Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Medicine

脊髄虚血再灌流のマウスモデルにおいて胸部大動脈閉塞によって再現可能対麻痺

doi: 10.3791/50910 Published: March 3, 2014

Summary

脊髄虚血 - 再灌流障害のメカニズムの理解の欠如は、高リスク大動脈操作次の麻痺を防止するために更なる補助剤を妨げてきた。このように、動物モデルの開発が不可欠である。この原稿は、マウスモデルにおける胸部大動脈閉塞後再現性の下肢麻痺を示しています。

Abstract

背景
下肢麻痺は、大動脈の介入を複雑にし続けています。根底にある病理の理解の欠如が発生したにこの傷害を減少させるための進歩を妨げてきた。現在のモデルは、胸部大動脈閉塞後再現性の下肢麻痺を示しています。

方法
成体雄性C57BL6マウスをイソフルランで麻酔した。 cervicosternal切開を通して大動脈を露出させた。胸部下行大動脈と左鎖骨下動脈を胸膜腔への進入せずに同定された。これらの動脈のスケルトン化を、4分(中等度虚血)または8分(長期の虚血)のための即時の閉鎖(偽)または閉塞が続いた。胸骨切開し、皮膚を閉じ、マウスを回復するための加温床に移した。回復後、機能分析は、48時間まで、12時間間隔で得た。

結果
偽手術を受けたマウスは、観察可能な後肢の赤字を示さなかった。 4分間の中等度の虚血を受けたマウスは、12時間で最小機能赤字は48時間で麻痺を完了するために、進行が続きました。長時間の虚血を受けたマウスは、術後の期間にどの位置においても観察可能な後肢の動きと直接麻痺を持っていた。全く観察術中や術後の死亡はなかった。

結論
即時または遅延は、マウスモデルにおいて達成することができるかどうかを再現可能な下肢麻痺。さらに、胸骨正中切開と慎重な解剖、高い生存率、および再現性を使用することによって達成することができる。

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

下肢麻痺が胸腹部の介入を複雑にし続けています。脊髄虚血-再灌流傷害(SCIR)として知られている損傷は、高リスク患者1の最大20%において麻痺をもたらす。このような左心バイパス、腰椎cerbrospinal流体排水溝、低体温循環停止および肋間動脈再移植などの外科的補助剤は、この合併症2の発生率が減少しているが、あまりにも多くの患者が影響を受け続けています。

臨床的には、脊髄虚血および再灌流傷害は、介入3以下麻痺即時または遅延のいずれかと見られている。しかし、この損傷の我々の理解は、機械的な細部の欠如によって窒息されています。その結果、いくつかのオプションは、それが発生した後に傷害を減衰させるために用意されています。

我々はこのようにして、小さな動物、ネズミ、脊髄虚血のモデル、および再灌流傷害を参加しているより良い、その病因を特徴づける。これまでの研究の大半は、この傷害、すなわちラット4、ウサギ5、および豚6モデルを特徴づけるために、より大きな動物モデルを使用している。しかしながら、これらは、それらのコスト、複雑さ、可変の再現性、及び、最も重要なのは、遺伝子操作のための利用可能な技術の欠如によって制限される。これらの公開の動物モデルの中で最も信頼性の高いウサギ腹部大動脈のクロスクランプが含まれます。しかし、人間の前脊髄ニューロンは、ほとんどの場合、より近位枝7から自分の血管供給を導出する。これらのモデルにおける脊髄の変数血管解剖は臨床使用に彼らの結果を移行することが困難に追加されます。

この原稿は、臨床的に関連して使用するのが簡単である胸部大動脈閉塞後、即時または遅延対麻痺のためのモデルを提示します。ミニsternoto経由大動脈弓の露出私は、低侵襲であり、最小の罹患率および死亡率を有する高度に再現性のある結果を誘発することができる。課題や技術的なニュアンスなしていないこのモデルがあるが、これらを容易に実現することができる後肢麻痺のモデルを生成するために慎重な切開および組織処理によって克服することができる。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1。術前準備と麻酔

  1. 作業中は無菌テクニックを守ってください。すべての楽器をレイアウト。
  2. それは適切な温度(36.5℃)に温めることができるように前に麻酔導入に温度調節ベッドをオンにします。レーザードップラー灌流モニターの電源をオンにし、それが誘導中に起動できるように。
  3. 誘導室でマウスを置きます。
    1. 慎重に誘導中にマウスの呼吸数を監視します。
    2. とすぐに呼吸数を視覚的に鈍化しているように、誘導室からマウスを外します。
    3. 麻酔の妥当性を評価するために、つま先のピンチを実行します。
  4. マウスが正常に麻酔をかけて、仰臥位にマウスを置きます。
  5. ノーズコーンに顔を挿入し、加熱テーブルにすべての四肢を固定します。
    1. 四肢がNO deviatiで、解剖学的位置に固定されることを保証するために特別な注意を払う1側にオン。マウスが不適切に配置されている場合、それは胸骨切開時に内胸動脈離断を回避することは困難である。
  6. バリカンまたは市販の除毛クリームを使用して、正中線胸部から髪を削除し、下肢腹面を残した。
    1. 脱毛クリームを使用した場合、アルカリ火傷が発生する可能性があるように、より大きく30秒の場所にクリームを放置しないようにします。
  7. 十分な麻酔を維持するために、揮発性麻酔薬気化器濃度を滴定する。
    1. 予想気化画分を高流量O 2でイソフルランを用いて、1〜5%の間である。
    2. 揮発性麻酔薬気化器の濃度が自発呼吸を維持しながら、手術刺激中に麻酔を維持するために滴定されるべきである。

2。直腸プローブレーザードップラー配置

  1. マウスの直腸に潤滑直腸プローブを挿入します。 OPERに所定の位置に固定しますベッドating。
  2. 36.5℃の目標直腸温するための加熱のベッドを調整
  3. マウスの大腿動脈を介して小さな切開を行い、離れて皮下組織から皮膚を解剖。
  4. 大腿動脈を介してレーザードップラープローブを挿入します。
  5. 灌流モニターが800灌流単位より大きく登録するまで、プローブ位置を調整します。
    1. 所定の位置にしっかりと安全なプローブ。 適切に固定しないプローブが誤って低潅流測定を持つことができます。

3。大動脈弓/鎖骨下動脈の解剖

  1. 胸骨切痕2cm上の皮膚切開を行い、静かに皮下組織から皮膚を解剖。
  2. 無料の顎下腺を解剖。
    1. 出血が発生した場合には、穏やかな圧力は、綿棒で適用することができます。
    2. 無血管平面に正中線を通して顎下腺を分割。
  3. そっとピンセットで胸骨を持ち上げ、組み合わせのプレを使用してオッズ比は胸骨の正中線を通して1cmの正中胸骨切開を行う。 正中線からの偏差の制御が困難になります内胸動脈出血する可能性があります。
  4. 胸骨の端にそれぞれの側に5-0後退縫合糸を配置し、横方向に動作してベッドに縫合糸を固定して胸骨を撤回。 気胸を防ぐために、あまりにも横方向に後退縫合糸を置かないでください。
  5. 気管に沿って鈍的切開自由ストラップの筋肉を使って。左ストラップ筋曝露を改善するためにハサミで分割することができる。
  6. 周囲の組織から胸腺を解放解剖。大血管を可視化されるまで、鈍的切開を続ける。胸膜腔に入ることを防ぐために、細心の注意を払ってください。
  7. 大動脈弓と左鎖骨下動脈に血管クランプを置きます。
  8. 遠位の流れを適切に中断していることを確認します。これは、灌流単位で> 90%の減少として見られる。
    1. デジ用の閉塞を継続4-8分間赤。
  9. 血管クランプを外し、胸の閉鎖前に、止血を確認してください。

4。胸骨切開と皮膚の閉鎖

  1. マウスの左側に引き出し縫合糸を取り除く。
  2. 右後退縫合糸で胸骨切開を閉じます。
    1. (以前に置か後退ステッチを使用して)、単一の胸骨縫合糸が胸骨閉鎖に適しています。別のステッチを配置することは不要であり、気胸と出血のリスクを増大させる。
  3. 5-0ステッチを実行しているとの緊密な肌。

5。回収率と術後の評価

  1. 回復ケージにマウスを転送します。ケージは、回収室の周囲温度を増加させ、環境への熱損失を低減するために加温パッド上に配置されるべきである。
  2. 密接兆候呼吸困難や発作活動のためのマウスを監視します。機関ガイドラインに従って鎮痛を管理する。 Euthanizeマウスはすぐに発作や呼吸困難が観察されている場合。
    1. CO 2チャンバー安楽死は、私たちの好ましい方法である。 CO 2が使用できない場合、頚椎脱臼も一つの選択肢です。
    2. 完全な回復には使用される揮発性麻酔薬と集中の長さに応じて、1〜2時間で期待することができる。
  3. 通常のケージにマウスを返します。ケージの床の上に食べ物や水の場所に配置します。
  4. ロコモーション8用バッソマウスのスケールを使用して、12時間間隔で神経学的状態を評価する。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

