Summary
La mezcla es un enfoque eficaz para generar biomateriales con una amplia gama de propiedades y características combinadas. Al predecir las interacciones moleculares entre las diferentes proteínas de la seda natural, nuevas plataformas de aleación de proteínas de seda de seda con la resistencia mecánica sintonizable, respuesta eléctrica, transparencia óptica, procesamiento químico, biodegradabilidad, estabilidad térmica o se pueden diseñar.
Abstract
Las proteínas fibrosas muestran diferentes secuencias y estructuras que se han usado para diversas aplicaciones en los campos biomédicos, tales como biosensores, la nanomedicina, la regeneración de tejidos, y la administración de fármacos. Materiales basados en las interacciones a escala molecular entre estas proteínas Diseñar ayudará a generar nuevos biomateriales aleación proteína multifuncional con propiedades sintonizables. Tales sistemas de materiales de aleación también proporcionan ventajas en comparación con polímeros sintéticos tradicionales debido a la biodegradabilidad materiales, biocompatibilidad, y plausibilidad en el cuerpo. Este artículo utiliza las mezclas de proteínas de seda salvaje tussah (Antheraea pernyi) y seda de mora del interno (Bombyx mori) como ejemplo para proporcionar protocolos útiles con respecto a estos temas, entre ellos cómo predecir las interacciones proteína-proteína mediante métodos computacionales, cómo producir aleación de proteína soluciones, cómo verificar los sistemas de aleación por análisis térmico, y la forma de fabricar materiales de aleación de variablesincluyendo los materiales ópticos con rejillas de difracción, materiales eléctricos con circuitos, recubrimientos y materiales farmacéuticas para la liberación del fármaco y la entrega. Estos métodos pueden proporcionar información importante para el diseño de los biomateriales multifuncionales de última generación basado en diferentes aleaciones de proteínas.
Introduction
La naturaleza ha creado estrategias para generar matrices biológicas sintonizables y multifuncionales utilizando un número limitado de proteínas estructurales. Por ejemplo, elastins y colágenos siempre se usan juntos en vivo para proporcionar las ventajas y funciones ajustables requeridos para tejidos específicos 1,2. La clave de esta estrategia es la mezcla. Blending involucra proteínas mezclado con proporciones específicas y es un enfoque tecnológico para generar sistemas de materiales simples con sintonizable y variadas propiedades 3-5. En comparación con las estrategias de ingeniería sintéticos 6,7, la mezcla también puede mejorar la uniformidad de los materiales y la capacidad de procesar el material debido a la facilidad de operación 8-16. Por lo tanto, el diseño, aleaciones biocompatibles proteínas multifuncionales es un área emergente de la investigación médica. Esta tecnología también proporcionará un conocimiento sistemático del impacto de las matrices de proteínas naturales en las funciones celulares y de tejidos, tanto en vitro e in vivo 10,17. Mediante la optimización de las interfaces moleculares entre diferentes proteínas, materiales de aleación a base de proteínas pueden abarcar una gama de funciones físicas, tales como estabilidad térmica a diferentes temperaturas, elasticidad para apoyar diversos tejidos, sensibilidad eléctrica en los órganos variables, y las propiedades ópticas de la córnea para la regeneración del tejido 3, 18-27. El resultado de estos estudios proporcionará una nueva plataforma de proteína-materiales en el campo de la ciencia biomédica de importancia directa para las reparaciones de tejido sintonizables y tratamientos de la enfermedad y, además, llevar a los dispositivos de implantes biodegradables en sus nuevas funciones terapéuticas y de diagnóstico se puede prever 3.
Muchas proteínas estructurales naturales tienen propiedades físicas y bioactivos críticos que pueden ser explotadas como candidatos para las matrices de biomateriales. Sedas de diferentes especies de gusanos, queratinas de los pelos y lanas, elastins y colágenos de diferentes tejidos, ydiversas proteínas vegetales son algunas de las proteínas estructurales más comunes que se utilizan para el diseño de materiales a base de proteínas variables (Figura 1) 18-27. En general, estas proteínas pueden formar diferentes estructuras moleculares secundaria (por ejemplo, láminas beta para sedas, o enrollado de las bobinas para queratinas) debido a sus únicas secuencias de ácido repetitivas amino primarios 3,28-35. Estas características promueven la formación de estructuras macroscópicas auto-ensambladas con funciones únicas en las interfases biológicas que provocó su utilidad como un recurso preciado de materiales de biopolímero. Aquí, se utilizaron dos tipos de proteínas estructurales (proteína A de la seda tussah salvaje y la proteína B de la seda de morera domesticado como un ejemplo) para demostrar los protocolos generales de la producción de diversos biomateriales de aleación de proteína. Los protocolos demostrados incluyen parte 1: predicciones de interacción de proteínas y simulaciones, parte 2: la producción de soluciones de aleación de proteína, y parte 3: fabricación de aleación de proteínasistemas y para aplicaciones ópticas, eléctricas y farmacéuticas.
Figura 1. Las materias primas de diversas proteínas estructurales que se utilizan comúnmente en nuestro laboratorio para el diseño de materiales a base de proteínas, incluyendo las sedas de diferentes especies de gusanos, queratinas de los pelos y lanas, elastins de diferentes tejidos, y varias proteínas vegetales.
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Protocol
1. Predicción de interacciones de proteínas
- Análisis Bioinformática de moléculas de proteína
- Visite el sitio web del Centro Nacional de Información Biotecnológica (www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/), y buscar los nombres de las proteínas que se utilizarán para el estudio de la aleación. Nota: Para este ejemplo, se usaron dos proteínas: la proteína A, que es la fibroína de seda tussah salvaje, y la proteína B, que es la fibroína de seda de morera doméstica. Para la proteína A, las secuencias de aminoácidos se pueden encontrar en "fibroína [Antheraea pernyi] GenBank: AAC32606.1" (Antheraea pernyi es el chino (Oak) tusor polilla). Para la proteína B, las secuencias de aminoácidos se pueden encontrar en "precursor de la fibroína de cadena pesada [Bombyx mori] NCBI Secuencia de Referencia: NP_001106733.1" y "precursor de la fibroína de cadena ligera [Bombyx mori] Secuencia de Referencia del NCBI: NP_001037488.1" juntos (Bombyx mori es el gusano de seda domesticada de la morera).
