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Medicine

Paraplejia reproducible por la oclusión de la aorta torácica en un modelo murino de la médula espinal por isquemia-reperfusión

doi: 10.3791/50910 Published: March 3, 2014

Summary

La falta de comprensión mecanicista de la médula espinal lesión por isquemia-reperfusión ha obstaculizado otros aditamentos para prevenir la paraplejia después de las operaciones de aorta de alto riesgo. Por lo tanto, el desarrollo de modelos animales es imperativo. Este manuscrito demuestra menor parálisis de las extremidades reproducible después de la oclusión de la aorta torácica en un modelo murino.

Abstract

Fondo
Parálisis de las extremidades inferiores sigue complicando las intervenciones de aorta. La falta de comprensión de la patología subyacente ha obstaculizado los avances para disminuir la incidencia de esta lesión. El modelo actual demuestra menor parálisis de las extremidades reproducible después de la oclusión de la aorta torácica.

Métodos
Ratones C57BL6 macho adultos fueron anestesiados con isoflurano. A través de una incisión cervicosternal la aorta fue expuesto. Las arterias aorta y subclavia izquierda torácica descendente se identificaron sin entrada en el espacio pleural. Esqueletonización de estas arterias fue seguido por el cierre inmediato (Sham) u oclusión de 4 min (isquemia moderada) o 8 min (isquemia prolongada). La esternotomía y la piel se cerraron y el ratón fue trasladado a la cama calentamiento para la recuperación. Después de la recuperación, el análisis funcional se obtuvo a los 12 intervalos h hasta las 48 h.

Resultados jove_content
Los ratones que fueron sometidos a cirugía simulada mostraron ningún déficit de las extremidades posteriores observable. Los ratones sometidos a isquemia moderada durante 4 min tuvieron déficit funcional mínima en 12 horas, seguido de la progresión a la parálisis completa a las 48 h. Los ratones sometidos a isquemia prolongada tenían una parálisis inmediata con ningún movimiento de las extremidades posteriores observable en cualquier punto en el postoperatorio. No había observado intraoperatoria o la mortalidad postoperatoria.

Conclusión
Reproducible inferior parálisis de las extremidades sean inmediatos o diferidos se puede lograr en un modelo murino. Además, mediante el uso de una esternotomía mediana y disección cuidadosa, las altas tasas de supervivencia, y reproducibilidad que se puede lograr.

Introduction

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Parálisis de las extremidades inferiores sigue complicando intervenciones toracoabdominal. La lesión, conocida como la médula espinal lesión por isquemia-reperfusión (SCIR), resulta en la parálisis en hasta el 20% de los pacientes de alto riesgo 1. Auxiliares quirúrgicas como el bypass cardíaco izquierdo, lumbar fluido drena cerbrospinal, paro circulatorio hipotérmico y reimplantación de la arteria intercostal han reducido la incidencia de esta complicación 2, sin embargo, demasiados pacientes continúan siendo afectados.

Clínicamente, la isquemia de la médula espinal y lesión por reperfusión se considera como inmediata o tardía parálisis después de la intervención 3. Sin embargo, nuestra comprensión de esta lesión ha sido sofocado por la falta de detalles mecanicista. Como resultado, algunas opciones están disponibles para atenuar el daño una vez que ha ocurrido.

Así, hemos alistado un animal pequeño, modelo murino de isquemia de la médula espinal, y la lesión de reperfusión amejor caracterizar su patogénesis. La mayoría de los estudios hasta la fecha han utilizado modelos animales más grandes para caracterizar esta lesión, a saber, la rata 4, 5 conejo, cerdo y 6 modelos. Sin embargo, éstos están limitados por su coste, la complejidad, la reproducibilidad variable y, lo más importante, la falta de técnicas disponibles para la manipulación genética. El más fiable de estos modelos animales publicados implica pinzamiento cruzado de infrarrenal de la aorta abdominal en conejos. Sin embargo, anteriores humano neuronas espinales más a menudo obtienen su suministro vascular de las ramas más proximales 7. Anatomía vascular variable de la médula espinal en estos modelos añade a la dificultad en la transición de sus resultados en el uso clínico.

Este manuscrito presenta un modelo para la paraplejía inmediata o retardada después de la oclusión de la aorta torácica que es clínicamente relevante y fácil de emplear. Exposición del arco aórtico a través de mini sternotomi es menos invasivo y puede provocar resultados altamente reproducibles con mínima morbilidad y mortalidad. Si bien este modelo en no sin problemas y matices técnicos, éstos se pueden superar con una cuidadosa disección y manipulación de tejidos para producir un modelo de parálisis de las extremidades posteriores que se puede implementar fácilmente.

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Protocol

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1. Preparación preoperatoria y anestesia

  1. Asegúrese de seguir una técnica estéril durante todo el procedimiento. Coloque todos los instrumentos.
  2. Girar en la cama control de la temperatura antes de la inducción de la anestesia de modo que pueda calentar a la temperatura apropiada (36,5 ° C). Potencia en el monitor de perfusión Doppler láser de modo que puede arrancar durante la inducción.
  3. Coloque el ratón en la cámara de inducción.
    1. Controle cuidadosamente la frecuencia respiratoria del ratón durante la inducción.
    2. Tan pronto como la frecuencia respiratoria se ha ralentizado visualmente, quitar el ratón de la cámara de inducción.
    3. Realice pizca dedo del pie para evaluar la adecuación de la anestesia.
  4. Con el ratón adecuadamente anestesiado, el lugar del ratón en la posición supina.
  5. Inserte cara en cono de la nariz y asegure todas las extremidades a la mesa de la calefacción.
    1. Preste especial atención a que las extremidades están asegurados en posición anatómica, sin deviatia un lado. Si el ratón está colocado de forma incorrecta, es difícil evitar la transección de la arteria torácica interna durante la esternotomía.
  6. El uso de máquinas de cortar o crema de depilación disponibles en el mercado, eliminar el vello del tórax en la línea media y la parte inferior izquierda la superficie ventral de la extremidad.
    1. Si se usa crema de depilación, evite dejar la crema en su lugar por más de 30 segundos, se pueden producir quemaduras como alcalinos.
  7. Valorar concentración vaporizador anestésico volátil para mantener la anestesia adecuada.
    1. Fracciones vaporizador esperados son entre 1-5% utilizando isoflurano con alto flujo de O2.
    2. Concentración vaporizador anestésico volátil debe ajustarse para mantener la anestesia durante la estimulación quirúrgica, manteniendo la respiración espontánea.

2. Colocación Laser Doppler sonda rectal

  1. Inserte la sonda rectal lubricado en el recto del ratón. Asegure en su lugar para operAting cama.
  2. Ajuste la cama de calefacción para una temperatura rectal objetivo de 36,5 ° C.
  3. Hacer de la pequeña incisión sobre la arteria femoral del ratón y diseccionar la piel lejos del tejido subcutáneo.
  4. Inserte la sonda Doppler láser sobre la arteria femoral.
  5. Ajuste las posiciones de la sonda hasta que el monitor de perfusión registra mayor que 800 unidades de perfusión.
    1. Sonda firmemente en su lugar. Sondas fijado en forma incorrecta puede tener mediciones falsamente baja perfusión.

3. La disección del arco aórtico / arteria subclavia

  1. Haga una incisión en la piel 2 cm por encima de la horquilla esternal y suavemente diseccionar la piel lejos del tejido subcutáneo.
  2. Diseccionar la glándula submandibular libre.
    1. Si se presenta sangrado, presionar con suavidad puede ser aplicado con un algodón.
    2. Divida la glándula submandibular a través de la línea media en el plano avascular.
  3. Levante suavemente el esternón con pinzas y con el scissSRO hacen 1 cm esternotomía media a través de la línea media del esternón. Cualquier desviación de la línea media puede resultar en hemorragia de la arteria mamaria interna que será difícil de controlar.
  4. Coloque 5-0 suturas de retracción en cada lado en el borde del esternón y retraer esternón asegurar lateralmente suturas a la cama en funcionamiento. Evite colocar suturas de retracción demasiado lateralmente para prevenir el neumotórax.
  5. Utilizando disección roma músculos correa libre a lo largo tráquea. El músculo correa de la izquierda se puede dividir con tijeras para mejorar la exposición.
  6. Diseccionar liberar el timo del tejido circundante. Continuar disección roma hasta que se visualizan los grandes vasos. Tenga mucho cuidado para evitar la entrada en el espacio pleural.
  7. Coloque las abrazaderas vasculares en el arco aórtico y la arteria subclavia izquierda.
  8. Verifique el flujo distal ha interrumpido de manera apropiada. Esto será visto como una reducción> 90% en unidades de perfusión.
    1. Continuar oclusión de desirojo para 4-8 min.
  9. Sacar la pinza vascular y verificar hemostasia antes del cierre del pecho.

4. Cierre de esternotomía y la piel

  1. Retire la sutura de retracción en el lado izquierdo del ratón.
  2. Cierre la esternotomía con la sutura de retracción derecha.
    1. Una sola sutura esternal (usando la puntada de retracción colocado previamente) es adecuada para el cierre esternal. Colocar otra puntada es innecesario y aumenta los riesgos de neumotórax y hemorragia.
  3. Cerrar la piel con el funcionamiento de 5-0 puntada.

5. Evaluación y Recuperación postoperatoria

  1. Transferir el ratón para jaula de recuperación. Jaula debe ser colocado sobre una almohadilla de calentamiento para aumentar la temperatura ambiente de la cámara de recuperación y reducir la pérdida de calor al medio ambiente.
  2. Vigilar de cerca el ratón en busca de signos de dificultad respiratoria o la actividad convulsiva. Administrar la analgesia por directrices de la institución. Eutharatones nize inmediatamente si se observan convulsiones o dificultad respiratoria.
    1. CO 2 eutanasia cámara es nuestro método preferido. La dislocación cervical es otra opción si el CO 2 no está disponible.
    2. La recuperación completa se puede esperar en 1-2 horas, dependiendo de la longitud de anestésico volátil y la concentración usada.
  3. Devuelva el ratón para jaula normal. Coloque los alimentos y el lugar de agua en el suelo de la jaula.
  4. Evaluar el estado neurológico a intervalos de 12 h utilizando Basso Ratón Escala de Locomotion 8.

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Representative Results

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Los ratones se sometieron a cirugía simulada (n = 3) o de oclusión aórtica para 4 (n = 3) a 8 min (n = 3). Los ratones después de la operación se calificaron por el Score Basso ratón (Figura 1). Los ratones que fueron sometidos a cirugía simulada no tenían déficits funcionales observables en cualquier momento después de la operación. Los ratones sometidos a isquemia moderada (4 min) tenían cerca de la función normal de las extremidades posteriores, a las 12 horas con el deterioro funcional progresivo a la parálisis completa por 48 horas. Los ratones en el grupo de isquemia prolongada (8 min) tenía parálisis completa después de la cirugía sin ninguna función recuperable (Figura 2).

Figura 1
Figura 1. Basso Puntuación de Función Hind extremidades Motor 8. Sistema de puntuación para la extremidad posterior disfunción neurológica graduada de 0 (sin función) a 9 (functi normaleson). Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Figura 2
Figura 2. Función postoperatorio de las extremidades posteriores. La gravedad del déficit neurológico se clasificó utilizando el ratón Basso escala a intervalos de 12 h después de la operación hasta 48 horas. Haz clic aquí para ver la imagen más grande.

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Discussion

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Paraplejia secundaria a la médula reperfusión isquemia de la médula es el resultado de un complejo de patologías poco comprendidos 9. Si bien esto es más frecuente después de la cirugía de la aorta toracoabdominal, una variedad de otros insultos tales como las disecciones de aorta, traumatismos, fenómenos embólicos, vasculitis, y la hipotensión sistémica 10 puede resultar en paraplejia. Para lograr una mejor comprensión de esta lesión y proporcionar objetivos futuros para eliminar esta lesión, los modelos animales se han convertido en una necesidad.

Los pacientes afectados por esta exposición complicación ya sea una parálisis inmediata o retardada. Este modelo y otros paralelos 11 adecuadamente la distribución bimodal de parálisis visto clínicamente. Mientras que la isquemia moderada (4 min) produce una parálisis retraso, la isquemia prolongada (8 min) dio como resultado una parálisis inmediata y permanente.

El modelo presentado tiene ventajas en comparación con aquellos que requieren colateral toracotomía 12,13. La mediana de exposición esternotomía sale de la cavidad pleural intacta y elimina la necesidad de intubaciones traqueales o el restablecimiento de la presión negativa en el espacio pleural. Clínicamente, la esternotomía se asocia con menos dolor postoperatorio en los que la toracotomía lateral y podría reducir la necesidad de analgésicos postoperatorios.

Esta modelo no está exento de limitaciones. Al igual que con otros modelos, la cirugía murino tiene una curva de aprendizaje y una buena técnica quirúrgica es imprescindible. Los ratones pueden sucumbir rápidamente si la disección no se hace con cuidado. Las causas más comunes de mortalidad intraoperatoria son hemorragia o neumotórax. Para evitar una hemorragia potencialmente mortal la esternotomía se debe hacer en la línea media. Si la esternotomía se hace demasiado lateralmente se puede producir una operación de las arterias mamarias internas y la posterior hemorragia. Además, la disección de la aorta descendente áspero y subclavia arteria puede resultar en una hemorragia la habrá dificultadest o imposible de controlar. El neumotórax es una complicación potencialmente mortal. Estos normalmente se producen durante la colocación de las suturas de retracción o la disección de la aorta. Si las suturas de retracción son lugar demasiado lateralmente o del arco aórtico no se diseca con cuidado un neumotórax puede ocurrir y son universalmente fatal.

Otras medidas tienen que ser empleadas para asegurar la reproducibilidad. Normotermia es crítica. Durante la cirugía los ratones se mantienen tan cerca de 36,5 ° C como sea posible. Incluso hipotermia leve se ha demostrado en tener efectos neuroprotectores significativos en modelos de accidente cerebrovascular 14,15 médula espinal y. Por otra parte, las mediciones Doppler láser deben ser monitoreados de cerca y ratones con reducción de sólo el 90% en el flujo distal deben ser incluidos para la comparación. Oclusión incompleta de las arterias aorta o subclavia pueden resultados en mayores flujos distales y resultados que son altamente variables.

En conclusión, el modelo murino de lparálisis de las extremidades ower presentado puede ser adoptado fácilmente, produciendo resultados altamente reproducibles. Las aplicaciones de este modelo pueden proporcionada al investigador con un medio para estudiar la paralización inmediata y retardada. Por otra parte, la adopción de este modelo podría resultar beneficioso en la lucha contra esta devastadora complicación.

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Disclosures

Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.

Acknowledgments

Nos gustaría dar las gracias a la Fundación de Cirugía Torácica para la Investigación y la Educación por su apoyo financiero a este proyecto.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
VMS Anesthesia Machine MDS Matrx
Isoflurane Vet One 13985-528-60 2.0% through nose cone 
Induction Chamber Vet Equip 941444
Heating Bed Vestavia Scientific
Lazer Doppler Monitor Moor Instruments VMS-LDF1
5-0 Suture, Polyester Surgidac VD-551 Taper Needle
Microdissecting Clips Biomedical Research Instruments 14-1030, 14-1060
Surgical Instruments Fine Surgical Instruments Forceps, needle holder

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References

  1. Conrad, M. F., Ye, J. Y., Chung, T. K., Davison, J. K., Cambria, R. P. Spinal cord complications after thoracic aortic surgery: long-term survival and functional status varies with deficit severity. J. Vasc. Surg. 48, 47-53 (2008).
  2. Okita, Y. Fighting spinal cord complication during surgery for thoracoabdominal aortic disease. Gen. Thorac. Cardiovasc. Surg. 59, 79-90 (2011).
  3. Wong, D. R., et al. Delayed spinal cord deficits after thoracoabdominal aortic aneurysm repair. Ann. Thorac. Surg. 83, 1345-1355 (2007).
  4. Taira, Y., Marsala, M. Effect of proximal arterial perfusion pressure on function, spinal cord blood flow, and histopathologic changes after increasing intervals of aortic occlusion in the rat. Stroke. 27, 1850-1858 (1996).
  5. Naslund, T. C., Hollier, L. H., Money, S. R., Facundus, E. C., Skenderis, B. S. Protecting the ischemic spinal cord during aortic clamping. The influence of anesthetics and hypothermia. Ann. Surg. 409-515 (1992).
  6. Qayumi, A. K., Janusz, M. T., Lyster, D. M., Gillespie, K. D. Animal model for investigation of spinal cord injury caused by aortic cross-clamping. J. Invest. Surg. 10, 47-52 (1997).
  7. Lang-Lazdunski, L., Matsushita, K., Hirt, L., Waeber, C., Vonsattel, J. P., Moskowitz, M. A., Dietrich, W. D. Spinal Cord Ischemia: Development of a model in the mouse. Stroke. 31, 208-213 (2000).
  8. Basso, D. M., Fisher, L. C., Anderson, A. J., Jakeman, L. B., McTigue, D. M., Popovich, P. G. Basso Mouse Scale for locomotion detects differences in recovery after spinal cord injury in five common mouse strains. J. Neurotrauma. 23, 635-659 (2006).
  9. Kwon, B. K., Tetzlaff, W., Grauer, J. N., Beiner, J., Vaccaro, A. R. Pathophysiology and pharmacologic treatment of acute spinal cord injury. Spine. J. 4, 451-464 (2004).
  10. Cheshire, W. P., Santos, C. C., Massey, E. W., Howard, J. F. Spinal cord infarction: etiology and outcome. Neurology. 47, 321-330 (1996).
  11. Kakinohana, M., et al. Delayed paraplegia after spinal cord ischemic injury requires caspase-3 activation in mice. Stroke. 42, (8), 2302-2307 (2011).
  12. Wang, Z., Yang, W., Britz, G. W., Lombard, F. W., Warner, D. S., Sheng, H. Development of a simplified spinal cord ischemia model in mice. J. Neurosci. Methods. 189, 246-251 (2010).
  13. model of ischemic spinal cord injury with delayed paralysis caused by aortic cross-clamping. Anesthesiology. 113, 880-891 (2010).
  14. Kang, J., et al. The effects of systemic hypothermia on a murine model of thoracic aortic ischemia reperfusion. J. Vasc. Surg. 52, 435-443 (2010).
  15. Li, J., Benashski, S., McCullough, L. D. Post-stroke hypothermia provides neuroprotection through inhibition of AMP-activated protein kinase. J. Neurotrauma. 28, (7), 1281-1288 (2011).
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Cite this Article

Bell, M. T., Reece, T. B., Smith, P. D., Mares, J., Weyant, M. J., Cleveland Jr., J. C., Freeman, K. A., Fullerton, D. A., Puskas, F. Reproducable Paraplegia by Thoracic Aortic Occlusion in a Murine Model of Spinal Cord Ischemia-reperfusion. J. Vis. Exp. (85), e50910, doi:10.3791/50910 (2014).More

Bell, M. T., Reece, T. B., Smith, P. D., Mares, J., Weyant, M. J., Cleveland Jr., J. C., Freeman, K. A., Fullerton, D. A., Puskas, F. Reproducable Paraplegia by Thoracic Aortic Occlusion in a Murine Model of Spinal Cord Ischemia-reperfusion. J. Vis. Exp. (85), e50910, doi:10.3791/50910 (2014).

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