Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Mikrovågsassisterad funktionalisering av poly (etylenglykol) och On-harts Peptider för användning i Chain Polymerisationer och Hydrogel Bildning

Published: October 29, 2013 doi: 10.3791/50890
Automatic Translation
1, 2, 1,2,3
1Department of Biomedical Engineering, University of Rochester, 2Department of Chemical Engineering, University of Rochester, 3Center for Musculoskeletal Research, University of Rochester Medical Center

Summary

Den här videon kommer att illustrera en snabb, effektiv metod för metakrylatbaserade poly (etylenglykol), som möjliggör kedja polymeriseringar och hydrogel syntes. Det kommer att visa hur man på motsvarande sätt införa metakrylamid funktioner till peptider, detalj gemensamma analysmetoder för att bedöma funktion effektivitet, ge förslag på felsökning och avancerade ändringar, och visar typiska hydrogel karakteriseringsmetoder.

Abstract

En av de viktigaste fördelarna med att använda poly (etylenglykol) (PEG) makromererna i hydrogel bildning är syntetiskt mångsidighet. Möjligheten att dra av en stor variation av PEG-molekylvikter och konfigurationer (arm nummer, armlängd, och förgrening mönster) ger forskare god kontroll över vilket hydrogel strukturer och egenskaper, inklusive Youngs modul och maskstorlek. Den här videon kommer att illustrera en snabb, effektiv, lösningsmedelsfritt, mikrovågsassisterad metod för metakrylatbaserade PEG prekursorer i poly (etylenglykol) dimetakrylat (PEGDM). Denna syntesmetod ger välbehövliga utgångsmaterial för applikationer inom drug delivery och regenerativ medicin. Den visade metoden är överlägsen traditionella methacrylation metoder eftersom det är betydligt snabbare och enklare samt mer ekonomisk och miljövänlig användning av mindre mängder av reagens och lösningsmedel. Vi kommer också att visa en anpassning av denna teknik för att på-harts methacrylamid funktionalisering av peptider. Denna on-harts metod tillåter N-terminalen av peptider som skall funktionaliseras med metakrylamid-grupper före avskyddning och klyvning från hartset. Detta möjliggör selektiv tillsats av metakrylamid-grupper till N-terminalen av peptiderna medan aminosyror med reaktiva sidogrupper (t ex primär amin av lysin, primär alkohol av serin, sekundära alkoholer av treonin och fenol av tyrosin) förblir skyddade, förebygga funktion på multipla ställen. Denna artikel kommer detalj vanliga analysmetoder (proton-NMR-spektroskopi (H-NMR) och Matrix Assisted laserdesorptionsjonisering Time of Flight masspektrometri (MALDI-TOF)) för att bedöma effektiviteten i de funktionalise. Vanliga fallgropar och föreslog felsökningsmetoder kommer att tas upp, som vilje modifieringar av teknik som kan användas för att ytterligare trimma makromer funktionalitet och resulte hydrogel fysiska och kemiskaegenskaper. Användning av syntetiserade produkter för bildandet av hydrogel för drug delivery-och cell-material interaktionsstudier kommer att demonstreras, med särskild uppmärksamhet ägnas åt att modifiera hydrogelkomposition att påverka maskstorlek, kontrollerar hydrogel styvhet och läkemedelsdosering.

Introduction

Poly (etylenglykol) (PEG) hydrogel är vanliga biomaterial som används inom regenerativ medicin och drogleveransapplikationer 1-3. Dessa hydrogeler erbjuder betydande fördelar jämfört med andra biomaterial. PEG-hydrogeler är syntetiska, som erbjuder en hög grad av kontroll över tekniska egenskaper såsom elasticitetsmodul och nedbrytningshastighet jämfört med deras naturliga biomaterial motsvarigheter 1. Eftersom de är syntetiskt framställda, har PEG betydligt mindre sats till sats variabilitet kontra naturligt framställda material 4. På grund av den kemiska sammansättningen av PEG, är dessa hydrogeler är mycket hydrofila, är resistenta mot proteinadsorption och biokompatibel 3. Detta motstånd mot proteinadsorption tillåter PEG hydrogel för att fungera som ett "oskrivet blad", gör det möjligt för forskare att förhöra och studera specifika biologiska eller kemiska faktorer (droger, biomolekyler, cellvidhäftnings peptider, etc.) och de specifika roller dessa factors spela i att kontrollera cell-och / eller vävnadsbeteende.

Figur 1
Klicka här för att visa en större bild .

Figur 1: Exempel på poly (etylenglykol) (PEG) arkitekturer A) Linjär PEG B) 4-armad PEG med en pentaerytritol kärna C) 8-armad PEG med en hexaglycerol kärna D) 8-armad PEG med en.... tripentaerytritol kärna. n är antalet PEG upprepas på varje arm. Varje upprepning har en molekylvikt av 44 g / mol, därför n kan beräknas från den totala molekylvikten och strukturen / arm #.

PEG-prekursorer finns med en mängd olika arkitekturer och molekylvikter (Figur 1 ). Variation av arkitektur (arm #) och etylenglykol upprepningar (n) av PEG kan användas för att styra egenskaperna hos hydrogel nätverk bildade av dessa makromerer. Omodifierad PEG innehåller terminala hydroxylgrupper som måste ersättas med en alternativ funktion för att underlätta kovalent tvärbindning via polymerisationer, den mest vanligen använda tvärbindningsstrategi för PEG hydrogel, innan bildandet av hydrogel nätverk. Det finns en mängd olika kemiska grupper som kan ingå i PEG-makromerer att underlätta polymerisation och nätverkstvärbindning (akrylat, metakrylat, vinyleter, norbomen, etc.). Trots olika terminal funktioner tillgängliga för att underlätta tvärbindning, finns det bara två mekanismer som polymerisering kan inträffa: steg-och chain-tillväxt (eller en blandning av de två, mixed-mode).

g2.jpg "width =" 600px "/>
Klicka här för att visa en större bild .

Figur 2:.. Teoretisk hydrogel nätverk schema A) Traditionella kedja tillväxt polymerisationsresultat i heterogena nätverk som innehåller tät poly (metakrylat) tvärbindande regioner och ökad nätverks nonidealities såsom loopar, oreagerade prekursorer och permanenta förvecklingar B) Steg-tillväxt polymerisationsresultat i signifikant mer homogena nätverksstrukturer (ej skalenlig).

Funktioner som tvärbinder via kedja-tillväxt polymerisation inte kräver närvaro av en extra tvärbindningsmedel. Men kedjan-polymeriserade hydrogeler producerar heterogena nätverksstrukturer som innehåller täta tvärbindningsregioner (Figur 2A) 1. Däremot steg-tillväxt polymerisation requires användning av ett tvärbindningsmedel eller sam-monomer, som är reaktiv med de terminala funktionella grupperna i PEG makromerer. Eftersom de terminala funktionella grupperna på PEG endast kan reagera med tvärbindningsmedlet och tvärbindningsmedlet kan endast reagera med de terminala funktionella grupperna på PEG resulterar detta i större nätverksstruktur homogenitet (figur 2B) 1. Steg-tillväxt polymerisationer också vanligtvis leder till högre omvandling av funktionella grupper, minska mängden oreagerade prekursorer och potential för immun / inflammatoriska reaktioner på grund av lösliga, oregistrerade makromerer 1. Mixed-mode polymerisationsmetoder har också utvecklats som kombinerar både steg-och chain-tillväxt polymerisation genom användning av makromerer som kan både själv reagerar (chain-tillväxt) och reagerar med ett tvärbindningsmedel (steg-tillväxt). Detta ger hydrogeler med egenskaperna för varje polymerisation mekanism, och kan användas för att framställa mer komplexa, olika nätstrukturer än enderasteg-eller enbart 1 kedja tillväxtnätverk.

