Summary
We hebben een techniek voor picoinjecting microfluïdische druppels die metalen elektroden niet vereist ontwikkeld. Als zodanig hulpmiddelen die onze techniek eenvoudiger te fabriceren en te gebruiken.
Abstract
Bestaande methoden voor picoinjecting reagentia in microfluïdische druppels vereisen metalen elektroden geïntegreerd in de microfluïdische chip. De integratie van deze elektroden voegt omslachtig en foutgevoelig stappen om het apparaat fabricageproces. We hebben een techniek die de behoefte aan metalen elektroden ondervangt tijdens picoinjection ontwikkeld. In plaats daarvan gebruikt de injectievloeistof zelf als elektrode, aangezien de meeste biologische reagentia bevatten opgeloste elektrolyten en geleidend. Door het elimineren van de elektroden, verminderen we apparaat fabricage tijd en complexiteit, en maken de apparaten meer robuust. Bovendien, onze benadering het injectievolume is afhankelijk van de spanning op de picoinjection oplossing; Dit stelt ons in staat om het volume geïnjecteerd door het moduleren van de aangelegde spanning snel aan te passen. We zien dat onze techniek verenigbaar met reagentia daarin gemeenschappelijke biologische verbindingen, waaronder buffers, enzymen en nucleïnezuren.
Introduction
In-druppel op basis microfluidics, worden micronschaal waterige druppeltjes gebruikt als "reageerbuizen" voor biologische reacties. Het voordeel van het uitvoeren van reacties in de kleine druppeltjes is dat elke druppel gebruikt slechts een paar pl van reagens en, met microfluidics, kunnen de druppels worden gevormd en verwerkt op kilohertz tarieven 1. Gecombineerd, deze eigenschappen kunnen miljoenen reacties met individuele cellen, nucleïnezuurmoleculen of verbindingen worden uitgevoerd in enkele minuten met ui totaal materiaal.
Druppels voor toepassingen zoals deze te gebruiken, zijn technieken die nodig zijn voor gecontroleerde hoeveelheden reagentia toe te voegen aan de druppels; dergelijke operaties zijn analoog aan pipetteren in reageerbuizen. Een werkwijze voor het bereiken is electrocoalescence, waarbij een druppel reagens wordt samengevoegd met het doel druppel aanleggen van een elektrisch veld. Het elektrische veld verstoort de rangschikking van oppervlakte-actieve moleculen op de interfaces van de druppels, inducing een dunne film instabiliteit en triggering coalescentie in emulsies die anders stabiel 2 zijn. Elektrisch geïnduceerde samenvoegen wordt ook benut in het ontwerp van de picoinjector, een apparaat dat reagentia injecteert in druppels als zij door een druk kanaal 3 stroomt. Om het elektrisch veld, picoinjector apparaten maken gebruik van metalen elektroden, maar de integratie van metalen elektroden in microfluïdische chips is vaak een complex en foutgevoelig proces als de vloeistof-soldeer draden gemakkelijk worden aangetast door luchtbellen of stof en ander vuil in het kanaal , evenals breuken van stress of buigen tijdens de installatie-apparaat.
Hier presenteren we een methode om picoinjection voeren zonder het gebruik van metalen elektroden, waardoor de fabricage eenvoudiger en robuuster. Om picoinjection triggeren, we gebruiken in plaats van de injectie vloeistof zich als een elektrode, aangezien de meeste biologische reagentia bevatten opgeloste elektrolyten en zijn geleidend. We voegen ook een "Faraday Moat "gevoelige gebieden van het apparaat en fungeren als een universele grond (figuur 1) af te schermen. moat elektrisch isoleert de druppeltjes stroomopwaarts van de picoinjection plaats door middel van een grond, het voorkomen van onbedoelde druppel fusie. Een bijkomend voordeel van onze techniek is dat de volume geïnjecteerd in de druppels hangt af van de grootte van de aangelegde spanning, waardoor het kan worden bijgesteld door het afstemmen van het toegevoerde signaal.
Wij fabriceren onze toestellen in poly (dimethylsiloxaan) (PDMS) met behulp van zachte fotolithografische technieken 4,5. Onze aanpak is compatibel met apparaten vervaardigd in andere materialen, zoals harsen, kunststoffen en epoxy. De kanalen hebben hoogtes en breedtes van 30 micrometer, die optimaal zijn voor het werken met druppeltjes 50 micrometer in doorsnede (65 pl) zijn. We introduceren reagentia via polyethyleen buis (0.3/1.09 mm binnen / buitendiameter) ingebracht in havens gemaakt tijdens apparaat fabricage met 0,50 mm biopsie stoten, vergelijkbaar met methoden descrIBED eerder 5. De exacte samenstelling van de injectievloeistof afhankelijk van de specifieke toepassing. De vloeistof hoeft alleen bevatten opgeloste elektrolyten bij concentraties hoog genoeg om voldoende geleidbaarheid opleveren voor de elektrische signaal naar de picoinjector te zenden. In benchtests hebben wij gevonden dat ionische concentraties hoger dan 10 mM moeten volstaan 6, hoewel deze waarde en de geleidbaarheid fluïdum afhangen van de specifieke afmetingen inrichting en grootte van de aangelegde spanning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Ontwerp Afmetingen van het apparaat en topologieën, gebaseerd op experimentele behoefte met behulp van Computer Aided Design (CAD)-software
Opmerking: Selecteer emulsie kanaal diameters kleiner dan die van de sferische druppels. Dit dwingt de druppels in een cilindrische of "worst"-vorm en zorgt voor meer effectieve picoinjection. Voor ons doel, ontwierpen wij 30 x 30 micrometer kanalen voor druppels die 50 micrometer in doorsnede waren.
- Model picoinjection site (s) na die beschreven door Abate et al.. 3 behalve dat de kanalen van de metalen elektroden verwijderd, omdat ze overbodig.
- Naar kanalen dienen als Faraday Gracht (figuur 1) die werken tussen picoinjection site (s) en de stroomopwaartse emulsie zodat zij beschermen de druppeltjes uit het elektrische veld.
Opmerking: Dit voorkomt onbedoelde samenvoeging.
2. Fabricate apparaten gebruiken Soft Photolithographic Technieken
- Genereer een transparantie fotolithografie masker op basis van het CAD-bestand met behulp van bestaande commerciële diensten.
- Met het fotomasker, behandelings fotolak op silicium wafers op een inrichting meester produceren, zoals eerder beschreven 4.
- Giet PDMS gemengd met verharder (11:01 verhouding) over het apparaat meester in een 5 cm polystyreen petrischaal.
- Plaats de master met PDMS in een vacuüm exsiccator voor ongeveer 15 min om eventuele luchtbellen te verwijderen.
- Hard de PDMS apparaat door deze in een 95 ° C oven gedurende 1 uur. Als alternatief zal de PDMS uitharden bij kamertemperatuur na 24 uur.
- Verwijder het apparaat door te snijden in de omtrek met een chirurgisch mes en zorgvuldig schillen van de inrichting van de master.
- Punch en uitlaat gaten in de PDMS met behulp van een 0,5 mm biopsie punch.
- Bond het apparaat op een glazen objectglaasje met behulp van een plasma-bonder 4.
3. Bereid een LuchtdrukPompbesturing naar een reservoir dat de Fluid op druk
- Wijzig de pomp uitgang, zodat de samengeperste lucht verlaat via een lengte van 2,7 mm binnendiameter polyethyleen buis.
- Construeren zodat de buis eindigt bij een Luer-lock spuit door het aanbrengen van het lumen via nippel op de achterkant van het luer-lock.
- Seal door de ruimte tussen de luer-lock draden en buis met epoxy.
- Bevestig een 27.5 G naald.
4. Bereid een Monodisperse emulsie van waterige (water-in-olie) Druppeltjes gesuspendeerd in een inert gefluoreerde vervoerder olie met 2% (gew / gew) opgelost Biocompatibele Oppervlakteactieve 7
De specifieke reagentia in deze druppels afhankelijk van de toepassing
- Ter voorbereiding van herinjectie, laadt de emulsie in een 1 ml spuit met een 27,5 G naald.
- Bevestig de spuit in een injectiepomp en oriënteren de pomp verticaal (naald naar boven).
Noot: Deze oriëntatie zorgt ervoor dat de druppels in te pakken in een laag boven de vervoerder olie. Wanneer de pomp wordt gestart, zal de druppels uit de spuit worden geduwd hoge volumefractie van de olielaag eronder.
5. Bereid Reagentia voor Inleiding tot de Microfluidic Chip
- Punch drie 0,5 mm gaten in de kap van een 15 ml centrifugebuis (een houder met een schroefdop is voldoende) met een biopsie punch, de naald of boor.
- Plaats een 0,5 mm draadelektrode en ~ 20 cm lengte van PE-slang 2 via twee van de gaten zodat zij de bodem van de buis bereikt.
- In de resterende gat, draad een ~ 2,5 cm van een ~ 20 cm lengte van de PE buis zodanig dat het zal rusten boven het vloeistofniveau.
- Verzegelen de openingen van de bovenkant van de dop met UV-uithardende epoxy.
- De buis wordt met de picoinjection vloeistof en schroef op de dop.
- Verbind de uitgang van de lucht-drukregeling pomp naar de kortere lengte van de slang door inserting van de naald in het lumen. De naald moet goed passen.
- Vul een 1 ml spuit met 1 M NaCl om te dienen als Faraday Gracht.
- Sluit een 27.5 G naald en zet de spuit in een injectiepomp.
- Vul een 1 ml spuit met vervoerder / spacer olie, sluit een 27.5 G naald en zet deze in een injectiepomp.
6. Bereid de microfluïdische apparaat voor Picoinjection
- Verbind de uitgang buis (langere) vanaf het injectievloeistof container naar de inlaatpoort van de picoinjection vloeistof op het microfluïdische chip.
- Sluit de spuit met de 1 M NaCl aan de inlaatpoort van de Faraday Gracht op microfluïdische chip met een lengte van PE slang.
- Sluit de spuit met de vervoerder olie aan de inlaatpoort van de microfluïdische chip met een lengte van PE slang.
- Plaats PE slang in de emulsie uitlaatpoort op de microfluïdische chip. Het slangetje moet eindigen in een emulsie collectie vaartuig, nochMally een 1,5 ml centrifugebuis.
- Plaats PE slang in de uitlaat poort voor de Faraday Moat op de microfluïdische chip. Het slangetje moet eindigen in een niet-geleidend en elektrisch geïsoleerde container naar een kortsluiting te voorkomen.
- Verbind de uitgang van de hoge-voltage (HV) versterker via poolklem op de metalen elektrode ondergedompeld in de vloeistof picoinjection.
- Verbind de massa-elektrode van de HV versterker via alligator clip om het metaal van de naald van de spuit met de 1 M NaCl.
7. Infuse reagentia in Microfluidic Chip
- Introduceer de 1 M NaCl (Faraday Moat) om het apparaat met een snelheid van 100 ul / uur.
- Introduceer de druppel emulsie en vervoerder olie aan tarieven die geschikt zijn voor de afmetingen apparaat. Voor onze demo-apparaat, introduceren we de druppels en olie op 200 en 400 pl / uur, respectievelijk. Het debiet moet het mogelijk maken de druppels naar de picoinjector passeren regelmatig gescheidendoor een spleet van de vervoerder olie.
- Stel de op de picoinjection fluïdum zodanig dat de vloeistofdruk aan de picoinjection opening in mechanisch evenwicht met het druppeltje kanaal druk.
Let op: Bij deze druk (de Laplace druk), dient de injectie vloeistof uitpuilen in de druppel kanaal zonder ontluikende uit en vormen een eigen druppels (figuur 2). Op deze debieten hierboven beschreven we een druk van ~ 13 psi op de injectieplaats vloeistof evenwicht bereiken op de injectieplaats.
8. Begin Picoinjection
- Als druppels langs de injectie opening, breng dan een 0-10 V, 10 kHz, AC signaal versterkt 1000 x door de HV-versterker (figuur 3).
- Moduleren injectievolume door verandering van de amplitude van de aangelegde spanning.
Opmerking: Hogere voltages moet zorgen voor meer vloeistof te worden ingevoerd om de druppels. In onze tests, zien we een stabiele en consistente injectie bij spanningen zijntussen 100 en 3000 V met injectieoplossingen NaCI variërend 10-500 mM (Figuur 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Microscopische opnamen met de picoinjection site die elektrificatie van de picoinjection fluïdum voldoende injectie (fig. 2) te activeren. Het geïnjecteerde volume kan worden geregeld door het moduleren van de amplitude van de aangelegde spanning met hogere spanning waardoor hogere injectievolume. Wij plotten het injectievolume versus de grootte van de aangelegde spanning voor drie representatieve molariteiten van injectievloeistof in (figuur 3). De snelheid tonen onze werkwijze, we selectief geïnjecteerd druppels langs de injectieplaats naargelang de aanwezigheid of afwezigheid van een fluorescente kleurstof (Film 1). Druppels langs de injector op 200 Hz, maar zo hoog als 10 kHz mogelijk, afhankelijk van de mogelijkheden van de druppel detectiemechanisme 3.
We schrijven de afhankelijkheid van injectievolume van de aangelegde spanning op het feit dat als druppeltjes benaderen en laat de picoinjection opening, de dikte van de olielaag scheidt de druppel-interface van de uitstulping op de injectieplaats af 8. De drempelspanning voor een elektrisch geïnduceerde dunne-film instabiliteit is evenredig met de dikte van deze laag 9,10. Zoals de druppeltjes naderen de picoinjector, het moment van coalescentie afhankelijk van de grootte van het elektrische veld. Hogere toegepaste spanningen zorgen voor eerdere samensmelting tussen de druppel en injectievloeistof, waardoor langer injectie looptijden. Omdat het injectievolume is afhankelijk van de inspuitduur is ook belangrijk derhalve aangelegde spanning.
Lagere molariteit ionaire oplossingen gemakkelijker het toegevoerde signaal verzwakken en vermindering van de elektrische veldsterkte op de injectieplaats vergelijking met de meer geconcentreerde oplossingen. Bijgevolg injectie vloeistoffen met lagere molariteiten van opgeloste ionen vereisen hogere toegepaste spanningen op dezelfde injectieplaats volumes te bereiken. Deze relatiesheup aangetoond voor diverse ionische molariteiten en toegepaste spanningen in een 2D heatmap (figuur 4).
Figuur 1. Basis apparaat setup. Druppels, vervoerder olie en 1 M NaCl worden ingevoerd om het apparaat via een spuit pompen. De dicht op elkaar gepakte druppels gelijkmatig worden verdeeld met behulp van elementaire stroom-focus geometrie. Aangezien de druppeltjes langs de picoinjection site wordt een elektrisch veld opgewekt door toepassing van een AC signaal aan een elektrode aangebracht in het picoinjection vloeistofhouder (aangeduid in het rood). Het elektrische veld zorgt voor coalescentie tussen de passerende druppels en picoinjection vloeistof. Druppeltjes stroomopwaarts van de injectieplaats worden afgeschermd van het elektrische veld door de Faraday Moat - een kanaal van 1 M NaCl (elke hoge molariteit ionische oplossing zou voldoende moeten zijn) in conthandelen met de massa-elektrode van de HV versterker (aangegeven in het zwart). Afmetingen van het apparaat kan worden geschaald als dat nodig is; voor onze doeleinden, ontwierpen wij 30 x 30 micrometer kanalen (net stroomopwaarts van de injectie) voor druppels die 50 micrometer in diameter zijn.
Figuur 2. Helderveld microscopie foto van de picoinjection plaats. Bij afwezigheid van een elektrisch veld (A), surfactantmoleculen voorkomen coalescentie op de injectieplaats en een scheidslijn zichtbaar op de druppel / injectievloeistof interface. Bij toepassing van een 250 V AC 10 kHz signaal de grens verdwijnt en reagens wordt geïnjecteerd als de druppel doorgangen (B). Voor visualisatie is injectievloeistof gekleurd met 2 mg / ml broomfenolblauw kleurstof. Figuur heruitgegeven frOM 6 met toestemming van The Royal Society of Chemistry (RSC)
Figuur 3. Gegevens demonstreren de relatie tussen aangelegde spanning en volumefractie verhogen (Vf) druppels na injectie (A) 100 mM, (B) 50 mM en (C) 25 mM (NaCl) injectievloeistoffen. Sterkere elektrische velden meer gemakkelijk scheuren de olie / water-interfaces en laat injectie over een grotere lengte van de passerende druppels - dit leidt tot grotere injectie volumes. Hogere molariteiten opgeloste elektrolyten verhoging van de geleidbaarheid van de injectieoplossing produceren sterkere elektrische velden op de injectieplaats een bepaalde spanning, wat leidt tot verhoogde injectievolume. Error bars geven 1 standaarddeviatie in beide richtingen voor> 1200 druppels bemonsterd op elk punt. Verbindingslijnen datapunten doenelke curve-fit of berekende theoretische model niet vertegenwoordigen. Druppelvolume wordt gemeten met een fluorescentie detectiesysteem 6 beschreven. Figuur opnieuw gepubliceerd vanaf 6 met toestemming van The Royal Society of Chemistry (RSC). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
.. Figuur 4 Heat kaart waarop injectievolume als functie van de aangelegde spanning en de molariteit van NaCl opgelost in de injectievloeistof Het injectievolume kan worden aangepast in het bereik van 0-36 pl met een resolutie van ~ 2,6 pl (4% Vf ) met 100V stappen van het aangeboden signaal. De grootste geïnjecteerde volumina waren bij 3000 V en 100 mM vloeistof bereikt. Increasing elektrisch veld boven dit maakt electrowetting, waardoor druppels spontaan op picoinjector, bezwarende injectie efficiëntie en consistentie. Pijlen / teken geven datapunten. Figuur opnieuw gepubliceerd vanaf 6 met toestemming van The Royal Society of Chemistry (RSC)
Film 1. Hoge snelheid video tonen selectief schakelen van de picoinjector. Slechts druppels met IR-783 fluorescente kleurstof (2 mg / ml) geïnjecteerd met reagens (500 mM NaCl).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De relatie tussen geïnjecteerde volume en aangelegde spanning is afhankelijk van vele factoren, met afmetingen inrichting lengte van de buis die de picoinjection vloeistof naar de inrichting, molariteit van picoinjection vloeistof en de snelheid van de druppels als ze passeren zij injector. Om deze reden adviseren wij dat het volume / spanning relatie vóór elke run van picoinjection worden gekenmerkt door het meten van injectie volumes aan de randen van het werkbereik van de spanning en molariteit. Bovendien, bij hogere spanningen en injectievloeistof molariteiten zien we een verschijnsel waarbij de picoinjection fluïdum niet langer gehouden in evenwicht op de injectieplaats opening, maar knoppen uit en vormt kleine druppels in het stroomkanaal. We schrijven dit gedrag Electrowetting, waarbij de waterfase gedeeltelijk plast hydrofobe kanalen, waardoor het kruipen van de opening en in het stromingskanaal 11. Als deze instabiliteit plaatsvindt vóór de gewensteinjectie volume is bereikt, overweeg dan het verminderen van de druppel debiet als ze passeren de injector en het verkleinen van de druppel kanaal inspuitduur verhogen.
Naast aanzienlijk stroomlijnen de vervaardiging van apparaten, zou deze techniek ook vereenvoudigen het uitvoeren van complexere en combinatorische reacties regimes. Bijvoorbeeld, het uitvoeren van meerdere picoinjections met onze techniek vereist slechts het toevoegen picoinjection kanalen de gewenste injectieplaatsen. Daarentegen vorige methoden vereisen picoinjection kanalen en bijbehorende metalen elektroden te worden opgenomen op alle locaties. Verder vorige benaderingen reguleren injectie volume relatief langzaam door het variëren inspuitdruk of druppel snelheid. Met onze aanpak, injectie volume kan worden elektronisch bij snelheden sneller dan de hoogste daling tarieven gemeld (zie openbaring) aangepast. Dit maakt het uitvoeren van complexere assays met injectievolumes aangepast aan de specifieke voorwaardenties binnen elke MicroDrop. Normalisatie en injectie van reagentia in polydisperse druppeltje populaties, bijvoorbeeld, zou on-the-fly bepaling van injectievolume vereist.
Deze techniek is ontwikkeld en gedemonstreerd om in hulpmiddelen waarin picoinjection voor multi-step biologische reacties zoals digitale PCR en genotypering-assays 12. Echter, met weinig of geen verandering in het protocol, moet de techniek van het gebruik aan een onderzoeker die toevoeging van reagentia tot druppeltjes voor biologisch, chemisch, of industriële toepassingen - zolang de injectievloeistof bevatten opgeloste ionen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
We begrijpen niet helemaal exacte mechanisme achter de relatie tussen de aangelegde spanning en injectievolume waargenomen in onze experimenten. Belangen van het laboratorium en de relevante gebieden van expertise zijn niet goed geschikt voor het nastreven van deze slepende kwestie. We moedigen mensen met meer natuurkunde en techniek inzicht om dit fenomeen te onderzoeken.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het Ministerie van Biotechniek en Therapeutische Wetenschappen aan UCSF, het California Institute for Quantitative Biosciences (QB3), en de Bridging the Gap Award van de Stichting Rogers Family.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml Luer-Lok™ syringes | BD Medical | 309628 | |
| LocTite UV-cured adhesive | Henkel | 35241 | |
| PE-2 tubing | Scientific Commodities | BB31695-PE/2 | |
| Novec HFE-7500 | 3M | 98-0212-2928-5 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S9888 | |
| 1.5 ml centrifuge tubes | Eppendorf | 22363531 | |
| BD Falcon 15 ml tube | BD Biosciences | 352097 | |
| Air pressure control pump | Control Air Inc. | We recommend one under the control of DAQ and control software | |
| Syringe pumps | New Era | Must be capable of holding 1 ml syringes and flowing at rates as low as 100 μl/hr | |
| HV-amplfier | Must be capable of 1,000x amplification of signals between 0.01 and 10 V | ||
| Plasma bonder/cleaner | Harrick Plasma | ||
| 3” silicon wafers | Sigma Aldrich | 647535 | |
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 with curing agent should be included | |
| SU-8 photoresist | MicroChem | Viscocity depends on device dimensions |
References
- Kritikou, E. It's cheaper in the Picolab. Nat. Rev. Genet. 6 (9), (2005).
- Ahn, K., Agresti, J., Chong, H., Marquez, M., Weitz, D. A. Electrocoalescence of drops synchronized by size-dependent flow in microfluidic channels. Appl. Phys. Lett. 88 (26), (2006).
- Abate, A. R., Hung, T., Mary, P., Agresti, J. J., Weitz, D. A. High-throughput injection with microfluidics using picoinjectors. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 107, 19163-19166 (2010).
- Harris, J., et al. Fabrication of a microfluidic device for the compartmentalization of neuron soma and axons. J. Vis. Exp. (7), (2007).
- Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J., Whitesides, G. M. Rapid prototyping of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane). Anal. Chem. 70 (23), 4974-4984 (1998).
- O'Donovan, B., Eastburn, D. J., Abate, A. R. Electrode-free picoinjection of microfluidic drops. Lab on a Chip. 12 (20), 4029-4032 (2012).
- Holtze, C., et al. Biocompatible surfactants for water-in-fluorocarbon emulsions. Lab on a Chip. 8 (10), 1632-1639 (2008).
- Chung, C., Lee, M., Char, K., Ahn, K., Lee, S. Droplet dynamics passing through obstructions in confined microchannel flow. Microfluid. Nanofluid. 9, 1151-1163 (2010).
- Herminghaus, S. Dynamical instability of thin liquid films between conducting media. Phys. Rev. Lett. 83 (12), 2359-2361 (1999).
- Priest, C., Herminghaus, S., Seemann, R. Controlled electrocoalescence in microfluidics: Targeting a single lamella. Appl. Phys. Lett. 89 (13), 134101-134103 (2006).
- Florent, M., Siva, A. V., Hao, G., Dirk, E., Frieder, M. Electrowetting-controlled droplet generation in a microfluidic flow-focusing device. J. Phys: Condens. Matter. 19 (46), (2007).
- Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. Picoinjection enables digital detection of RNA with droplet rt-PCR. PLoS ONE. 8 (4), (2013).