- Seleccione y save las secuencias de aminoácidos de la proteína A y la proteína B de la base de datos.
- Visita el sitio web de ExPASy (el Portal de Recursos Bioinformática SIB) (www.expasy.org) o utilizar otro software comercial para el cálculo de los datos de Bioinformática básicos de las proteínas sobre la base de sus secuencias, incluyendo, pero no limitado a, la carga total por molécula, el índice de hidrofobicidad de la molécula, curva de valoración de las moléculas a diferentes valores de pH, etc Esta información se utilizará como elementos básicos para la simulación computacional de interacciones de proteínas, y le ayudará a entender si estas dos proteínas tienen interacciones fuertes. [Nota: Este paso no es para predecir con precisión todos los detalles de la interacción de proteínas como las que se utilizan en pequeños péptidos o proteínas de la ciencia funcional. El propósito de esta sección es sólo para evitar la producción de una mezcla de proteínas con separaciones macrofase obvias que no se puede llamar un material "aleación". Por lo tanto, la estimación podría ser aproximada pero ªsistema de aleación proteína E se puede verificar mediante un método experimental descrito en el paso 3.1 utilizando análisis térmico preciso].
- Simulación Computacional de Proteínas sistema de aleación
A continuación se describe un procedimiento para simular el sistema de aleación de proteínas. Un programa de simulación está escrito en lenguaje de programación C que se puede utilizar en un sistema informático único o multiprocesador. Un modelo de celosía-masa-resorte (LSM) se utilizó para simular la aleación proteínas 36-39. El modelo LSM da una descripción simple de la fuerza neta sobre la masa cuando está unido a un resorte y se puede resolver la ecuación de la fuerza para entender el movimiento para cada masa. Un algoritmo sencillo programa para modelar este sistema de aleación de proteínas utilizando el modelo LSM se da como sigue:- Representar a una sola proteína como una partícula de grano grueso que tiene una masa de m.
- Utilice un Hookean o un resorte-neo Hookean para representar un enlace 38,39. Mediante la interrelación de un número finito de partículas con muelles, uno puede make un dominio sub-aleación que representa un bloque de construcción estable de la aleación de las proteínas. Para representar los diferentes tipos de bonos en el intra-vinculación, utilice diferentes constantes de resorte / rigidez.
- Modelar el sistema de aleación de proteína como un material compuesto de débilmente reticulados sub-aleaciones. De nuevo aquí se utilizaron diferentes rigideces para representar diferentes enlaces entre las interrelaciones de los sub-aleaciones.
- Modelar la ruptura de bonos y el proceso de reforma por un modelo de Bell 40,41, a través del cual se permiten enlaces débiles que reformar pero fuertes lazos no pueden reformar una vez que se rompen. Cuando el sistema se destacó lo suficiente (tanto en los bonos intra-e inter-suballoy suballoy), los bonos pueden dividirse y reformarse.
- Con el fin de estudiar los efectos de deformación de la aleación proteínas cuando están estresados, aplicar fuerzas externas al sistema. Distribuir estas fuerzas por igual a cada partícula en la resolución de la ecuación de fuerza (Leyes del Newton).
- Para modelar las interaccionesentre la solución (tales como moléculas de agua) y las proteínas, aplicar una fuerza de arrastre adicional o fuerza de fricción a cada partícula.
- Resolver la ecuación de la fuerza para cada partícula con las acciones de cada fuerza (la fuerza del resorte de la unión, la fuerza externa, y la fuerza de fricción).
- Calcular y extraer las posiciones de las partículas de proteína como una función del tiempo.
- Calcular las cantidades físicas que caracterizan la aleación proteínas de las posiciones de las partículas.
- Cambie la rigidez de bonos en el programa para entender las interacciones entre diferentes proteínas. (La rigidez media de enlace se calcula a partir del módulo de Young de los materiales de proteínas. El módulo de Young de diferentes materiales fibrosos de proteínas se puede conseguir ya sea por la tracción de prueba universal 18, o directamente desde las literaturas anteriores 2-4,18).
2. Producción de Proteínas Soluciones de aleación
Seda salvaje tussah (proteína A) y de la seda de mora doméstica (proteína B) se seleccionan aquí como un ejemplo de sistema de aleación de proteínas. Este protocolo presenta primero la forma de obtener la solución de seda tussah salvaje (proteína A).
- Cortar capullos de seda tussah salvajes primas o fibras con un peso de 3 g.
- Mida 3 g de dicarbonato de sodio o carbonato de sodio (Nota: Si se utiliza carbonato de sodio, el peso molecular de las cadenas de proteínas reducirá durante el proceso de ebullición 42).
- Llene un vaso de vidrio de 2 L con agua destilada (H 2 O). Luego, coloque el vaso de vidrio en un escenario caliente, cubrir con papel de aluminio, y llevar a ebullición.
- Quite la cubierta de papel de aluminio y añadir el bicarbonato de sodio medido lentamente en el agua hirviendo, lo que permite que se disuelva por completo. (Nota: El papel de bicarbonato de sodio es el "jabón" para limpiar las proteínas sericina solubles y otras impurezas unidas en la superficie de las fibras de seda salvaje Si utiliza oth.er fibras de proteína naturaleza, por favor seleccionar agentes químicos correspondientes de acuerdo a la literatura).
- Añadir las fibras de proteína primas (fibras de seda salvaje) en el agua hirviendo y dejar hervir durante 2-3 horas (Nota:. El tiempo de ebullición tiene impacto crítico en el peso molecular de las cadenas de proteínas 26,43 Uno debe seleccionar el momento apropiado de acuerdo a la literatura o mediante la realización de experimentos de control 26,43. La temperatura de ebullición también podría ajustarse para afectar el peso molecular de las cadenas de proteínas 26,43,44).
- Después de hervir, retirar con cuidado las fibras de proteína con una espátula de la solución y exprimirlos para quitar el exceso de agua. (PRECAUCIÓN: Las fibras son muy caliente!)
- A continuación, sumergir las fibras en un vaso de precipitados de 2 L con agua destilada fría, y lavar las fibras de dos veces durante 30 minutos cada uno para eliminar completamente los residuos impuros de la superficie de la fibra. Seque las fibras en una campana de extracción durante al menos 12 horas.