マウスは、偽手術を受けた(n = 3)または4(n = 3)で8分間の大動脈閉塞(n = 3)であった。術後マウスはバッソマウススコア( 図1)によって等級付けした。偽手術を受けたマウスは、術後の任意の時点で観察可能な機能欠損がありませんでした。適度な虚血(4分)にかけたマウスは、48時間で麻痺を完了するために、進行性の機能低下との12時間の時点で、通常の後肢機能の近くに持っていた。長時間の虚血·グループ(8分)のマウスはいずれの回復可能な機能(図2)することなく、手術後の完全な麻痺を持っていた。

図1
図1。バッソは後肢運動機能8のスコア 。 9(正常なfunctiを0(機能なし)から段階的後肢神経機能障害のスコアリングシステム)に。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

図2
図2。術後後肢機能。神経障害の重症度は、術後48時間まで12時間間隔でバッソマウスのスケールを使用して等級分けした。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

脊髄虚血再灌流への二次対麻痺はあまり理解されていない病態9の複合体の結果である。これは最も一般的に胸腹部大動脈手術後に見られますが、このような大動脈解離、外傷、塞栓現象、血管炎、および全身性低血圧10など他の傷害の様々な対麻痺になることがあります。この損傷の更なる理解を得て、この損傷を排除する将来の標的を提供するために、動物モデルが必要となっている。

この合併症を呈するいずれか即時または遅延麻痺に罹患した患者。このモデルは、他は十分に臨床的に見られる麻痺の11峰性分布を平行。適度な虚血(4分)遅れ麻痺を生産しながら、長時間の虚血(8分)即時かつ永続的な麻痺が生じた。

提示されているモデルは、文献を必要とするものに比べて利点を有するateral開胸12,13。胸骨正中切開露光は無傷胸膜腔を出て、気管挿管または胸膜腔の負圧を再確立する必要がなくなる。臨床的には、胸骨切開は横開胸よりもはるかに少ない術後疼痛に関連しており、術後の鎮痛剤の要件を減らすことがあります。

このモデルには限界がないわけではない。他のモデルと同様に、マウスの手術は学習曲線を持っていると良い外科技術が不可欠です。解剖は注意して行われていない場合は、マウスはすぐに屈することができます。術中死亡率の最も一般的な原因は、出血や気胸である。潜在的に致命的な出血を回避するために胸骨正中なされなければならない。胸骨切開をあまり横方向に行われた場合内胸動脈とそれに続く出血のトランザクションが発生する可能性があります。さらに、大動脈や鎖骨下動脈下行の大まかな解剖はインクルード困難な点となります出血につながることができますTまたは制御することは不可能。気胸は他の潜在的に致命的な合併症である。これらは通常、後退縫合糸または大動脈の解剖の配置中に発生する。後退縫合糸があまりにも横方向に場所や大動脈弓である場合は気胸が発生する可能性があります、注意して切開し、普遍的に致命的ではありません。

さらなるステップは、再現性を確保するために採用される必要がある。正常体温は非常に重要です。手術マウスの間に36.5℃のできるだけ近くに保持されています。であっても軽度の低体温は、脊髄および脳卒中モデル14,15の有意な神経保護効果を有することで示されている。更に、レーザードップラー測定値は、厳密に監視されるべきであり、遠位の流れにおけるわずか90%の減少を有するマウスを比較のために含まれるべきである。非常に多様で、より高い遠位の流れと結果における大動脈または鎖骨下動脈の不完全な閉塞は、缶の結果。

結論として、Lのマウスモデル提示文章理解四肢麻痺を簡単に再現性の高い結果が得られ、採用することができる。このモデルのアプリケーションでは、即時と遅延麻痺を研究する手段を研究者に提供することができます。また、このモデルの採用は、この壊滅的な合併症との闘いに有益で証明するかもしれない。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

著者らは、競合する経済的利益を宣言していません。

Acknowledgments

私たちは、このプロジェクトの財務支援のための研究と教育のための胸部外科の財団に感謝したいと思います。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
VMS Anesthesia Machine MDS Matrx
Isoflurane Vet One 13985-528-60 2.0% through nose cone 
Induction Chamber Vet Equip 941444
Heating Bed Vestavia Scientific
Lazer Doppler Monitor Moor Instruments VMS-LDF1
5-0 Suture, Polyester Surgidac VD-551 Taper Needle
Microdissecting Clips Biomedical Research Instruments 14-1030, 14-1060
Surgical Instruments Fine Surgical Instruments Forceps, needle holder