Medan det finns en uppsjö av funktionella grupper, vilka kan användas för att funktionalisera PEG och underlätta hydrogel formation, metakrylater och norbornener är några av de vanligaste kedja-och steg-tillväxt polymerisationsbetingelser molekyldelar, respektive. Båda dessa funktioner erbjuder utmärkt Spatiotemporal kontroll över nätverks polymerisation, och när den används för att kapsla in celler, dessa nätverk stöder hög total cellöverlevnads 5-7. Dimetakrylat funktionaliserad PEG (PEGDM) tvärbindning via kedjepolymerisering och tillåter inkorporeringen av biomolekyler eller andra faktorer genom sampolymerisation med akrylat-, metakrylat-, eller på liknande sätt-functionalized biomolekyler 5,6. PEGDM hydrogeler har betydande fördelar jämfört med alternativa chain-tillväxt polymerisationssystem såsom akrylat funktionalis PEG (PEGDA). Med traditionella metoder, kan PEGDA syntetiseras snabbare än PEGDM; hoWever, med hjälp av mikrovågsassisterad syntes är PEGDM syntes ännu effektivare. PEGDA ofta syntetiseras i övernatt 8 eller 24-hr 9-reaktioner, men kan också syntetiseras i fyra timmar vid förhöjda temperaturer 10. PEGDM är också traditionellt syntetiseras genom att reagera över natten 11 eller under 24 timmar 5, med vissa metoder utökning av reaktionstiden till 4 dagar 12. Använda mikrovågsassisterad metod demonstreras här, kan PEGDM framställas i en 5 minuters reaktion. Medan PEGDM har långsammare reaktionskinetik än PEGDA 13, är tvärbindningsreaktionen för PEGDM fortfarande snabbt, inträffar inom några minuter, och uppnår större makromer omvandling än PEGDA som den ökade hydrofobiciteten hos metakrylatgrupp ökar funktionell grupp aggregering i lösning och därmed öka sannolikheten för radikal överföring och metakrylat omställning 14. PEGDM hydrogel är också förknippade med ökad cell livskraft och tillväxtjämfört med PEGDA hydrogel, sannolikt på grund av minskning av reaktionshastigheten vid en viss tidpunkt, vilket minskar radikalt koncentration och oreagerade makromerer nuvarande 14. Tiol-en-polymerisationer, såsom de med användning av norbornen-funktionaliserad PEG (PEGN) bildar hydrogeler via steg-tillväxt polymerisation, och kräver användning av PEGN och ett tvärbindningsmedel som innehåller i genomsnitt mer än två funktionella grupper. Sedan thiyl radikaler reagerar med norbornen-kol-kol-dubbelbindningar, multi-tiol-innehållande tvärbindningsmedel som vanligen används för att tvärbinda PEGN hydrogeler, som möjliggör facile inkorporering av peptider med cystein aminosyror funktionaliteter 7. Medan det finns många andra kemiska sammansättningar som reagerar via steg-tillväxt polymerisation (Michael-additionsreaktioner såsom tiol-akrylat 15 och tiol-vinylsulfon 16, "klicka" reaktioner såsom alkynen-azid 17 etc), tiol-norbomen hydrogeler är mycket vanligt, eftersom belastningen frånden norbornen ringen avsevärt ökar reaktionshastigheten och minskar risken för att den norbornen dubbelbindningen som undergår kedjepolymerisering 7.

Beslutet mellan metakrylat, norbomen, eller suppleant funktionalisering för att underlätta hydrogel bildningen bygger till stor del på det tillvägagångssätt. Till exempel har kedja-tillväxt polymeriserad PEGDM nätverk visats som väl lämpad för att styra cell lokalisering i utvecklingen av en vävnadstekniska periostet 18,19. Steg-tillväxt polymeriserade PEG-nät är bättre lämpade för inkorporering av peptidsekvenser för att underlätta enzymatiskt lyhörd hydrogel nedbrytning på grund av lättheten att införlivandet av enzymsubstratsekvenser med hjälp av tiol (cystein) som innehåller peptider och norbornen funktion makromerer 20. Om forskningsfrågan ska hanteras bäst med hjälp av steg-tillväxt hydrogel, Fairbanks et al. Ger en detaljerad beskrivning av norbornene funktion strategi för PEG-7. Denna uppsats kommer detalj hur PEG och peptidsekvenser kan funktionaliseras (med en metakrylat för PEG, och en metakrylamid för peptider) för kedjan polymerisationsreaktionerna.

Traditionellt är PEGDM produceras genom att reagera PEG med metakryloyl-klorid och trietylamin i diklorometan. Reaktionen tillåts att fortskrida vid rumstemperatur över natten 11 eller under 24 timmar 5, med några metoder, som sträcker sig reaktionstiden till 4 dagar 12 före filtrering, utfällning i dietyleter, och samling. Även om många variationer av denna metod finns, alla är tidsödande, kräver en stor mängd kemiska syntesmaskiner och är inte miljövänliga, eftersom de inbegriper användning av relativt stora mängder av högrena reagens och lösningsmedel. För att kringgå dessa begränsningar, Lin-Gibson et al. Utvecklat en mikrovågsassisterad, lösningsmedelsfri metod att functionalize PEG med te rminal metakrylatgrupper (Figur 3A) 12. I denna reaktion de terminala alkoholgrupper av PEG reagera med en av karbonylgrupperna atomer av metakrylsyra-anhydrid för bildning av en karboxylgrupp. Detta genererar PEGDM produkt, med metakrylsyra som en sidoprodukt. Denna syntes har många av de karakteristiska fördelarna med mikrovågssyntes, inklusive minskad reaktionstid och lösningsmedelsfria syntesmetoder 21. Den mikrovågssyntes är att föredra framför de tidigare diskuterade metoder eftersom det är betydligt snabbare, kräver mindre omfattande syntesutrustning (t.ex. glas, reaktionsplattor), och använder mindre total reagens och lösningsmedel mängder som lösningsmedel behövs bara för produktrening / insamling och inte för syntes, vilket gör det mer ekonomiskt och miljövänligt.

0px "/>
Klicka här för att visa en större bild .

Figur 3:. Funktionalise Schema A) Poly (etylenglykol) bringas att reagera med 10x molöverskott metakrylsyra-anhydrid för att framställa poly (etylenglykol) metakrylat B) Samma metod kan användas för att funktionalisera den N-terminalen av peptidsekvenser som bildar en. metakrylamid funktion peptid. Genom att utföra denna procedur innan klyvning av peptiden från hartset, kan selektiv funktionalisering av N-terminalen utföras som sidogrupper aminosyra förblir skyddad. n: antal PEG upprepar i makromeren (n = 45,5, 227 och 455, respektive, för 2, 10 och 20 kDa linjär PEG används). R1-RN: aminosyrasidokedjor. PG1 till PGN: sidokedjeskyddsgrupper. TFA: trifluorättiksyra. TIPS: triisopropylsilan. Dodt: 3,6-dioxa-1 ,8-octanedithiol. H2O: vatten.

Den mikrovågsassisterad methacrylation metod har nyligen anpassats av vår grupp att funktionalisera N-terminalen av peptider med metakrylamid-grupper (figur 3B) för att underlätta peptid införlivande i en mängd olika polymerer och polymera nätverk. Vid denna reaktion reagerar den primära aminen i N-terminalen av peptiden med karbonylgruppen atom på metakrylsyra-anhydrid för att bilda en amid. Detta genererar metakrylamid funktion peptid, med metakrylsyra produceras som en biprodukt. Vid användning av detta förfarande för att funktionalisera N-terminalen av peptidsekvenserna är det viktigt att aminosyror som innehåller reaktiva sidokedjor (primära aminer (lysin), alkoholer (serin, treonin) och fenoler (tyrosin)) skyddas under funktionalisering, och grupper är bara klyvs efter metakrylamid inkorporering.

Denna artikel kommer att visa båda dessa microave assisterade metoder för att syntetisera PEGDM och funktionalisera på-harts peptidsekvenser, belyser vanliga fallgropar och föreslå felsökningsmetoder. I denna artikel kommer metoder för att utföra analytisk kemiska tekniker som vanligtvis används för att bedöma produktfunktion vara detaljerad, och förslag och resurser för att utföra mer avancerade ändringar kommer att ges. Typiska resultat kommer att demonstreras, som omfattar användning av syntetiserade PEGDM bildar hydrogel nätverk, utnyttja de bildade hydrogelerna att styra frisättningen av en modell drog, och anställa funktion peptider för att underlätta cell-hydrogel interaktioner. Särskild uppmärksamhet kommer att ägnas åt att karakterisera hydrogel maskstorlek och diskutera hur hydrogelkomposition kan ställas in för att påverka det underliggande fysiska egendom, vilket i sin tur styr bulkmaterialegenskaper såsom styvhet och läkemedelsfrisättningsprofil.

Protocol

1. Mikrovågsassisterad syntes av PEGDM

  1. För att förhindra kontaminering med vatten, varvid pre-torr hela glasvaran i en ugn (> 60 ° C) i en timme.
    OBS: Obligatorisk glas ingår: två 100 ml-bägare, en 250 ml-bägare, 3 spatlar, en 250 ml-Büchner-kolv, en 7-cm Buchner-tratt, en 10-cm urglas.
  2. Pre-chill 100-150 ml vattenfri dietyleter (74.12 g / mol) för fällning därefter vid steg 1.6 genom att hälla den i en bägare, som täcker över bägaren med ett urglas och placerar bägaren på en omkristallisering skål fylld med is. Flytta mikrovågsugn och virvel i ett dragskåp.
    Anm: Dietyleter kan också förkyld placerar bägaren på en kemisk frys. Den lägre dietyleter temperatur uppnås genom kylning i en frys kommer att öka hastigheten och effektiviteten för nederbörd.
  3. I en liten väga båt Väg in 5 g poly (etylenglykol) (PEG) av molekylerlar vikten på ditt val (1,000-100,000 Da).
    1. Om det finns, ta bort plastbiten från locket på scintillationsflaska. Tarera flaskan, och dispensera 10 molärt överskott av metakrylsyraanhydrid i flaskan (MA, 154,16 g / mol) per ekvation 1 i huvan. Lägg PEG till scintillationsflaska.
      Ekvation 1 (1)
      där Ekvation 1,1 är massan av PEG i g, Ekvation 1,2 är molekylvikten av PEG i g / mol, Ekvation 1,3 är antalet terminala OH-grupper på PEG, och Ekvation 1,4 är molekylerlar vikten av MA i g / mol.
  4. Löst vrid locket på scintillationsflaska. Ställ mikrovågsugnen till 5 min på högsta effekt. Bära värmebeständiga handskar, ta bort flaskan från mikrovågsugnen var 30 sek.
    1. Dra åt locket och skaka i 30 sekunder. Upprepa tills lösningen har microwaved för fullständig 5 min. Hättan kan behöva bytas ut under förfarandet på grund av sprickbildning.
  5. Med locket lossat, låt PEGDM svalna till rumstemperatur. Upplös PEGDM i en liten mängd (10-15 ml) av diklormetan (DCM, 84,93 g / mol).
    Anmärkning: Det rekommenderas att den PEGDM svalna signifikant (~ 5 min) innan DCM Dessutom, för att förhindra kokning av DCM (en misstänkt cancerframkallande ämne) på grund av kvarvarande värme. Den PEGDM kan brytas i små bitar med hjälp av en spatel och vortex att underlätta upplösningen.
  6. Fällning PEGDM i 10x överskott iskall dietyleter under 20 min.
    Obs: Det kan vara nödvändigt att scRatch bägarens sidor med en spatel för att initiera kristallbildning för att utfälla lågmolekylära PEG (2500 Da), men kommer PEG med en molekylvikt under 1000 Da inte utfälla trots repor.
  7. Med användning av en Biichner-tratt och kolv, samla in de PEGDM genom vakuumfiltrering. Filtrera inte till fullständig torrhet, eftersom detta kommer att öka vatten adsorption till PEGDM.
    OBS: Om det behövs för det specifika vakuumsystem i bruk, kan en vakuumfälla placeras mellan filtrerings setup och vakuumkällan för att skydda vakuumpumpen från att skadas av ångor från lösningsmedel.
  8. Överför den filtrerade PEGDM till ett 50 ml koniskt rör med en stor gauge nål genomborrad genom locket för ventilation. Förvara över natten i en vakuumkammare för att torka.
  9. Lös åter PEGDM i DCM och återutfälla (som i 1,5-1,7 steg) som ett slutligt steg för att avlägsna oreagerad MOR. Torka igen som i steg 1.8.

2. Karakterisering av PEGDM Funktion

  1. Använda deutererad kloroform (120,38 g / mol) som lösningsmedel, framställning av prover för ett H-NMR. Placera ett litet prov av PEGDM (≈ 10 mg) i en scintillationsampull med en liten mängd av lösningsmedlet (≈ 1,0 ml). Mål-koncentrationen är 10 mg / ml.
    1. När provet är upplöst, överföra den till en ren NMR-rör. Provet bör fylla de nedersta 4-5 cm av NMR-rör.
  2. Samla proton-NMR-spektra. Våra data samlas in med hjälp av en 400 MHz-spektrometer. Kör prover i rumstemperatur i minst 64 scanningar för att få underlag upplösning.
  3. Om NMR-analys (Figur 4) visar PEGDM funktionalisering är mindre än 90%, bör det methacrylation proceduren upprepas. Justera massa MA används för att redogöra för den minskade mängden icke-funktionaliserad PEG.

Obs: procent av PEG funktion in PEGDM kan beräknas ur den observerade: teoretiska förhållandet mellan terminal methacrylate protoner (a, b och c) till centrala PEG protoner (d) (Figur 4). För linjära PEG, är det teoretiska antal centrala PEG protoner beräknas genom ekvation 2:

Ekvation 2 (2)
där Ekvation 2,1 är molekylvikten av PEG i g / mol och Ekvation 2,2 är molekylvikten av en enda PEG upprepningen (44 g / mol). För icke-linjära PEG, måste denna ekvation ändras för att återspegla den specifika förgreningsstruktur (Figur 1). Den procent funktion kan sedan beräknas med hjälp av ekvation 3:
Ekvation 3 (3)
där Ekvation 3,1 är det observerade området under metakrylat protontoppar (a, δ = 1,94 ppm, b och c, δ = 5,57 och 6,12 ppm) och Ekvation 3,3 är det teoretiska antalet metakrylat-protoner (a = 3 * Ekvation 1,3 , B = 1 * Ekvation 1,3 och c = 1 * Ekvation 1,3 - 6, 2 respektive 2 för linjär PEG). Den funktionprocentberäkning ska utföras med toppar a, b och c var för sig, och sedan averaged för att få en samlad procent funktionalisering.

Anm: Tillräckligt funktionaliserad PEGDM kan sedan dialyseras (i vatten, mot vatten) och uppsamlades genom lyofilisering för att avlägsna återstående metakrylsyraanhydrid och metakrylsyra. Den slutliga produkten ska blandas med en liten mängd (0,01 vikt-%) av inhibitor, såsom citronsyra eller vitamin C och förvarades med torkmedel vid -20 ° C fram till användning. Slut PEGDM produkt kan användas för att producera hydrogel, som beskrivs i JUPITER artikel av Khetan och Burdick 22.

3. Mikrovågsassisterad funktionalisering av On-harts peptider

Obs: Våra peptider syntetiseras med användning av Fmoc-Gly-Wang-harts, med användning av en automatiserad peptidsyntesapparat med UV-övervakning, och 0,2 M aminosyralösningar i N-metylpyrrolidon (NMP, 99,1 g / mol). 5% piperazin (86,1 g / mol) i dimetylformamid (DMF, 73,1 g / mol) användes för avlägsnande av skyddsgrupper, 0,5 M O-bensotriazol-N, N, N ', N'-tetrametyl-uronium-hexafluoro-fosfat (HBTU, 379,3 g / mol) i DMF användes som aktivator, och 2 M diisopropyletylamin (DIEA, 129,3 g / mol) i NMP används som aktivator bas. Peptider kan även erhållas från en kommersiell peptid leverantör. Vid användning av kommersiella källor är det viktigt att peptider upphandlas på-harts med sidokedjan aminosyran skyddande grupper intakta istället helt kluvna, som är standard.

OBS: Det är viktigt att eventuella aminosyror med reaktiva sidokedjor är skyddade, så att metakrylamid funktion endast uppträder vid den primära aminen med N-änden av sekvensen. Se Tabell 1 för aminosyror med reaktiva sidogrupper, och typiska skyddsgrupper. Aminosyror med skyddande grupper är införlivade i sekvensen under peptidsyntes på samma sätt som oskyddade aminosyror, och är ofta tillgängliga från samma aminosyra leverantörer.

AMINOSYRA Reaktiv grupp Skyddsgrupp
Lysin Primär amin tert-butyloxikarbonyl (Boc)
Serin Primär alkohol tert-butyl (tBu)
Treonin Sekundär alkohol tBu
Tyrosin Fenol tBu

Tabell 1: Reaktiva aminosyror och typiska skyddsgrupper.

  1. Syntetisera peptider med användning av standard-fast fas-peptidsyntes, och lagra på hartset vid 4 ° C i DMF tills klar för användning.
  2. Med hjälp av en 7 cm Buchner-tratt med filterpapper och 250 ml kolv, samla peptidhartset från DMF via filtrering.
  3. Om de är närvarande bort plastbiten från locket till scintillationsampull. Överför massan till scintillationsampull. Med användning av en engångspipett, lägg bara tillräckligt MA att täcka hartset i scintillationsflaska.
  4. Löst placera locket på scintillationsflaska. Ställ mikrovågsugnen till 3 min på högsta effekt. Bära värmebeständiga handskar, ta bort flaskan från mikrovågsugnen var 15-20 sek.
    1. Dra åt locket och skaka i 15 sekunder. Upprepa tills lösningen har microwaved för full 3 min.
  5. Med locket lossas, låt peptidlösningen svalna till rumstemperatur. Med hjälp av en liten mängd DMF och en Biichner-tratt med filterpapper och kolv, samla peptidhartset från ampullen.
  6. Överför peptidhartset till ett färskt scintillationsflaska och spjälka och avskydda peptiden.
    1. Per 0,25 mmol harts använder vi en 2 tim vid rumstemperatur reaktionen med rotation, med hjälp av ett klyvnings cocktail av 18,5 ml trifluorättiksyra (TFA, 114,02 g / mol) med 0,5 ml vardera av triisopropylsilan (TIPS, 158,36 g / mol), 3,6-dioxa-1 ,8-octanedithiol (Dodt, 182,30 g / mol) och avjoniserat vatten (18,02 g / mol).
      OBS: Denna cocktail är tillräckligt för de flesta peptider, men kommer inte avskydda 2,2,4,6,7-pentametyl-dihydrobensofuran-5-sulfonyl (Pbf)-skyddade aminosyror (som vanligen används för att skydda arginin sidokedjor). Om sekvensen innehåller några Pbf-skyddade grupper, bör 0,5 ml av TFA ersättas med 0,5 ml tioanisol (124.20 g / mol) och spjälkning tid ökade till 4 timmar.
      OBS: Om en molnig, kristallint ämne bildas i klyvningen cocktail peptiden sannolikt kraschar ut ur lösningen och volymen av klyvnings cocktail bör fördubblas.
  7. Kyl 400 ml vattenfri dietyleter på is i en bägare täckt med urglas.
  8. Fällning peptiden i 10x överskott dietyleter, och delar upp lösningen jämnt bland fyra 50 ml koniska rör. Centrifugera vid 3200 x g under 10 min för att samla in peptiden.
    1. Häll bort etern, och återsuspendera-peptid i 100 ml färsk dietyleter fördelade mellan två 50 m koniska rör. Upprepa centrifugerprocessen återsuspendering i 50 ml färsk eter två gånger för totalt fyra etertvättar.
      Anmärkning: Detta avlägsnar de kemikalier som används i klyvningscocktail och spjälkades skyddande grupper från den fasta peptiden.
  9. Efter den sista centrifugeringssteget, dekantera avfalls ethenne och torka peptiden natten under vakuum.

4. Karakterisering av Peptid Funktion

  1. Använd 50:50 H2O: Acetonitril (41,05 g / mol) + 0,1% TFA som lösningsmedel för MALDI-TOF-analys av peptidprover. Placera ett litet prov (1-2 mg) av peptiden i en 1,5 ml Eppendorf-rör och upplösning av provet i 1 ml av MALDI lösningsmedel.
  2. Förbered matrislösningen. En vanligen använda matris α-cyano-4-hydroxikanelsyra (CHCA, 189,2 g / mol) som matris. Lös upp 10 mg / ml matris i MALDI lösningsmedel, som bildar en lager matrislösning.
    Anm: Matrisen stamlösningen kan lagras vid rumstemperatur under upp till en vecka för ytterligare analyser.
  3. Kombinera peptiden och matrislösningen i ett förhållande 1:1. Spot denna kombinerade lösningen på tre separata ställen på MALDI-provplattan och att addera en pl / fläck.
    1. Torka fläckar, antingen genom lufttorkning eller med hjälp av en värmepistol. Respot och torr varjeprovet.
      OBS: Respotting ger en mer enhetlig peptid / matrisprov, och hjälper till att få en tydlig signal. En standardpeptidblandning bör också kombineras med matrislösningen i ett förhållande 1:1 och fläckig (endast en gång) på MALDI plattan.
  4. Samla MALDI-TOF-data. På grund av tillsatsen av det metakrylamid gruppen till N-terminalen av peptiden, bör det finnas en 68 g / mol ökning i molekylvikt över den för peptidmolekylvikten enbart.
    OBS: Som den PEGDM syntes kan peptiderna inte refunctionalized, som vid klyvning av de skyddande grupperna på aminosyror med reaktiva sidokedjor avlägsnas, och den selektiva funktionaliseringen av N-terminaler inte längre kan säkerställas.
    1. Om MALDI-analys (figur 5) visar peptiden fullständigt funktionaliserade, och alla skyddsgrupper på lämpligt sätt klyvas, kan peptiden dialyserades (i vatten, mot vatten) och uppsamlades genom lyofilisering för att Avtagbare restföroreningar (cleavage cocktail, eter, klyvs skyddande grupper etc). Den fasta peptiden bör överföras till en liten Eppendorf-rör och lagrades vid -20 ° C fram till användning.

Representative Results

Proton-NMR är en av de vanligaste analystekniker för att bedöma effektiviteten i en kemisk reaktion, som området under varje spektra topp står i proportion till de relativa nivåerna av det proton i provet, vilket gör bestämning av förhållandet mellan produkt och reaktant i provet. För denna reaktion kan 1H-NMR-analys (Figur 4) användas för att beräkna% funktionalisering från den observerade: teoretiska förhållandet mellan terminal metakrylat protoner (a, b och c) till centrala PEG protoner (d). Den PEGDM visas i figur 4 var 2000 Da före funktionalisering, och därför n = 2000 Da / (44 Da / PEG repetition) = 45,5, så d = 4 * (n-1) = 178, vilket gör det proton: NMR enheten förhållande 178 / 102,16 = 1,74. I detta fall, topp en kan inte användas för att bedöma% funktion, eftersom närvaron av vatten i provet ökar artificiellt arean under toppen. Med hjälp av topp b, är det% funktion 1,00 * 1,74 / 2 * 100% = 87,1%; using peak c, är det% funktion 1,08 * 1,74 / 2 * 100% = 94,1%. Därför är den totala% funktionalisering 91% och detta PEGDM är tillräckligt funktionaliserad för användning i hydrogel syntes. Normalt är cirka 90% funktion uppnås efter en enda runda av methacrylation.

På grund av den mångfald av protontoppar som uppstår i ett H-NMR-analys av peptider, är peptiden funktion lättare undersöktes med användning av MALDI-TOF masspektrometri. Detta visas i figur 5, där peptiden GKRGDSG syntetiserades och utsattes för metakrylamid funktionalisering. En liten fraktion av peptiden klövs för prefunctionalization molekylvikt bedömning (figur 5A), som visade den observerade molekylvikttopp inträffar vid 676 g / mol, den förväntade molekylvikten av peptiden, vilket indikerar korrekt syntes av peptidsekvensen. Återstoden av peptiden genomgick metakrylamid funktionellsering före klyvning. Eftersom denna peptid innehåller Pbf skyddad R aminosyror, var klyvning utfördes i en cocktail innehållande tioanisol under 4 timmar. Efter metakrylamid funktionalisering, inträffar den observerade molekylvikttopp vid 744 g / mol (Figur 5B), den förväntade vikten av det metakrylamid funktionaliserad peptiden (676 68 g / mol) och inte vid den förväntade molekylvikten för den icke-funktionaliserad peptid, vilket indikerar korrekt funktionalisering.

För att demonstrera funktionaliteten hos både PEG och metakrylamid funktionaliserad peptid, var PEGDM hydrogeler som framställts med och utan 0,5 mM metakrylamid funktionaliserad GKRGDSG (Figur 6). Hydrogeler framställdes med 10 vikt-% linjär 10 kDa PEGDM i PBS med 0,05 vikt-% litium fenyl-2 ,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) som fotoinitiator. Hydrogelen prekursorlösningen injicerades mellan två glasskivor åtskilda av en glasskiva distans och hålls samman med bindemedel klipp. Prekursorlösning exponerades sedan för 365 nm UV-ljus vid 2 mW / cm 2 under 10 minuter för att inducera tvärbindning, varefter gelerna 8 mm diameter uppsamlades med användning av en cylindrisk stans. Gelerna sköljdes i PBS och fick svälla under 2 dagar för att säkerställa jämvikts svällande betingelser uppnåddes 16,20. Mänskliga MSCs (passagen 3) odlades till 80% sammanflytning och såddes på hydrogel vid 15.000 celler / cm 2. Cellerna tilläts vidhäfta under 48 h innan de överfördes till färskt medium innehållande 0,5 | il / ml kalcein AM och 2 ^ il / ml etidium-homodimer (LIVE / DEAD Viability Kit från Invitrogen) och avbildas i faskontrast och fluorescens vid 10X förstoring med användning av en Nikon Eclipse Ti 2000. MSCs kunde inte hålla sig till de ofunktionaliserade PEG hydrogeler (Figur 6A), men efter införandet av cellvidhäftnings peptiden RGD de kunde ansluta sig till och sprids på hydrogel ytan (Figur 6B). De LIVE / DEAD bilderpresenteras representerar inte livskraft seedade MSC befolkningen, som MSC är vidhäftningsberoende celler som lossnar från gelytan vid dödsfall och kommer att tas bort under medieöverföringsprocessen, vilket leder till onaturligt hög seedade cellernas livskraft. Snarare är de fluorescerande bilderna är avsedda att avgränsa mellan vidhäftande celler och små variationer i hydrogelen topologi, vilket kan vara svårt i faskontrast ensam. Interestingly nonspread celler ympades på PEG-bara geler färgas positiva för både kalcein AM och etidium homodimer, vilket indikerar att celler dör vid tiden för avbildning.

