Summary
Vekst av Medicago truncatula planter i symbiose med nitrogenfikserende bakterier Sinorhizobium meliloti i individuelle, sterile mikrokosmos laget av standard laboratorie plater tillater hyppig undersøkelse av rotsystemer og knuter uten at det går sterilitet. Planter kan opprettholdes i disse vekstkammer i opp til 9 uker.
Abstract
Rhizobial bakterier danner symbiotiske, nitrogenfikserende knuter på røttene av kompatible verts legume planter. En av de mest velutviklede modellsystem for å studere disse interaksjonene er anlegget Medicago truncatula cv. Jemalong A17 og rhizobial bakterien Sinorhizobium meliloti 1021. Gjentatt avbildning av planterøttene og scoring av symbiotiske fenotyper krever metoder som er ikke-destruktiv til enten planter eller bakterier. Det symbiotiske fenotyper av noen plante-og bakterie mutanter viser seg etter relativt korte perioder av vekst, og ikke krever langsiktig observasjon av verten / symbiont samhandling. Men små forskjeller i symbiotiske effektivitet og nodule senescence fenotyper som ikke er tydelig i de tidlige stadier av nodulation prosessen krever relativt lange vekstperioder før de kan scores. Flere metoder har blitt utviklet for langsiktig vekst og observasjon av dette vert / symbiont pair.Imidlertid er mange av disse metoder krever gjentatt vanning, noe som øker muligheten for kontaminering av andre mikroorganismer. Andre fremgangsmåter krever at en forholdsvis stor plass for vekst av et stort antall planter. Metoden som beskrives her, symbiotiske vekst av M. truncatula / S. meliloti i sterile, single-plante mikrokosmos, har flere fordeler. Planter i disse microcosms har tilstrekkelig fuktighet og næringsstoffer for å sikre at vanning er ikke nødvendig for opp til ni uker, noe som forhindrer kryssforurensning under vanning. Dette gjør fenotyper som skal kvantifiseres som kan være savnet i kortsiktige vekst systemer, for eksempel subtile forsinkelser i nodule utvikling og tidlig nodule senescence. Dessuten er røttene og knuter i microcosm lett sees gjennom platen lokket, slik at opp-forankring av anlegg for observasjon er ikke nødvendig.
Introduction
Samspillet mellom legume vertsplanten Medicago truncatula A17 og rhizobial bakterien Sinorhizobium meliloti 1021 er en av de mest medgjørlig modellsystemer for studier av root nodule utvikling og nitrogen-fixing symbiose. Genomene til både symbiotiske partnere har blitt sekvensert 1,2 og både anlegg og bakterien er mottagelig for genetisk manipulasjon 3,4. Analyse av de fenotyper av både plante-og bakterie mutanter krever evne til å observere stadier av nodul utvikling og for å kvantifisere det symbiotiske produktivitet over tid. Her beskriver vi en fremgangsmåte for observasjon av roten nodul utvikling av M. truncatula cv. Jemalong A17 inokulert med S. meliloti 1021 innenfor enkelte mikrokosmos laget av standard, runde 100 mm diameter, 15 mm dype laboratorie plater (figur 1A). The Shoot er eksponert og vokser gjennom en tann portal i siden av platen (Figures 1B, 1C, og 1E). Røtter er inneholdt i microcosms og holdes sterilt, samtidig som den tillater observasjon gjennom lokket av platen (fig. 1D). Siden shoot er tilgjengelig, er veksten ikke er begrenset, og det kan måles med jevne mellomrom uten at sterilitet av roten. Metoden for å lage hakk-plate microcosms ble opprinnelig utviklet av Leigh, et al. Fem for dyrking av alfalfa planter, men det var ikke allment vedtatt til tross for sine mange fordeler fremfor andre metoder. En variant av denne metoden ble også utviklet for analyse av samspillet mellom planterøttene og mycorrhizae seks. Vi har nå tilpasses og optimaliseres denne metoden for vekst av M. truncatula planter. Fordelene ved denne protokollen over mer vanlig brukte fremgangsmåter er beskrevet nedenfor.
Det er flere metoder som er i bred bruk for nodulation studier av M. truncatula inoculert med S. meliloti 7. Den mest brukte metoden for storskala utarbeidelse av nodulated røtter er vekst i aeroponic caissons 7. I denne metoden, blir plantene opphengt over et stort fartøy og røtter blir luftet med en blanding av S. meliloti og næringsstoff løsning 7. Denne metoden er praktisk dersom bare en genotype av S. meliloti er å bli testet. Siden det kreves aerosolisering av høye konsentrasjoner av bakterier, er det en høy sannsynlighet for kryss-forurensning mellom senkekasser inokulert med forskjellige bakteriestammer. En annen metode som ofte brukes til å tilberede store mengder inokulerte planter er vekst i kar eller potter av perlite, vermikulitt, sand eller brent leire som er fylt med næringsløsning og inokulert med S. meliloti 7. Denne metoden krever bruk av åpne kar eller potter, og krever vanning og påfyll av næringsløsningen. En annen ulempe med potter, er at plantenemå fjernes fra denne partikkel matrise for undersøkelse av røttene og knuter. En annen ulempe med denne metoden er at et stort område av inkubator plass kreves da mange forskjellige S. meliloti genotyper som skal sammenlignes, fordi en separat potten må brukes for hver bakterie genotype. Den "Leonard jar" er en variant av denne metode 8,9. En Leonard slagverktøy er sammensatt av to steriliserte fartøy som er stablet den ene oppå den andre og er forbundet med en veke. Growth medium er plassert i den nedre beholderen og trekkes gjennom veken ved kapillærvirkning inn i en vekst matrise av perlitt, vermikulitt, sand og kalsinert leire i den øvre beholder. Frøplante (e) er plassert i vekst matrisen og inokulert med S. meliloti. Denne metoden krever ikke vanning, men undersøkelse av røtter og knuter krever at frøplante bli fjernet fra det partikkelvekst matrisen.
Det er flere metoder som tillater enkel undersøkelse av roots. En av disse er den gjennomsiktig plast "vekst pose" 7. En ulempe ved denne metoden er at hyppig vanning er nødvendig siden bare ≤ 10 ml flytende medium som er optimale for vekst M. truncatula i poser 7. Pouch eksperimenter er også vanligvis begrenset til ~ 2 uker 7, på grunn av nedbryting av papiret veken i posen. To andre metoder som ofte brukes er lik vår metode i at plantene er dyrket på agar og røttene er synlige, men disse metodene har også ulemper at vår fremgangsmåte unngår. I disse fremgangsmåter, blir plantene fullstendig inne 24,5 cm x 24,5 cm agarplater forseglet rundt toppen med porøse kirurgisk tape eller dyrket i agar-skrå-rør proppet med bomullsplugger eller plasthylser 7. Begge disse fremgangsmåter tillater enkel undersøkelse av røtter, og kan holdes steril. Imidlertid er de agar skrå-rør vanligvis dyrket med bare 20 ml agarmedium 7 og krever vanning og et næringsstoffapparat.Foruten for langsiktig vekst av planter. Planter dyrket innenfor de 24,5 cm x 24,5 cm agarplate mikrokosmos har nok fuktighet og næringsstoffer for langsiktig vekst, men den økende skyte raskt blir begrenset innenfor den vedlagte plate mikrokosmos og etylen gass kan bygge opp hemme nodulation 7. I prosedyren som er beskrevet her, er det shoot utsatt og vokser fritt utenfor mikrokosmos som inneholder ~ 70 ml av media, slik at langsiktig vekst.
Den fremgangsmåte som er beskrevet her, kan være nyttig ikke bare for å studere nodulation av legume planter, men også for studium av roten fenotyper av andre mellomstore anlegg. Forskjellen mellom disse microcosms og en tradisjonell polykarbonat plantevev-kultur glasset er at røtter i platen microcosms beskrevet her vokser på den vertikale overflaten av agar i stedet ned i et horisontalt lag av agar i bunnen av glasset. Dette gjør at roten til å løftes av fra agaroverflaten med minimal dAmage til rothår og minimal vedheft av agar til roten overflaten, noe som forenkler behandlingen av rothår ved mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Utføre trinnene 1, 2, 4 og 6 i en steril laminær strømningshette er anbefalt.
En. Utarbeidelse av M. truncatula A17 Frøplanter
Merk: M. truncatula A17 frø anvendt i disse studiene er produsert under avkjølte drivhusbetingelser ved ~ 22 ° C, eller i et plantevekst rom opprettholdt ved 22-26 ° C med ~ 150 til 400 mmol / m -2 s -1 lys.
- Hell frøspiring plater: Bruk 100 mm firkantede plater (15 mm dype) og hell autoklaveres 1,1 til 1,2% vekt / volum renset agar 10 til en dybde på 3-5 mm. Hver plate vil bli brukt til å spire ~ 0,25 til 0,5 g av frø (tilsvarende 63 til 125 frø / plate).
Merk: Det er viktig å bruke plantecellekultur-testet, renset agar for alle platene som er beskrevet i denne protokollen. Leverandøren og katalognummer informasjon for agar er oppført i tabellen over spesifikke reagenser og utstyr. - Scarify / sterilisere M. truncatula A17 frøs: veie tilstrekkelige frø for ønsket antall frøplanter. (M. truncatula A17 frø er ~ 4 mg hver) Place frø i sterile 125 ml kolber med sterile foliedeksel (0,25 til 0,5 g frø / kolbe, og dette er ~ 63-125 frø) og pipette 20 ml konsentrert (96%) H 2 SO 4 langs sidene av kolben.
Merk: Acid scarification vil sterilisere frøene. Også, ved å pipettere syren langs sidene av kolben, det vil re-steriliseres inne i kolben som har kommet i kontakt med unsterilized frø. - Bryte opp klumper av frø med en steril glass-pipette. Swirl hver kolbe ofte for 10-12 min. Små, brune groper vil bli synlig på frøene. Disse er små hull i frøhylsteret 11.
Merk: Bruk vernebriller og hansker når du arbeider med konsentrert H 2 SO 4. - Fjern H 2 SO 4 og skyll frøene: Når minst 10% av frøene har små brune groper, eller 12 min har gått, avhengig av hva somkommer først, fjern alle syre fra kolbene med en steril glass pipette. (Place avfall syre i en 1-2 L begerglass som inneholder minst 300 ml vann fra springen. Dette vil fortynne syren og hindre overoppheting.) Vipp kolbe til å samle inn de resterende syre i kurven på flaska og bruker et lite glass pipette til fjerne all gjenværende syre. Hvis restsyre gjenstår, vil den reagere med skyllevann, varme frøene og drepe dem.
- Skyll frøene ved raskt å helle 100 ml steril ultrarent vann inn i hver kolbe. Det overskytende volum av vann vil fortynne syren og hindre overoppheting og frø skade under reaksjonen av syren med vann. Hell av vannet og flamme-sterilisere leppen på kolben.
- Skyll frø 8-10x med 50 ml sterilt ultrarent vann. Swirl kolben under hver skylling. Kolben skal betraktes sterile på dette punkt, og leppen på kolben bør flammet før hver skylling.
- La frøene absorbere over natten: Ettersiste skylling, hell 50 ml steril ultrarent vann i hver kolbe, erstatte den sterile folie på hver kolbe og sted ved 4 ° C i mørke natten.
- Plasser frøene på spiring plate: Etter å la frøene absorbere over natten, hell av vannet, skyll 2x med ~ 25 ml ultrarent vann, deretter legge 20 ml sterilt ultrarent vann, virvel for å resuspendere frø og hell dem på en 1.1 til 1.2% agar spiring plate fra trinn 1.1. Dersom frø forbli i kolben, tilsett mer vann og hell igjen. Fordel frøene fra hver kolbe til en plate (63-125 frø / plate).
- Virvle plate for å fordele frøene. Frøene bør fordeles jevnt i en 4-5 cm båndet ved den ene ende av platen. Dette vil være "toppen" av platen. "Bunnen" 5-6 cm bør holdes fri for frø (Figur 2A).
- Tegn av vannet med en steril pipette. Vippe plate i en 45 ° vinkel for å la det resterende vann renne til bunnen av platen. Sett lokket på Tilted plate og beskytte mot lys. Plater bør få lov til å renne 10-20 min. (Figur 2B).
- Sett opp spiring: Fjern alt vann som har samlet seg på bunnen av den skråstilte plate med en steril pipette.
- Sett på lokket og forsegle platen med parafilm. Bruk hansker og holde steril (figur 2C).
- Stable spiring plater og deretter slå dem alle opp på en 90 ° vinkel. Frøene vil bli liggende på den vertikale overflaten av agar. Fullt absorberte frø bør lett holder seg til agar. Røttene vil vokse nedover (figur 2D).
- Vikle stabelen spiring platene i folien for å blokkere lys og holde ved 25 ° C i 3 dager.
Merk: Hvis spire inntektene for mindre enn 3 dager, kan røttene være for kort til å nå agar i mikrokosmos. Hvis spiring fortsetter mer enn fire dager før overføring til mikrokosmos plater, overlevelse av frøplanter vilvære dårlig. Hvis M. truncatula økotyper eller mutanter med lavere spire priser er å bli sammenlignet, skal den sakte-spirende ecotype få lov til å spire lenger enn tre dager.
2. Utarbeidelse av individuelle Plate mikrokosmos
- Forbered Jensens medium 12 (se tabell 1 for komposisjon), slik at ~ 70 ml medium for hver mikrokosmos. Forbered i mugger eller kolber som er praktisk for rask helle (ikke mer enn 1-2 l pr mugge) og la et magnetisk oppsikt bar i mugge under autoklavering.
- Etter medium er avkjølt til ~ 55-65 ° C, kosttilskudd har blitt lagt til, og pH har blitt sjekket (se tabell 1), helles i rund 100 mm diameter, 15 mm dype tallerkener. Plater skal helles ~ 0,9 til 1 cm dyp (~ 70 ml / plate).
- Komponenter av Jensens medium kan danne en uklar bunnfall, slik at det er viktig å returnere beholderen til den magnetisk røreplate jevne mellomrom for å hindre at komponentene bunnsetter seg. Utfellinger kan være visible i platen etter at de stivner, og påvirker ikke ytelsen, så lenge de er jevnt fordelt på platene.
- Stable platene under støping for å hindre dannelse av kondens på platelokk.
- Etter Jensens platene har stivnet, hakk begge platene og lokk med en veie spatel som har blitt bøyd til en U-form 5 (figur 3A). Varm svingen av slikkepotten med en brenner til red hot, hakk 5-6 plater og deretter varme igjen. Når tann lokket er plassert på tannplaten, vil dette skape en oval portal gjennom hvilken shoot av frøplante vil vokse (figur 3B). Hvis hakk platene skal lagres, pakk individuelt med parafin film ..
Tre. Utarbeidelse av Sinorhizobium meliloti kulturer
To dager før plante vaksiner, starter kulturer av alle S. meliloti stammer for å bli vaksinert på frøplanter. Cultures bør dyrkes i LBMC (Luria-Bertani [Miller]) medium 13 supplert med 2,5 mM MgSo4, 2,5 mM CaCl 2, og passende antibiotika (TY medium fungerer også bra). Så lite som 2 til 3 ml av hver kultur vil være tilstrekkelig.
- Vokse ved 30 ° C med risting for to dager før cellene er tett.
- For de fleste plante vaksiner, vekstfasen av S. meliloti er ikke kritisk. Vanligvis sen log-eller tidlige stasjonære fase celler brukes.
4. Legging av M. truncatula Frøplanter på individuelle mikrokosmos
- Etter tre dager, åpne en spiring plate (utarbeidet i trinn 1) og skyll straks med sterilt ultrarent vann. Dip tang i etanol og flamme kort for å sterilisere. Bruk steril tang til å forsiktig dytte roten tips av alle frøplanter under vann for å hindre uttørking. Røtter vil variere fra 2-6 cm lange. De fleste vil være 3-4 cm. Velg planter med rette røtter og ingen åpenbaredefekter.
- Sjekk lokkene av Jensens mellom mikrokosmos for oppbygging av kondens. Flikk lokket for å fjerne kondens eller erstatte den med en ny laftet lokk. Dersom det er et overskudd av kondens på lokket, kan frøplante roten holde lokket og deretter dør etter kondensasjonen tørker.
- Ved hjelp av pinsett, forsiktig plukke en frøplante fra spiring platen ved cotyledons og lå roten på et Jensens medium mikrokosmos. Sørg for at roten spissen er i kontakt med agar.
- Fjern forsiktig frøet pelsen hvis det er fortsatt til stede. Frøet strøk bør være løs etter bløtlegging i vann i 5-10 min. Forsiktig erte frøet frakk med pinsett før det gir måte, og kast. De cotyledons og omtrent 0,5 cm i skyte skal stikke ut av U-hakk i platen (figur 4A). Sett forsiktig lokket på plate med U-hakk av lokket over frøplante, skaper en portal for frøplante (figur 4B).Sett platene til side i horisontale stabler inntil alle spirene har blitt plassert på mikrokosmos.
- Bruk alle frøplanter fra hver spiring plate som ser levedyktig og har en rett rot. (Hvis det er mulig, la en plate av frøplanter uåpnet å bruke som erstatning for visnet frøplanter like før vaksinasjonen.)
- Etter å legge ut alle frøplanter, tillate dem å sitte på den horisontale Jensens mikrokosmos mens S. meliloti podestoff suspensjoner blir forberedt.
5. Utarbeidelse av S. meliloti inoculum utestengelse
- Sjekk S. meliloti kulturer jevne etter vaksinasjonen for å være sikker på at de vokser. Etter 2 dager vekst, OD 600 bør være mellom 2 og 4.
- Pipetter 0,5 ml av hver kultur til et sterilt 1,5 ml rør og centrifuge til pellet. Fjern supernatanten.
- Vask cellene to ganger i enten 0,85% steril NaCl eller sterilt ultrarent vann. Suspender cellene i 0,5 ml 0,85% sterile NaCl eller ultrarent vann.
- Måle OD 600 av en 1/10 fortynning av resuspendert S. meliloti kulturer fra trinn 5.3. Basert på denne leser, gjør en suspensjon av hver kultur i sterilt ultrarent vann ved OD 600 = 0,05. Hvis celletettheten er for høy, kan nodulation bli hemmet. Lag nok av den fortynnede suspensjonen, slik at 100 pl kan bli inokulert på hver frøplante. Den uklarhet i OD 600 = 0,05 suspensjon bør være bare knapt merkbar ved øyet.
6. Inokulering og Tetting av mikrokosmos
- Umiddelbart før begynnelsen vaksinasjoner, sjekk for visnet frøplanter som ikke har overlevd overgangen til den Jensens mellom mikrokosmos. Erstatte disse spirene med friske planter fra spire plater.
- Åpne hvert mikrokosmos og vaksinere 100 mL av den aktuelle S. meliloti suspensjon på frøplante roten. Sett på lokk og sett til side i horisontal stacks på 6-10 mikrokosmos. For hver S. meliloti belastning som skal sammenlignes, inokulere minst 15 planter. For stammer som har små forskjeller i symbiotisk produktivitet, vaksinere 30-35 planter. La det være minst 10 planter uinokulert som en negativ kontroll. Vaksinere 30-35 planter med S. meliloti 1021 eller annen egnet villtypestammen for å tjene som positiv kontroll.
- Etter S. meliloti suspensjon har hatt tid til å adsorberes på rotoverflaten og suspensjonen væske har trengt inn i agar (minst 20 min.), vikle hver plate individuelt med parafinfilm. Plater bør pakkes opp til kanten av hakk, men parafin filmen bør ikke blokkere veksten av frøplante (Figur 4C).
- På tidspunktet for innpakning, foreta en siste sjekk for røttene overholdt til innsiden av platen lokket. Hvis du vil fjerne følges røtter fra lokket, lå platen flat på benken og trykk eller sveip lokket til å banke roten tilbake ned på agar surface.
- Stille opp frøplante portaler i hver stabel med 6-10 plater. Lå bunken på en 90 ° vinkel med spirene peker oppover (Figur 4D). Klissete av parafin filmen vil holde platene på plass lenge nok til å pakke inn hele stabelen i folie, slik at en 1-2 cm stripe uinnpakket hvor spirene dukke opp (figur 4E). Folien vil beskytte røttene mot lys.
- Plasser folie innpakket stabler i en tent vekstkammer eller vekstrommet ved 21-25 ° C, 60-70% relativ luftfuktighet og 100-175 mikromol / m -2 s -1 lys på en 16 timers lys / 8 timers mørke syklus ( Fig. 1A). Under disse vekstforhold, forlenget inkubasjon ved lysnivåer høyere enn 200 mikromol / m -2 s -1 kan ha en skadelig effekt på planteveksten.
7. Undersøkelse av rotsystemer og Kvanitifisering av symbiotiske Fenotyper
Planter kan opprettholdes imikrokosmos for opptil ni uker.
- Nodule nummer kan kvantifiseres på en rekke tidspunkter ved pakker opp folien fra hver bunke og telle knuter. Utvikling knuter på planter inokulert med S. meliloti 1021 villtype er åpenbar etter 10-14 dager etter vaksinasjonen.
- Symbiotisk produktivitet kan også måles på hvert tidspunkt ved å måle lengden på den nye shoot.
- Endelig kvantifisering av symbiotisk produktivitet er vanligvis utføres på syv uker etter vaksinasjon med å ta av skyte og måle ferskvekt av skyte. Dette trinnet kan utføres så sent som i 9 uker hvis lengre vekst er ønskelig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fremstilling og inokulering av disse plate microcosms er relativt enkelt sammenlignet med de fleste andre metoder som er beskrevet i innledningen. Bruk av disse mikrokosmos tillater også langvarig plantevekst (opp til 9 uker) uten vanning eller næringstilskudd, vedlikehold av rot sterilitet, både enkel undersøkelse av røtter og beskyttelse av røtter fra lys, skyter ubegrenset vekst av anlegget, enkel tilgang til shoot for lengdemåling, og fjerning av planter fra microcosms med minimal skade på rothår. Figur 1A viser unge planter som vokser i microcosms i en inkubator. Bildene i figur 1B-1E viser flere forskjellige visninger av mikrokosmos som inneholder M. truncatula A17 planter inokulert med villtype S. meliloti 1021. Hvis pakket tett, vil> 220 mikrokosmos passe på en 73,8 cm x 67,5 cm inkubator hylle. Figurene 1B og 1C viser mikrokosmos i etfolie-viklet stabel med planter som kommer ut av portalene i microcosms. Figur 1D viser et enkelt microcosm med folien fjernet og roten, og knuter som viser gjennom fronten av platen. Figur 1E viser samme microcosm ligger flatt med anlegget som kommer ut portalen i platen. Den skuddlengden kan måles fra det punktet av veksten fra mikrokosmos (figur 1C) uten å forstyrre anlegget. Figur 5A viser skuddlengden data for M. truncatula A17 planter inokulert med villtype S. meliloti 1021 sammenlignet med uinokulert planter på 7 uker og 9 uker etter inokulasjon. Vekst i mikrokosmos er ideell for å samle en rekke tidspunkter av nodule utvikling og skuddlengden. Ved den endelige endepunktet, blir skuddene klippet bort for måling av skyte ferskvekt (figur 5B). Figur 6 viser eksempler på tre symbiotiske fenotyper på 7 uker post-vaksinasjon. Den relative symbiotisk produktivitet M. truncatula A17 planter inokulert med forskjellig S. meliloti stammer er kvantifisert ved skuddlengden (Figur 6A) og skyte ferskvekt (figur 6B). Antall rot knuter på plantene inokulert med disse stammer er vist i figur 6C. En rosa farge på grunn av produksjon av leghemoglobin indikerer at knuter er funksjonelle og kan nitrogenfiksering, samtidig som små hvite knuter er vanligvis ikke-funksjonelt, og / eller avbrutt og brune knuter er senescent og nekrotisk 14-18. Sammenligningen i figur 6 viser at det symbiotiske produktiviteten av M. truncatula A17 planter inokulert med S. meliloti 1021 bærer pstb-LAFR5-exoY plasmid, som overexpresses den ExoY undecaprenyl-fosfat galaktose fosfotransferase, er større enn den til villtype S. meliloti 1021 og stammer bærer negative c ontrol plasmid pstb-LAFR5. Disse ExoY overekspresjon stammer produserer mer av det symbiotiske exopolysaccharide succinoglycan enn kontrollstammene. Evnen til å kvantifisere forskjeller i symbiotiske fenotyper som tar flere uker å manifestere er en stor fordel med denne metoden. For alle tiltak av symbiotisk produktivitet på M. truncatula A17, den Sinorhizobium medicae stammer WSM419 og ABS7 prestere bedre enn S. meliloti 1021 (figurene 6A-6C). (Dataene fra Figur 6 opprinnelig dukket opp i Jones (2012) 19.) På den tiden at mikrokosmos er demontert og skyte friske vekter er målt, røtter kan også bli fotografert av mikroskopi. Figur 7 viser representative utsikt over M. truncatula A17 røtter etter fjerning fra mikrokosmos. De rothår har opplevd minimal skade, siden røttene lå på overflaten av agaren og ikke er opp-røtter fra en horisontal lag av agar.
_content "> planter kan opprettholdes i opp til 9 uker i disse microcosms fordi det er ~ 70 ml agar dyrkningsmedium i platen. etter lengre vekstperioder, kan enkelte plantene begynner å tørke. syv ukers vekst er optimal for den symbiose med S. meliloti 1021. For mer effektiv symbiose av M. truncatula A17 med S. medicae WSM419 eller S. medicae ABS7, kortere vekstperiode på 4-5 uker er optimal.| Endelig konsentrasjon per L | Antall på lager løsning | Lager konsentrasjon |
| 1 g CaHPO 4 | NA | NA |
| 0,2 g MgSo4 · 7H 2 0 | 1 ml | 0,2 g / ml |
| 0,2 g K 2 HP0 4 | 1 ml | 0,2 g / ml |
| 0,2 g NaCl | 1 ml | 0,2g / ml |
| 0,1 g FeCl 3 · 6H20 | 1 ml | 0,1 g / ml |
| 11,5 g agar-renset (se tabell over spesifikke reagenser for agar spesifikasjoner) | ||
| MilliQ H 2 0-1 L |
Tabell 1. Jensens medium agar protokoll for plate mikrokosmos. Forberedelse instruksjoner for Jensens medium.
Fremgangsmåte:
- Legg over ingrediensene, og bland med magnetisk rørepinne.
- Autoklav 45 min, flytende syklus, med rørepinne i mugge.
Merk: CaHPO 4 og FeCl 3 vil utløse ut under autoklavering. Rør for å få dem tilbake i suspensjon, media vil fortsatt forbli skyet - Kule under omrøring inntil det er ikke smertefullt å plukke opp mugge med bare hendene.
- Tilsett 1 ml spormineraler per L (se nedenfor for oppskrift) while røring
Merk: Sørg for å resuspender bunnfallet i spormineraler før dispensering. - Til 0,25 ml 4 N NaOH per L, under omrøring.
- Sjekk pH ved å fjerne ~ 100 mL media med steril pipette og gjelder for pH-papir
Merk: pH 5-10 range papir fungerer godt. pH bør være ~ 7 Tillat et par sekunder for full fargeutvikling. Hvis pH ikke er riktig, kan det ha vært en forberedelse feil. - Hell platene så tykt som mulig, reblanding kolbe ved å gå tilbake til den magnetisk røreplaten
Merk: Hvis en plate som er overfylt (dvs. væsken suger opp på undersiden av lokket)
Merk: Forvent å få ~ 15 plater per liter.
Trace mineraler lager en L (sterilisere ved autoklavering)
| 1 g H 3 BO 3 |
| 1 g ZnSO 4 · 7H 2 0 |
| 0,5 g CuSO 4 · 5H 2 0 |
| 0,5 g MnCl 2 · 4H 2 0 |
| 1 g NaMoO 4 · 2H 2 0 |
| mili-Q H to 0-1 L |
Figur 1. Visninger av mikrokosmos som inneholder planter inokulert med S. meliloti 1021 A) Planter i mikrokosmos plater vokser i en inkubator. B) M. truncatula A17 planter inokulert med S. meliloti 1021 vill type vokser gjennom hakk i toppen av Jensens agar mikrokosmos. C) Tilleggs utsikt nærbilde av platene i B viser planter vokser gjennom hakk i mikrokosmos. D) En av mikrokosmos plater fra B og C med roten knuter avbildes gjennom lokket. E) Platen from D ligger flatt med shoot dukker opp fra hakk.
Figur 2. Seed spiring plate set-up. A) Frø er fordelt over en halvdel av en 100 mm kvadratisk plate. B) Agar overflate er drenert ved å tillate vann å samle seg på bunnen av en skråstilt plate. C) Plater er innpakket i parafinfilm, stablet og D) stabelen slått til en 90 o vinkel og innpakket i folie.
Figur 3. Bygging av mikrokosmos av innskjæring Jensens plater med en bøyd slikkepott. A) En metallveie spatel som er bøyd for å danne en oval er flamme-oppvarmet og brukt til hakk en U-formet hull i siden avplate, og i siden av lokket. Bunnen av U-hakk i platen bør være på toppen av agaroverflaten. Bunnen av U-hakk i lokket bør være helt på toppen av lokket. B) Skifte av lokket bort på platen skaper en oval-formet portal gjennom hvilken frøplante kan stikke frem.
Figur 4. Innsetting av frøplanter i mikrokosmos. A) To syn viser hvordan frøplante root bør legge på agar overflaten med cotyledons og ~ 0,5 cm av shoot utstående ut av U-hakk i platen. B) og C) Plassere lokket på plate med hakk stilt opp vil skape en oval portal for frøplante. Innpakking platen godt med parafinfilm vil holde lokket i å bevege seg og hindre uttørking. D) Platene kan deretter stables sammen i grupper på 6-10, og E) innpakket med folie. Klikk her for å se større figur .
Figur 5. Representative symbiotiske fenotyper etter 7 uker vekst og 9 uker vekst av M. truncatula A17 i enkelt mikrokosmos. A) Shoot lengde av planter inokulert med S. meliloti 1021, og skuddlengden av uinokulert planter ble målt til 7 uker uten å fjerne plantene fra mikrokosmos. Ved 9 uker etter inokulering, ble skuddlengden målt (A), og deretter ble skuddene avkuttet og veies (B).
. Jpg "/>
Figur 6. Representative symbiotiske fenotyper etter 7 uker vekst av M. truncatula A17 i enkelt mikrokosmos. exoY-overekspresjon stammer av S. meliloti 1021 har forbedret symbiose på vertsplanten Medicago truncatula A17. Den symbiotiske produktivitet S. meliloti 1021 på M. truncatula A17 er forbedret i stammer som overuttrykker den undecaprenyl-fosfat galaktose fosfotransferase kodet av exoY. Symbiotisk produktivitet blir målt ved (A) skuddlengden i cm, og (B) skyter ferskvekt i gram. Tallene av rosa, funksjonelle knuter (nederst grafen bar), hvit, ineffektive knuter (midten graf bar), og brune, nekrotiske knuter (øverste graf bar) er vist i (C). Den symbiotiske produktivitet og nodule antall planter inokulert med S. medicae stammer WSM419 og ABS7 vises også. Stjernene enn graf barer betegne en statistiskly signifikant forskjell fra 1021 villtype referanse belastning i en uparet t-test. Planter inokulert med en exoY :: Tn5 null mutant som ikke produserer noen succinoglycan hadde lignende skuddlengder og ferskvekt til uinokulert planter, og produserte bare hvite, ineffektive knuter. Grafene i (A) og (B) ble opprinnelig utgitt på 19. Klikk her for å se større figur .
Figur 7. Roots avbildes på et disseksjonsmikroskop etter fjerning fra microcosms. Røtter kan lett fjernes fra microcosms for avbildning med minimal skade på rothår fordi de ligger på overflaten av agaren. Bildene viser røttene til M. truncatula A17 på 10 dager etter inokulering (A, B) (C). Røttene viste inokulert med S. meliloti 1021 wild type (A), en S. meliloti stamme bærer en eglC :: GUS fusjon (B), og en S. meliloti stamme bærer en SMc00911 :: GUS fusion 20 (C). GUS farging av S. meliloti celler som bærer SMc00911 :: GUS fusjon er synlig på rothår og roten overflaten i E. Bar tilsvarer 100 mikrometer. Klikk her for å se større figur .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det er flere trinn i protokollen som er kritiske for suksess: 1) Nødvendigheten av å bruke renset, plantecellekultur testet agar kan ikke understrekes nok. Dette er ikke kritisk for alfalfa frøplanter, men det er kritisk for vekst av M. truncatula A17. 2) Det er viktig å spire frøplanter på vertikale agarplater som beskrevet i trinn 1.. Den utbredt teknikk for spirende frøplanter på en invertert horisontal flate i en 15 mm dyp tallerken 7 er ikke anbefales for denne protokollen fordi frøplante røtter vil bli for kort og / eller ikke rett. Frøplanter med rett voksende røtter på 2-4 cm i lengde er ideelle for overføring fra spire platene til mikrokosmos. Tre dager med vekst i de vertikale spiring plater er vanligvis ideell for røttene å oppnå denne lengden. 3) Det er også avgjørende for å unngå forurensning av frøplanter med rhizobia før vaksinasjonen. Før overføring av frøplanter fra spire platene til microcosms, bør arbeidsområdet være grundig rengjort med etanol og alle instrumenter som brukes i overføringen bør være hyppig flamme sterilisert. En annen potensiell kilde til forurensning kan unngås ved å fremstille den S. meliloti belastningsskader suspensjoner for inokulering av mikrokosmos i et eget arbeidsområde fra det som brukes for frøplante forberedelse. Soppforurensning av de microcosms kan også unngås ved å fjerne alle rester av frøhylsteret fra det indre av microcosm, siden soppsporer kan være innebygd i pelsen. 4) Frøplanter overlevelse kan maksimeres ved å holde frøplante røtter fuktig og i kontakt med agar til alle tider, og av svært skånsom behandling under transport. Enhver frøplante med roten fanget i agar i spiring platen skal fjernet forsiktig for å unngå skade på roten. En høy avkastning av levedyktige planter kan oppnås ved å gjøre en siste sjekk for visnet frøplanter i stabler av mikrokosmos før begynnelsen vaksinasjoner, og erstatte dem viddh nye frøplanter. Hvis frøplanter er i god stand, og har ikke overholdt til innsiden av platen lokket, bør mindre enn 5% av frøplanter må byttes ut på dette tidspunkt. Obstruksjon av skuddvekst fra mikrokosmos kan forebygges ved å sørge for at ingen rester av frøet pelsen er begrensende cotyledons og at mikrokosmos er Parafilm-innpakket nøye slik at de skyter ikke vil bli hindret.
Vi rutinemessig bruker denne metoden for å studere symbiose i vertsplanter M. truncatula A17 og alfalfa, og vi er for tiden å optimalisere teknikken for vekst av andre M. truncatula sortar, andre arter av Medicago og arter av Melilotus (sweetclovers). Vi har ennå ikke testet denne metoden med M. truncatula A20, som er en ecotype som brukes som en genetisk kartlegging partner med A17. Vi har funnet ut at M. truncatula cv. R108 ikke vokser godt på den rensede plantecellekultur testet agar som vi bruker for øyeblikket, og vi prøver å identifisere en annen agar preparat eller en agar-erstatning for bruk som et mikrokosmos vekst-substrat for denne sorten.
I sammenligning av metoden beskrevet her med andre vanlig brukte fremgangsmåter for analyse av M. truncatula A17 / S. meliloti symbiose, har vi funnet dette å være langt den beste metoden for samtidig å sammenligne det symbiotiske ytelsen til et stort antall S. meliloti stammer. Vi rutinemessig oppstilling 250 microcosms i en tid (10 ulike stammer av S. meliloti inokulert på 25 planter i hver.) Når bare en genotype av S. meliloti eller S. medicae skal benyttes, og kryss-kontaminering er ikke fare for, kan aeroponic senkekasser eller vekstposer være en mer passende metode. Denne plate microcosm metode er også den beste metoden for å gjøre periodiske observasjoner av progresjon av nodul utvikling og symbiotisk produktivitet over en lang periodetid. Fenotyper som manifesterer i de senere stadier av symbiose, som nodule senescence, kan studeres lettere med denne metoden enn med andre protokoller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av USDA National Institute of Food and Agriculture, Landbruks-og matdepartementet Forskningsinitiativet stipend 2010-65108 - 20582 til KMJ Vi takker Brian K. Washburn for kritisk gjennomgang av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar purified, plant cell culture-tested | Sigma | A7921 |
References
- Galibert, F., et al. The composite genome of the legume symbiont Sinorhizobium meliloti. Science. 293, 668-672 (2001).
- Young, N. D., et al. The Medicago genome provides insight into the evolution of rhizobial symbioses. Nature. 480, 520-524 (2011).
- Glazebrook, J., Walker, G. C. Genetic techniques in Rhizobium meliloti. Methods Enzymol. 204, 398-418 (1991).
- Cheng, X., Wen, J., Tadege, M., Ratet, P., Mysore, K. S. Reverse genetics in medicago truncatula using Tnt1 insertion mutants. Methods Mol Biol. 678, 179-190 (2011).
- Leigh, J. A., Signer, E. R., Walker, G. C. Exopolysaccharide-deficient mutants of Rhizobium meliloti that form ineffective nodules. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 6231-6235 (1985).
- Wong, K. K. Y., Fortin, J. A. A Petri Dish Technique for the Aseptic Synthesis of Ectomycorrhizae. Canadian Journal of Botany-Revue Canadienne De Botanique. 67, 1713-1716 (1989).
- Barker, D. G., et al. The Medicago truncatula handbook. Mathesius, U., Journet, E. P., Sumner, L. W. , (2006).
- Leonard, L. T. A Simple Assembly for Use in the Testing of Cultures of Rhizobia. J Bacteriol. 45, 523-527 (1943).
- Trung, B. C., Yoshida, S. Improvement of Leonard jar assembly for screening of effective rhizobium. Soil Sci Plant Nutr. 29, 97-100 (1983).
- Penmetsa, R. V., Cook, D. R. Production and characterization of diverse developmental mutants of Medicago truncatula. Plant Physiol. 123, 1387-1398 (2000).
- Garcia, J., Barker, D. G., Journet, E. P. The Medicago truncatula handbook. Mathesius, U., Journet, E. P., Sumner, L. W. , (2006).
- Vincent, J. M. A Manual for the Practical Study of the Root-Nodule Bacteria. , Blackwell. (1970).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1982).
- Pladys, D., Vance, C. P. Proteolysis during Development and Senescence of Effective and Plant Gene-Controlled Ineffective Alfalfa Nodules. Plant Physiology. 103, 379-384 (1993).
- Vasse, J., de Billy, F., Truchet, G. Abortion of infection during the Rhizobium meliloti-alfalfa symbiotic interaction is accompanied by a hypersensitive reaction. The Plant J. 4, 555-566 (1993).
- Johnson, L. E. B., Vance, C. P. Histological and Biochemical Comparisons of Plant Induced Ineffective Nodules. Phytopathology. 71, 884 (1981).
- Vance, C. P., Johnson, L. E. B., Hardarson, G. Histological Comparisons of Plant and Rhizobium Induced Ineffective Nodules in Alfalfa. Physiological Plant Pathology. 17, 167 (1980).
- Van de Velde, W., et al. Aging in legume symbiosis. A molecular view on nodule senescence in Medicago truncatula. Plant Physiol. 141, 711-720 (2006).
- Jones, K. M. Increased production of the exopolysaccharide succinoglycan enhances Sinorhizobium meliloti 1021 symbiosis with the host plant Medicago truncatula. J Bacteriol. 194, 4322-4331 (2012).
- Queiroux, C., et al. A comparative genomics screen identifies a Sinorhizobium meliloti 1021 sodM-like gene strongly expressed within host plant nodules. BMC Microbiol. 12, 74 (2012).