- Derretir 45,784 g de nit calciotasa (Ca (NO 3) 2) en un vaso de precipitados de vidrio para formar un líquido a 65 ° C para disolver las fibras de proteína de seda salvajes. (Nota: Si se utilizan otras fibras de proteína natural, seleccione un disolvente correspondiente para disolver las proteínas Aquí también se puede utilizar la solución 9,3 M LiSCN o LiBr, o una solución de fosfato de 85% para la disolución de las fibras de seda diferentes..)
- Combinar las fibras y el disolvente en una proporción de 1 g de fibra en 10 ml de disolvente. Permitir que las fibras se disuelven a 95 ° C durante 5 a 12 hr. (Nota: El tiempo de disolución depende del peso molecular de las proteínas 26,43-45)
- El uso de jeringas, inyectar la solución salvaje de seda en 12 ml casetes de diálisis (máximo 1000 MW como el tamaño de corte) o tubos de diálisis sellados (máximo 1000 MW como el tamaño de corte) y se dializa frente a 2 l de agua destilada. (Nota: La inyección es más eficiente si manteniendo la solución a 35 ° C, de lo contrario la viscosidad de la solución de proteína aumentará dramáticamente a temperatura ambiente). Cambie el agua destilada con frecuencia para quitar Ca (NO3) 2 disolventes en la solución (después de 30 minutos, 2 horas, 6 horas, y después cada 12 horas durante 3 días. En total, habrá aproximadamente 8 cambios de agua).
- Después de 3 días, recoger las soluciones de proteínas a partir de los casetes de diálisis o tubos y colocar en 13.000 tubos velocidad nominal.
- Centrifugar las soluciones durante 1 hora a 3500 rpm a 4 ° C para eliminar los depósitos 3x. Después de cada ejecución centrífuga, tire rápidamente el sobrenadante en tubos nuevos. Guarde las soluciones finales en un refrigerador 4 ° C.
- Vierta 5 ml de solución de proteína en un polidimetilsiloxano (PDMS) sustrato u otro sustrato hidrofóbico plana y deje que se seque completamente (esto suele tardar más de 12 horas). Pesar la película de proteína sólida restante y calcular la concentración de la solución final por porcentaje en peso (w / v%) = peso medido (en mg) ÷ 5 (en ml) ÷ 10.
- Recoge otra fibra proteína natural seleccionado (en este case, seda de mora casero se usó como la proteína de B), y repetir el proceso anterior con un "jabón" apropiado y disolución de disolvente, hasta que se obtiene la solución de proteína final de agua con concentración medida. [Nota: Si los materiales de proteínas se encuentran en forma de polvo, utilizar tubos o membranas porosas adecuadas para mantener las muestras durante el proceso de "enjabonado". Si la proteína ya ha sido purificada, vaya directamente al paso 2.8 para disolver el polvo. Si la proteína ya ha sido purificada y es soluble en agua, que su solución acuosa con una concentración deseada y luego vaya al paso 2.15 a continuación para hacer soluciones de proteínas de fusión.]
- Diluir lentamente la solución de Proteína A (solución de seda aquí salvaje) en agua destilada a 4 ° C para formar una proteína de 1,0% en peso de una solución acuosa. Haga el mismo proceso para la proteína B (seda aquí domesticado).
- Mezclar lentamente la proteína 1% en peso de una solución con una solución de proteína B a las 4 ° C con una pipeta para evitar protein la agregación durante la mezcla. (Nota 1: No utilice un instrumento vortex para mezclar las proteínas ya que algunas proteínas (por ejemplo, sedas) formarán hidrogeles durante la vibración 46,47 Nota 2:. Si es posible, utilizar dispositivos adicionales para controlar la velocidad de mezcla y fabricación de tamaño mezclado Asegúrese de mezclar lo más lento posible para evitar la agregación. No pipetear rápidamente la solución durante la mezcla).
- Las soluciones finales de mezcla deben tener una relación de masa especificada o una relación molar de la proteína A: Proteína B. Típicamente, la mezcla con relación de masas de 90:10, 75:25, 50:50, 25:75, 10:90 para obtener un amplio espectro de soluciones de aleación. Utilice soluciones puras de proteína A y la proteína B como controles. Para una solución de mezcla con una relación molar de la proteína A: B = Proteína R: (100-R). Calcular la proporción de volumen de mezcla (basado en una misma solución de 1% en peso) por: Volumen A: Volumen B = R · (MW de A): (100-R) · (MW de B).
- Emitir inmediatamente las soluciones finales a sustratos PDMS para formar películas u otros desimateriales señados. (Nota: No almacene soluciones de aleación de proteínas de alta concentración durante mucho tiempo Más agregados pueden formar más tarde debido a las interacciones proteína-proteína en agua.). Si es necesario, diluir las soluciones de mezcla con agua destilada libre de iones y mantenerlos en un refrigerador 4 ° C para evitar la agregación de proteínas adicionales en soluciones.
3. fabricación de proteínas Variable Materiales aleación
- Confirmar aleación Predicción por análisis térmico 3,9,31-35
- Preparar sustratos PDMS y limpiarlos por inmersión en agua destilada.
- Reparto de las soluciones de mezclas de proteínas con diferentes proporciones de mezcla sobre los sustratos de PDMS.
- Secar las soluciones durante al menos 12 horas en una campana química con el flujo de aire hasta que se forman películas (Nota: Utilice el mismo volumen para diferentes soluciones de modo que el espesor de las películas puede ser fijo).
- Quite las películas de aleación de proteínas a partir de los sustratos de PDMS y colocarlos en platos limpios.
- Pesar muchos calorimetría diferencial de barrido (DSC) cacerolas de aluminio y tapas para el estudio DSC. Coinciden con los pares de giro horizontal y tapas dispongan de un peso total equivalente (peso de la bandeja con el peso de la tapa es igual a un peso constante). Por ejemplo, se utilizó aquí un peso total de tapa y sartén 22,50 mg, y se prepararon ocho conjuntos de tapa y sartén combinaciones con este peso total.
- Encapsular 6 mg cada tipo de proteína seca se mezcla en los moldes de aluminio de DSC y sellarlos con sus tapas emparejados en proceso 3.1.5. Sellar la olla vacía y par tapa para ser utilizado con la muestra como la referencia de modo que sólo la capacidad calorífica de muestras a sí mismos se grabará durante el análisis térmico (Nota: La DSC comparará la capacidad calorífica del platillo de referencia + tapa vs. que de muestra + pan + tapa. Debido a los pesos iguales, la capacidad de calor de fondo de las sartenes y tapas se contabilizará dejando sólo la capacidad calorífica de la muestra en el recipiente).
- Ponga las referencias sellados y sartenes de muestra en un instrumento DSC, conpurgado flujo de gas nitrógeno seco de 50 ml / min, y equipado con un sistema de enfriamiento refrigerado. Antes de las mediciones de la muestra, el instrumento DSC primero debe ser calibrado con zafiro y el indio para el flujo de calor y la temperatura, respectivamente.
- Pre-ejecutar el DSC a una velocidad de calentamiento de 2 K / min hasta 150 ° C y luego mantener a esta temperatura durante 15 minutos para eliminar cualquier resto de las moléculas de agua en las muestras (típicamente alrededor de 3-10% del peso total). Enfriar rápidamente hacia abajo (10 K / min) a 25 ° C.
- Ejecutar el DSC de nuevo a una velocidad de calentamiento de 2 K / min hasta 300 ° C, o hasta que el pico de la degradación de las mezclas de proteínas parece 34. Registre las capacidades caloríficas de la muestra de proteína a diferentes temperaturas durante este proceso. Enfríe la DSC y cambiar la vieja muestra de una nueva muestra con una relación de mezcla diferente.
- Calcular y trazar la Capacidad de Calor vs curvas de temperatura para cada muestra de mezcla de proteína utilizando el software DSC 31-35.
- Juzgar la miscibility de mezclas de proteínas por el método siguiente (Ver Figura 4 térmica y la Figura 5) y si las dos proteínas son totalmente miscibles, que puede ser llamado "aleaciones de proteínas". De lo contrario, el término "compuesto de proteínas" sería un nombre adecuado de acuerdo con las teorías descriptivas de polímeros 48,49):
- Las proteínas individuales A y B deben tener única temperatura de transición de vidrio individuales, T g (A) y T g (B) (Véase las curvas verdes y azules en la Figura 5) 3,48;
- Esta única temperatura de transición vítrea normalmente es intermedia entre las de los dos componentes individuales de proteínas, T G (A) y Tg (b) (véase la Figura 5) 3,48;
- La separación de fases no es miscible mezclas se obtiene si tanto Tg (A) y T g (B) aparecieron en sus posiciones originales (Figura 5), y con cada paso g Taltura en proporción a la composición, las dos proteínas son completamente inmiscibles 3,48.
- Semi-miscible mezcla compuesta de tipo tendrá un muy amplio de transición vítrea, o puede tener todavía dos transiciones vítreas, pero cada uno ha migrado más cerca el uno al otro con respecto a los componentes de las proteínas puras, T G (A) y T G (B) ( véase la Figura 5). En este caso, puede haber estructuras de fase micro-heterogéneos formados entre los dos componentes de la proteína, y la composición puede variar de un lugar a otro.
- Si (3.1.11.1) es el caso mostrado en la DSC, y se puede confirmar que la proteína AB es un sistema de aleación, luego pasar a fabricar materiales de aleación de proteínas.
- Fabricación de Materiales Ópticos por aleaciones de proteínas
- Producir (en el laboratorio de fabricación) o comprar una superficie topográfica diseñada para la fundición. En este ejemplo específico, se utilizó un vidrio con cuatro patrones de difracción (Figura 4Optical).
- Coloque el vaso con patrones de difracción en un plato, y asegúrese de que la superficie modelada se enfrenta hacia arriba.
- Spread solución de PDMS de manera uniforme sobre la superficie del vidrio, y cubrir completamente los patrones de superficie (PDMS La solución se hace por encapsulamiento y la solución de catalizador en un 9: relación de mezcla 1 de acuerdo con la instrucción del usuario 23,44).
- Coloque el plato de fundición en un horno de 65 ° C durante al menos 2 horas, mientras que en una superficie plana. La solución de PDMS debe secarse en un sustrato sólido durante este proceso.
- Eliminar sustrato PDMS desde el cristal. Los patrones de difracción ahora deben ser transferidos a la superficie de PDMS.
- Rompa los moldes de PDMS con patrones de difracción utilizando una perforadora adecuada.
- Caída soluciones de aleación de proteínas en la superficie de PDMS con patrones de difracción, y secarlos durante al menos 12 horas para obtener películas con patrones de difracción.
- Para obtener materiales de aleación de proteínas insolubles, coloque todo el conjunto de drY películas, incluidos los moldes de PDMS en un horno de vacío a 60 ° C (25 kPa) con un plato de agua en la parte inferior de la cámara. Bombear aire en el horno, y dejar que las muestras de recocido vapores de agua por lo menos durante 2 horas. (Este proceso se llama recocido de vapor de agua de temperatura controlada 45. Comparando con el método metanol ampliamente utilizado, puede generar contenido similar de lámina beta en los materiales de seda 45). Cortar el vacío y retire la película insoluble en agua del sustrato PDMS utilizando pinzas. Para este ejemplo, se utilizan aleaciones de seda de seda domesticados salvajes.
- Prueba de la calidad de los patrones de difracción en películas, comparándolos con los patrones originales en el cristal (por ejemplo, recoger imágenes de SEM para los detalles micro-escala; recoger patrones de difracción láser para la calidad patrón general).
- Fabricación de circuitos eléctricos en proteínas Materiales Aleaciones
- Para fabricar un patrón de circuito eléctrico sobre el sustrato de vidrio, primero CLEAna portaobjetos de vidrio utilizando algún desengrasante disolvente tal como Alconox en un limpiador ultrasónico durante 5 min, seguido por 5 min en acetona, seguido por 5 min en metanol. El metanol se utiliza el pasado, ya que se evapora más lentamente que la acetona lo que puede ser arrancado el sustrato en lugar de secado y los residuos que dejan.
- Blow el portaobjetos de vidrio seco usando gas nitrógeno seco que se genera por la evaporación de un 180 L Dewar de nitrógeno líquido.
- Dar a conocer los materiales de sustrato en la cámara de deposición. (Estas directrices son para un sistema de pulverización catódica, pero otras técnicas de deposición se podrían utilizar.) Si la cámara está diseñada con una carga cerrada, el vacío en la cámara de deposición no se ve afectada de forma significativa. Evacuar la carga cerrada a una presión de 30 mTorr.
- Abrir la válvula de compuerta entre la esclusa de carga y la cámara principal de deposición e introducir el sustrato en la cámara.
- Encienda el gas Ar y el regulador de presión y controlar la presión a la depositio deseadapresión n. Presiones más altas dan energía farfulló inferiores átomos de metal y películas más uniformes mientras que las presiones más bajas dan mejores adherir películas más rápido depositadas. La gama de presiones es generalmente de entre 3 mTorr y 60 mTorr, con 20 mTorr funcionando bien.
- Los metales son entonces proyectadas sobre un obturador que protege el sustrato de recubrimiento utilizando una potencia de RF de 100 W. Se requiere un circuito de sintonización para dirigir la potencia de RF a la diana de metal. De alimentación de CC podría ser utilizado en lugar de RF para objetivos metálicos. Con el fin de eliminar capas de óxido y contaminantes de la diana, pre-pulverización catódica durante varios minutos.
- Abrir el obturador y el metal por pulverización catódica sobre el sustrato. La velocidad de deposición para la configuración descrita es de aproximadamente 10 nm por min. Esta tasa dependerá de la distancia, presión, fuerza del imán de trabajo en el cátodo de magnetrón, espesor objetivo y el metal pulverizado. Ajustar el tiempo de deposición para conseguir el espesor deseado.
- Retire la lámina de vidrio revestida de lacámara.
- El uso de un spinner, girar un recubrimiento de resina fotosensible sobre la superficie de la película. Muchas resinas se pueden utilizar. Para este caso, se utilizó fotoprotector positivo.
- Después de la resisten sea hilado sobre la película, hornear suave a 90 ° C durante 5 minutos para secar la capa protectora.
- Coloque una máscara de contacto con una imagen del dispositivo firmemente contra el resistir. Una fuente de luz UV se utiliza para exponer el fotorresistente. La exposición es 10 segundos, pero varía dependiendo de la fuerza de la fuente de luz y la capa protectora utilizado.
- Coloque la película en el revelador fotoprotector hasta que aparezca la imagen proyectada. Los lavados de desarrolladores de distancia del resisten que fue expuesto a la luz UV que causan la ruptura de los enlaces del polímero. Inmediatamente después de que aparezca la imagen, sumergir la película en agua DI para detener el desarrollador de trabajar en la fotoprotección no expuesta.
- Blow las películas secas con gas nitrógeno seco.
- Coloque las películas en un horno a 120 ° C durante 15 minutos para "hornear dura" la fotoresistir.
- Después de las películas se enfrían, colocarlos en una solución de ataque hasta que el metal no protegido por el fotoprotector despega. Dip en agua para detener el grabado.
- Enjuague con acetona para eliminar la resina fotosensible endurecida.
- Enjuague con metanol y secar con nitrógeno seco.
- Una vez que los vidrios de capas están listos, la caída de diferentes soluciones de aleación de proteínas en las superficies de vidrio, y seque por lo menos durante 12 horas para obtener películas de aleación de proteínas en los vasos. (Se sugiere concentrarse primero las soluciones de aleación a 5% en peso para obtener películas de aleación de proteína de espesor.)
- Debido a las interacciones hidrofóbicas hidrófilo-, las películas metálicas delgadas se transferirán de las superficies de vidrio a la aleación de la proteína unida película de superficies 51. Despegar las películas de aleación de proteínas con los patrones de metal fino de los sustratos de vidrio utilizando fórceps.
- Para obtener materiales de aleación de proteínas insolubles, coloque las películas secas en un horno de vacío a 60 ° C (25 kPa) con awater plato en el fondo de la cámara. Bombear aire en el horno, y dejar que las muestras de recocido vapores de agua por lo menos durante 2 horas. Cortar el vacío y retire la película insoluble en agua del sustrato utilizando pinzas.
- Pon a prueba las cualidades eléctricas de los patrones de metal en las películas de aleación de proteínas, tales como la resistencia eléctrica y compararlos con los patrones originales en el cristal.
- La fabricación de materiales farmacéuticos por aleaciones de proteínas
- Para fabricar unas películas de aleación de proteínas con compuestos farmacéuticos, primero preparar un sustrato PDMS como se describe en el paso 3.2. Limpie el sustrato PDMS formado por agua destilada.
- Disolver o dispersar los compuestos farmacéuticos en una solución acuosa. Usar ultrasonido o vortex para mezclar homogéneamente los compuestos farmacéuticos con el agua. Si los compuestos no son solubles en agua, se dispersan los polvos con una distribución homogénea en el agua destilada libre de iones.
- Calcular la relación masa deseadade los compuestos para las aleaciones de proteínas por: volumen de la solución del compuesto x porcentaje de peso de solución de compuesto: volumen de solución de proteína de aleación de x porcentaje en peso de solución de compuesto (se utilizó aquí solución 1% en peso de la aleación). Seleccionar una relación para obtener una película con una densidad compuesto deseado en la película de aleación de proteína.
- Mezclar lentamente la solución del compuesto con la solución de aleación de proteínas siguiendo las mismas instrucciones de la sección 2 proceso de 2.16. (Nota: Para evitar la gelificación, no ultrasonicate o vórtice de la solución durante la mezcla).
- Verter un volumen calculado de la mezcla sobre el sustrato de PDMS y secar por lo menos 12 horas en una campana química para obtener una película de aleación de proteína que contiene una relación diseñada de compuestos farmacéuticos.
- Físicamente reticulado la película siguiendo la misma instrucción en la Sección 3.2 Proceso 3.2.8. Un ejemplo de películas de aleación con fármacos modelos insolubles de una densidad baja (LD) o un alto (HD) densidad podría ser visto en la Figura 4
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Representative Results
Típica interacciones proteína-proteína (por ejemplo, entre la proteína A y proteína B) pueden contener carga-carga (electrostáticas) lugares de interés, la formación de enlaces de hidrógeno, interacciones hidrofóbicas hidrófilo-, así como dipolo, disolvente, contraión, y los efectos entrópicos entre la específica dominios de las dos proteínas (Figura 2) 3. Por lo tanto, en lo fundamental, podemos predecir los efectos de estas interacciones mediante simulaciones computacionales.
Figura 2. Las interacciones entre la proteína A y la proteína B. Típicamente, estas interacciones podría basarse en carga-carga (electrostáticas) lugares de interés, la formación de enlaces de hidrógeno, interacciones hidrófobas o hidrófilas-entre los dominios específicos de estas dos proteínas.
La aleación de proteínassistema puede ser modelado como un material compuesto de sub-dominios de aleación de proteína reticulada, donde cada uno de estos sub-aleaciones se supone que es estable. Las interacciones entre las proteínas (A y B) se pueden considerar como los bonos con diferentes rigideces (para este estudio, consideramos sólo dos tipos de enlaces débiles o fuertes en la Figura 3). Los enlaces débiles podrían representar los enlaces de hidrógeno y otros bonos descritos en la Figura 2. La aleación de proteína en su conjunto se forma a través de dos enlaces cruzados entre muchos sub-aleaciones que rodeaban juntos a través de ambos lazos fuertes y débiles. Los sub-aleaciones se forman utilizando lazos fuertes y dentro de los sub-aleaciones que permiten la formación de enlaces más débiles. La proteína de aleación en su conjunto se forma a través de dos enlaces cruzados entre muchos sub-aleaciones tradicionales que unen a través de varios lazos fuertes y débiles. Cuando el sistema se destacó lo suficiente, bonos, tanto los débiles y los fuertes se rompen. Bajo condiciones adecuadas los enlaces débiles se les permitereformar los vínculos de nuevo. Sin embargo, los lazos más fuertes se rompen de manera irreversible. La existencia de los enlaces débiles permite que el contenido de proteínas de aleación para mantener su integridad estructural bajo estrés externo 36-41. Esta simulación numérica utiliza un modelo matemático desarrollado a través de un enfoque de abajo hacia arriba que se basa en métodos de elementos finitos a través de modelo de celosía de primavera 36-41.
Figura 3. simulación computacional para demostrar la ventaja mecánica de un sistema de aleación de proteína durante el estiramiento. Durante la simulación de estiramiento, un tipo de proteína (color azul) puede formar una red elástica como resortes que proporcionan super-elasticidad para los materiales, mientras que otro tipo de proteínas (color verde) puede proporcionar fuertes reticulantes físicos para la estabilización de la red material. Stru dinámicotransiciones ctural (por ejemplo, formaciones de enlace de hidrógeno y deformaciones) podrían ser inducidos en diferentes dominios para almacenar y liberar energía o proporcionar soporte mecánico adicional durante el estiramiento.
La Figura 3 muestra una simulación computacional típico de las propiedades mecánicas de un sistema de aleación de proteína (con seda tussah salvaje como la proteína A y la seda de morera domesticado como proteína B) durante el estiramiento. Durante la simulación de estiramiento, un tipo de proteína (color azul) puede formar una red elástica con resortes que proporcionan super-elasticidad para los materiales, mientras que otro tipo de proteína (color verde) puede servir como partículas con fuertes reticulantes físicos para la red de material. Transiciones estructurales dinámicos (por ejemplo, formación de enlaces de hidrógeno y de deformación) puede ser inducida en diferentes dominios para almacenar y liberar energía o proporcionar soporte mecánico adicional durante el estiramiento. Los estudios de simulación dansa foto teórico general para comprender las interacciones entre diferentes moléculas de proteínas estructurales, tales que los pares útiles de proteínas podrían ser recogidos para generar materiales de aleación de proteínas con interacciones fuertes y propiedades específicas, tales como la extraordinaria elasticidad mecánica.
Generalmente, una vez que la proteína A y B se seleccionan (aquí están seda salvaje y seda domesticado), una solución de aleación de proteína puede ser producida en varios pasos (Figura 4). En primer lugar, las fuentes de proteínas como fibras naturales o polvos deben limpiarse o purificarse. Por ejemplo, un proceso de desgomado podría ser utilizado para eliminar la sericina de seda solubles en proteínas recubiertas en la mayoría de las fibras de fibroína de seda 20. En segundo lugar, un disolvente adecuado es necesario encontrar para disolver las fuentes de proteínas insolubles en soluciones. Por ejemplo, la solución de LiBr alta concentración es un buen disolvente para cortar beta-hoja de estructuras secundarias en diferentes sedas y disolver las fibras en soluciones.En tercer lugar, un método de diálisis se puede utilizar para eliminar la disolución de disolvente y recuperar las moléculas de proteína en una solución acuosa. Centrifugación adicional es a menudo necesario para eliminar las impurezas y agregados no disueltos en la solución. Finalmente, las soluciones acuosas de proteínas diferentes se pueden mezclar suavemente con diversas proporciones. Por lo tanto, si las dos soluciones de proteínas no tienen separación macrofase, serán mezclados juntos con interacciones fuertes y formar nuevo sistema de aleación de proteína para diferentes aplicaciones biomédicas. Para hacer que los materiales de aleación de proteína insoluble en el cuerpo, diferentes tratamientos de reticulación físicos o químicos pueden ser adaptados. Por ejemplo, se ha encontrado que la alta temperatura y de alta presión de recocido vapor de agua podía diferentes materiales de seda o de elastina increíblemente de reticulación 6,52. Mientras que diferentes materiales de queratina se pueden reticular por sus enlaces disulfuro natural en las cadenas laterales de la proteína 53.
Una vez que el psoluciones de aleación rotein se producen y verificados, que se pueden formar en una amplia gama de biomateriales con propiedades sintonizables, incluyendo matrices de materiales para aplicaciones térmicas, mecánicas, ópticas, eléctricas, químicas, o biomédicas (Figura 4). En este artículo, tres aplicaciones emergentes para estos materiales para demostrar la ventaja única de biomateriales de aleación de proteínas han sido seleccionados (Figura 4). A través de técnicas de microfabricación modernas, diferentes patrones de superficie se pueden generar en micro o nano-escala de materiales de aleación de proteína (Figura 4 aplicación óptico). Por ejemplo, si un patrón de difracción óptica se produce en la superficie de la película, esta película se puede utilizar como un medio para transferir haces de láser en diferentes patrón óptico 22,23. Si se surgió el material de aleación de proteína en una solución de enzima, el perfil de degradación de las películas se puede entender mediante la comparación de los patrones de difracción en tiempo real de la películacon el patrón original (en lugar de hacia atrás y adelante de lavar y el examen de las películas degradadas en el aire). Otra técnica emergente es para recubrir diferentes circuitos micro-escala y resonadores inalámbricos en los materiales de aleación de proteína (Figura 4 aplicación eléctrica). A través de esta técnica, micro-corrientes de tejidos u órganos dañados in vivo pueden ser monitoreados, con señales inalámbricas transfieren directamente a los médicos 24,51. Y el material de dureza mecánica y biodurabilidad en el cuerpo pueden ser fácilmente controladas por relaciones de mezcla y componentes específicos de proteínas de los materiales. Finalmente, los diferentes fármacos para el cáncer soluble o insoluble se pueden incorporar directamente en los materiales de aleación de proteína (Figura 4 aplicación química). Medicamentos contra el cáncer son a menudo muy tóxicos, y pueden dañar no sólo las células cancerosas, pero también el sistema inmunológico humano normal. Por lo tanto, el control de la región y la dosis de administración de fármacos de cáncer por día en el cuerpo es uno de tque los temas más importantes de la ciencia farmacéutica. A través de la incorporación de fármacos contra el cáncer en materiales de aleación de proteína, podemos implantar el material sólo en tejidos de cáncer u órganos, y controlar la velocidad de liberación del fármaco contra el cáncer por día desde la red de aleación de proteína mediante el control de los componentes proteicos y relaciones de mezcla. Dado que la matriz de proteína es totalmente biodegradable, los materiales de aleación de proteína serán eliminados automáticamente por las enzimas del cuerpo después del período de liberación del fármaco. Los residuos de materiales de aleación de proteínas son puramente aminoácidos, que pueden ser absorbidos por el cuerpo de forma natural para producir más otras proteínas esenciales in vivo. Los pacientes que se curan por la liberación controlada de fármacos contra el cáncer a partir de materiales de aleación de proteína implantados finalmente recuperado sin aditivos en el cuerpo, y ambas matrices de aleación de proteínas naturales y medicamentos contra el cáncer serán absorbidos eficientemente en el cuerpo durante el proceso de curado.
Figura 4. pasos generales para producir un material de aleación de proteínas, incluyendo la limpieza o purificación de las fuentes de material de proteína, la disolución de los materiales de proteínas insolubles en soluciones, dianalysizing para eliminar la disolución de disolvente de una solución acuosa de proteínas, la centrifugación y mezcla junto con diferentes proporciones, y tratamientos de reticulación físicos o químicos. La solución aleación proteína posteriormente se puede formar en una amplia gama de biomateriales con propiedades sintonizables, incluyendo materiales para matrices térmicas, mecánicas, ópticas, eléctricas, químicas o aplicaciones biomédicas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Aquí, hemos demostrado los procedimientos críticos de cómo fabricar materiales eléctricos en proteen aleaciones con detalles en la Figura 5. películas metálicas delgadas, tales como circuitos eléctricos se pueden crear usando varias técnicas de deposición diferentes, incluyendo la evaporación, ablación láser, o farfulla. Sputtering fue seleccionado para el estudio actual, ya que ofrece una flexibilidad significativa para la energía de las especies chisporroteaban a través del ajuste de la presión del gas de pulverización catódica y potencia aplicada al cátodo, así como la uniformidad de la deposición a través del ajuste de la presión del gas y el tamaño del cátodo. Deposición catódica puede ser usado para proyectar una película metálica sobre un sustrato de vidrio (Figura 5A). En este caso, las películas de circuito Ag se depositaron en una cámara de alto vacío con una presión base de aproximadamente 1 x 10 -7 Torr. El gas de bombardeo iónico Ar se introduce en la cámara a una presión de 20 mTorr y la Ag se depositó usando un generador de RF a 100 W durante 20 min a partir de un cátodo de magnetrón planar 2 pulgadas que es de 8 cm de la superficie del sustrato. Los dispositivos son defined usando técnicas de fotolitografía comunes en las películas sobre vidrio, seguido por ataque químico húmedo (véase el procedimiento detallado en la Figura 5A). Los dispositivos también pueden ser definidos por deposición a través de una máscara física directamente sobre las películas de proteína. La resistividad eléctrica a temperatura ambiente de los circuitos eléctricos de las películas de proteína se midió utilizando ambas técnicas de dos terminales y de cuatro terminales. La ventaja del enfoque de cuatro terminal es para eliminar la resistencia de contacto de la medición, pero encontramos que la resistencia de contacto no es significativa por lo que una medición de dos terminales es suficiente. Las dos medidas terminal utiliza un multímetro de buena calidad situado en la toma de contacto escala de ohmios con la película en ambos extremos del alambre metálico (mostrado esquemáticamente en la Figura 5B). En esta medición, el multímetro sirve como una fuente de corriente y un voltímetro y la resistencia medida es la tensión dividida por la corriente. La resistividad se calcula utilizandoρ = RA / l, donde R es la resistencia, A es el área de la sección transversal del alambre y l es la distancia entre las sondas. Para el creado aquí, el R se midió para ser 23,5 Ω utilizando la pendiente de la curva de tensión de corriente en la Figura 5B (R = ΔVoltage / ΔCurrent), l es 4,45 x 10 -2 m, y A se encontró que era 6,685 x 10 -10 m 2. Usando estos números, una resistividad de 3,6 x 10 -7 Ω · m se encontró para las películas, aproximadamente 20x mayor que el de metal de plata a granel (1,6 x 10 -8 Ω · m). Una resistividad más alta medida en películas en comparación con mayor es típico debido a la trayectoria de la corriente ya limitada y la incapacidad de portadores de carga para evitar defectos. El calentamiento del metal con una pistola de calor aumentó su resistencia indica un aumento en la tasa de dispersión de electrones por fonones característicos de conducción metálica.
Figura 5 (A) Procedimiento para hacer circuitos eléctricos en las películas de aleación de proteína (en este caso los circuitos de plata sobre seda tussah salvaje y películas de mezcla de seda de mora como un ejemplo): (a) portaobjetos sin revestir; (B) el plasma de plata durante la deposición por pulverización catódica de un objetivo diámetro de 2 pies; (C) con recubrimiento de plata portaobjetos de vidrio; (D) muestra recubierta de plata retenida a la ruleta con el mandril vacío antes de agregar la fotoprotección; (E) de diapositivas de plata recubierta con resina fotosensible se puso en el horno durante soft-hornee a 120 ° C; (F) La exposicion a la radiación UV para romper los enlaces de polímero en la fotoprotección; (G) Desarrollar la fotoprotección; (H) Hard-hornear la resisten a prepararse para el grabado en ácido; (I) Etch en el ácido, entonces detener el ataque químico de un enjuague en un baño de agua; (J) Secar el portaobjetos; (K) proteína de solución de aleación moldeada sobre el portaobjetos; (L) los patrones de plata de transferencia de la película de proteína seca. (B) -7 Ω · m, aproximadamente 20 veces más grande que la de metal de plata a granel. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6. modelo de análisis térmico utilizado para la verificación de miscibilidad del sistema de la proteína mezclado. Si la proteína A y B tienen temperaturas de transición vítrea T solo individuo, G (A) y T G (B), respectivamente (verde y azul curvas), un completamente miscible sistema de aleación proteína sólo mostrará una transición vítrea diferente de la Tg s de A y B (curva roja). De lo contrario, la proteínas son mezclas inmiscibles con tanto g T (A) y T g (B) (curva negro), o compuestos semi-miscibles con dos desplazado transiciones vítreas (curva naranja).
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Discussion
Uno de los procedimientos más importantes en la producción de "aleación" sistema de la proteína es verificar la miscibilidad de las proteínas mezcladas. De lo contrario, es sólo una mezcla de proteínas o proteína sistema compuesto inmiscible sin propiedades estables y sintonizables. Un método de análisis térmico experimental se puede utilizar para este fin y para confirmar sus propiedades de la aleación. Interacciones proteína-proteína pueden ser vistos de acuerdo con el modelo de Flory-Huggins celosía 48 como interacciones entre el "solvente" (el componente de proteína predominante) y el "soluto" (el componente de proteína de menor importancia). Sobre la base de este modelo, el cambio de energía libre durante la mezcla entre el "solvente" y el "soluto" gobierna la miscibilidad de la mezcla 48. Generalmente, hay tres diferentes grados de miscibilidad: (a) (material de la forma de una fase macroscópicamente) totalmente miscible, (b) metaestable (formar fases semi-miscibles en el material), y (c) inmiscibles (quedan-dos fases originales con dominios B proteína A individual y) 3,48. Correspondientemente, los comportamientos de transición de vidrio de un sistema de dos proteínas pueden demostrar estas diferencias e idealmente pueden expresarse utilizando un modelo de diagrama de fases (Figura 6). Por ejemplo, si la proteína A y B tienen sus temperaturas individuales individuales de transición vítrea, Tg (A) y T g (B), respectivamente (Figura 6 verdes y curvas azules), un sistema de aleación proteína totalmente miscible debe mostrar sólo una transición vítrea durante el calentamiento. Esta única de transición vítrea es normalmente intermedia entre la Tg s de A y B (Figura 6). De lo contrario, las proteínas podrían formar una mezcla inmiscible con lo cual tanto Tg (A) y T g (B) aparecen en sus posiciones originales (Figura 6). Las proteínas también pueden formar un sistema de semi-miscible indicado por dos desplazado tran cristalsiciones (Figura 6). Un ejemplo práctico de totalmente miscible proteína "aleación" sistema (forma de transición de un vidrio) se puede encontrar en las exploraciones de DSC de muestras de la mezcla de seda tropoelastina en la Figura 4 (aplicación térmica) 9. Con la disminución del contenido de seda, las temperaturas de transición vítrea (Tg) de las mezclas aumentó gradualmente desde 178 ° C (seda pura) a 190 ° C (tropoelastina puro) 9, sin embargo, mantener constantemente una transición vítrea única homogénea para todo tipo de mezclas. Según el modelo de Flory-Huggins, esto indica que todas las mezclas de seda tropoelastina de varias relaciones de mezcla son estables y son completamente miscibles aleaciones de proteínas sin separaciones macrofase.
En conclusión, las nuevas generaciones de materiales de aleación de proteína pueden ser producidos y fabricados en diferentes dispositivos médicos (por ejemplo, películas, suturas, tornillos, placas, micro-agujas, geles), controlada y con atúnble óptica, eléctrica, química, térmica, y las propiedades mecánicas. Mediante el control de los componentes y proporciones de mezcla, diversas propiedades biofísicas de materiales de aleación de proteína, tales como elasticidad, resistencia, rugosidad de la superficie, carga superficial, biodurabilidad y actividad química, pueden ser manipulados, lo que finalmente puede afectar las funciones de los tejidos, así como la celular local comportamientos asociados con estos materiales. Además, debido a la naturaleza de la vida útil programable proteínas ', in vivo se convierte en una plataforma viable para estos materiales de aleación. Estas ventajas podrían proporcionar nuevas opciones para los dispositivos médicos implantables en el futuro en el que la recuperación quirúrgica de reparación posterior se puede evitar. Estos biomateriales aleación proteína también ofrecerían una nueva vía para producir dispositivos médicos con funciones y propiedades biológicas sintonizables, y se combina con el cumplimiento de los tejidos y las necesidades relacionadas. Este artículo ofrece una revisión del protocolo general para la forma de fabricar estos dispositivos ybeneficiaría tanto a los científicos y médicos clínicos en múltiples campos de la biomedicina.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Los autores agradecen a la Universidad de Rowan para el apoyo de esta investigación. XH también agradece al Dr. David L. Kaplan de la Universidad de Tufts y el NIH P41 Tissue Resource Center Ingeniería (TERC) para capacitaciones técnicas anteriores.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Q100 Differential Scanning Calorimeters (DSC) | TA Instruments, New Castle, DE, USA |
N/A | You can use any type of DSC with a software to calculate the heat capacity. |
| SS30T Vacuum Sputtering System | T-M Vacuum Products, Inc., Cinnaminson, NJ, USA | N/A | With custom built parts; you can use any type of sputtering system to coat. |
| VWR 1415M Vacuum Oven | VWR International, Bridgeport, NJ, USA | N/A | You can use any type of vacuum oven to physically crosslink the samples. |
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