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Conrad, M. F., Ye, J. Y., Chung, T. K., Davison, J. K., Cambria, R. P. Spinal cord complications after thoracic aortic surgery: long-term survival and functional status varies with deficit severity. J. Vasc. Surg. 48, 47-53 (2008).
  2. Okita, Y. Fighting spinal cord complication during surgery for thoracoabdominal aortic disease. Gen. Thorac. Cardiovasc. Surg. 59, 79-90 (2011).
  3. Wong, D. R., et al. Delayed spinal cord deficits after thoracoabdominal aortic aneurysm repair. Ann. Thorac. Surg. 83, 1345-1355 (2007).
  4. Taira, Y., Marsala, M. Effect of proximal arterial perfusion pressure on function, spinal cord blood flow, and histopathologic changes after increasing intervals of aortic occlusion in the rat. Stroke. 27, 1850-1858 (1996).
  5. Naslund, T. C., Hollier, L. H., Money, S. R., Facundus, E. C., Skenderis, B. S. Protecting the ischemic spinal cord during aortic clamping. The influence of anesthetics and hypothermia. Ann. Surg. 409-515 (1992).
  6. Qayumi, A. K., Janusz, M. T., Lyster, D. M., Gillespie, K. D. Animal model for investigation of spinal cord injury caused by aortic cross-clamping. J. Invest. Surg. 10, 47-52 (1997).
  7. Lang-Lazdunski, L., Matsushita, K., Hirt, L., Waeber, C., Vonsattel, J. P., Moskowitz, M. A., Dietrich, W. D. Spinal Cord Ischemia: Development of a model in the mouse. Stroke. 31, 208-213 (2000).
  8. Basso, D. M., Fisher, L. C., Anderson, A. J., Jakeman, L. B., McTigue, D. M., Popovich, P. G. Basso Mouse Scale for locomotion detects differences in recovery after spinal cord injury in five common mouse strains. J. Neurotrauma. 23, 635-659 (2006).
  9. Kwon, B. K., Tetzlaff, W., Grauer, J. N., Beiner, J., Vaccaro, A. R. Pathophysiology and pharmacologic treatment of acute spinal cord injury. Spine. J. 4, 451-464 (2004).
  10. Cheshire, W. P., Santos, C. C., Massey, E. W., Howard, J. F. Spinal cord infarction: etiology and outcome. Neurology. 47, 321-330 (1996).
  11. Kakinohana, M., et al. Delayed paraplegia after spinal cord ischemic injury requires caspase-3 activation in mice. Stroke. 42, (8), 2302-2307 (2011).
  12. Wang, Z., Yang, W., Britz, G. W., Lombard, F. W., Warner, D. S., Sheng, H. Development of a simplified spinal cord ischemia model in mice. J. Neurosci. Methods. 189, 246-251 (2010).
  13. model of ischemic spinal cord injury with delayed paralysis caused by aortic cross-clamping. Anesthesiology. 113, 880-891 (2010).
  14. Kang, J., et al. The effects of systemic hypothermia on a murine model of thoracic aortic ischemia reperfusion. J. Vasc. Surg. 52, 435-443 (2010).
  15. Li, J., Benashski, S., McCullough, L. D. Post-stroke hypothermia provides neuroprotection through inhibition of AMP-activated protein kinase. J. Neurotrauma. 28, (7), 1281-1288 (2011).
脊髄虚血再灌流のマウスモデルにおいて胸部大動脈閉塞によって再現可能対麻痺
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bell, M. T., Reece, T. B., Smith, P. D., Mares, J., Weyant, M. J., Cleveland Jr., J. C., Freeman, K. A., Fullerton, D. A., Puskas, F. Reproducable Paraplegia by Thoracic Aortic Occlusion in a Murine Model of Spinal Cord Ischemia-reperfusion. J. Vis. Exp. (85), e50910, doi:10.3791/50910 (2014).More

Bell, M. T., Reece, T. B., Smith, P. D., Mares, J., Weyant, M. J., Cleveland Jr., J. C., Freeman, K. A., Fullerton, D. A., Puskas, F. Reproducable Paraplegia by Thoracic Aortic Occlusion in a Murine Model of Spinal Cord Ischemia-reperfusion. J. Vis. Exp. (85), e50910, doi:10.3791/50910 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter