Picoinjection av mikroflödes Drops Utan metallelektroder

Summary

Vi har utvecklat en teknik för picoinjecting mikroflödes droppar som inte kräver metallelektroder. Som sådana utrustningar med vår teknik är enklare att tillverka och att använda.

Abstract

Befintliga metoder för picoinjecting reagenser i mikroflödes droppar kräver metallelektroder integrerade i mikroflödessystem chip. Integrationen av dessa elektroder lägger omständliga och felbenägna steg till enheten tillverkningsprocessen. Vi har utvecklat en teknik som undanröjer behovet av metallelektroder under picoinjection. Istället använder man injektionsvätskan sig som en elektrod, eftersom de flesta biologiska reagenser innehåller upplösta elektrolyter och är ledande. Genom att eliminera elektroderna minskar vi Komponentframställning tid och komplexitet, och göra enheterna mer robusta. Dessutom, med vår strategi, injektionsvolym beror på den spänning som appliceras på picoinjection lösning; detta gör det möjligt för oss att snabbt justera volymen injicerades genom att modulera den pålagda spänningen. Vi visar att vår metod är kompatibel med reagens som innehåller gemensamma biologiska föreningar, innefattande buffertar, enzymer och nukleinsyror.

Introduction

I droppBaserade mikrofluidik, är micron skala vattendroppar som "provrör" för biologiska reaktioner. Fördelen med att utföra reaktioner i de små dropparna är att varje droppe använder bara ett fåtal pl av reagens och, med mikrofluidik, kan dropparna formas och bearbetas vid kilohertz priser ^1. Tillsammans har dessa egenskaper tillåter miljontals reaktioner med individuella celler, nukleinsyramolekyler, eller föreningar som skall utföras i en fråga om minuter med pl av totala materialet.

För att använda droppar för tillämpningar som dessa, är tekniker som behövs för att lägga kontrollerade volymer av reagens till dropparna; sådan verksamhet är analoga med pipettering i provrör. En metod för att åstadkomma detta är electrocoalescence, varvid en droppe av reagens slås samman med målet droppe genom att applicera ett elektriskt fält. Det elektriska fältet stör arrangemanget av ytaktiva molekyler på gränssnitten i dropparna, inducing en tunnfilms instabilitet och utlösa sammansmältning i emulsioner som i övrigt är stabil ^2. Elektriskt inducerad sammansmältning utnyttjas också vid utformningen av den picoinjector, en anordning som sprutar in reagens in i dropparna när de strömmar förbi en trycksatt kanal ^3. För att tillämpa det elektriska fältet, picoinjector anordningar utnyttjar metallelektroder, men integrering av metallelektroder i microfluidic chips är ofta en komplex och felbenägen process som flytlödningstrådar är lätt äventyras av luftbubblor eller damm och annat skräp i kanalen samt frakturer från stressen eller böjning under Enhetsinställningar.

Här presenterar vi en metod för att utföra picoinjection utan användning av metallelektroderna, vilket gör tillverkningen enklare och mer robust. För att utlösa picoinjection, istället använder vi injektionsvätskan sig som en elektrod, eftersom de flesta biologiska reagenser innehåller upplösta elektrolyter och är ledande. Vi lägger också en "Faraday Moat "för att skydda känsliga delar av anordningen och fungera som en universell marken (Figur 1). The vallgrav isolerar elektriskt dropparna uppströms om picoinjection plats genom att tillhandahålla en grund, vilket förhindrar oavsiktlig dropp fusion. En extra fördel med vår teknik är att volym injicerades i dropparna beror på storleken av den pålagda spänningen, så att det kan justeras genom att trimma den pålagda signalen.

Vi tillverka våra enheter i poly (dimetylsiloxan) (PDMS) med mjuka fotolitografiska tekniker ^4,5. Vår strategi är kompatibel med enheter som tillverkas i andra material, såsom plaster, plast och epoxi. Kanalerna har höjder och bredder av 30 | im, som är optimala för att arbeta med droppar 50 ^ m i diameter (65 pl). Vi introducerar reagenser via polyethelene slang (0.3/1.09 mm inner / ytterdiameter) in i hamnar som skapats under Komponentframställning med 0.50 mm biopsi slag, liknande metoder described tidigare ^5. Den exakta sammansättningen av injektionsvätskan är beroende av den specifika tillämpningen. Vätskan behöver endast innehålla upplösta elektrolyter vid koncentrationer som är tillräckligt höga för att ge tillräcklig ledningsförmåga för den elektriska signal som skall sändas till picoinjector. I bänktester, har vi funnit att joniska högre koncentrationer än 10 mM borde räcka ^6, även om detta värde och vätske konduktivitet beror på de specifika enhets dimensionerna och storleken på den pålagda spänningen.

Protocol

1. Design Enhets Mått och topologier som bygger på experimentella behov Använda Computer Aided Design (CAD) programvara

Obs: Välj emulsionskanaldiameter mindre än de sfäriska droppar. Detta tvingar dropparna i en cylindrisk eller "korv" form och möjliggör en effektivare picoinjection. För våra syften, utformade vi 30 x 30 ìm kanaler för droppar som var 50 mikrometer i diameter.

1. Modell picoinjection ställe (n) efter de beskrivna av Abate et al. ³ med undantag av att kanalerna för metallelektroderna tas bort, eftersom de är onödiga.
2. Lägg kanaler att fungera som Faraday Moat (Figur 1) som körs mellan picoinjection webbplats (s) och uppströms emulsion så att de skyddar dropparna från det elektriska fältet.
   OBS: Detta förhindrar oavsiktlig sammanslagning.

2. Fabricera enheter Använda Soft Fotolitograferaographic Tekniker

1. Generera en öppenhet fotolitografi mask baserad på CAD-filen med hjälp av befintliga kommersiella tjänster.
2. Med fotomasken, bota fotoresist på kiselskivor för att framställa en anordning ledar, såsom beskrivits tidigare ^4.
3. Häll PDMS blandat med härdare (11:01 ratio) över enheten mästare som finns i en 5 cm polystyren petriskål.
4. Placera mästare med PDMS i en vakuumexsickator för ungefär 15 minuter för att ta bort eventuella luftbubblor.
5. Bota PDMS anordningen genom att placera det i en ugn 95 ° C under 1 timme. Alternativt kommer PDMS härda vid rumstemperatur efter 24 timmar.
6. Ta bort enheten genom att skära i ytterkanten med en kirurgisk kniv och försiktigt skalar enheten från mastern.
7. Punch inlopp och utlopp hål i PDMS med hjälp av en 0,5 mm biopsi punch.
8. Bond enheten till en glasmikroskopskiva med användning av en plasma bindningsanordning ^4.

3. Förbered ett LufttryckKontroll pump för att tryck en behållare innehållande den Fluid

1. Ändra pumpens uteffekt så att den trycksatta luften avgår genom en längd av 2,7 mm inre polyeten diameter slangen.
2. Konstruera den så att röret slutar i en luer-lock sprutspetsen genom att passa lumen över bröstvårtan på den bakre delen av luer-lock.
3. Försegla genom att fylla utrymmet mellan luer-lock-gängor och slangen med epoxi.
4. Bifoga en 27,5 G nål.

4. Förbered en monodispers emulsion av vattenhaltig (vatten-i-olja) Droppar suspenderas i en inert Fluorerad Carrier Olja med 2% (vikt / vikt) löst Biokompatibel Ytaktivt ⁷

De särskilda reagens som ingår i dessa droppar beror på tillämpningen

1. Som förberedelse för återinjektion, ladda emulsionen i en 1 ml spruta med en 27,5 G nål.
2. Fäst sprutan på en sprutpump och orientera pumpen vertikalt (nålen uppåt).
   Obs: Denna orientering bringar dropparna att packa i ett skikt ovanför transportör olja. När pumpen startas, kommer dropparna att tryckas ut ur sprutan på hög volym bråkdel av oljelager under dem.

5. Förbered Reagenser för Introduktion till mikroflödes Chip

1. Stansa tre 0,5 mm hål i locket av ett 15 ml centrifugrör (någon behållare med skruvlock kommer att räcka) med användning av en biopsistans, nål, eller borr.
2. Sätt i en 0,5 mm diameter tråd elektrod och en ~ 20 cm längd av PE-2 slangen genom två av hålen, så att de når botten av röret.
3. I den återstående hål, gänga en ~ 2,5 cm av en ~ 20 cm längd på PE-slang så att den kommer att vila över vätskenivån.
4. Täta eventuella luckor på toppen av locket med UV-härdad epoxi.
5. Fyll röret med picoinjection vätskan och skruva på locket.
6. Anslut utgången från den lufttrycksstyrpumpen till kortare rörlängd genom insatsning nålen i lumen. Nålen bör passa väl.
7. Fyll en 1 ml spruta med 1 M NaCl för att fungera som Faraday Moat.
8. Anslut en 27,5 G nål och säkra sprutan i en sprutpump.
9. Fyll en 1 ml spruta med bärare / distans olja, anslut en 27,5 G nål, och fäst den i en sprutpump.

6. Förbered mikroflödessystem enhet för Picoinjection

1. Anslut utgången slang (längre längd) från injektionsfluidbehållaren till inloppsporten hos picoinjection vätska på microfluidic chip.
2. Anslut sprutan innehållande 1 M NaCl till inloppsöppningen för Faraday-Moat på microfluidic chip med en längd av PE-rör.
3. Anslut sprutan innehållande bäraren olja till inloppsporten hos microfluidic chip med en längd av PE-rör.
4. Sätt PE slang in i emulsionen utloppsporten på mikroflödeschipet. Slangen bör avsluta i en emulsion uppsamlingskärlet, och inte hellernormalt ett 1,5 ml centrifugrör.
5. Sätt PE slangen i utloppet för Faraday Moat på mikroflödessystem chip. Slangen bör avsluta i ett icke-ledande och elektriskt isolerad behållare för att förhindra kortslutning.
6. Anslut utgången av högspännings (HV) förstärkare via krokodilklämma till metallelektrod nedsänkt i picoinjection vätskan.
7. Anslut jordelektrod HV förstärkare via krokodilklämman till metallen på sprutans nål innehållande 1 M NaCl.

7. Ingjuta Reagenser till Microfluidic Chip

1. Introducera 1 M NaCl (Faraday Moat) till enheten med en hastighet av 100 il / timme.
2. Introducera droppemulsion och transportör olja till priser som är lämpliga för enheten dimensioner. För vår demo-enhet, vi introducerar dropparna och olja vid 200 och 400 l / timme. Flödeshastigheten bör ge dropparna passera picoinjector regelbundet åtskildamed ett mellanrum av transportör olja.
3. Justera tryck som appliceras på picoinjection fluid så att fluidtrycket vid picoinjection öppning är i mekanisk jämvikt med droppkanal.
   OBS: Vid detta tryck (Laplace trycket), bör injektionsvätskan bukta in i droppkanalen utan spirande av och bilda sina egna droppar (Figur 2). Vid dessa flödeshastigheter som beskrivits ovan, använder vi ett tryck av ~ 13 psi till injektionsvätska för att uppnå jämvikt vid injektionsstället.

8. Begin Picoinjection

1. Som droppar passerar injektionsöppning, tillämpa en 0-10 V, 10 kHz, förstärkt AC-signal 1000 x från HV-förstärkaren (Figur 3).
2. Modulera injektionsvolym genom att ändra amplituden hos den pålagda spänningen.
   Obs: Högre spänningar bör möjliggöra mer vätska som ska införas för att dropparna. I våra tester, ser vi en stabil och konsekvent injektion vid spänningar varamellan 100 och 3000 V med hjälp av injektionslösningar av NaCl som sträcker sig från 10 till 500 mm (figur 4).

Representative Results

Mikroskopiska bilder tas på picoinjection platsen visar att elektrifiering av picoinjection vätskan är tillräckligt för att utlösa injektion (Figur 2). Den injicerade volymen kan styras genom modulering av amplituden hos den pålagda spänningen, varvid högre spänningar som möjliggör högre volymer injektion. Vi plotta injektionsvolym kontra storleken på den pålagda spänningen för tre representativa molariteter av injektionsvätska i (Figur 3). För att påvisa den hastighet vår metod, selektivt insprutas vi droppar passerar injektionsstället, beroende på närvaro eller frånvaro av ett fluorescerande färgämne (film 1). Droppar passerar injektorn vid 200 Hz, men så hög som 10 kHz är möjliga, beroende på kapaciteten hos den mekanism droppdetektering ^3.

Vi tillskriver beroendet av injektionsvolym på den pålagda spänningen på det faktum att eftersom de små dropparna att närma sig och passera picoinjection öppning, tjockleken av oljeskiktet som separerar droppen gränssnittet från bula vid injektionsstället minskar ^8. Tröskelspänningen för en elektriskt inducerad tunnfilmsinstabilitet är proportionell mot tjockleken hos detta skikt ^9,10. Därför, som dropparna närmar picoinjector, ögonblicket koalescens beror på storleken av det elektriska fältet. Högre pålagda spänningar möjliggöra tidigare sammansmältning mellan droppen och injektionsvätska, vilket längre injektions löptider. Eftersom injektionsvolym beror på insprutningens varaktighet, alltså även det beror på applicerad spänning.

Lägre molaritet joniska lösningar lättare dämpa signalen och minska den elektriska fältstyrkan vid injektionsstället jämfört med mer koncentrerade lösningar. Följaktligen injektionsvätskor med lägre molariteter av lösta joner kräver högre pålagda spänningar för att uppnå samma injektionsvolymer. Dessa förbindelserhöft demonstreras för en rad joniska molariteter och tillämpad spänningar i en 2D heatmap (Figur 4).

Figur 1. Grundinställningar enhet. Droppar, bärarolja, och 1 M NaCl införes till apparaten via sprutpumpar. De tätt packade dropparna jämnt fördelade med hjälp av grundläggande flödes fokus geometri. När dropparna passera picoinjection plats, är ett elektriskt fält som genereras genom att applicera en AC-signal till en elektrod införd i picoinjection fluidbehållaren (indikeras i rött). Det elektriska fältet möjliggör sammansmältning mellan passerande dropparna och picoinjection vätska. Droppar uppströms om injektionsstället är skärmade från det elektriska fältet genom Faraday Moat - en kanal för en M NaCl (någon hög molaritet jonisk lösning bör räcka) i fortsagera med jordelektroden av HV-förstärkare (visas i svart). Enhetsmått kan skalas efter behov; för våra syften, utformade vi 30 x 30 ìm kanaler (precis uppströms från injektionsstället) för droppar som var 50 mikrometer i diameter.

Figur 2. Ljusfältsmikroskopi bilder av picoinjection stället. I frånvaro av ett elektriskt fält (A), ytaktiva molekyler förhindra koalescens vid injektionsstället och en distinkt gräns är synlig på droppen / injektion fluidgränssnitt. Vid applicering av en 250 V 10 kHz AC-signal försvinner gränsen och reagens injiceras som droppen passerar (B). För visualisering, har injektionsvätska färgats med 2 mg / ml bromfenolblått färgämne. Figur åter publicerade fr^OM-6 med tillstånd från The Royal Society of Chemistry (RSC)

Figur 3. Data som visar sambandet mellan pålagd spänning och volymfraktion ökning (Vf) av droppar efter injektionen för (A) 100 mM, (B) 50 mM, och (C) 25 mM (NaCl) injektionsvätskor. Starkare elfält mer lätt brista gränssnitten olja / vatten och möjliggöra injektion över en större längd på de passerande droppar - detta leder till större injektionsvolym. Högre molariteter av upplösta elektrolyter ökar konduktiviteten i injektionslösningen, som producerar starkare elektriska fält vid injektionsstället för en viss spänning, vilket leder till ökade injektionsvolymer. Felstaplar representerar en standardavvikelse i endera riktningen för> 1200 droppar samplade vid varje punkt. Linjer som förbinder datapunkter görainte utgör någon kurva-fit eller beräknade teoretiska modell. Droppvolymen mäts genom ett fluorescensdetektionssystem som beskrivs i ^6. Figur åter publicerat från ⁶ med tillstånd från The Royal Society of Chemistry (RSC). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

.. Figur 4 Värme karta som visar injektionsvolym som funktion av pålagd spänning och molaritet löst NaCl i injektionsvätskan Injektionsvolymen kan justeras i intervallet 0 till 36 pl med en upplösning på ~ 2,6 pl (4% Vf ) med 100V steg om den tillämpade signalen. De största injicerade volymerna uppnåddes vid 3000 V och 100 mM vätska. Increasing elektriskt fält över detta möjliggör electrowetting, vilket droppar att spontant bildas vid picoinjector, negativt påverka injektionen effektivitet och konsekvens. Pilar / fästingar indikera datapunkter. Figur åter publicerat från ⁶ med tillstånd från The Royal Society of Chemistry (RSC)

Film 1. Höghastighets tagningar demonstrera selektiv omkoppling av picoinjector. Endast droppar innehållande IR-783 fluorescerande färgämne (2 mg / ml) injiceras med reagens (500 mM NaCl).

Discussion

Förhållandet mellan injektionsvolym och pålagd spänning är beroende av många faktorer, inklusive enhetsdimensioner, slangens längd uppbär picoinjection fluid till enheten molaritet picoinjection fluidum och hastigheten hos de små dropparna när de passerar de injektor. Därför rekommenderar vi att volymen / spänningsförhållande karakteriseras före varje körning av picoinjection genom att mäta injektionsvolymer vid kanterna av arbets serier av spänning och molaritet. Dessutom vid högre spänningar och injektionsfluid molariteter observerar vi ett fenomen i vilket picoinjection fluiden är inte längre hålls vid jämvikt vid injektionsöppningen, men istället knoppar av och bildar små droppar i flödeskanalen. Vi tillskriver detta beteende att electrowetting, vari vattenfasen delvis väter de hydrofoba kanaler, vilket gör att krypa ut ur öppningen och in i flödeskanalen ^11. Om denna instabilitet inträffar före önskadinjektionsvolym uppnås överväga att minska droppflödeshastighet, som de passerar injektorn och minska dropp kanalen för att öka insprutnings varaktighet.

Förutom att påtagligt effektivisera tillverkningen av enheter, bör denna teknik även förenkla utförandet av mer komplexa och kombinatoreaktions regimer. Till exempel utför multipla picoinjections med vår teknik kräver bara lägga picoinjection kanaler på de önskade platserna för injektion. Däremot tidigare metoder kräver picoinjection kanaler och medföljande metallelektroder som ska ingå på alla platser. Vidare, tidigare metoder reglerar injektionsvolym relativt långsamt genom att variera insprutningstryck eller dropphastighet. Med vår metod kan injektionsvolymen justeras elektroniskt på priserna snabbare än den högsta drop priser som rapporterats (se avslöjande). Detta möjliggör utförande av mer komplexa analyser, med injektionsvolymer anpassade till den specifika villkorningar inom varje microdrop. Normalisering och insprutning av reagens i polydispersa dropp populationer, till exempel, skulle kräva on-the-fly bestämning av injektionsvolymer.

Denna teknik har utvecklats och visat sig fungera i enheter som använder picoinjection för flerstegs biologiska reaktioner såsom digital PCR och genotypning analyser ^12. Men, med liten eller ingen förändring av protokollet, bör tekniken vara till nytta för alla försöks kräver tillsats av reagenser till droppar för eventuella biologiska, kemiska eller industriella applikationer - så länge injektionsvätskan innehåller upplösta joniska arter.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 ml Luer-Lok™ syringes	BD Medical	309628
LocTite UV-cured adhesive	Henkel	35241
PE-2 tubing	Scientific Commodities	BB31695-PE/2
Novec HFE-7500	3M	98-0212-2928-5
NaCl	Sigma Aldrich	S9888
1.5 ml centrifuge tubes	Eppendorf	22363531
BD Falcon 15 ml tube	BD Biosciences	352097
Air pressure control pump	Control Air Inc.		We recommend one under the control of DAQ and control software
Syringe pumps	New Era		Must be capable of holding 1 ml syringes and flowing at rates as low as 100 μl/hr
HV-amplfier			Must be capable of 1,000x amplification of signals between 0.01 and 10 V
Plasma bonder/cleaner	Harrick Plasma
3” silicon wafers	Sigma Aldrich	647535
PDMS	Dow Corning		Sylgard 184 with curing agent should be included
SU-8 photoresist	MicroChem		Viscocity depends on device dimensions