En av många fördelar med att PEG hydrogel är deras mycket avstämbara karaktär. Modifiering av specifika makeup av PEG hydrogelen ger forskare en hög grad av kontroll över egenskaper såsom elasticitetsmodul. Såsom illustreras i figur 7, båda PEG-molekylvikt (figur 7A) och viktprocenthalten ( (Figur 8). Samtliga hydrogeler framställdes med 10 vikt-% linjär PEGDM i PBS med 0,05 vikt-% LAP som fotoinitiator. 40 | il av hydrogel prekursorlösning var i en ml sprutor med spetsarna avskurna, och exponerade för 365 nm UV-ljus vid 2 mW / cm 2 under 10 minuter för att bilda hydrogeler, som producerar cylindriska geometrier ungefär 5 mm i diameter och 2 mm i höjd . Gelerna tilläts svälla i PBS under 2 dagar före mekanisk testning. Hydrogel modulen bestämdes med användning av en MTS QT / 5 med en 5 N belastningscell under sammanpressning mellan 5 och 10% av ursprunglig hydrogel höjd vid en hastighet av 0,1 mm / sek. Efter mekanisk provning var fullbordad maskstorlek bestäms genom mätning hydrogelpartiklar mass pre-(M s) och efter (M D) 24 timmar för frystorkning via Flory-Rehner ekvation som beskrivs i diskussionsavsnittet, med beräkningar som gjorts i MATLAB. Som en hypotes, att öka molekylvikten av PEG-makromeren orsakat en ökning av hydrogel maskstorlek (figur 8A) och en minskning i hydrogel styvhet (figur 8B). Hydrogel maskstorlek och den erhållna gelén styvhet kan också styras genom att förändra viktprocent PEG. Hydrogeler framställdes med varierande vikt-% av linjär 10 kDa PEGDM och hydrogel styvhet och maskstorlek bestämdes såsom beskrivits tidigare (figur 9). Såsom illustreras i figur 7B ökar vikt% PEG orsakar en signifikant minskning av maskstorlek (figur 9A) och ökningen av hydrogel-styvhet (Figur 9B).

Hydrogeler innehåller inkapslat bovint serumalbumin (BSA) bildades med användning av varierande molecular vikt PEG (2, 10, och 20 kDa). Samtliga hydrogeler framställdes med 10 vikt-% PEGDM i PBS innehållande 50 | ig / ml BSA, såsom beskrivits för figur 6. Geler inkuberades i 1 ml PBS vid 37 ° C och överfördes till färsk PBS vid varje tidpunkt. Släpp BSA kvantifierades med användning av Bradford-analysen från Thermo Scientific. Hydrogel maskstorlek bestämdes såsom beskrivits för figur 8. Såsom illustreras i fig 7A, inträffar BSA frisättningen snabbare från hydrogeler bildade med användning av högre molekylvikt PEGDM, som ett resultat av den större maskstorlek inom hydrogelen (Figur 10).

Figur 4
Figur 4. Representativa 1 H-NMR av 2 kDa linjär PEGDM funktionaliserad använda mikrovågsassisterad metod. Procent funktionalisering kan vara calculated baserat på den observerade:. teoretiska förhållandet mellan terminal metakrylat protoner (a, b och c) till centrala PEG protoner (d) Klicka här för att visa en större bild .

Figur 5
Figur 5. Representative MALDI-TOF-peptid GKRGDSG (A) före och (B) efter funktionalisering med hjälp av mikrovågsassisterad metod. Notera att den observerade molekylvikt topp efter funktionalisering sker vid 744 g / mol, den förväntade vikten av det metakrylamid funktionaliserad peptiden (676 68 g / mol) och inte på den förväntade molekylvikten för den ej funktion peptid (676 g / mol). Klicka här för att visa en större bild .


Figur 6. Representant fas kontrast (till vänster) och LIVE / DEAD (grön / röd) fluorescerande bilder (höger) av MSCs odlade på A) PEG-geler ensamma och B) PEG-geler som innehåller 0,5 mM methacrylamide funktion GKRGDSG. MSCs inte kan ansluta sig till och sprids på de PEGDA geler ensam, men vid införlivandet av cellvidhäftnings peptiden RGD, har möjlighet att ansluta sig till och sprids på hydrogel ytan. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 7
Figur 7. A), PEG-molekylvikt och B) viktprocenten PEG används för att bilda hydrogel-nätverk påverkar hydrogel maskstorlek (_8 ;) och resulterande hydrogelen styvhet och frisättningshastigheten för inkapslade läkemedel. A) Öka PEG-molekylvikt (från vänster till höger) till konstant vikt i procent ökar hydrogel maskstorlek, minskande hydrogel styvhet och öka hastigheten av läkemedelsfrisättning. B) Minskning av vikt procentandel av PEG (vänster till höger) som används för att bilda hydrogel ökar hydrogel maskstorlek, på samma sätt minskar hydrogel stelhet och öka hastigheten för läkemedelsfrisättning (ej skalenlig). Klicka här för att visa en större bild .

Figur 8
Figur 8. A) Maskstorleken ökar och B) hydrogel stelhet minskar med ökande molekylvikt av PEG-makromeren. N = 10, felstaplar = SEM, *** p &# 60; 0,001 av en envägs ANOVA med Tukey HSD post hoc-test. Alla statistiska analyser genomfördes med hjälp av Prism 5. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 9
Figur 9. A) Maskstorleks minskar och B) hydrogel styvhet ökar med ökande vikt-% PEG. N = 9-10, felstaplar = SEM, ** p <0,01, *** p <0,001 med envägs ANOVA med Tukey HSD post- hoc-test. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 10
Figur 10. Frisättning av encapsulated modelläkemedlet bovint serumalbumin (BSA) från hydrogeler bildade med användning av 2 kDa, 10 kDa, 20 kDa molekylvikt PEG. BSA frisättningen inträffar snabbare från hydrogeler bildade med användning av högre molekylvikt PEGDM, som ett resultat av den större maskstorlek inom hydrogelen . n = 6, felstaplar = SEM. Den% BSA släppt är signifikant olika (p <0,0001) mellan alla tre grupperna vid varje tidpunkt utom t = 1 och 2,5 timme när frisättningen från de 2 och 10 kDa geler är likvärdiga, med tvåvägs upprepade mätningar ANOVA med Bonferroni post-hoc-test. Klicka här för att visa en större bild .

Discussion

De metoder som tidigare illustrerats är ovärderliga för syntesen av PEGDM och metakrylamid funktionalisering av peptider eller andra aminhaltiga föreningar. Dessa material kan sedan användas för regenerativ medicin och läkemedelsadministreringsapplikationer. På grund av den hydrofila naturen hos PEG-hydrogeler som bildats från PEG-makromerer har en hög vattenhalt som liknar många vävnader i kroppen 2. Denna kvalitet gör PEG mycket resistenta mot proteinadsorption och därför inert i kroppen 3. Emellertid kan den hygroskopiska naturen hos PEG bli besvärande under funktionalisering. Om vatten är närvarande i den PEG-provet under methacrylation förfarandet kommer metakrylsyraanhydrid reagerar preferentiellt med vatten för att producera metakrylsyra och dålig funktionalisering av PEG kommer att resultera.

