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Medicine

Riproducibile Paraplegia da Toracica aortica occlusione in un modello murino di Spinal Cord ischemia-riperfusione

doi: 10.3791/50910 Published: March 3, 2014

Summary

La mancanza di comprensione meccanicistica del midollo spinale ischemia-riperfusione ha impedito ulteriori aggiunte per evitare paraplegia seguenti operazioni aortica ad alto rischio. Pertanto, lo sviluppo di modelli animali è imperativo. Questo manoscritto dimostra riproducibile paralisi degli arti inferiori in seguito toracica occlusione aortica in un modello murino.

Abstract

Sfondo
Arti inferiori paralisi continua a complicare interventi aortici. La mancanza di comprensione della patologia sottostante ha ostacolato progressi per diminuire il verificarsi questa lesione. L'attuale modello dimostra riproducibile paralisi degli arti inferiori in seguito toracica occlusione aortica.

Metodi
Adulto topi C57BL6 sesso maschile sono stati anestetizzati con isoflurano. Attraverso un'incisione cervicosternal l'aorta è stato esposto. I aorta discendente e succlavia sinistra arterie toraciche sono stati identificati senza l'ingresso nello spazio pleurico. Scheletrizzazione di queste arterie è stata seguita da chiusura immediata (Sham) o occlusione per 4 min (ischemia moderata) o 8 min (ischemia prolungata). La sternotomia e la pelle sono stati chiusi e il mouse è stato trasferito a letto riscaldamento per il recupero. Dopo il recupero, l'analisi funzionale è stata ottenuta a intervalli di 12 ore fino a 48 ore.

Risultati
I topi sottoposti a chirurgia simulata non hanno mostrato deficit degli arti posteriori osservabile. I topi sottoposti a ischemia moderato per 4 min avevano deficit funzionale minimo a 12 ore seguita da progressione alla paralisi completa in 48 ore. I topi sottoposti a ischemia prolungata avevano una paralisi immediato con nessun movimento arti posteriori osservabile in qualsiasi momento nel periodo postoperatorio. Non c'era intraoperatoria osservati o mortalità post operatoria.

Conclusione
Riproducibile inferiore paralisi degli arti immediati o differiti può essere realizzato in un modello murino. Inoltre, utilizzando una sternotomia mediana e attenta dissezione, alti tassi di sopravvivenza e la riproducibilità può essere raggiunto.

Introduction

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Arti inferiori paralisi continua a complicare interventi toraco-addominali. La lesione, noto come midollo spinale danno da ischemia-riperfusione (SCIR), causando paralisi in fino al 20% dei pazienti ad alto rischio 1. Aggiunte chirurgiche come la sinistra di bypass al cuore, lombari scarichi fluidi cerbrospinal, ipotermia e arresto circolatorio dell'arteria intercostale reimpianto hanno ridotto l'incidenza di questa complicanza 2, tuttavia, troppi pazienti continuano a essere colpiti.

Lesioni Clinicamente, ischemia del midollo spinale e la riperfusione è visto come immediato o successivo paralisi dopo l'intervento 3. Tuttavia, la nostra comprensione di questo pregiudizio è stato soffocato dalla mancanza di dettagli meccanicistica. Come risultato, sono disponibili per attenuare il pregiudizio conclamata alcune opzioni.

Abbiamo così arruolato un animale piccolo, murino, modello di ischemia del midollo spinale, e danno da riperfusione ameglio caratterizzare la sua patogenesi. La maggior parte degli studi fino ad oggi hanno utilizzato modelli animali più grandi per caratterizzare questa lesione, vale a dire 4 ratto, coniglio 5, e maiale 6 modelli. Tuttavia, questi sono limitati dal loro costo, la complessità riproducibilità variabile, e, soprattutto, la mancanza di tecniche disponibili per la manipolazione genetica. Il più affidabile di questi modelli animali pubblicati coinvolge sottorenale bloccaggio trasversale dell'aorta addominale in conigli. Tuttavia, anteriori umano neuroni spinali spesso derivano il loro apporto vascolare da rami più prossimali 7. Variabile anatomia vascolare del midollo spinale in questi modelli aggiunge alla difficoltà di transizione loro risultati in uso clinico.

Questo manoscritto presenta un modello di paraplegia immediato o ritardato seguente toracica occlusione aortica che è clinicamente rilevante e facile da utilizzare. L'esposizione dell'arco aortico via mini sternotola mia è meno invasivo e può suscitare risultati altamente riproducibili con la morbilità e la mortalità minima. Mentre questo modello in non senza difficoltà e sfumature tecniche, questi possono essere superati con un'attenta dissezione e la manipolazione dei tessuti per produrre un modello di arto posteriore paralisi che può essere facilmente implementato.

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Protocol

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1. Preoperatoria Preparazione e Anestesia

  1. Assicurarsi di osservare la tecnica sterile durante tutta la procedura. Disporre tutti gli strumenti.
  2. Accendere il letto controllo della temperatura prima dell'induzione anestetica modo che possa riscaldare a temperatura appropriata (36,5 ° C). Accendere il monitor perfusione laser Doppler in modo che possa avviarsi durante l'induzione.
  3. Posizionare il mouse nella camera di induzione.
    1. Monitorare attentamente la frequenza respiratoria del mouse durante l'induzione.
    2. Non appena la frequenza respiratoria è rallentato visivamente, rimuovere il mouse dalla camera di induzione.
    3. Eseguire pizzico punta a valutare l'adeguatezza di anestetico.
  4. Con il mouse adeguatamente anestetizzato, mouse posto in posizione supina.
  5. Inserire la faccia nel cono e fissare tutte le estremità al tavolo di riscaldamento.
    1. Prestare particolare attenzione per garantire che le estremità sono fissate in posizione anatomica, senza deviatisu un lato. Se il mouse viene posizionato in modo improprio, è difficile evitare interna recisione arteria toracica durante sternotomia.
  6. Utilizzando tagliaunghie o disponibile in commercio crema depilatoria, eliminare i peli dal torace linea mediana e inferiore sinistro superficie ventrale estremità.
    1. Se si utilizza crema depilatoria, evitare di lasciare la crema sul posto per più di 30 secondi, possono verificarsi ustioni da alcali.
  7. Titolare volatili concentrazione vaporizzatore anestetico per mantenere l'anestesia adeguata.
    1. Frazioni vaporizzatore attesi sono compresi tra 1-5% con isoflurano con alto flusso O 2.
    2. Volatile concentrazione vaporizzatore di anestetico deve essere titolata per mantenere l'anestesia durante la stimolazione chirurgica pur mantenendo la respirazione spontanea.

2. Rettale Sonda Laser Doppler Placement

  1. Inserire sonda rettale lubrificato nel retto del mouse. Fissare in atto per operrativo letto.
  2. Regolare il letto riscaldamento per una temperatura rettale obiettivo di 36,5 ° C.
  3. Fai la piccola incisione sopra arteria femorale del mouse e sezionare la pelle dal tessuto sottocutaneo.
  4. Inserire la sonda Doppler laser su arteria femorale.
  5. Regolare la posizione della sonda finché il monitor perfusione registra maggiore di 800 unità di perfusione.
    1. Sonda fermamente sicuro al suo posto. Sonde impropriamente depositati possono avere misure falsamente bassa perfusione.

3. Dissezione aortica di Arch / Arteria succlavia

  1. Effettuare una incisione cutanea 2 centimetri al di sopra della sternale e delicatamente sezionare la pelle dal tessuto sottocutaneo.
  2. Sezionare la ghiandola sottomandibolare libero.
    1. Se si verifica sanguinamento, una leggera pressione può essere applicato con un batuffolo di cotone.
    2. Dividere la ghiandola sottomandibolare tramite linea mediana nel piano avascolare.
  3. Sollevare delicatamente sterno con una pinza e con il SCISSRUP fanno 1 centimetro sternotomia mediana attraverso la linea mediana dello sterno. Qualsiasi deviazione dalla linea mediana può causare emorragia interna dell'arteria mammaria che sarà difficile da controllare.
  4. Mettere 5-0 suture retrazione su ogni lato al bordo dello sterno e ritrarre sterno lateralmente garantire punti di sutura al letto di funzionamento. Evitare di posizionare suture retrazione troppo lateralmente per evitare pneumotorace.
  5. Utilizzando smussa muscoli cinghia libera lungo trachea. Il muscolo cinghia di sinistra può essere diviso con le forbici per migliorare l'esposizione.
  6. Sezionare liberare il timo dal tessuto circostante. Continuare smussa fino a quando le grandi navi sono visualizzati. Prestare la massima attenzione per evitare l'ingresso nello spazio pleurico.
  7. Posizionare i morsetti vascolari su arco aortico e all'arteria succlavia sinistra.
  8. Verificare il flusso distale è opportunamente interrotto. Questo sarà visto come una riduzione> 90% in unità di perfusione.
    1. Continua occlusione per desirosso per 4-8 min.
  9. Rimuovere il morsetto vascolare e verificare emostasi prima della chiusura del torace.

4. Chiusura della sternotomia e pelle

  1. Rimuovere la sutura svincolo sul lato sinistro del mouse.
  2. Chiudere la sternotomia con il giusto distacco sutura.
    1. Una singola sutura sternale (tramite il punto di svincolo precedentemente posizionato) è adeguata per la chiusura sternale. Posizionamento di un altro punto è inutile e aumenta i rischi di pneumotorace e di emorragia.
  3. Chiudere la pelle con l'esecuzione 5-0 punti.

5. Valutazione Recupero e postoperatoria

  1. Trasferire il mouse per gabbia di recupero. Gabbia deve essere posto su una piastra elettrica per aumentare la temperatura della camera di recupero e ridurre la perdita di calore verso l'ambiente.
  2. Seguire da vicino il mouse per i segni distress respiratorio o attività convulsiva. Somministrare analgesia secondo le linee guida dell'istituzione. Euthatopi scere immediatamente se si osservano sequestro o distress respiratorio.
    1. CO eutanasia a 2 camere è il nostro metodo preferito. Dislocazione cervicale è un'altra opzione se CO 2 non è disponibile.
    2. Recupero totale può essere prevedibile in 1-2 ore, a seconda della lunghezza di anestetico volatile e concentrazione usata.
  3. Riportare il mouse per gabbia normale. Disporre il cibo e posto acqua sul pavimento della gabbia.
  4. Valutare lo stato neurologico, ad intervalli di 12 h con Basso mouse Scale for Locomotion 8.

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Representative Results

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Topi subito un intervento chirurgico sham (n = 3) o occlusione aortica per 4 (n = 3) per 8 min (n = 3). Topi dopo l'intervento sono stati classificati con il punteggio Basso Mouse (Figura 1). I topi sottoposti a chirurgia simulata non avevano deficit funzionali osservabili in qualsiasi momento dopo l'intervento. I topi sottoposti a ischemia moderata (4 min) avevano vicino normale funzione arti posteriori a 12 ore con il declino funzionale progressivo alla paralisi completa per 48 ore. Mice in gruppo ischemia prolungata (8 minuti) ha avuto la paralisi completa dopo l'intervento chirurgico, senza alcuna funzione di recupero (Figura 2).

Figura 1
Figura 1. Basso Nota per la funzione Hind Arto motore 8. Sistema di punteggio per arto posteriore neurologico disfunzione graduata da 0 (nessuna funzione) a 9 (functi normalea). Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

Figura 2
Figura 2. Funzione postoperatoria Hind-Limb. La gravità del deficit neurologico è stata classificata con il Basso mouse scala ad intervalli di 12 h dopo l'intervento fino a 48 ore. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

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Discussion

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Paraplegia secondaria di midollo spinale ischemia riperfusione è il risultato di un complesso di patologie poco conosciute 9. Mentre questo è più frequente dopo chirurgia dell'aorta toraco, una varietà di altri insulti come dissezioni aortiche, traumi, fenomeni embolici, vasculite, ipotensione sistemica e 10 può causare paraplegia. Per ottenere una maggiore comprensione di questo pregiudizio e fornire obiettivi futuri per eliminare questo pregiudizio, i modelli animali sono diventati una necessità.

I pazienti affetti da questa complicanza mostra sia una paralisi immediato o ritardato. Questo modello e altri adeguatamente parallelo 11 la distribuzione bimodale della paralisi visto clinicamente. Mentre ischemia moderata (4 min) ha prodotto una paralisi differite, ischemia prolungata (8 min) ha comportato una paralisi immediata e permanente.

