Picoinjection av Microfluidic Drops Uten metall elektroder

Summary

Vi har utviklet en teknikk for picoinjecting microfluidic dråper som ikke krever metall elektroder. Som sådan, utstyr som inneholder vår teknikk er enklere å fremstille og å bruke.

Abstract

Eksisterende metoder for picoinjecting reagenser inn microfluidic dråper krever metall elektroder integrert i microfluidic chip. Integreringen av disse elektrodene legger tungvinte og utsatt for feil skritt til enheten fabrikasjon prosessen. Vi har utviklet en teknikk som unngår behovet for metall elektroder under picoinjection. I stedet bruker den i seg selv injeksjonsfluid som en elektrode, siden de fleste biologiske reagenser inneholder oppløste elektrolytter, og er elektrisk ledende. Ved å eliminere elektrodene, reduserer vi enheten fabrikasjon tid og kompleksitet, og gjøre de enheter mer robust. I tillegg, med vår tilnærming, injeksjonsvolumet er avhengig av spenningen som påføres picoinjection løsning; Dette gir oss mulighet til å raskt justere volumet injiseres ved å modulere spenningen. Vi viser at vår teknikk er kompatibel med reagenser inneholdende vanlige biologiske forbindelser, inkludert buffere, enzymer og nukleinsyrer.

Introduction

I dråpebasert MicroFluidics blir mikron skala vandige dråper som brukes som "test"-rør for biologiske reaksjoner. Fordelen å utføre reaksjoner i de små dråper er at hver dråpe bruker bare noen få pl av reagenser, og med MicroFluidics, kan dråpene bli dannet og behandles på kilohertz priser ^en. Sammen har disse egenskaper tillater millioner av reaksjoner med de enkelte celler, nukleinsyre-molekyler, eller forbindelser som skal utføres i løpet av noen minutter med pl av totalmaterialet.

Slik bruker dråper for slike programmer, er teknikker som trengs for å legge kontrollerte mengder reagenser til dråpene; slike operasjoner er analoge til pipettering i reagensglass. En metode for å oppnå dette er elektrokoalescens, karakterisert ved at en dråpe av reagens slås sammen med målet fallet ved å påføre et elektrisk felt. Den elektriske feltet forstyrrer arrangement av overflateaktive molekyler på grensesnittene av dråpene, inducing en tynn-film ustabilitet og utløser koalesens i emulsjoner som er ellers stabil ^to. Elektrisk indusert sammenslåing er også utnyttes ved utformingen av picoinjector, en enhet som injiserer reagenser inn i dråper som de strømmer forbi en trykk kanal ^3. For å anvende det elektriske felt, picoinjector anordninger anvender metallelektroder, men integrering av metallelektroder i microfluidic brikker er det ofte et komplisert og utsatt for feil prosess som den væske-lodde ledninger er lett kompromittert av luftbobler eller støv og annet rusk i kanalen , samt brudd fra stresset eller bøyd under oppsett enhet.

Her presenteres en fremgangsmåte for å utføre picoinjection uten anvendelse av metallelektroder, noe som gjør fremstillingen enklere og mer robust. For å utløse picoinjection, vi i stedet bruke seg selv injeksjonsvæske som en elektrode, siden de fleste biologiske reagenser inneholder oppløste elektrolytter og er ledende. Vi legger også til et "Faraday Moat "for å skjerme sensitive områder av enheten og fungere som en universell bakken (Figur 1). Den vollgrav elektrisk isolerer dråpene oppstrøms av picoinjection området ved å tilby et bakken, hindrer utilsiktet dråpe fusjonen. En ekstra fordel med vår teknikk er at volum injisert i dråpene er avhengig av størrelsen av den påtrykte spenning, slik at den kan justeres ved å justere den påtrykte signal.

Vi dikte våre enheter i poly (dimethylsiloxane) (PDMS) ved hjelp av myke fotolitografiske teknikker ^4,5. Vår tilnærming er kompatibel med enheter fabrikkert i andre materialer, som harpiks, plast og epoxy. Kanalene har høyder og bredder på 30 mikrometer, som er optimal for å arbeide med små dråper 50 mikrometer i diameter (65 pl). Vi introduserer reagenser via polyethelene tubing (0.3/1.09 mm indre / ytre diameter) settes inn portene som er opprettet i løpet av enheten fabrikasjon med 0,50 mm biopsi slag, ligner metoder descrIbed tidligere ^fem. Den nøyaktige sammensetningen av injeksjonsvæske avhenger av den spesifikke applikasjonen. Væsken trenger kun inneholder oppløste elektrolytter ved konsentrasjoner høye nok til å gi tilstrekkelig ledningsevne for det elektriske signalet for å bli overført til picoinjector. I benken testing, har vi funnet at konsentrasjoner større enn ioniske 10 mM bør være tilstrekkelig ^{til 6,} selv om denne verdien og væskeledningsevnen er avhengig av de spesifikke dimensjoner og størrelsen av den påtrykte spenning for enheten.

Protocol

En. Design Enhets Mål og Topologier Basert på Experimental Trenger hjelp Computer Aided Design (CAD) programvare

Merk: Valg emulsjon kanaldiameter som er mindre enn de av de kuleformede dråper. Dette tvinger dråper inn i et sylindrisk eller "pølse"-form, og sørger for mer effektiv picoinjection. For vårt formål, har vi designet 30 x 30 mikrometer kanaler for dråper som var 50 mikrometer i diameter.

1. Model picoinjection side (r) etter de som er beskrevet av Abate et al. ³ med unntak av at kanaler for metallelektrodene er fjernet, da de er unødvendige.
2. Legg kanaler for å tjene som Faraday Moat (figur 1) som kjører mellom picoinjection side (r), og oppstrøms emulsjonen slik at de beskytter dråpene fra det elektriske felt.
   Merk: Dette hindrer utilsiktet sammenslåing.

2. Dikte enheter Bruke Soft Photolithfisk metode Teknikker

1. Generere en transparent fotolitografi maske basert på CAD-filen ved hjelp av eksisterende kommersielle tjenester.
2. Med fotomaske, kurere fotoresist på silisiumskiver for å produsere en enhets master, som tidligere beskrevet ^4..
3. Hell PDMS blandet med herder (11:01 ratio) over enheten mester som finnes i en 5 cm isopor petriskål.
4. Plasser master med PDMS i et vakuum eksikkator for ca 15 min for å fjerne eventuelle luftbobler.
5. Kurere PDMS-enheten ved å plassere den i en 95 ° C ovnen i en time. Alternativt vil de PDMS herde ved romtemperatur etter 24 timer.
6. Fjern enheten ved å kutte rundt omkretsen med en kirurgisk kniv og forsiktig peeling enheten fra master.
7. Punch innløp og utløp hull i PDMS ved hjelp av en 0,5 mm biopsi punch.
8. Bond enheten til et glass objektglass ved hjelp av en plasma bønder ^fire.

Tre. Forbered en trykkluftStyre Pumpe for å trykk et reservoar inneholdende den Fluid

1. Modifiser pumpe-utgangen, slik at trykkluften går ut gjennom en lengde av 2,7 mm indre diameter polyetylenrør.
2. Konstruer det slik at røret ender ved en luer-lock sprøytespissen ved å montere hulrommet over nippel på baksiden av luer-lock.
3. Tett ved å fylle rommet mellom de luer-lock tråder og slangen med epoxy.
4. Fest en 27,5 G nål.

4. Forbered en monodisperse emulsjon av Aqueous (Vann-i-olje) Dråper Suspendert i en Inert Fluor Carrier Oil med 2% (vekt / vekt) Oppløst Biokompatibelt Surfactant ⁷

De spesifikke reagenser finnes i disse dråper er avhengig av anvendelsen

1. I forberedelsene til reinjeksjon, legger emulsjonen inn en 1 ml sprøyte med en 27,5 G nål.
2. Fest sprøyten i en sprøytepumpe og orientere pumpen vertikalt (nål oppover).
   Note: Denne orientering bevirker at dråpene til å pakke inn et lag over bæreolje. Når pumpen er startet, vil dråpene bli skjøvet ut av sprøyten ved høy volumfraksjon av oljelaget under dem.

5. Forbered Reagenser for Introduksjon til Microfluidic Chip

1. Punch tre 0,5 mm hull i korken på en 15 ml sentrifugerør (noen beholder med skrukork vil nok) ved hjelp av en biopsi punsj, nål, eller drill.
2. Sett i en 0,5 mm diameter tråd-elektrode og en ~ 20 cm lengde av PE-rør 2 gjennom to av hullene, slik at de når bunnen av røret.
3. I de resterende hullet, træ en ~ 2,5 cm av en ~ 20 cm lengde på PE rør slik at det vil hvile over væskenivået.
4. Forsegl noen hull på oversiden av hetten med UV-herdende epoksy.
5. Fyll røret med picoinjection fluid og skrue på hetten.
6. Koble utgangen fra luft-trykkreguleringspumpe av den korte rørlengde av innsatsening nålen inn i lumen. Nålen skal sitte tett.
7. Fyll en 1 ml sprøyte med 1 M NaCl for å tjene som Faraday Moat.
8. Koble en 27,5 G nål og fest sprøyten i en sprøytepumpe.
9. Fyll en annen en ml sprøyte med transportør / spacer olje, koble en 27,5 G nål, og fest den i en sprøytepumpe.

6. Forbered Microfluidic Enhet for Picoinjection

1. Koble utgangsrøret (lengre lengde) fra injeksjonsfluidbeholder til innløpsporten på picoinjection lakk på microfluidic chip.
2. Koble sprøyten inneholdende 1 M NaCl til innløpsåpningen for Faraday Moat på microfluidic chip med en lengde av PE-rør.
3. Koble sprøyten inneholdende bærerolje til innløpsporten på microfluidic chip med en lengde av PE-rør.
4. Sett PE rør inn i emulsjon utgangsporten på microfluidic chip. Røret skal avsluttes i en emulsjon oppsamlingsbeholder, og hellernormalt en 1,5 ml sentrifugerør.
5. Sett PE rør inn i utgangsporten for Faraday Moat på microfluidic chip. Røret skal avsluttes i en ikke-ledende og elektrisk isolert beholder for å forhindre en kortslutning.
6. Koble utgangen av høyspent (HV) forsterker via alligator klipp til metallelektrode nedsenket i picoinjection væske.
7. Koble jordingselektrode i HV forsterkeren via krokodilleklemme til metallet på sprøytenålen inneholdende 1M NaCl.

7. Infuse reagenser inn Microfluidic Chip

1. Introduser en M NaCl (Faraday Moat) til enheten med en hastighet på 100 pl / time.
2. Introduser dråpe emulsjon og frakte olje til priser som passer for dimensjoner enheten. For vår demo-enhet, innfører vi dråpene og olje på 200 og 400 mL / hr, henholdsvis. De strømningshastigheter bør tillate dråpene å passere picoinjector med jevne mellomrom atskiltetter et gap av transportør olje.
3. Justere trykket til picoinjection fluid slik at fluidtrykket ved picoinjection åpningen er i mekanisk likevekt med dråpe kanal.
   Legg merke til: I denne trykk (Laplace-trykk), bør injeksjonsfluid bule ut i dråpekanalen uten spirende av og danner sitt eget dråper (figur 2). Ved disse strømningshastigheter er beskrevet ovenfor, gjelder et trykk på ~ 13 psi til injeksjonsfluid for å oppnå likevekt ved injeksjonsstedet.

8. Begynn Picoinjection

1. Ettersom dråpene passerer innsprøytningsåpningen, bruke en 0-10 V, 10 kHz, AC-signal forsterkes 1000 x ved HV-forsterkeren (figur 3).
2. Modulere injeksjonsvolum ved å endre amplituden av den påtrykte spenning.
   Merk: Høyere spenninger bør tillate mer væske til å bli introdusert til dråpene. I vår test, vi observerer stabil og konsistent injeksjon på spenningene ermellom 100 og 3000 V ved hjelp av injeksjonsoppløsninger av NaCl som strekker seg 10 til 500 mM (figur 4).

Representative Results

Mikroskopiske bilder tatt på picoinjection nettstedet viser at elektrifisering av picoinjection væske er nok til å utløse injeksjon (figur 2). Det injiserte volum kan reguleres ved å modulere amplituden av den påtrykte spenning, med høyere spenninger muliggjør høyere injeksjonsvolumer. Vi plotte injeksjonsvolum sammenlignet med størrelsen av det påtrykte spenning for tre representative molarities av injeksjonsvæske i (fig. 3). For å demonstrere den hastighet vår metode, vi selektivt injisert dråpene passerer injeksjonsstedet, avhengig av nærvær eller fravær av et fluorescerende fargestoff (Film 1). Drops passerer injektoren ved 200 Hz, selv så høyt som 10 kHz er mulige, avhengig av egenskapene til dråpedeteksjonsmekanisme ^3..

Vi tilskriver avhengighet av injeksjonsvolum på spenningen til det faktum at når dråpene nærmer og passere picoinjection orifice, tykkelsen av det oljesjikt som skiller dråpene fra grensesnittet bule på injeksjonsstedet reduseres ^8.. Den terskelspenning for et elektrisk indusert tynnfilm ustabilitet er proporsjonal med tykkelsen av dette laget ^9,10. Derfor, som dråpene nærmer picoinjector, det øyeblikk av koalesens er avhengig av størrelsen av det elektriske felt. Høyere anvendte spenninger tillate tidligere koalesens mellom dråpen og injeksjonsvæske, forårsaker lengre injeksjon varigheter. Ettersom injeksjonsvolumet er avhengig av injeksjon varighet, det derfor også avhengig av påtrykt spenning.

Lavere molaritet ioniske løsninger lettere dempe den tilførte signal og reduserer den elektriske feltstyrke på injeksjonsstedet sammenlignet med mer konsentrerte oppløsninger. Derfor injeksjonsvæsker med lavere molarities av oppløste ioner krever høyere anvendte spenninger for å oppnå de samme injeksjonsvolumer. Dette forholdethip er vist for en rekke ioniske molarities og anvendte spenninger i et 2D heatmap (figur 4).

Figur 1. Basic setup enhet. Dråper, operatør olje, og 1M NaCl blir introdusert til enheten via pumper sprøyte. De tettpakkede dråper fordeles jevnt ved hjelp av grunnleggende flow-fokus geometri. Ettersom de små dråper passerer picoinjection området, blir et elektrisk felt generert ved å anvende en vekselstrømsignal til en elektrode innsatt i picoinjection fluidbeholderen (angitt i rødt). Den elektriske feltet gjør det mulig for koalesens mellom de passerende dråper og picoinjection væske. Dråper oppstrøms av injeksjonsstedet er skjermet fra elektriske felt av Faraday Moat - en kanal for 1 M NaCl (noen høy molaritet ionisk oppløsning bør være tilstrekkelig) i fortsopptre med jordelektroden på den HV-forsterker (vist i sort). Enhets dimensjoner kan skaleres etter behov; for vårt formål, har vi designet 30 x 30 mikrometer kanaler (bare oppstrøms injeksjonsstedet) for dråper som var 50 mikrometer i diameter.

Figur 2. Lyse felt mikroskopi-bilder av picoinjection området. I fravær av et elektrisk felt (A), overflateaktive molekyler hindre koalesens på injeksjonsstedet, og en klar grense kan leses av på dråpe / injeksjonsfluidgrensesnitt. Ved anvendelse av en 250 V 10 kHz vekselstrømsignal, forsvinner grensen og reagens injiseres i dråpe passerer (B). For visualisering, har injeksjonsfluid blitt farget med 2 mg / ml av bromfenol blått fargestoff. Figur re-publisert frOM ⁶ med tillatelse fra The Royal Society of Chemistry (RSC)

Fig. 3. Data demonstrerer sammenhengen mellom påtrykt spenning og volumfraksjon øker (Vf) av dråper etter injeksjon for (A) 100 mM, (b) 50 mM, og (C) 25 mM (NaCl) injeksjonsvæsker. Sterkere elektrisk felt mer lett briste på olje / vann-grenseflater og tillate injeksjon over en større lengde av de passerende dråper - Dette fører til store injeksjonsvolumer. Høyere molarities av oppløste elektrolytter øker ledningsevnen av injeksjonsløsningen, i det for en gitt spenning injeksjonsstedet produsere sterkere elektrisk felt, noe som fører til økte injeksjonsvolumer. Feil søylene representerer en standardavvik i begge retninger for> 1200 dråper samplet på hvert punkt. Linjer som kobler datapunkter gjøreikke representere noen kurve-fit eller beregnes teoretisk modell. Drop volumet er målt ved en fluorescens-deteksjonssystem som er beskrevet i ^6.. Figur re-publisert fra ⁶ med tillatelse fra The Royal Society of Chemistry (RSC). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

.. Figur 4. Varme kart som viser injeksjonsvolum som en funksjon av påtrykt spenning, og molariteten av oppløst NaCl i sprøytevæsken Injeksjonsvolumet kan reguleres i området fra 0 til 36 pl med en oppløsning av 2,6 pl (~ 4% Vf ) med 100V trinn på det påtrykte signal. De største injiserte volumer ble oppnådd på 3000 V og 100 mM væske. Increasing elektriske feltet over dette muliggjør electrowetting, forårsaker dråper til spontant dannes ved picoinjector, negativt påvirker injeksjons effekt og konsistens. Piler / flått indikerer datapunkter. Figur re-publisert fra ⁶ med tillatelse fra The Royal Society of Chemistry (RSC)

Movie en. Høy hastighet opptak demonstrere selektiv veksling av picoinjector. Kun dråper som inneholder IR-783 fluorescerende fargestoff (2 mg / ml) injiseres med reagens (500 mM NaCl).

Discussion

Forholdet mellom injeksjonsvolum, og spenningen er avhengig av mange faktorer, inkludert enhet dimensjoner, lengde av produksjonsrøret som bærer picoinjection fluid til enheten, molaritet av picoinjection fluid, og hastigheten av dråpene når de passerer de injektor. Av denne grunn anbefaler vi at volumet / spenningsforhold karakteriseres før hver kjøring av picoinjection ved å måle injeksjonsvolum på kantene av arbeids utvalgene av spenning og molariteten. I tillegg, ved høyere spenninger og injeksjonsfluid molarities vi observerer et fenomen hvori picoinjection fluid ikke lenger holdt i likevekt ved injeksjonsåpningen, men i stedet knopper av og danner små dråper i strømningskanalen. Vi tilskriver denne oppførselen til electrowetting, karakterisert ved at den vandige fase delvis fukte de hydrofobe kanaler, slik at den til å krype ut av åpningen og inn i strømningskanalen ^11.. Hvis denne ustabiliteten oppstår før den ønskedeinjeksjonsvolum er oppnådd, vurdere å redusere dråpestrømningshastighet når de passerer injektoren og en innsnevring av dråpe kanal for å øke injeksjons varighet.

I tillegg til å betydelig effektivisere fabrikasjon av enheter, bør denne teknikken også forenkle utførelsen av mer komplekse og kombinatoriske reaksjonsregimer. For eksempel å utføre flere picoinjections med vår teknikk krever bare legge picoinjection kanaler på de ønskede områder av injeksjon. I motsetning til tidligere metoder krever picoinjection kanaler og medfølgende metall elektroder for å bli inkludert på alle områder. Videre tidligere tilnærminger regulere injeksjonsvolum relativt langsomt ved å variere injeksjonstrykk eller dråpehastighet. Med vår tilnærming, kan injeksjonsvolumet justeres elektronisk på prisene raskere enn de høyeste slipp priser rapportert (se avsløring). Dette muliggjør utførelsen av mer kompliserte analyser, med injeksjonsvolum som er skreddersydd til det bestemte betingelsesjoner innenfor hver microdrop. Normalisering og injeksjon av reagenser i polydisperse dråpe populasjoner, for eksempel, ville kreve on-the-fly bestemmelse av injeksjonsvolumer.

Denne teknikken har blitt utviklet og demonstrert til å jobbe i enheter som benytter picoinjection for flertrinns biologiske reaksjoner som digital PCR og genotyping analyser ^12. Imidlertid, med liten eller ingen endring i protokollen, bør teknikken være til nytte for en hvilken som helst experimenter som krever tilsetning av reagenser til dråper for eventuelle biologiske, kjemiske eller industrielle anvendelser - så lenge som injeksjonsfluid inneholder oppløste ioniske arter.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 ml Luer-Lok™ syringes	BD Medical	309628
LocTite UV-cured adhesive	Henkel	35241
PE-2 tubing	Scientific Commodities	BB31695-PE/2
Novec HFE-7500	3M	98-0212-2928-5
NaCl	Sigma Aldrich	S9888
1.5 ml centrifuge tubes	Eppendorf	22363531
BD Falcon 15 ml tube	BD Biosciences	352097
Air pressure control pump	Control Air Inc.		We recommend one under the control of DAQ and control software
Syringe pumps	New Era		Must be capable of holding 1 ml syringes and flowing at rates as low as 100 μl/hr
HV-amplfier			Must be capable of 1,000x amplification of signals between 0.01 and 10 V
Plasma bonder/cleaner	Harrick Plasma
3” silicon wafers	Sigma Aldrich	647535
PDMS	Dow Corning		Sylgard 184 with curing agent should be included
SU-8 photoresist	MicroChem		Viscocity depends on device dimensions