昆虫飛翔挙動監視のための早期変成挿入技術

Introduction

でも、遠隔測定記録用途のための昆虫に取り付けられた電子システムと、電極を挿入する、自然の飛行¹の間にどのように神経系の機能を理解するための主要な方法であった。昆虫人工システムを取り付けるか、注入する昆虫の自然な飛行を邪魔する可能性が関与する多くの課題を提起しました。大人の昆虫に表面的な添付ファイルまたは人工的なプラットフォームの外科的挿入は、体内に誘導される慣性やストレス力によって引き起こさ挿入デバイスの可能性のあるシフトに信頼性がない。表面的に取り付けられるか、または外科的に挿入された電極は、異物などの昆虫によって拒否されやすい。さらに、注入作業は、外骨格の周りのスケールと杭の除去を必要とする。厚いクチクラ層はまた、それにより、昆虫の自然な飛行を妨害する、側副組織損傷を引き起こす可能性の外科神経支配のために貫通する必要がある。すべてのTヘセ要因は、外科的または表面的な移植手術に挑戦し、繊細なタスクにすることができます。外部から昆虫への制御およびセンシングシステムを取り付けるに関わるこれらの懸念を緩和するために、変成成長が関与する新たな方法論は、この資料に記載されます。

完全変態の昆虫の変成岩開発は中間蛹（ 図1）を有する成人に幼虫（またはニンフ）の転換から始まります。変態プロセスは改造が続く変性症を含む広範な組織再プログラミングを必要とする。この変換は、いくつかの複雑な動作を^2,3を実証昆虫大人まで地上波幼虫をオンにします。

手術が早期変成段階^4,5の間に実行された場所、極端並体結合手術後の昆虫の生存が実証されている。これらの手術では、発達組織発生のコーエド外科的創傷は、より短い期間で修復することができる。導電性電極の注入は変成成長の初期段階（図1）中に実行された場合、これらの観​​察に続いて、新たな技術が開発されている。これは昆虫の⁶に生体力学的に確実な取り付けを可能にします。信頼性の高いインタフェースは、昆虫の神経および神経筋システム⁷で固定されています。この技術は「早期変態挿入技術^{」（EMIT）8}として知られています。

全体組織系の再構築後、蛹に挿入された構造は、大人の昆虫で出現する。飛翔筋群は、総胸部体重の65％を構成すると、このように、EMIT手順⁹には比較的便利なターゲットである。基本的なウイングビートの間に、dorsolongitudinal（DL）を給電する飛行形態の変化と背腹は（DV）の筋肉は翼articulatを引き起こすリフト^10を生成するイオンのジオメトリ。したがって、DLとDVの筋肉の機能調整は飛行神経生理学の下で活発な研究話題となっている。電子的にプログラムされた視覚的な環境でのテザリングの昆虫は、複雑な運動器官の行動^11,12の神経生理学を研究するための最も一般的な方法であった。発光ダイオードパネルからなる円筒状の競技場は、フライング昆虫が真ん中に係留され、動きが動的に周囲のパノラマの視覚表示を更新することによってシミュレートされ、これらの仮想現実環境のために使用されてきた。このような果実ショウジョウバエフライ小さく昆虫の場合、テザリングは、昆虫の背側胸部に金属ピンを装着すると、永久磁石^13,14の下にピンを配置することによって達成される。この方法は、任意の電気生理学的解析することなく、高速カメラで目視観察を介してモータ応答の定量を可能にする。また、このメタODはたばこスズメガの大きく重い身体を一時停止するのは非効率となっている。この問題を解決するために、我々はそれらの底部に取り付けられた磁石を備えた軽量フレームは、電磁力によって浮上される磁気浮上フレームから恩恵。市販の神経アンプとLEDアレイと組み合わせると、これは飛行モータ出力を制御し、 たばこスズメガの関連電気生理学を記録するためのプラットフォームを提供します。

Protocol

注：プロトコルに従うために必要な材料および試薬のソースは、以下の「試薬」の表に記載されている。

1。記録電極接続用のプリント基板（PCB類）の製造

NOTE：実用的な実験手順を提供するために、ワイヤ電極は、FFC（フレキシブルフラットケーブル）コネクタにこれらの電極を挿入するためにPCBに半田付けされている。

1. 銅張積層板の0.5x5センチ²枚を切る。
2. 細い先端マーカーを使用して、マスクパターンをエッチングなど3 0.1x5cm ²の長方形パッドを描画します。
3. 換気の良い場所やヒュームフードの内側にプリント基板のエッチング液を用いて露光積層板をエッチングする。非反応性テープでラミネートカットアウトの長さの約1cmをカバーしています。 PCBのエッチング剤とテープスコッチテープで卒業したビーカーの内側に銅積層カットアウトの少なくとも100ミリリットルで卒業ビーカーを埋める。銅ラミネートcutouの半分Tは、PCBエッチング液中に沈めなければならない。
4. 20分間の回転台にビーカーを置く。
5. エッチング液からカットアウトを取り外し、10分間水を満たしたビーカーに入れてください。
6. ティッシュペーパーを用いて、イソプロピルアルコールを適用し、非エッチング銅パッドを露出させるためにマーキングを除去する。
7. 約1cm、長より小さな正方形にプリント基板をカットします。
8. 3センチメートルそれぞれの長さに鋭い刃を用いてコーティングし、アニーリングし、ステンレス鋼線の2枚（裸0.11 "0.008、コーティングされた」）を切る。ステンレス鋼線のこれらの部分は、昆虫の胸部に挿入される活性電極である。
9. ブレードを使用して、各ワイヤの各端からプラスチックコーティング4-5ミリメートル削除。顕微鏡の使用をお勧めします。
10. 接地電極用チップ拡張機能を作成するために絶縁されたステンレス鋼線の1 0.7センチメートルピースをカット。そっと刃で被覆を除去や半田IRの熱でそれを溶かすステップ1.9で実行されるように。
11. アース接続の場合は4.5センチの長さに（リッツまたはインダクタ）可撓性ワイヤの一枚をカット。
12. ステップ1.11で作成接地接続線にステップ1.10で作成ステンレス鋼0.7センチの部分を半田付けします。露出されたステンレス製の先端部は、アース接続の終了時にあるべきである。
13. 非反応性のテープを使用してはんだ付けスペースにしっかりと作製した電極板をテープで固定します。電極がハンダ付けされ、ボード上のすべてが、パッド1〜2ミリマスクす​​るテープを使用。パッドのこのマスクされた、はんだフリーエンド、ステップ4.1で説明したFFCコネクタに挿入されます。
14. それぞれの一端が電極基板の対応するパッドにハンダ付けすることができるように、3電極ワイヤの位置を合わせます。簡単にはんだ付け用の電極パッ​​ド間にステンレス鋼用フラックスを適用します。
15. パッド上の露出した電極をそれぞれハンダ付けします。
16. 10分間、アセトン、イソプロピルアルコール中の電極を浸し各はんだ残基をきれいにする。超音波浴の使用は、洗浄性能を向上させる。

マンドゥカセクスタ蛹へ2。外科的挿入

注：昆虫は昼と夜の間の遷移時に最も活発になります。そのため、人工的な昼/夜サイクルは自動コンセントタイマーを用いて昆虫チャンバ内に確立されるべきである。これらは、7時間の暗闇と17時間の明サイクルをシミュレートするために設定する必要があります。