Därför är en av de viktigaste åtgärder som kan vidtas för att säkerställa ett framgångsrikt methacrylation av PEG eller peptiden att bibehålla vattenfrirous reaktionsbetingelser. Den rekommenderade steget att torka allt glas innan användning är avsedd att förhindra vattenförorening. Närvaron av vatten i provet kan ses i NMR-analys, som en bred topp vid 1,7 ppm (fig 4). Om dålig methacrylation observeras även efter torkning allt glas, kan kemikalier torkas över natriumsulfat eller andra torkmedel (molekylsiktar etc.) före användning. Destillationen kan också användas för att avlägsna vatten och renar metakrylsyraanhydrid före användning, och azeotropisk destillation kan användas för att torka PEG 23. I extrema fall kan syntesen utföras i en handskbox för att ytterligare säkerställa ett adekvat vattenfria betingelser. En andra omgång av methacrylation, enligt samma förfarande, kan också utföras för att öka funktionalisering. Eftersom det alltid finns en risk att ytterligare rundor av funktionalisering kommer att krävas, bör man i steg 1,7 och 1,9 för att snabbt samla PEGDM genom vakuumfiltrering. Vakuumfiltrering under längre tid än som är absolut nödvändigt ökar exponeringen av PEG till luft, vilket ökar möjligheten för vatten adsorption.

Även om den procentuella överskottet av metakrylsyraanhydrid till funktionella hydroxylgrupper är oförändrad, vilket ökar PEG funktion (t.ex. arm #) på PEG gångaren är i allmänhet förknippas med en minskning i procent funktion uppnådda (opublicerade resultat, Benoit lab). För att preemptively upp denna minskning av funktion effektivitet, eller om särskilda svårigheter uppstår uppnå tillräckligt hög funktionalisering, varaktighet mikro reaktionen kan ökas, förutsatt att mikrovågsugnen intervallet bibehålls på 30 sek. Medan 10 molärt överskott är vanligen tillräcklig, kan mängden metakrylsyra-anhydrid som används i reaktionen även ökas för att öka den procentuella funktionalisering uppnås 12.

Det är viktigt att denytterligare fällningssteg (1.9) utföras för att uppnå goda NMR signaler. Även om det är frestande att utföra den andra utfällningen samma dag som syntes, torkning av provet över natten innan omfällning har befunnits underlätta avlägsnandet av överskott av metakrylsyraanhydrid och metakrylsyra. Provberedning är också viktigt för att uppnå ren NMR-spektra, och därför prover bör beredas med hjälp av rekommenderade förhållanden. Figur 4 visar representativa 1 H-NMR-resultat för korrekt funktion PEGDM. Genom att analysera förhållandet mellan terminal metakrylat protoner till central PEG protoner var PEGDM fast besluten att på lämpligt sätt funktionalis. MALDI provberedning är lika viktiga för att uppnå en tydlig läsning. MALDI är särskilt känslig för förekomsten av salter och hög koncentration i proverna. Om en tydlig MALDI läsning (en intensitet över 50 godtyckliga enheter (AU) med en hög signal: brus-förhållande) inte kan erhållas, prov solution bör spädas 1:100 i MALDI lösningsmedel innan de kombineras med matrislösningen och omanalyseras. Figur 5 visar representativa MALDI-TOF resultat efter rätt peptidfunktionalisering, klyvning, och provberedning. Klyvning av ett litet prov av hartset före funktionalisering (figur 5A) visar korrekt syntes av peptiden GKRGDSG, med korrekt metakrylamid funktionalisering av den peptid som visas i figur 5B.

Även funktionalisering av på-harts peptider är ett relativt stabilt förfarande, klyvnings villkor som krävs för varje sekvens kräver ofta tuning. För längre sekvenser där många aminosyror har skyddade sidokedjor (> 30 aminosyror långa, eller> 15 aminosyror med skyddsgrupper), bör ökas varaktigheten av klyvning med en timme. Men om klyvning tiden förlängs för mycket, kan peptidbindning klyvning leda till följd av långvarig surt exponering. MALDI ana lys kan vara till stor hjälp för att avslöja eventuella fel som uppstått i peptidsyntes eller klyvning. En observerade minskningen under förväntade molekylvikter kan tyda på att aminosyror (s) har inte riktigt par, eller att peptidfraktione inträffade (se tabell 2 för källor för vanligt förekommande förändringar i molekylvikt). Om den observerade molekylvikten är högre än väntat med vikten av en skyddsgrupp som används, är det troligt att klyvning och avskyddning var otillräcklig och peptiden bör recleaved för ytterligare tid.

x; "> MW förändring (g / mol) <td style = "width: 64px;"> 24 DTH: 64px; "> -113 03px; "> Pro 20 "style =" height: 20px; width: 103px; "> Tyr
Aminosyradeletion MW förändring (g / mol) Okluvna Protecting Groups Vanligt förekommande joner MW förändring (g / mol)
Ala -71 Acetyl 42 Cl - 35
Arg -158 Allyl 40 K + 39
Asn -114 Alloc 85 Mg 2 +
ASP -115 Boc 100 Na * 23
Cys -103 Fmoc 223
Gin -128 OtBu 56
Glu -129 Pbf 252
Gly -57 tBu 56
Hans -137 Trt 242
Lie -113
Leu
Lys -128
Met -131
Phe -147
-97
Ser -87
Thr -101
Trp -186
-147
Val -99

Tabell 2. Vanligast observerade förändringar i peptidmolekylvikt.

Makromerer framställda med användning av mikrovågsassisterade methacrylation metoder kan användas i ett antal regenerativ medicin eller läkemedelsleveransapplikationer. De funktionaliserade peptider och PEGDM syntetiserade här kan också införlivas i polymerer med användning av nitroxid-medierad polymerisation (NMP), Atom Transfer Radical Polymerisation (ATRP) eller kallufts Addition-Fragmentering Transfer (RAFT) metoder 24. Hydrogel-nät kan även framställas i närvaro av celler, som tidigare visats i JoVE artikel av Khetan och Burdick 22. Detta kräver ofta införlivandet av cellvidhäftnings peptider såsom RGD-eller extracellulära matrixmolekyler, som PEG ensam inte ger cell-material interaktioner kritiska för överlevnad och funktion av vissa celltyper 25. Peptider, till exempel, kan syntetiseras med användning av traditionella fastfas-peptidsyntes och funktionaliserad såsom beskrivits här för att möjliggöra inkorporering i hydrogel-nätverk. Såsom framgår av fig 6, införande av det metakrylamid-functionalized celladhesion peptid GK RGDS G i hydrogeler (0,5 mM) underlättar adhesion av humana mesenkymala stamceller (MSC) till PEG-hydrogel-ytor, vilket ökar antalet kopplade och sprider celler (Figur 6B ), jämfört med PEG hydrogeler utan cellvidhäftningspeptid ( 26. För att införliva denna PEG spacer och undvika icke-specifika interaktioner, kan peptider konjugeras till monofunctionalized PEG via N-hydroxisuccinimidyl-aktiverade estrar, såsom beskrivs av Hern och Hubbell 26.

Tillämpningar av hydrogel nätverk kräver god kontroll över materialegenskaper. En betydande fördel med att PEG-hydrogeler är en hög grad av kontroll över dessa egenskaper. Till exempel, molekylvikten, arm nummer och vikt-% av PEG som användes i bildning av hydrogel-nätverk kan ändras för att fins tune egenskaper för specifika tillämpningar. Detta medger god kontroll över hydrogelen maskstorlek (ξ), som styr hydrogel svällningsförhållandet (Q) och styvhet (elasticitetsmodulen, E). Detta illustreras i figur 7A och kvantifieras i Figur 8, där ökande PEG-makromeren molekylvikt resulterar i en ökning av hydrogel maskstorlek (figur 8A) och en minskning i hydrogel styvhet (figur 8B).