Il modello presentato ha vantaggi rispetto a quelli che richiedono alateral toracotomia 12,13. L'esposizione sternotomia mediana lascia la cavità pleurica intatta ed elimina la necessità di intubazione tracheale o ristabilire la pressione negativa nello spazio pleurico. Clinicamente, la sternotomia è associato con molto meno dolore postoperatorio in rispetto alla toracotomia laterale e potrebbe ridurre il fabbisogno di analgesici postoperatori.

Questo modello non è senza limiti. Come per gli altri modelli, la chirurgia murino ha una curva di apprendimento e una buona tecnica chirurgica è un imperativo. I topi possono soccombere rapidamente se la dissezione non è fatto con cura. Le cause più comuni di mortalità intraoperatoria sono emorragia o pneumotorace. Per evitare emorragie potenzialmente fatali sternotomia deve essere effettuato linea mediana. Se la sternotomia è fatta troppo lateralmente, si può verificare una transazione delle arterie mammarie interne e conseguente emorragia. Inoltre, dissezione approssimativa di aorta discendente e succlavia può provocare emorragia del sarà diffit o impossibile da controllare. Pneumotorace sono un'altra complicazione potenzialmente fatale. Questi si verificano in genere durante il posizionamento di suture retrazione o dissezione dell'aorta. Se suture retrazione sono luogo troppo lateralmente o aortico non è sezionato con cura un pneumotorace può verificarsi e sono universalmente fatale.

Ulteriori misure devono essere adottate per garantire la riproducibilità. Normotermia è critica. Durante la chirurgia topi sono quanto più vicino a 36,5 ° C possibile. Anche lieve ipotermia è stato indicato per avere significativi effetti neuroprotettivi in modelli midollo spinale e ictus 14,15. Inoltre, le misurazioni laser Doppler devono essere strettamente monitorati e topi con riduzione di solo il 90% del flusso distale dovrebbero essere inclusi per il confronto. Occlusione incompleta dei dell'aorta o delle arterie succlavia può risultati in flussi più elevati distali e risultati che sono altamente variabili.

In conclusione, il modello murino di lower estremità paralisi presentato può essere facilmente adottato, ottenendo risultati altamente riproducibili. Applicazioni di questo modello possono fornito l'investigatore con un mezzo per studiare la paralisi immediata e ritardata. Inoltre, l'adozione di questo modello potrebbe rivelarsi utile nella lotta contro questa devastante complicazione.

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Disclosures

Gli autori dichiarano interessi finanziari concorrenti.

Acknowledgments

Vorremmo ringraziare la Fondazione Chirurgia Toracica di Ricerca e Formazione per il loro sostegno finanziario di questo progetto.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
VMS Anesthesia Machine MDS Matrx
Isoflurane Vet One 13985-528-60 2.0% through nose cone 
Induction Chamber Vet Equip 941444
Heating Bed Vestavia Scientific
Lazer Doppler Monitor Moor Instruments VMS-LDF1
5-0 Suture, Polyester Surgidac VD-551 Taper Needle
Microdissecting Clips Biomedical Research Instruments 14-1030, 14-1060
Surgical Instruments Fine Surgical Instruments Forceps, needle holder

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References

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Bell, M. T., Reece, T. B., Smith, P. D., Mares, J., Weyant, M. J., Cleveland Jr., J. C., Freeman, K. A., Fullerton, D. A., Puskas, F. Reproducable Paraplegia by Thoracic Aortic Occlusion in a Murine Model of Spinal Cord Ischemia-reperfusion. J. Vis. Exp. (85), e50910, doi:10.3791/50910 (2014).More

Bell, M. T., Reece, T. B., Smith, P. D., Mares, J., Weyant, M. J., Cleveland Jr., J. C., Freeman, K. A., Fullerton, D. A., Puskas, F. Reproducable Paraplegia by Thoracic Aortic Occlusion in a Murine Model of Spinal Cord Ischemia-reperfusion. J. Vis. Exp. (85), e50910, doi:10.3791/50910 (2014).

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