1. 適切な挿入時間を決定するために、毎日たばこスズメガの蛹を調べます。蛹は翼がダークスポットを示す約1日後に挿入するための準備が整いました。
2. 蛹を麻酔するためには、約6時間、冷蔵庫（4C）に配置します。
3. 挿入スペースを準備します。ワークスペースには、イソプロピルアルコール、鋭いピンセット、ブレード、および30 Gの皮下注射針を含む​​べきである。オプションとして、シアノアクリレート接着剤は、電極固定を強化するために使用することができる。
4. にそれらを浸漬またはイソプロピルアルコールで拭いて、針、ピンセット、電極を殺菌。
5. 冷蔵庫から蛹を削除し、ワークスペースに移す。
6. 興味のある筋肉群に対応している胸部上の位置を決定します。この例では、研究の焦点は、翼のアップストロークの動きに責任背腹の筋肉です。
7. 鋭い刃を使用して、そっとexocutical層を介して1x1のCM ²の長方形を傷つける。ピンセットを使用して、徐々にこれらの作品をはがす。
8. （オプション）胸部の露出領域から翼の髪を除去するために真空を使用してください。
9. ゆっくりと羽を筋群を対象とした2つの挿入ポイントを作成するために胸部に取り付ける中胸に約5mmの針を挿入します。
10. ピンセットを用いて、2つの挿入ポイントに二つの記録電極を案内する。
11. （オプション）、電極の周りの毛をきれいに、機械的耐久性を向上させるために、そして寛大にワイヤアプリケータで胸郭上の各挿入点を中心にシアノアクリレート接着剤を適用します。
12. 虫が出現すると登ることができるように、壁や​​天井をカバーする適切な材料（ラフやテクスチャ）との出現のためのケージを準備します。穿孔された段ボール箱または包装紙を使用してもよい。
13. 約6センチ、長さ2ミリメートル径の強​​固な固定スティックを準備します。プラスチック製撹拌機、綿棒、又は金属ワイヤは、この工程のために使用することができる。
14. 慎重に突き出た口吻の下穴から、このスティックをスライドさせます。
15. 蛹の周りにロールバックできないようなケージ表面にスティックの両サイドを固定します。中胸が上を向いているように、ケージの中に蛹を置きます。豊富な運動は、血リンパの電極、ロスに損傷を与える、または挿入は無用なる可能性があります。

3。 マンドゥカセクスタに粉砕電極を挿入する

注：グランド（参照リファレンス）電極は信号結合を回避するために胸部の腹部または遠位部分に挿入する必要があります。この挿入は、蛹の開発の後期段階の間または昆虫が出現した後のいずれかで行うことができる。接地電極用のウィンドウは蛹または成体段階接地電極挿入のいずれかに蛹中で調製しなければならない。

1. 蛹の挿入のために：（ステップ2.7を参照）、アクティブ電極の周囲mesothoracicキューティクルの剥離した後、30 Gの皮下注射を使用して近くに胸部への背側腹部（0.5x0.5センチ²程度）exocutical層を介して別の四角形を傷つける針。セクション2に記載された技術を使用して、このウィンドウに接地電極を挿入する。
2. 大人のステージ接地電極の挿入のために：昆虫が出現した後、固定する6から24時間、4℃の冷蔵庫に入れてください。
   残りのステップは蛹と成虫の挿入で同じです。
3. inserを準備しますイソプロピルアルコール、鋭いピンセット、30 Gの皮下注射針、シアノアクリレート系接着剤、接着剤を適用するための配線の一部、熱焼灼器（オプション）、歯科用ワックススティック（オプション）を含むのTiONのワークスペース。
4. 約1〜2センチメートル離れて後方腹部に沿って記録電極からの挿入ポイントの位置を確認します。
5. ゆっくりと腹部を穿刺し、挿入部位を提供するために、針を挿入します。
6. ピンセットを使用して、慎重に挿入部位に接地電極を挿入し、それが深い3〜4ミリメートルになるまで圧力を加える。所定の位置に電極を保持し、挿入部位周辺に接着剤を適用するために、ワイヤを使用しています。
7. （省略可能）、機械的強度を高める熱焼灼器を使用し、先端にワックスを少量（2〜3 mm）のビーズを収集します。挿入部位の近くにチップを置き、ワックスは、電極を包囲し、所定の位置にしっかりと保持しているような熱を加える。

アダプタボードの4。準備

「ontent>注：アダプタボードは、FFC（平フレックスケーブル）コネクタを介して無線記録ヘッドステージに電極板を接続するために必要なこのために、電極板に似ボードは、以下のことにより製造される必要がある1.7に1.1ステップ。

1. 準備されたボードの一端にFFCコネクタをハンダ付けします。
2. もう一方の端にある3つのパッドにワイヤーをフック3 30 AWG（米国ワイヤゲージ）はんだ。
3. 次の段階で説明したように、オシロスコープの測定値のためのアダプタボード上の3つのパッドに3のミニコネクタをハンダ付けします。
4. ヘッドステージコネクタに、これら3本のワイヤのもう一方の端を半田付けします。
5. 浮上フレームの上にヘッドステージ回路基板を固定します。

オシロスコープで5。プリレコード（オプション）

NOTE：電極の信頼性を評価し、信号対雑音比を観察するために、係留オシロスコープ記録がwirelを展開する前に得ることができるESS記録システム。アダプタボード上のミニワイヤコネクタは、このために使用されるべきである。

1. 細胞外の神経記録アンプにオシロスコープを接続します。 1Hzで、20kHzのローパスカットオフ周波数、および100の利得のハイパスカットオフ周波数増幅器のパラメータを設定する。
2. アンプの入力チャンネルにアダプタボード上のメスのミニワイヤコネクタをそれぞれ接続してください。
3. それは（その夜明け時間中に）アクティブ状態にあるときにケージから注入された電極板で昆虫を削除します。測定が行われる前に、それが上に置かれるために昆虫の下にティッシュ一枚の紙を置きます。
4. ピンセットを使用して、アダプタボード上のFFC受容体に電極板をスライドさせます。虫が休んでいるとき、フラット、低電圧のベースラインを観察し、虫が羽をフラップとして電図（EMG）の生成は、スパイク。
   注：representatワイヤレス記録システムで観察した昆虫飛翔：第6章を参照してくださいIVEオシロスコープ結果。
5. 必要に応じて、オシロスコープの表示パラメータを調整します。オシロスコープ上のデータをキャプチャし、データを保存します。

無線記録システムと6。観測昆虫飛翔

注：電磁浮遊プラットフォームはつながマンドゥカsextaの飛行中のEMG信号の無線記録のために構築することができます。浮上プラットフォームは、テザリングメカニズムのバランスをとるように設計されたフレームで構成されています。浮上は、フレーム、従って昆虫は、テザリング配線の制約なしに、テスト中にヨーすることができます。フレームは、溶融堆積モデリング（FDM）のマシンを使用して迅速プロトタイプ化することができます。磁石は、基本プラットフォームの一連の磁石によって浮上するために、このフレームの下部に取り付けられている必要があります。昆虫は、フレームの頂部から吊り下げFFCコネクタに接続されている。この浮上プラットフォームは、資料を使を構築した、LEDアリーナの内側に位置していますG 5×7個々のLEDのアレイで構成される60のパネル。このシステムは^{、15、16、17飛ぶ}果実の視覚刺激のための環境を開発するための確立された方法に基づいた。アリーナは、マイクロコントローラ可能時計方向及び反時計回りの両方のシミュレーションと同様に回転速度を制御することによって制御される。

1. 浮上プラットフォーム上のアダプタボードコネクタにヘッドステージを接続することで無線記録システムをセットアップします。
2. それは、その夜明け時間中に、好ましくは、活性状態にあるときにケージから昆虫を削除します。
3. ピンセットを使って、慎重に昆虫がしっかりとセットアップ内に吊り下げられるように浮上フレームにFFC受容体に電極板を挿入します。
4. 無線データ伝送を活性化するためにヘッドステージに磁気スイッチの近くに磁気杖を置く。青色光はヘッドステージがアクティブであることを示す点灯します。
5. 内のライトをオフにする完全な暗闇の余地。赤いランプが部屋に照明を追加するために使用することができます。コンピュータ上のテレメトリデータ収集ソフトウェアを開き、提供された場合、適切なプリロードの設定ファイルを選択します。視野信号を開始するためにデータ収集を開始する。
6. 信頼性の高い無線接続及び電極の動作を保証するために、無線記録システム上のEMG信号の観測に関連するユーザインタフェースを選択する。
7. 直流安定化電源とマイコン：全てのLEDアリーナのコンポーネントをオンにします。マイクロコントローラは、周期的な光パターンの毎分回転数を調整することができ、また、光の回転方向を制御することができる。
8. ゆっくりとアリーナ内で浮上プラットフォームのバランスをとる。そうでなければ、フレームはおそらく昆虫を負傷地面に迅速に引っ張られ、慎重に浮上ベースの中央より上のフレームの位置を合わせます。
9. ビデオ記録システムを開始する。
10. ソフトウェアの関連記録]タブを選択しますインターフェイス。録画時間を指定し、ファイル保存先。データを保存するために適切な出力設定を選択します。ソフトウェア内の記録セッションを開始するために[スタート]ボタンをクリックします。これは、数値コンピューティング環境にインポートできるデータファイルが保存されます。
11. 虫がLEDの動きに対応している方向に飛ぶように観察します。 LEDの方向を逆にし、虫が方向を逆転させることを確認してください。必要に応じてこの回数だけを実行します。

Representative Results

全体的なEMIT手順の概略を、スズメガの変成サイクルにおける主要な段階及び対応する電極挿入工程を示す、 図1に示されている。電極挿入は、4〜7日羽化前後半蛹の段階で実行する必要があります。これは筋線維は、電極の周りに開発し、昆虫にインプラントを固定することができます。

二つの活性電極および接地電極が挿入された完成した後期蛹挿入の典型的な結果を図2に示す。

二つの活性電極および接地電極が挿入された完成した成体ステージ挿入の典型的な結果を図3に示す。

LEDの分野では、図4に示されているたばこスズメガのための飛行中に回転誘導するために用いる。マイクロワットLEDアレイ垂直パタンの回転速度の制御を可能にするようにプログラムされている。 LEDパターンの角速度は、毎秒7.3度に設定した。磁気浮上プラットフォームは、昆虫が自由にLEDアレイに応答してオンにできるようにするためにLEDアリーナの中央に置いた。

図5は 、翼羽ばたきの前後オシロスコープで背腹の筋肉から取得した筋肉電位信号を示しています。信号は、100倍の増幅および1Hzの高域通過フィルタと20kHzのローパスフィルタで処理されている。休止期間ではありませんが、筋電位が観察されない。翼の羽ばたきの間の筋電位は、約15 HZ-20Hzの時に起こる。

図6は 、翼羽ばたきの前後にワイヤレス計装で取得筋肉電位信号を示しています。休止期間ではありませんが、筋電位が観察されない。筋肉の電位は、DUR翼の羽ばたきをINGは、約15Hzで-20Hzで発生する。

図1 EMIT手順プロトコールに記載のように。EMIT手順の概略図が、 マンドゥカsextaの上で行わ。

図2。記録電極は、EMITを使用して挿入された直後に、後期段階の蛹の蛹挿入。写真。

図3。蛾の出現。移植された記録電極Aと大人の蛾の写真FTERの羽化。

図4。録画設定。磁気浮上プラットフォームとLEDの分野は、 たばこスズメガの飛翔筋からEMG信号を記録するために使用。ここマンドゥカセクスタリボルビング LEパターンに応じて、ヨー操縦を行っている。

図5。オシロスコープEMG。アンプとオシロスコープを使用して背腹筋の2.5秒の筋電図記録。

図6。ワイヤレス筋電図。1.9ワイヤレスヘッドステージ記録部と、データ収集ソフトウェアを使用して背腹筋の筋電図秒記録。

Discussion

プロトコルの後の手順でデータを記録する能力に影響を与える記録電極の外科的挿入中のいくつかの重要なステップがあります。記録電極は、その背側の翼スポットを発揮した後に蛹1日の中に挿入する必要があります。挿入が2日以上、この時間が経過した後に実行されている場合は、昆虫の組織は周りの開発および挿入された電極を安定させるのに十分な時間がありません。これは、成人期に移植電極および信頼性の低い録音の動きにつながる可能性があります。

これは、5mm以上の深さで蛹飛行筋に記録電極を挿入しないことが重要である。そうでなければ、血リンパは、挿入ポイントを終了し、弱い飛翔筋の開発になります。血リンパが出現しない場合は、手順を停止し、蛹24時間、再び電極を挿入しようとする前に回復することができます。挿入部位は目を洗浄する必要がありoroughlyすべての翼の髪の電極はさなぎに挿入される前に。これは、挿入孔に入ると、電極組織界面に干渉するの毛髪を防止する。

大人の蛾に最適な翼の健全性を確保するために、挿入部位は、ピンセットを用いて羽の毛の羽化前日に再洗浄する必要があります。加えて、次の日に発生した羽化を支援するために、皮下注射針で切開しキューティクルウィンドウの端を緩め、ピンセットを使用することをお勧めします。任意の接着剤や血リンパがキューティクルウィンドウの端の近くに乾燥している場合は、蛾は羽化後にその翼を膨張させることができず、この試料は、実験のために有用ではありません。

挿入時間が日中に与えられているが、これらは変成開発のタイムラインとして多少​​異なる場合がありますpoikilothermsため飼育温度の関数である。提供日は、RTで飼育昆虫のためのものです。標準25°の場合、C昆虫館インキュベーターを使用する場合、現像は、約10〜20％速くなり、挿入時間はそれに応じて調整する必要がある。

この研究の限界は、迅速な試作したABS樹脂浮上フレームによってセットアップに導入回転慣性だろう。蛾の質量は約4グラムである間、フレームの質量は最大で200グラムすることができます。電磁的に浮揚フレームを使用する利点は、フレームと支持構造との間の摩擦接触の喪失である。しかし、比較的重いフレームの使用は、虫が回転し、LEDのパターンに応じて、ヨー操縦を完了するために多くのエネルギーを費やすようになります。この研究で使用繋留フレームの変形が少なく、緻密材料および/または慣性荷重を低減する薄いフレームを構築するための使用であってもよい。

変態期の発達的変化は、昆虫が飛ぶ方法を学ぶために、神経工学の方法に新しい機能をもたらします。それは驚くべき観察である成人期の挿入に関して緩和し、組織の反応における蛹の段階の結果の間に電極挿入。したがって、昆虫運動器官の挙動を最小限に抑え、短期間の効果を予測可能な神経筋のインタフェースを実現しながら、昆虫や上合成システムの機械的な取り付けを確実にベースの挿入を放出する。最後の二十年の間に、非常に小さなスケールの無人航空機に取り組んrobotistsは昆虫の飛行に触発されている。小説電気生理学的手法を有効にする以外に、EMITの手順は、その感覚と行動生理学^8を制御するために、昆虫の電気的興奮性細胞への神経エンジニアのためのアクセスを提供することができる昆虫·マシン·インターフェース（IMI）が可能になります。これは「biobotically "飼いならすと昆虫運動を制御する可能性を秘めている。したがって、この記事で紹介した具体的な方法論だけでなく、昆虫の飛行の研究に有用であるだけでなく、ためハイブリッドセンチスケールの飛行biobots ¹⁸として昆虫をdomesticating。このようなハイブリッドプラットフォームのアプリケーションは、モバイル環境センシングシステムに昆虫を変換することである。これらの作業の動物は、潜在的に環境情報を収集して格納することにより、共同共有生態系を監視する人間を支援することができます。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Coated stainless steel wire	A-M Systems	791900	0.008’’ bare, 0.011’’ coated, annealed
Flexible electrode wire			Litz or inductor wire can be used.
Surface-mount FFC connector	Hirose Connector	FH28E-20S-0.5SH(05)
Tweezers	Grobet USA		Clean with 70% alcohol before use on the insect.
Kim-Wipes	Kimberly-Clark Worldwide	34155	Any size delicate-wipe tissues can be used.
Teflon tape			5 mm width Teflon tape.
Hypodermic Needle	Becton Dickinson & Co.	30511	20-30 G hypodermic needle can be used. Video showed 30 G.
Rigid fixation stick			Variety of materials can be used (e.g., coffee stirrers)
Insect emergence cage			Plastic pet cage lined with packing paper or similar padding. Ventilation holes are needed.
Thermal cauterizer	Advanced Meditech International	CH-HI CT2103 (tip)	Optional equipment used for application of dental wax.
Dental wax	Orthomechanics LC., Broken Arrow, Oklahoma		Optional material used for stabilizing the electrodes on the insect.
Magnetic levitation platform			Custom designed frame fabricated in-house with 3D prototyping.