Den underliggande fysiska kännetecken som styr bulk beteende i dessa hydrogel nät, maskstorlek, beräknas med hjälp av Flory-Rehner ekvation 16. För att utföra denna beräkning, är det volymetriska svällningsförhållandet (Q) först beräknas enligt ekvation 4:
Ekvation 4 (4)

där ρ s är densiteten för vatten (1 g / ml), är ρ p densitet av PEG (1,12 g / ml), M är mellan svälld massa av hydrogelen och M D torr massa av hydrogel (ofta mäts efter frysning och lyofilisering av hydrogeler). Molekylvikten mellan tvärbindningar (Mc, i g / mol) beräknas sedan från ekvation 5:
Ekvation 5 (5)

där Mn är talmedelvärdet för molekylvikt av PEG (i g / mol), Ekvation 5,05 är den specifika volymen hos polymeren Ekvation 5,1 , V är en den molära volymen av vatten (18 ml / mol), är V 2 jämvikts polymerens volymfraktion av hydrogelen
( Ekvation 5,2 ) Och X 1 16. Antalet bindningar mellan tvärbindningar (n) beräknas sedan från ekvation 6:
Ekvation 6 (6)

där N ^ är antalet bindningar i PEG-repeat (3) och M r är MW av PEG-upprepningen (44 g / mol) 27. Detta medger att root-mean-square end-to-end-avstånd av polymerkedjan Ekvation 6,1 (I nm) ska beräknas enligt ekvation 7:
Ekvation 7 (7)

där L är den genomsnittliga bindningslängden (0,146 nm, beräknat baserat på CC-och CO-bindningslängder) och C n är det karakteristiska förhållandet mellan polymeren (4,0 för PEG) 28. Finellt, maskstorlek av hydrogelen kan beräknas från ekvation 8:
Ekvation 8 (8)

Hydrogel egenskaper kan på liknande sätt justeras genom att justera mängden av PEG som används vid bildning av hydrogeler. Minskning av viktprocenten av PEG-makromeren resulterar i en ökning av hydrogel med en maskstorlek, som därefter minskar hydrogel styvhet. Figur 7B illustrerar och Figur 9 kvantifierar hur viktprocenten av PEG som används i hydrogelen bildning kan användas för att styra maskstorlek (figur 9A) och resulte hydrogel styvhet (Figur 9B). Som substrat stelhet har visat sig påverka cell beteenden såsom stamcellsdifferentiering 29, är förmågan att tätt styra styvhet en viktig egenskap i hydrogel tillverkning.

Hydrogeler kan även användas för att kontrol drug delivery. Såsom visas i figur 7A och visas i figur 10, att öka molekylvikten av PEG-makromerer ökar maskstorlek av hydrogelen nätverk och därefter öka frisättningen av inkapslat modelläkemedel, bovint serumalbumin (BSA). Medan hydrogel prover i studien förstördes vid t = 195 timmar för att möjliggöra mätning av hydrogel våt-och torrmassor för maskstorlek beräkningar, är det vår erfarenhet att fortsatt BSA frigivning skulle ske hade proverna inkuberats under längre tidsperioder. Den ofullständiga frisättning av BSA observeras i figur 10 är inte oväntat, eftersom andra grupper har också rapporterat att BSA är resistent mot diffusion inom PEG hydrogel-nätverk 30. Ofullständig frisättning av inkapslat protein kan bero på vätebindning mellan proteiner och PEG-makromerer, eller kovalent bindning mellan den metakrylat-gruppen på PEG och primära aminogrupper på lysinrester i BSA 31 (figur 2A), är det också möjligt att en del av det inkapslade BSA finns i regioner av hydrogel som har betydligt mindre mask storlek än det totala genomsnittet i gelén, förhindrar dess release. Även ofullständiga, nonFickian release (data visas ej) av inkapslat BSA observerades i detta fall, kontrollerad enligt Ficks lag frisättning av många andra modell droger, inklusive insulin och ovalbumin, har visat genom att använda liknande PEGDM hydrogel 30. Dessutom Watkins och Anseth har använt konfokal laserscanningsmikroskopi för att visa att frisättning av fluorescerande molekyler från liknande hydrogeler modelleras acceptabelt med enligt Ficks lag diffusion migthods 32.

Medan de hydrogel som bildas i denna studie är icke nedbrytbara, är nedbrytningen nätverk annan parameter som kan införlivas i och stämmas inom dessa nätverk. Att tillhandahålla kontrollerad hydrogel nedbrytning kan resultera i förändringar i cellbeteende 33, främjande av vävnadstillväxt eller värd vävnadsinväxt, eller eliminering av behovet för explantation 34. Nedbrytbara PEG-hydrogeler vanligen syntetiseras genom ringöppnande hydrolytiskt nedbrytbar d, l-laktid, glykolid, eller ε-kaprolakton-grupper på hydroxylgrupperna i PEG före methacrylation 35. Dessa tre grupper nedbrytas genom hydrolys av ester-funktioner, varvid glykolid estrar som har den största känsligheten för nedbrytning, följt av laktid och kaprolakton ester, på grund av deras varierande hydrofobicitet. Efter inkorporering av hydrolytiskt nedbrytbara grupper, kan PEG vidare funktionaliseras med hjälp av methacrylation förfarande detailed i den här artikeln, som möjliggör bildandet av hydrogel nätverk genom efterföljande radikalinitierad kedjepolymerisering 36,37. Hastigheten för nedbrytning av hydrogelpartiklar näten kan styras genom att variera identiteten av hydrolytiskt nedbrytbara grupp (glykolid, laktid, etc), och genom att variera antalet av nedbrytbara upprepningar som införts i den struktur 35,38.

Teoretiskt skulle metoderna påvisade här att användas för akryle av PEG och peptider genom att ersätta metakrylsyraanhydrid med akryl-anhydrid i steg 1,3 och 3,3, respektive. Dock är akrylsyraanhydrid mer än 20 gånger kostnaden för metakrylsyraanhydrid 39,40, vilket gör mikrovågsassisterad akryle betydligt mindre attraktiva än mikrovågsassisterad methacrylation.

Vi har visat en enkel, snabb metod för att functionalize PEG och peptider, hur man ska värdera effektiviteten av detta förfarande, och ges resurser för usjunger de syntetiserade material för att bilda hydrogel nätverk. Dessa syntetiska verktyg är mycket mångsidig i sina ansökningar, och borde vara en stapelvara i valfritt antal drug delivery-och materialforskningslaboratorier.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Detta arbete har finansierats delvis av Howard Hughes Med-in-Grad gemenskap (AVH), genom nystartade fonder som Dr Danielle Benoit från University of Rochester och Ortopedisk Forskning och utbildning Foundation / Musculoskeletal Transplant Foundation (fastighetsfonder / MTF). Författarna vill tacka Dr James L. McGrath för att använda sin utrustning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3,6-Dioxa-1,8-octanedithiol Tokyo Chemical Industry Co, LTD D2649 CAS 14970-87-7
Acetonitrile J.T. Baker UN1648 CAS 75-05-8
Amino Acids AAPPTech Glycine: AFG101 CAS 29022-11-5
Arginine: AFR105 CAS 154445-77-9
Asparagine: AFD105 CAS 71989-14-5
Serine: AFS105 CAS 71989-33-8
Anhydrous diethyl ether Fisher Scientific UN1155 CAS 60-29-7
Citric acid Sigma Aldrich C1857 CAS 77-92-9
Deuterated chloroform Cambridge Isotope Laboratories Inc. DLM-7-100 CAS 865-49-6
Dichloromethane Fisher Scientific UN1593 CAS 75-09-2
Diisopropylethylamine Alfa Aesar A1181 CAS 7087-68-5
Dimethylformamide Fisher Scientific D119-4 CAS 68-12-2
Fmoc-Gly-Wang resin Peptides International RGF-1301-PI 100-200 mesh size
Methacrylic anhydride Alfa Aesar L14357 CAS 760-93-0
N-Methylpyrrolidone VWR BDH1141-4LG CAS 872-80-4
On-resin peptides Synthesized in-house On-resin peptides can also be purchased from Peptides International, GenScript, AAPPTec, etc.
O-Benzotriazole-N,N,N’,N’-tetramethyl-uronium-hexafluoro-phosphate AnaSpec Inc 510/791-9560 CAS 94790-37-1
Peptide Calibration Standard Care 206195
Piperazine Alfa Aesar A15019 CAS 11-85-0
Poly(ethylene glycol) 2 kDa linear Alfa Aesar B22181 CAS 25322-68-3
Poly(ethylene glycol) 10 kDa linear Alfa Aesar B21955
Poly(ethylene glycol) 20 kDa linear Sigma Aldrich 81300 JenKem Technologies USA is an alternate supplier of linear and multi-arm PEG
Thioanisole Alfa Aesar L5464 CAS 100-68-5
Trifluoroacetic acid Alfa Aesar A12198 CAS 76-05-1
Triisopropylsilane Alfa Aesar L09585 CAS 6485-79-6
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid Tokyo Chemical Industry Co, LTD C1768 CAS 28166-41-8

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lin, C. C., Anseth, K. S. PEG Hydrogels for the Controlled Release of Biomolecules in Regenerative Medicine. Pharm. Res. 26, 631-643 (2009).
  2. Ifkovits, J. L., Burdick, J. A. Review: Photopolymerizable and degradable biomaterials for tissue engineering applications. Tissue Eng. 13, 2369-2385 (2007).
  3. Peppas, N. A., Hilt, J. Z., Khademhosseini, A., Langer, R. Hydrogels in biology and medicine: From molecular principles to bionanotechnology. Adv. Mater. 18, 1345-1360 (2006).
  4. Lutolf, M. P., Hubbell, J. A. Synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments for morphogenesis in tissue engineering. Nat. Biotechnol. 23, 47-55 (2005).
  5. Benoit, D. S., Durney, A. R., Anseth, K. S. The effect of heparin-functionalized PEG hydrogels on three-dimensional human mesenchymal stem cell osteogenic differentiation. Biomaterials. 28, 66-77 (2007).
  6. Benoit, D. S., Collins, S. D., Anseth, K. S. Multifunctional hydrogels that promote osteogenic human mesenchymal stem cell differentiation through stimulation and sequestering of bone morphogenic protein 2. Adv. Funct. Mater. 17, 2085-2093 (2007).
  7. Fairbanks, B. D., et al. A Versatile Synthetic Extracellular Matrix Mimic via Thiol-Norbornene Photopolymerization. Adv. Mater. 21, 5005 (2009).
  8. Moon, J. J., Hahn, M. S., Kim, I., Nsiah, B. A., West, J. L. Micropatterning of Poly(Ethylene Glycol) Diacrylate Hydrogels with Biomolecules to Regulate and Guide Endothelial Morphogenesis. Tissue Eng. A. 15, 579-585 (2009).
  9. Burdick, J. A., Anseth, K. S. Photoencapsulation of osteoblasts in injectable RGD-modified PEG hydrogels for bone tissue engineering. Biomaterials. 23, 4315-4323 (2002).
  10. Yanez-Soto, B., Liliensiek, S. J., Murphy, C. J., Nealey, P. F. Biochemically and topographically engineered poly(ethylene glycol) diacrylate hydrogels with biomimetic characteristics as substrates for human corneal epithelial cells. J. Biomed. Mater. Res. A. 101A, 1184-1194 (2013).
  11. Benoit, D. S. W., Anseth, K. S. Heparin functionalized PEG gels that modulate protein adsorption for hMSC adhesion and differentiation. Acta Biomater. 1, 461-470 (2005).
  12. Lin-Gibson, S., et al. Synthesis and characterization of PEG dimethacrylates and their hydrogels. Biomacromolecules. 5, 1280-1287 (2004).
  13. Anseth, K. S., Wang, C. M., Bowman, C. N. Reaction Behavior and Kinetic Constants for Photopolymerizations of Multi(Meth)Acrylate Monomers. Polymer. 35 (94), 3243-3250 (1994).
  14. Bencherif, S. A., et al. End-group effects on the properties of PEG-co-PGA hydrogels. Acta Biomater. 5, 1872-1883 (1016).
  15. Rydholm, A. E., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Degradable thiol-acrylate photopolymers: polymerization and degradation behavior of an in situ forming biomaterial. Biomaterials. 26, 4495-4506 (2005).
  16. Zustiak, S. P., Leach, J. B. Hydrolytically Degradable Poly(Ethylene Glycol) Hydrogel Scaffolds with Tunable Degradation and Mechanical Properties. Biomacromolecules. 11, 1348-1357 (2010).
  17. Malkoch, M., et al. Synthesis of well-defined hydrogel networks using Click chemistry. Chem. Commun. , 2774-2776 (2006).
  18. Hoffman, M. D., Benoit, D. S. Emerging Ideas: Engineering the Periosteum: Revitalizing Allografts by Mimicking Autograft. , (2012).
  19. Hoffman, M. D., Xie, C., Zhang, X., Benoit, D. S. The effect of mesenchymal stem cells delivered via hydrogel-based tissue engineered periosteum on bone allograft healing. Biomaterials. , (2013).
  20. Hubbell, J. A., Lutolf, M. P., Raeber, G. P., Zisch, A. H., Tirelli, N. Cell-responsive synthetic hydrogels. Adv. Mater. 15, 888-892 (2003).
  21. Lidstrom, P., Tierney, J., Wathey, B., Westman, J. Microwave assisted organic synthesis - a review. Tetrahedron. 57, 9225-9283 (2001).
  22. Khetan, S., Burdick, J. Cellular encapsulation in 3D hydrogels for tissue engineering. J. Vis. Exp. (32), e1590 (2009).
  23. Antonios, M., Kurtis, K., Lucas, K. Drying poly(ethylene glycol). Nat. Protoc. Exchange. , (2012).
  24. Nicolas, J., Mantovani, G., Haddleton, D. M. Living radical polymerization as a tool for the synthesis of polymer-protein/peptide bioconjugates. Macromol. Rapid Comm. 28, 1083-1111 (2007).
  25. Nuttelman, C. R., Benoit, D. S. W., Tripodi, M. C., Anseth, K. S. The effect of ethylene glycol methacrylate phosphate in PEG hydrogels on mineralization and viability of encapsulated hMSCs. Biomaterials. 27, 1377-1386 (2006).
  26. Hern, D. L., Hubbell, J. A. Incorporation of adhesion peptides into nonadhesive hydrogels useful for tissue resurfacing. J. Biomed. Mater. Res. 39, 266-276 (1998).
  27. Andreopoulos, F. M., Beckman, E. J., Russell, A. J. Light-induced tailoring of PEG-hydrogel properties. Biomaterials. 19, 1343-1352 (1998).
  28. Merrill, E. W., Dennison, K. A., Sung, C. Partitioning and Diffusion of Solutes in Hydrogels of Poly(Ethylene Oxide). Biomaterials. 14, 1117-1126 (1993).
  29. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
  30. Weber, L. M., Lopez, C. G., Anseth, K. S. Effects of PEG hydrogel crosslinking density on protein diffusion and encapsulated islet survival and function. J. Biomed. Mater. Res. A. 90A, 720-729 (2009).
  31. Mellott, M. B., Searcy, K., Pishko, M. V. Release of protein from highly cross-linked hydrogels of poly(ethylene glycol) diacrylate fabricated by UV polymerization. Biomaterials. 22, 929-941 (2001).
  32. Watkins, A. W., Anseth, K. S. Investigation of molecular transport and distributions in poly(ethylene glycol) hydrogels with confocal laser scanning microscopy. Macromolecules. 38, 1326-1334 (2005).
  33. Anseth, K. S., Benoit, D. S. W., Durney, A. R. Manipulations in hydrogel degradation behavior enhance osteoblast function and mineralized tissue formation. Tissue Eng. 12, 1663-1673 (2006).
  34. Hillwest, J. L., et al. Prevention of Postoperative Adhesions in the Rat by in-Situ Photopolymerization of Bioresorbable Hydrogel Barriers. Obstet. Gynecol. 83, 59-64 (1994).
  35. Sawhney, A. S., Pathak, C. P., Hubbell, J. A. Bioerodible Hydrogels Based on Photopolymerized Poly(Ethylene Glycol)-Co-Poly(Alpha-Hydroxy Acid) Diacrylate Macromers. Macromolecules. 26, 581-587 (1993).
  36. Skaalure, S. C., Milligan, I. L., Bryant, S. J. Age impacts extracellular matrix metabolism in chondrocytes encapsulated in degradable hydrogels. Biomed. Mater. 7, 024111-0210 (2012).
  37. Hoffman, M. D., Benoit, D. S. Agonism of Wnt-beta-catenin signalling promotes mesenchymal stem cell (MSC) expansion. J. Tissue. Eng. Regen. Med. , (2013).
  38. Sawhney, A. S., Pathak, C. P., Vanrensburg, J. J., Dunn, R. C., Hubbell, J. A. Optimization of Photopolymerized Bioerodible Hydrogel Properties for Adhesion Prevention. J. Biomed. Mater. Res. 28, 831-838 (1994).
  39. Methacrylic Anhydride [Internet]. , Available from: https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=AAAL14357-18 (2013).
  40. Acrylic Anhydride [Internet]. , Available from: http://www.polysciences.com/Catalog/Department/Product/98/productid--40/ (2013).

Tags

Chemistry poly (etylenglykol) peptider polymerisation polymerer methacrylation peptid funktionalisering, MALDI-TOF hydrogeler makromersyntesen
Mikrovågsassisterad funktionalisering av poly (etylenglykol) och On-harts Peptider för användning i Chain Polymerisationer och Hydrogel Bildning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Van Hove, A. H., Wilson, B. D.,… More

Van Hove, A. H., Wilson, B. D., Benoit, D. S. W. Microwave-assisted Functionalization of Poly(ethylene glycol) and On-resin Peptides for Use in Chain Polymerizations and Hydrogel Formation. J. Vis. Exp. (80), e50890, doi:10.3791/50890 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter