weber, L. M., Lopez, C. G., Anseth, K. S. Effects of PEG hydrogel crosslinking density on protein diffusion and encapsulated islet survival and function. J. Biomed. Mater. Res. A. 90A, 720-729 (2009).
  31. Mellott, M. B., Searcy, K., Pishko, M. V. Release of protein from highly cross-linked hydrogels of poly(ethylene glycol) diacrylate fabricated by UV polymerization. Biomaterials. 22, 929-941 (2001).
  32. Watkins, A. W., Anseth, K. S. Investigation of molecular transport and distributions in poly(ethylene glycol) hydrogels with confocal laser scanning microscopy. Macromolecules. 38, 1326-1334 (2005).
  33. Anseth, K. S., Benoit, D. S. W., Durney, A. R. Manipulations in hydrogel degradation behavior enhance osteoblast function and mineralized tissue formation. Tissue Eng. 12, 1663-1673 (2006).
  34. Hillwest, J. L., et al. Prevention of Postoperative Adhesions in the Rat by in-Situ Photopolymerization of Bioresorbable Hydrogel Barriers. Obstet. Gynecol. 83, 59-64 (1994).
  35. Sawhney, A. S., Pathak, C. P., Hubbell, J. A. Bioerodible Hydrogels Based on Photopolymerized Poly(Ethylene Glycol)-Co-Poly(Alpha-Hydroxy Acid) Diacrylate Macromers. Macromolecules. 26, 581-587 (1993).
  36. Skaalure, S. C., Milligan, I. L., Bryant, S. J. Age impacts extracellular matrix metabolism in chondrocytes encapsulated in degradable hydrogels. Biomed. Mater. 7, 024111-0210 (2012).
  37. Hoffman, M. D., Benoit, D. S. Agonism of Wnt-beta-catenin signalling promotes mesenchymal stem cell (MSC) expansion. J. Tissue. Eng. Regen. Med. , (2013).
  38. Sawhney, A. S., Pathak, C. P., Vanrensburg, J. J., Dunn, R. C., Hubbell, J. A. Optimization of Photopolymerized Bioerodible Hydrogel Properties for Adhesion Prevention. J. Biomed. Mater. Res. 28, 831-838 (1994).
  39. Methacrylic Anhydride [Internet]. , Available from: https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=AAAL14357-18 (2013).
  40. Acrylic Anhydride [Internet]. , Available from: http://www.polysciences.com/Catalog/Department/Product/98/productid--40/ (2013).

Tags

Chemistry Poly (ethylene glycol) peptider polymerisasjon polymerer methacrylation peptid funksjonalisering, MALDI-TOF hydrogeler makromer syntese
Mikrobølgeovn-assistert funksjon av Poly (etylenglykol) og On-resin Peptider for bruk i Chain polymerisasjoner og hydrogeldannelse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Van Hove, A. H., Wilson, B. D.,… More

Van Hove, A. H., Wilson, B. D., Benoit, D. S. W. Microwave-assisted Functionalization of Poly(ethylene glycol) and On-resin Peptides for Use in Chain Polymerizations and Hydrogel Formation. J. Vis. Exp. (80), e50890, doi:10.3791/50890 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter