Summary
Hemos desarrollado una técnica para picoinjecting gotas de microfluidos que no requieren electrodos de metal. Como tales, los dispositivos que incorporan nuestra técnica son más simples de fabricar y de usar.
Abstract
Los métodos existentes para picoinjecting reactivos en gotas de microfluidos requieren electrodos de metal integradas en el chip de microfluidos. La integración de estos electrodos añade pasos engorrosos y propensos a errores en el proceso de fabricación del dispositivo. Hemos desarrollado una técnica que obvia las necesidades de electrodos de metal durante picoinjection. En lugar de ello, se utiliza el propio fluido de inyección como un electrodo, ya que la mayoría de los reactivos biológicos contienen electrolitos disueltos y son conductores. Mediante la eliminación de los electrodos, se reduce el tiempo de fabricación del dispositivo y la complejidad, y hacer los dispositivos más robustos. Además, con nuestro enfoque, el volumen de inyección depende de la tensión aplicada a la solución picoinjection; esto nos permite ajustar rápidamente el volumen inyectado mediante la modulación de la tensión aplicada. Se demuestra que nuestra técnica es compatible con los reactivos que incorporan compuestos biológicos comunes, incluyendo tampones, enzimas y ácidos nucleicos.
Introduction
En la microfluídica basada en gotitas, gotitas acuosas escala de micras se utilizan como "tubos de ensayo" para reacciones biológicas. La ventaja de llevar a cabo reacciones en las pequeñas gotas es que cada gota utiliza sólo unos pl de reactivo y, con la microfluídica, las gotas se puede formar y procesada a tasas kilohercios 1. En combinación, estas propiedades permiten a millones de reacciones con las células individuales, moléculas de ácido nucleico, o compuestos que se deben realizar en cuestión de minutos con l de total de material.
Para usar las gotas para aplicaciones de este tipo, se necesitan técnicas para la adición de volúmenes controlados de reactivos a las gotas; tales operaciones son análogos a pipeteando en tubos de ensayo. Un método para lograr esto es electrocoalescence, en el que una gota de reactivo se combina con la caída de destino mediante la aplicación de un campo eléctrico. El campo eléctrico altera la disposición de las moléculas de tensioactivo en las interfaces de las gotas, INDucing una inestabilidad de película delgada y desencadenando coalescencia en emulsiones que son por lo demás estable 2. Fusión inducida eléctricamente también es explotada en el diseño de la picoinjector, un dispositivo que inyecta reactivos en gotas a medida que fluyen más allá de un canal de presión 3. Para aplicar el campo eléctrico, los dispositivos picoinjector utilizan electrodos de metal, pero la integración de electrodos de metal en los chips de microfluidos es a menudo un proceso complejo y propenso a errores que los alambres de líquido de soldadura son fácilmente comprometidos por burbujas de aire o polvo y otros desechos en el canal , así como de las fracturas de estrés o doblarse durante la configuración del dispositivo.
Aquí presentamos un método para llevar a cabo picoinjection sin el uso de electrodos de metal, por lo que la fabricación más simple y más robusta. Para activar picoinjection, nosotros en cambio utilizamos el propio fluido de inyección como un electrodo, ya que la mayoría de los reactivos biológicos contienen electrolitos disueltos y son conductores. También vamos a añadir un "Faraday Moat "para proteger a regiones sensibles del dispositivo y actuar como un suelo universales (Figura 1). El foso aísla eléctricamente las gotas de aguas arriba del sitio picoinjection proporcionando un suelo, la prevención de fusión gotita no deseado. Un beneficio adicional de nuestra técnica es que el volumen inyectado en las gotas depende de la magnitud de la tensión aplicada, permitiendo que se ajusta mediante la regulación de la señal aplicada.
Fabricamos nuestros dispositivos en poli (dimetilsiloxano) (PDMS) usando técnicas fotolitográficas suaves 4,5. Nuestro enfoque es compatible con dispositivos fabricados en otros materiales, como resinas, plásticos y resinas epoxi. Los canales tienen alturas y anchuras de 30 micras, que son óptimas para trabajar con gotitas de 50 m de diámetro (65 pl). Introducimos los reactivos a través de tubos de polietileno (0.3/1.09 mm de diámetro interior / exterior) insertado en los puertos creados durante la fabricación del dispositivo de 0,50 mm punzones de biopsia, de forma similar a los métodos described previamente 5. La composición exacta del fluido de inyección depende de la aplicación específica. El fluido sólo necesita contener electrolitos disueltos en concentraciones lo suficientemente altas para producir la suficiente conductividad para la señal eléctrica que se transmite a la picoinjector. En pruebas de banco, hemos encontrado que las concentraciones iónicas superiores a 10 mM deberían bastar 6, aunque este valor y conductividades de fluido dependen de las dimensiones específicas del dispositivo y la magnitud de la tensión aplicada.
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Protocol
1. Diseño Dimensiones del dispositivo y topologías Basado en Experimental necesidades mediante diseño asistido por ordenador (CAD) Software
Nota: Selección de diámetros del canal de emulsión más pequeñas que las de las gotitas esféricas. Esto obliga a las gotitas en una forma cilíndrica o "salchicha" y permite picoinjection más eficaz. Para nuestros propósitos, hemos diseñado 30 x 30 micras canales de gotas que eran 50 m de diámetro.
- Sitio picoinjection Modelo (s) después de los descritos por Abate et al. 3 con la excepción de que se eliminan los canales para los electrodos de metal, ya que son innecesarias.
- Añadir canales para servir como el Faraday Foso (Figura 1) que se ejecutan entre el sitio (s) picoinjection y la emulsión de aguas arriba de tal manera que sirvan para proteger las pequeñas gotas del campo eléctrico.
Nota: Esto evita la fusión accidental.
2. Dispositivos Fabricar Uso Soft fotolitoTécnicas radiográficos
- Generar una máscara de fotolitografía transparencia basado en el archivo CAD utilizando los servicios comerciales existentes.
- Con la fotomáscara, curar fotoprotector en obleas de silicio para producir un dispositivo maestro, como se describió anteriormente 4.
- Pour PDMS mezcla con el agente endurecedor (11:1) sobre el maestro del equipo contenido en un 5 cm de poliestireno caja de Petri.
- Coloque el principal con PDMS en un desecador de vacío durante aproximadamente 15 minutos para eliminar cualquier burbuja de aire.
- Curar el dispositivo de PDMS colocándolo en un horno de 95 ° C durante 1 hora. Alternativamente, el PDMS curarán a TA después de 24 horas.
- Retire el dispositivo de corte en todo el perímetro con una hoja de bisturí y pelar cuidadosamente el dispositivo desde el maestro.
- Perforar orificios de entrada y salida en el PDMS usando un punzón de biopsia de 0,5 mm.
- Una el dispositivo a un portaobjetos de microscopio de vidrio usando un dispositivo de unión de plasma 4.
3. Preparar una presión de aireControl de bombas para presurizar un depósito que contiene el fluido
- Modificar la salida de la bomba de tal manera que las salidas de aire a presión a través de una longitud de 2,7 mm de tubo de polietileno de diámetro interior.
- Construirla de tal manera que el tubo termina en una punta de la jeringa luer-lock mediante el ajuste de la luz sobre el pezón en la parte posterior del luer-lock.
- Sellar rellenando el espacio entre las roscas luer-lock y el tubo con epoxi.
- Coloque una aguja 27,5 g.
4. Preparar una monodisperso Emulsión acuosa de las gotitas (agua-en-aceite) suspendidos en un aceite inerte fluorado portador con 2% (peso / peso) disuelto biocompatible Surfactante 7
Los reactivos específicos contenidos en estas gotitas dependen de la aplicación
- En preparación para la reinyección, cargue la emulsión en una jeringa de 1 ml con una aguja de 27,5.
- Fije la jeringa en una bomba de jeringa y orientar la bomba verticalmente (la aguja hacia arriba).
Nota: Esta orientación hace que las gotas para empacar en una capa por encima del aceite del portador. Cuando se pone en marcha la bomba, las gotas serán empujados fuera de la jeringa en la fracción de alto volumen de la capa de aceite por debajo de ellos.
5. Preparar Reactivos para Introducción al chip de microfluidos
- Perforar tres agujeros de 0,5 mm en la tapa de un tubo de centrífuga de 15 ml (cualquier recipiente con un tapón de rosca será suficiente) usando un punzón de biopsia, la aguja, o de perforación.
- Insertar un diámetro de electrodo de alambre de 0,5 mm y una longitud de ~ 20 cm de PE-2 tubería a través de dos de los agujeros para que lleguen a la parte inferior del tubo.
- En el agujero restante, hilo de ~ 2,5 cm de un cm de longitud ~ 20 de la tubería de PE de forma que éste descanse sobre el nivel del fluido.
- Selle todos los espacios en la parte superior de la tapa con epoxi curado UV.
- Llene el tubo con el líquido picoinjection y el tornillo de la tapa.
- Conectar la salida de la bomba de control de presión de aire a la longitud más corta de la tubería por insertoing la aguja en el lumen. La aguja debe quedar ajustado.
- Llene una jeringa de 1 ml con 1 M de NaCl para servir como la de Faraday Foso.
- Conecte una aguja de 27,5 y asegure la jeringa en una bomba de jeringa.
- Llene otra jeringa de 1 ml con aceite del portador / espaciador, conecte una aguja de 27,5, y fijarlo en una bomba de jeringa.
6. Prepare el dispositivo de microfluidos para Picoinjection
- Conectar el tubo de salida (longitud más larga) desde el recipiente de fluido de inyección al puerto de entrada del fluido picoinjection en el chip microfluídico.
- Conectar la jeringa que contiene el NaCl 1 M a la lumbrera de entrada para el Foso de Faraday en el chip de microfluidos con una longitud de tubo de PE.
- Conectar la jeringa que contiene el aceite portador al puerto de entrada del chip de microfluidos con una longitud de tubo de PE.
- Introduzca el tubo de PE en el orificio de salida de la emulsión en el chip microfluídico. El tubo debe terminar en un recipiente de recogida de emulsión, ninormalmente un tubo de centrífuga de 1,5 ml.
- Introduzca el tubo de PE en el puerto de salida para el Foso de Faraday en el chip microfluídico. El tubo debe terminar en un material no conductor y el recipiente aislado eléctricamente para evitar un cortocircuito.
- Conectar la salida del amplificador de alta tensión (HV) a través de pinza de cocodrilo para el electrodo de metal sumergido en el fluido picoinjection.
- Conectar el electrodo de tierra del amplificador de alta tensión a través de pinza de cocodrilo para el metal de la aguja de la jeringa que contiene el NaCl 1 M.
7. Infuse Reactivos en microfluidos chip
- Introducir el NaCl 1 M (Foso de Faraday) para el dispositivo a una velocidad de 100 l / hr.
- Introducir la emulsión de gotas de aceite del portador y con tasas adecuadas a las dimensiones del dispositivo. Para nuestro equipo de demostración, introducimos las gotas y el aceite a 200 y 400 l / h, respectivamente. Los caudales deben permitir que las gotas pasen la picoinjector a intervalos regulares separadospor un hueco de aceite portador.
- Ajustar la presión aplicada al fluido picoinjection de tal manera que la presión del fluido en el orificio de picoinjection está en equilibrio mecánico con el canal de gota.
Nota: En esta presión (la presión de Laplace), el fluido de inyección debe sobresalir en el canal de gotita sin gemación y la formación de sus propias gotas (Figura 2). A estas velocidades de flujo descritos anteriormente, se aplica una presión de ~ 13 psi para el fluido de inyección para alcanzar el equilibrio en el sitio de la inyección.
8. Comience Picoinjection
- Como gotas de pasar el orificio de inyección, aplique un 0-10 V, 10 kHz, la señal amplificada AC 1000 x por el amplificador de HV (Figura 3).
- Modular el volumen de inyección cambiando la amplitud de la tensión aplicada.
Nota: Los voltajes más altos deberían permitir más fluido que se presentó a las gotas. En nuestras pruebas, observamos inyección estable y consistente con tensiones serentre 100 y 3000 V utilizando soluciones de inyección de NaCl que van desde 10 hasta 500 mM (Figura 4).
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Representative Results
Imágenes microscópicas tomadas en el lugar muestran picoinjection que la electrificación del fluido picoinjection es suficiente para desencadenar la inyección (Figura 2). El volumen inyectado se puede controlar mediante la modulación de la amplitud de la tensión aplicada, con tensiones más elevadas que permiten volúmenes de inyección más altas. Trazamos el volumen de inyección en comparación con la magnitud de la tensión aplicada durante tres molaridades representativas de fluido de inyección en (Figura 3). Para demostrar nuestro método de la velocidad, se inyecta selectivamente gotitas que pasan por el lugar de la inyección en función de la presencia o ausencia de un colorante fluorescente (Película 1). Gotas pasan el inyector a 200 Hz, aunque las tasas de hasta 10 kHz son posibles, dependiendo de las capacidades del mecanismo de detección de gota 3.
Atribuimos la dependencia del volumen de inyección de la tensión aplicada al hecho de que a medida que se acercan a las gotas y pasan la picoinjectorificio de iones, el espesor de la capa de aceite que separa la interfaz de gotita de la protuberancia en el sitio de inyección disminuye 8. El voltaje de umbral para una inestabilidad de película delgada eléctricamente inducida es proporcional al espesor de esta capa de 9,10. Por lo tanto, como las gotitas se acercan a la picoinjector, el momento de la coalescencia depende de la magnitud del campo eléctrico. Voltajes más altos aplicados permiten coalescencia anterior entre la gota y el fluido de inyección, provocando duraciones de inyección más largos. Debido a que el volumen de inyección depende de la duración de la inyección, por lo tanto, depende también de la tensión aplicada.
Soluciones iónicas inferiores molaridad atenúan más fácilmente la señal aplicada y reducen la intensidad de campo eléctrico en el sitio de la inyección en comparación con soluciones más concentradas. En consecuencia, fluidos de inyección con molaridades inferiores de los iones disueltos requieren voltajes más altos aplicados para lograr los mismos volúmenes de inyección. Esta relacionesla cadera se demuestra para una gama de molaridades iónicos y voltajes aplicados en un mapa de calor 2D (Figura 4).
Figura 1. Básico de configuración del dispositivo. Las gotas, aceite portador, y 1 M NaCl se introducen en el dispositivo a través de bombas de jeringa. Las gotas densas son espaciados uniformemente con la geometría básica de flujo de enfoque. Como las gotitas pasan el sitio picoinjection, un campo eléctrico se genera mediante la aplicación de una señal de CA a un electrodo insertado en el recipiente de fluido picoinjection (indicado en rojo). El campo eléctrico permite la coalescencia entre las gotitas de paso de fluido y picoinjection. Las gotas de aguas arriba del sitio de la inyección están protegidos contra el campo eléctrico por el Faraday Foso - un canal de NaCl 1 M (cualquier solución iónica de alta molaridad debería ser suficiente) en contactuar con el electrodo de tierra del amplificador de alta tensión (indicado en negro). Dimensiones de los dispositivos se pueden ampliar según sea necesario; para nuestros propósitos, hemos diseñado 30 x 30 micras canales (justo aguas arriba del sitio de la inyección) para las gotas que eran 50 m de diámetro.
Figura 2. De campo brillante imágenes de microscopía del sitio picoinjection. En la ausencia de un campo eléctrico (A), moléculas de tensioactivo impiden la coalescencia en el sitio de la inyección y un límite distinto es visible en la interfaz de fluido de goteo / inyección. Tras la aplicación de una señal de CA 250 V 10 kHz, el límite desaparece y el reactivo se inyecta como los pases de gotitas (B). Para la visualización, fluido de inyección se ha coloreado con 2 mg / ml de colorante azul de bromofenol. Figura re-publicado from 6 con el permiso de la Royal Society of Chemistry (RSC)
Figura 3. Datos que demuestran la relación entre la tensión aplicada y el volumen de fracción aumento (Vf) de gotas después de la inyección para (A) 100 mM, (B) 50 mM, y (C) 25 mM (NaCl) fluidos de inyección. Campos eléctricos más fuertes más romperse fácilmente las interfaces de aceite / agua y permitir la inyección en una longitud mayor de las gotitas de paso - esto lleva a los volúmenes de inyección mayores. Molaridades más altas de electrolitos disueltos aumentan la conductividad de la solución de inyección, la producción de los campos eléctricos más fuertes en el sitio de la inyección para una tensión dada, que conduce a un aumento de los volúmenes de inyección. Las barras de error representan 1 desviación estándar en cualquier dirección para> 1.200 gotas de la muestra en cada punto. Las líneas que conectan los puntos de datos hacenno representan ningún tipo de curva de ajuste o modelo teórico calculado. Volumen de la gota se mide por un sistema de detección de fluorescencia se describe en 6. Figura re-publicado desde 6 con el permiso de la Royal Society of Chemistry (RSC). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
.. Figura 4 Mapa de calor que muestra el volumen de inyección como una función de la tensión aplicada y la molaridad de NaCl disuelto en el fluido de inyección El volumen de inyección se puede ajustar en el rango de 0 a 36 pl con una resolución de ~ 2,6 pl (4% Vf ) con incrementos de 100 V de la señal aplicada. Los mayores volúmenes inyectados fueron alcanzados en 3000 V y líquido 100 mM. Increasing campo eléctrico por encima de este permite electrohumectación, causando gotas para formar espontáneamente en la picoinjector, afectando negativamente a la eficacia de inyección y la consistencia. Flechas / garrapatas indican los puntos de datos. Figura re-publicado desde 6 con el permiso de la Royal Society of Chemistry (RSC)
Película 1. Tomas de alta velocidad que demuestra conmutación selectiva de la picoinjector. Sólo gotas que contiene IR-783 colorante fluorescente (2 mg / ml) se inyectan con el reactivo (NaCl 500 mM).
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Discussion
La relación entre el volumen de inyección y la tensión aplicada depende de muchos factores incluyendo las dimensiones del dispositivo, la longitud del tubo que lleva el fluido picoinjection al dispositivo, molaridad de fluido picoinjection, y la velocidad de las gotitas a medida que pasan que inyector. Por este motivo, se recomienda que la relación volumen / tensión caracterizarse antes de cada ejecución de picoinjection midiendo volúmenes de inyección en los bordes de los rangos de trabajo de la tensión y la molaridad. Además, a mayores voltajes y molaridades fluido de inyección se observa un fenómeno en el que el fluido picoinjection ya no se mantiene en equilibrio en el orificio de inyección, pero en lugar brotes fuera y forma pequeñas gotas en el canal de flujo. Atribuimos este comportamiento a electrohumectación, en el que la fase acuosa moja parcialmente los canales hidrófobas, haciendo que se arrastran fuera del orificio y en el canal de flujo 11. Si esta inestabilidad se produce antes de la deseadase consigue el volumen de inyección, considere la reducción de la velocidad de flujo de gotas a medida que pasan el inyector y el estrechamiento del canal de gota para aumentar la duración de la inyección.
Además de agilizar notablemente la fabricación de dispositivos, esta técnica también debe simplificar la ejecución de los regímenes de reacción más complejos y combinatorias. Por ejemplo, la ejecución de múltiples picoinjections con nuestra técnica sólo requiere la adición de canales picoinjection en los sitios deseados de la inyección. Por el contrario, los métodos anteriores requieren canales picoinjection y electrodos metálicos acompañante para ser incluido en todos los sitios. Además, los enfoques anteriores regulan volumen de inyección relativamente lenta mediante la variación de la presión de inyección o de la velocidad de las gotitas. Con nuestro enfoque, el volumen de inyección se puede ajustar electrónicamente a tasas más rápido que las tasas de abandono más altas reportadas (por favor vea la divulgación). Esto permite la ejecución de ensayos más complejos, con volúmenes de inyección adaptados a la condición específicaciones dentro de cada una de microgotas. La normalización y la inyección de reactivos en poblaciones de gotas polidispersos, por ejemplo, requeriría determinación sobre la marcha de los volúmenes de inyección.
Esta técnica ha sido desarrollado y demostrado para trabajar en dispositivos que utilizan picoinjection para las reacciones biológicas de múltiples pasos, tales como la PCR digital y ensayos de genotipificación 12. Sin embargo, con poco o ningún cambio en el protocolo, la técnica debería ser de utilidad para cualquier investigador que requiere la adición de reactivos a las gotas de las aplicaciones biológicas, químicas o industriales - siempre y cuando el fluido de inyección contiene especies iónicas disueltas.
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Disclosures
No entendemos plenamente mecanismo físico exacto detrás de la relación entre la tensión aplicada y el volumen de inyección observado en nuestros experimentos. Los intereses del laboratorio y áreas de especialización pertinentes no son muy adecuados para la consecución de esta pregunta persistente. Animamos a los que tienen más de la física y la perspicacia de ingeniería para explorar este fenómeno.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el Departamento de Bioingeniería y Ciencias Terapéuticas de la UCSF, el Instituto de California para la cuantitativos Biosciences (QB3), y la Reducción de la Brecha Premio de la Fundación de la familia de Rogers.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml Luer-Lok™ syringes | BD Medical | 309628 | |
| LocTite UV-cured adhesive | Henkel | 35241 | |
| PE-2 tubing | Scientific Commodities | BB31695-PE/2 | |
| Novec HFE-7500 | 3M | 98-0212-2928-5 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S9888 | |
| 1.5 ml centrifuge tubes | Eppendorf | 22363531 | |
| BD Falcon 15 ml tube | BD Biosciences | 352097 | |
| Air pressure control pump | Control Air Inc. | We recommend one under the control of DAQ and control software | |
| Syringe pumps | New Era | Must be capable of holding 1 ml syringes and flowing at rates as low as 100 μl/hr | |
| HV-amplfier | Must be capable of 1,000x amplification of signals between 0.01 and 10 V | ||
| Plasma bonder/cleaner | Harrick Plasma | ||
| 3” silicon wafers | Sigma Aldrich | 647535 | |
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 with curing agent should be included | |
| SU-8 photoresist | MicroChem | Viscocity depends on device dimensions |
References
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