Summary
Рост Medicago truncatula растений в симбиозе с азотфиксаторов Sinorhizobium meliloti в отдельных стерильных микрокосм, изготовленной из стандартных лабораторных пластин позволяет частое обследование корневых систем и узелков без ущерба стерильности. Растения могут быть сохранены в этих камерах роста до 9 недель.
Abstract
Ризобиальных бактерии образуют симбиотические, азотфиксирующих клубеньков на корнях совместимых хост-бобовых растений. Одним из наиболее хорошо развитых модельных систем для изучения этих взаимодействий является завод Люцерна truncatula резюме. Jemalong A17 и ризобиального бактерия Sinorhizobium meliloti 1021. Повторное изображений корней растений и забил симбиотических фенотипов требуется методы, которые неразрушающего либо к растений или бактерий. Симбиотические фенотипы некоторых основных бактериальных мутантов становятся очевидными после относительно коротких периодов роста, и не требуют долгосрочное наблюдение взаимодействия хост / симбионтов. Тем не менее, тонкие различия в симбиотических эффективности и узелок старением фенотипы, которые не видны на ранних стадиях процесса нодуляции требуют относительно длительные периоды роста, прежде чем они могут быть забил. Некоторые методы были разработаны для долгосрочного роста и наблюдения этого хоста / симбионтов пары.Тем не менее, многие из этих методов требуют неоднократного полив, что увеличивает возможность заражения другими микробами. Другие методы требуют относительно большого пространства для роста большого числа растений. Метод, описанный здесь, симбиотические рост M. truncatula / С. meliloti в стерильных, одного завода микрокосм, имеет ряд преимуществ. Растения в этих микрокосм есть достаточное количество влаги и питательных веществ для того, чтобы полив не требуется на срок до 9 недель, предотвращая перекрестного загрязнения во время полива. Это позволяет фенотипы быть количественно, которые могут быть пропущены в системах роста краткосрочных, таких как тонкие задержки в развитии конкреций и в начале конкреций старения. Кроме того, корни и узелки в микромире легко просматривать через крышку пластины, поэтому до-укоренения растений для наблюдения не требуется.
Introduction
Взаимодействие между бобовых растений-хозяев Medicago truncatula A17 и ризобиальных бактерии Sinorhizobium meliloti 1021 является одним из самых сговорчивых модельных систем для изучения развития узелков корневой и азотфиксирующего симбиоза. Геномы обоих симбиотических партнеров были последовательными 1,2 и оба завода и бактерии поддаются генетической манипуляции 3,4. Анализ фенотипов как основных бактериальных мутантов требуется способность наблюдать этапы развития узелков и количественно симбиотические производительность с течением времени. Здесь мы опишем метод для наблюдения развития клубеньковых М. truncatula резюме. Jemalong A17 инокулированные S. meliloti 1021 в рамках отдельных микрокосм, изготовленных из стандарта, круглый диаметром 100 мм, 15 мм в глубину лабораторных пластин (рис. 1А). Съемки подвергается и растет через зубчатым портала в стороне пластины (FigurES 1B, 1C и 1E). Корни содержатся в микрокосмах и выдерживают стерильный, позволяя при наблюдении через крышку пластины (фиг. 1D). Поскольку съемки доступен, его рост не ограничен и может быть измерена с периодическими интервалами без ущерба стерильность корня. Метод создания зубчатый пластинчатые микрокосм была первоначально разработана Ли и др.. 5 для выращивания растений люцерны, но она не была широко принята, несмотря на его многочисленные преимущества по сравнению с другими методами. Разновидностью этого метода была также разработана для анализа взаимодействия между корнями растений и микоризы 6. Мы теперь адаптирована и оптимизирована этот метод для роста M. truncatula растения. Преимущества этого протокола более наиболее часто используемых методов описаны ниже.
Есть несколько методов, которые в настоящее время в широком использовании для нодуляции исследований М. truncatula inoculated с S. meliloti 7. Наиболее часто используемый способ получения масштабной желвачный корней рост аэропонного кессонов 7. В этом способе растения подвешены на большой емкости и корни газированные смесью S. meliloti и питательный раствор 7. Этот способ является практичным, если только один генотип С. meliloti для которого требуется проверить. Так как это требует аэрозолизации высоких концентраций бактерий, существует высокая вероятность перекрестного загрязнения между кессонов, привитых различных бактериальных штаммов. Другой метод, который часто используется для подготовки большого количества привитых растений является рост в кадках или горшках перлит, вермикулит, песок или кальцинированной глины, которые переплетаются с питательным раствором и инокулированного S. meliloti 7. Этот метод требует использования открытых ваннах или горшках, и требует полива и пополнение питательного раствора. Другим недостатком является то, что горшках растениядолжны быть удалены из этой матрицы макрочастиц для изучения корней и узелков. Другой недостаток этого метода в том, что большая площадь инкубатора пространства требуется при многих различных С. meliloti генотипы должны быть сравнены, потому отдельный горшок должен быть использован для каждого бактериального генотипа. "Леонард банку" является вариацией на этом методе 8,9. Леонард сосуд состоит из двух стерилизованных сосудах уложенных один поверх другого и соединенных фитиль. Среда роста помещается в нижней емкости и втягивается через фитиль под действием капиллярных сил в матрицу роста перлит, вермикулит, песок или прокаленной глины в верхней судна. Рассада (ы) размещаются в матрице роста и инокулировали S. meliloti. Этот метод не требует полива, но исследование корней и узелков требует, чтобы саженец быть удалены из матрицы роста частиц.
Есть несколько методов, которые позволяют легко экспертизу кенгуруц. Одним из них является прозрачным "мешочек рост" пластик 7. Недостатком этого метода является то, что частый полив требуется, так как только ≤ 10 мл жидкой среды является оптимальным для выращивания М. truncatula в мешочках 7. Чехол эксперименты также обычно ограничивается ~ 2 недели 7, в связи с распадом бумаги фитиль в сумке. Два других методов, которые обычно используются похожи на нашего метода в том, что растения, выращенные на агаре и корни видны, но эти способы также имеют недостатки, что наша процедура позволяет избежать. В этих способах растения полностью содержится в пределах 24,5 см х 24,5 см чашках с агаром запечатанных вокруг верхней части с пористой или хирургической лентой, выращенные в агар-уклон труб закрывали пробками хлопка или пластмассовыми крышками 7. Оба этих метода позволяют легко Анализ корней и может быть стерильными. Тем не менее, скошенного агара трубки обычно выращивают только с 20 мл агаровой среде 7 и требуют полива и питательных веществddition для долгосрочного роста растений. Растения, выращенные в пределах 24,5 см х 24,5 см агаром микрокосм есть достаточное количество влаги и питательных веществ для долгосрочного роста, но растет стрелять быстро становится скованным в закрытых пластина микрокосм и газообразный этилен может создать ингибирования нодуляции 7. В процедуре, описанной здесь, стрелять подвергается и растет свободно вне микромира, которая содержит ~ 70 мл средства массовой информации, что позволяет долгосрочного роста.
Процедура, описанная здесь может быть полезен не только для изучения клубеньков бобовых растений, но и для изучения корневых фенотипов других среднего размера растений. Разница между этими микрокосмах и традиционный поликарбонат растительной ткани-культуры в том, что банку корни в пластине микрокосмах описанных здесь расти на вертикальной поверхности агара, а не вниз в горизонтальном слое агара в нижней части банки. Это позволяет корневой быть отходит от поверхности агара с минимальной DAmage для корневых волосков и минимальной адгезией агара к поверхности корня, что облегчает изучение корневых волосков с помощью микроскопа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Выполнение шагов 1, 2, 4 и 6 в стерильном ламинарном боксе рекомендуется.
1. Подготовка М. truncatula A17 Рассада
Примечание: М. truncatula A17 семена, используемые в этих исследованиях производятся под охлажденных тепличных условиях при температуре ~ 22 ° C, или в комнате роста растений, поддерживаемой при 22-26 ° С с ~ 150-400 ммоль / м -2 с -1 света.
- Налейте прорастания семян пластин: Используйте 100 мм квадратных пластин (15 мм в глубину) и залить автоклавного 1.1-1.2% вес / объем очищенного агара 10 на глубину 3-5 мм. Каждая пластина будет использоваться, чтобы прорасти ~ 0,25-0,5 г семян (эквивалент 63-125 семян / пластины).
Примечание: Очень важно использовать культуре клеток растений проверенные, очищенный агар для всех пластин, описанных в этом протоколе. Поставщик и номер по каталогу информация для агара указана в Таблице специфических реагентов и оборудования. - Разрыхлить / стерилизовать М. truncatula A17 семянс: Взвесьте достаточные семена нужного количества саженцев. (M. truncatula A17 семена ~ 4 мг каждого) Место семена в стерильных 125 мл колбах со стерильным крышками из фольги (0,25-0,5 г семян / колбу, это ~ 63-125 семена) и пипетка 20 мл концентрированной (96%) H 2 SO 4 вдоль боковых сторон колбы.
Примечание: кислота скарификация будет стерилизовать семена. Кроме того, с помощью пипетки кислоты вдоль сторон колбы, он будет повторно стерилизовать внутри колбы, которая вступает в контакт с нестерильных семян. - Разбейте комки семян со стерильным стеклянной пипетки. Вихревой каждую колбу часто на 10-12 мин. Небольшие, коричневые ямы станет видимым на семенах. Эти крошечные отверстия в семенной оболочки 11.
Примечание: Используйте защитные очки и перчатки при работе с концентрированной H 2 SO 4. - Удалить H 2 SO 4 и промыть семена: Когда, по крайней мере 10% семян имеют небольшие коричневые ямы, или 12 мин прошли, в зависимости от тогона первом месте, удалить все кислоту из колб с стерильную стеклянную пипетку. (Место отходов кислоты в 1-2 л стакан, содержащий не менее 300 мл водопроводной воды. Это будет разбавить кислоту и предотвращения перегрева.) Наклоните колбу для сбора остатков кислоты в кривой колбу и использовать небольшую стеклянную пипетку к удалить все оставшиеся кислоту. Если остаточная кислота остается, она будет реагировать с промывочной воды, нагреть семена и убить их.
- Промойте семена, быстро заливки 100 мл стерильной воды высшей степени очистки в каждую колбу. Избыток объем воды будет разбавлять кислоты и предотвратить перегрев и повреждение семян в процессе реакции кислоты с водой. Слейте воду и пламя стерилизовать губу колбы.
- Промыть семена 8-10X с 50 мл стерильной сверхчистой воды. Вихревой колбу в течение каждого полоскания. Колбу следует рассматривать стерильный в этой точке и губа колбы должна быть запылано перед каждым полоскания.
- Пусть семена впитывают ночлега: После того, какпоследнего полоскания, залить 50 мл стерильной воды высшей степени очистки в каждой колбе, замените стерильную фольгу на каждой колбы и место при 4 ° С в темноте в течение ночи.
- Место семена на всхожесть пластины: После позволяя семена впитывают всю ночь, слейте воду, промойте 2x с ~ 25 мл воды высокой степени очистки, а затем добавить 20 мл стерильной сверхчистой водой, вихревые ресуспендировать семена и залить их на 1,1-1,2% агар прорастания пластины из шаг 1.1. Если семена остаются в колбе, добавьте больше воды и залить снова. Распределите семена из каждой колбы в одной тарелке (63-125 семена / пластины).
- Вихревой тарелку распространять семена. Семена должны быть равномерно распределены в диапазоне 4-5 см на одном конце пластины. Это будет "сверху" пластины. «Дно» 5-6 см должны быть свободны от семян (рис. 2А).
- Слить воду с стерильной пипеткой. Наклоните пластину под углом 45 °, чтобы в канализацию оставшиеся воды в нижней части пластины. Замените крышку на ТильТед пластины и защиты от света. Плиты должны иметь возможность слить 10-20 мин. (Фиг.2В).
- Установка прорастание: Удалить все воду, которая собирается в нижней части наклонной пластины с стерильной пипетки.
- Закройте крышку и уплотнение тарелку парафильмом. Надевайте перчатки и стерильная чистота (рис. 2С).
- Стек прорастания пластины, а затем повернуть все из них до под углом 90 °. Семена будет лежать на вертикальной поверхности агара. Полностью впитал семена должны легко придерживаться агара. Корни будут расти вниз (рис. 2, г).
- Оберните пачку прорастания пластин в фольге, чтобы блокировать свет и держать при температуре 25 ° С в течение 3 дней.
Примечание: Если прорастание выручка за менее чем 3-х дней, корни могут быть слишком коротким, чтобы достичь агара в микрокосм. Если всхожесть продолжается более 4 дней до перевода в микромира пластин, выживание рассады будетбыть бедным. Если М. truncatula экотипы или мутанты с более медленными темпами прорастания должны быть сравнены, медленно-прорастающих экотип должно быть позволено, чтобы прорасти срок более 3 дней.
2. Подготовка индивидуальных микрокосм Plate
- Подготовка среды 12 (см. Таблицу 1 для композиции), позволяющий ~ 70 мл среды Дженсена для каждого микрокосма. Подготовка в кувшины или колб, которые удобны для быстрого розлива (не более 1-2 л на кувшин) и оставить магнитной мешалкой в кувшин во время обработки в автоклаве.
- После средней остынет до ~ 55-65 ° C, добавки были добавлены, и рН был проверен (см. таблицу 1), разлить в круглом диаметром 100 мм, 15 мм в глубину пластины. Плиты следует вылить ~ 0,9-1 см в глубину (~ 70 мл / планшет).
- Компоненты среды Дженсена могут образовывать мутного осадка, поэтому важно, чтобы вернуть кувшин с магнитной мешалки периодически, чтобы предотвратить компоненты из осаждение. Осадки могут быть по отношениюible в пластине после того как они затвердевают и не влияет на производительность тех пор, пока они равномерно распределены среди пластинок.
- Стек пластин во время заливки, чтобы предотвратить образование конденсата на пластинчатых крышками.
- После пластины Дженсена укрепили, засечь обе пластины и крышки с весом шпателем, который был согнут в U-образной 5 (рис. 3А). Нагрейте изгиб шпателем с горелкой до докрасна, первоклассных 5-6 пластин, а затем нагреть снова. Когда зубчатый крышка находится на зубчатым пластины, это создаст овальную портал, через который стрелять из рассады будет расти (рис. 3б). Если зубчатый пластины должны храниться, оберните индивидуально с парафиновой пленки ..
3. Подготовка Sinorhizobium meliloti культур
За два дня до растений прививок, начать культур всех S. meliloti напрягается, чтобы быть внесено на рассаду. Cultuразрешение должны быть выращены в LBMC (Лурия-Бертани [Миллер]) среднего 13 дополнена 2,5 мМ MgSO 4, 2,5 мМ CaCl 2, и соответствующими антибиотиками (TY среда также хорошо работает). Как ни мало 2-3 мл каждой культуры будет достаточно.
- Расти при 30 ° С при встряхивании в течение 2 дней, пока клетки не плотны.
- Для большинства растений прививок, фаза роста S. meliloti не является критическим. Как правило, в конце войти или ранней стационарной фазы клетки используются.
4. Разметка М. truncatula Рассада на отдельных микрокосмы
- После 3 дней, открыть прорастания пластину (полученного на стадии 1), и сразу же залить стерильной сверхчистой воды. Dip щипцы в этаноле и пламени кратко стерилизации. Используйте стерильного пинцета аккуратно введите кончики корней всех саженцев под водой, чтобы предотвратить высыхание. Корни будет колебаться от 2-6 см в длину. Большинство будет 3-4 см. Выберите саженцы с прямыми корнями и не очевиднодефекты.
- Проверьте крышек средних микрокосм в Дженсена для наращивания конденсации. Флик крышку, чтобы удалить конденсат или заменить его на новый зубчатый крышкой. Если есть избыток конденсата на крышке, корень рассады может присоединиться к крышке, а затем умирают после конденсации высыхает.
- Используя щипцы, осторожно выбрать саженец от прорастания пластины семядолей и заложить корень на средней микромира Дженсена. Убедитесь, кончика корня находится в контакте с агаром.
- Аккуратно удалите семенную оболочку, если она по-прежнему присутствует. Семенной пальто должна быть свободной после вымачивания в воде в течение 5-10 мин. Аккуратно дразнить семенной оболочки с пинцетом, пока он не уступает, и выбросьте. Семядоли и около 0,5 см съемки должны выступать из U-паз в пластине (рис. 4А). Осторожно установите крышку пластины с U-вырезом крышки над рассады, создание портала для рассады (рис. 4В).Установите пластины в сторону в горизонтальной стеков, пока все саженцы не были размещены на микрокосм.
- Используйте все саженцы из каждого прорастания пластины, которые выглядят жизнеспособными и иметь прямой корень. (Если возможно, оставьте одну тарелку рассады не открываются для использования в качестве замены для увядших саженцев непосредственно перед прививкой.)
- После возложения все саженцы, чтобы они могли сидеть на микрокосм по горизонтальной Дженсена в то время как С. Готовятся meliloti суспензии посевной.
5. Подготовка S. meliloti посевного материала Суспензии
- Проверьте S. meliloti культуры периодически после прививки, чтобы быть уверенным, что они растут. После роста 2 дня, ОП 600 должно быть между 2 и 4.
- Пипетка 0,5 мл каждой культуры в стерильный 1,5 мл пробирку и центрифугируют для осаждения. Удалить супернатант.
- Вымойте клеток два раза в любом 0,85% стерильного NaCl или стерильной воды высшей степени очистки. Ресуспендируют клеток в 0,5 мл 0,85% стераздражать NaCl или сверхчистой воды.
- Измерьте OD 600 1/10 разведения ресуспендированного S. В meliloti культур, начиная с шага 5.3. Исходя из этого чтения, сделать суспензию каждой культуры в стерильной сверхчистой воды на OD 600 = 0,05. Если плотность клеток является слишком высокой, клубеньков может быть подавлено. Сделать достаточное количество разбавленной суспензии так, чтобы 100 мкл может быть внесено на каждый саженец. Помутнение OD 600 = 0,05 приостановлении должно быть только едва заметно на глаз.
6. Прививка и Герметизация микрокосмы
- Непосредственно перед начинающим прививок, проверьте увядших саженцев, которые не пережили переход на средних микрокосм в Дженсена. Замените эти саженцы со свежими рассады от всходов пластин.
- Откройте каждый микрокосм и привить 100 мкл соответствующей S. meliloti подвеску на корню рассады. Закройте крышку и отложите в горизонтальном НТККкс 6-10 микрокосм. Для каждого S. meliloti штамм для сравнения, привить не менее 15 растений. Для штаммов, которые имеют тонкие различия в симбиотической производительности, привить 30-35 растений. Оставьте как минимум 10 заводов неинокулированную в качестве отрицательного контроля. Привить 30-35 растений с S. meliloti 1021 или другой соответствующий штамм дикого типа в качестве положительного контроля.
- После того, как С. meliloti подвеска успел адсорбировать на поверхности корня и суспензию жидкость всасывается в агар (по крайней мере 20 мин.), оберните каждую тарелку индивидуально с парафиновой пленки. Плиты должны быть обернуты до самого края выреза, но парафин фильм не должен блокировать рост рассады (рис. 4С).
- Во время упаковки, сделать окончательную проверку для корней, прилипших к внутренней стороне крышки пластины. Для удаления прилипших корни от крышки, заложить пластину плашмя на скамейке и нажмите или Флик крышку выбить корень обратно на агар суrface.
- Выстроить рассада порталы каждого стека 6-10 пластин. Положите стопку под углом 90 ° с сеянцы направлена вверх (рис. 4D). Клейкость парафиновой пленки проведет пластин в месте достаточно долго, чтобы обернуть весь стек в фольгу, оставляя 1-2 см полосу развернул где сеянцы появляются (рис. 4E). Фольга защитит корни от света.
- Поместите фольги завернутые стеки в освещенной камере роста или комнату роста на 21-25 ° С, 60-70% относительной влажности и 100-175 мкмоль / м -2 с -1 света на 16 ч света / 8 ч темноты ( На фиг.1А). В этих условиях роста, длительной инкубации при освещенности выше, чем 200 мкмоль / м -2 с -1 может иметь отрицательное влияние на рост растений.
7. Экспертиза систем корней и количественного симбиотических фенотипов
Растения могут быть сохранены вмикрокосмы на срок до 9 недель.
- Число Узелок может быть определена количественно в серии временных точках по разворачивания фольгу от каждого стека и подсчета узелки. Разработка узелки на заводах инокулированные S. meliloti 1021 дикого типа являются очевидными 10-14 дней после посева.
- Симбиотическая производительности также может быть измерена в каждый момент времени, измеряя длину формирующейся стрелять.
- Окончательный количественный анализ симбиотической производительности обычно выполняется в 7 недель после прививки, отсоединив стрелять и измерения сырой вес побега. Этот шаг может быть выполнен как в конце 9 недель, если больше рост желательно.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Подготовка и посев этих плит микрокосмах относительно прост по сравнению с большинством других способов, описанных во введении. Использование этих микрокосмах также позволяет длительное роста растений (до 9 недель) без полива или питательных добавок, содержание корневой стерильности, как легко экспертиза корней и защиты корней от света, непринужденно рост побегов растения, легкий доступ к фотосессии для измерение длины, и удаление растений из микрокосмах с минимальным ущербом для корневых волосков. рис. 1А показывает молодые саженцы, растущие в микрокосм в инкубаторе. Изображения на рисунках 1B-1E шоу несколько разные взгляды на микрокосм, содержащих М. truncatula A17 растения, привитые дикого типа S. meliloti 1021. Если плотно упакованы,> 220 микрокосм помещается на 73,8 см х 67,5 см инкубатор шельфа. Фиг.1В и 1С-шоу микрокосм вв упаковке из фольги стек с растениями, выходящих из порталов в микрокосмах. Рисунок 1D показан один микромир с фольгой удалены и корнем и узелков, показывая через переднюю часть пластины. Рис 1E показывает то же самое микрокосм лежа с завода, выходящего из портал в пластине. Длина стрелять можно измерить с точки выхода из микромира (рис. 1в), не нарушая завод. 5А показывает данные о длине стрелять для М. truncatula A17 растения, привитые дикого типа S. meliloti 1021 по сравнению с неинокулированных растений на 7 недель и 9 недель после прививки. Рост микрокосмах идеально подходит для сбора серию временных точках развития узелков и побегов. На заключительном временной точке, побеги обрезаны для измерения веса свежих (фиг.5В). Рисунок 6 показывает примеры 3 симбиотических фенотипов в 7 недель позт-прививка. Относительная симбиотические продуктивность М. truncatula A17 растения Инокулированные с различными S. meliloti штаммы можно измерить с помощью побегов (рис. 6А) и веса свежих (рис. 6б). Количество корневых клубеньков на растениях, зараженных этими штаммами показан на рисунке 6С. Розовый цвет в связи с производством leghemoglobin указывает, что узелки функциональны и способны фиксации азота, в то время как маленькие белые узелки, как правило, нефункциональные и / или прерывается и коричневые узелки стареющей и некротические 14-18. Сравнение на рисунке 6 показывает, что симбиотические Продуктивность M. truncatula A17 растения, привитые S. meliloti 1021 несущий плазмиду PSTB-LAFR5-exoY, который сверхэкспрессирует в ExoY undecaprenyl-фосфат галактозы фосфотрансферазу, больше, чем у дикого типа С. meliloti 1021 и штаммы, несущие отрицательную С ontrol плазмиды ПСТБ-LAFR5. Эти ExoY сверхэкспрессирующих штаммы производить больше симбиотической экзополисахарида сукциногликан чем контрольных штаммов. Возможность количественного различия в симбиотических фенотипов, которые принимают несколько недель, чтобы проявить является основным преимуществом данного метода. Для всех мер симбиотической производительности на М. truncatula A17, Sinorhizobium medicae штаммы WSM419 и ABS7 работают лучше, чем S. meliloti 1021 (фиг.6А-6С). (Данные из рисунке 6, первоначально появились в Джонс (2012) 19.) В то время, микрокосм разбирается и стрелять свежие веса измеряются, корни также могут быть отображены с помощью микроскопа. Рисунок 7 показывает репрезентативные вид М. truncatula A17 корни после удаления из микрокосм. Корневые волоски испытали минимальные повреждения, так как корни лежали на поверхности агара и не до-корнями из горизонтальном слое агара.
_content "> Растения могут сохраняться до 9 недель в этих микрокосм, потому что есть ~ 70 мл агаровой среде роста в пластине. После длительных периодов роста, некоторые растения могут начать сохнуть. Семь недель роста является оптимальным для симбиоза с С. meliloti 1021. Для более эффективного симбиоза М. truncatula A17 с С. medicae WSM419 или S. medicae ABS7, на более короткий период роста 4-5 недель является оптимальным.| Конечная концентрация на л | Количество раствора | Концентрация со |
| 1 г CaHPO 4 | Не Доступно | Не Доступно |
| 0,2 г MgSO 4 · 7H 2 0 | 1 мл | 0,2 г / мл |
| 0,2 г K 2 HP0 4 | 1 мл | 0,2 г / мл |
| 0,2 г NaCl | 1 мл | 0,2г / мл |
| 0,1 г FeCl 3 · 6Н20 | 1 мл | 0,1 г / мл |
| 11,5 г агар-очищенный (см. Таблицу специфических реагентов для спецификаций агара) | ||
| MilliQ H 2 0 до 1 л |
Таблица 1. Среднего агар протокол Дженсена для пластинчатых микрокосм. Способ приготовления для средних Дженсена.
Шаги:
- Добавить выше ингредиентов, и смешать с магнитной мешалкой.
- Автоклав 45 мин, жидкость цикл, с мешалкой в кувшин.
Примечание: CaHPO 4 и FeCl 3 будет осаждаться в течение автоклаве. Движение, чтобы получить их обратно в ходовой части; СМИ будут по-прежнему остаются облачно - Охладите при перемешивании, пока не будет совсем не больно, чтобы забрать кувшин с голыми руками.
- Добавить 1 мл микроэлементы на L (см. ниже рецепт) белыйИль перемешивание
Примечание: Убедитесь, что ресуспендируют осадок в микроэлементы перед разливом. - Добавить 0,25 мл 4 N NaOH на литр, при перемешивании.
- Проверьте рН, удаляя ~ 100 мкл среды с стерильной пипеткой и применяя к индикаторной бумаги
Примечание: рН 5-10 Диапазон бумага хорошо. рН должно быть ~ 7 Разрешить несколько секунд для развития полного цвета. Если рН не является правильным, может быть ошибка подготовка. - Налейте тарелки, как толстые, как это возможно, ремиксы колбу, вернувшись на магнитной мешалки
Примечание: Если пластина переполнен (то есть жидкий отстой вверх на нижней части крышки),
Примечание: Ожидайте получать ~ 15 пластин за литр.
Микроэлементы складе 1 л (стерилизовать автоклавированием)
| 1 г Н 3 ВО 3 |
| 1 г ZnSO 4 · 7H 2 0 |
| 0,5 г CuSO 4 · 5H 2 0 |
| 0,5 г MnCl 2 · 4H 2 0 |
| 1 г NaMoO 4 · 2H 2 0 |
| воен-Q H 2 0 до 1 л |
Рисунок 1. Мнения микрокосм, содержащих растений инокулированные S. meliloti 1021) Растения в микромире пластин растущих в инкубаторе. Б) М. truncatula A17 растения, привитые S. meliloti 1021 дикого типа растет через паз в верхней части агара микрокосмах Дженсена. C) Дополнительная крупным планом из пластин в B показывая растения, произрастающие через пазы в микрокосм. D) Один из микромира плит из В и С с корнем узелки распечатанных через крышку. E) Пластина сюдам D лежа с побега, выходящего из надреза.
Рисунок 2. Всхожесть семян пластина настройки. А) Семена распределяются по одной половины 100 мм квадратной пластины. B) Агар поверхность сливают, позволяя воде, чтобы собрать на дне наклонном пластины. C) Плиты упакованы в парафиновой пленки, многоярусные и D) из стека Оказалось под углом 90 ° и завернуть в фольгу.
Рисунок 3. Строительство микрокосмах насечка пластины Дженсена с изогнутой шпателем. А) металла весом шпатель, который был изогнут, чтобы сформировать овал является пламени нагревается и используется засечь U-образный вырез в сторонепластины и на стороне крышки. В нижней части U-образным надрезом в пластине должно быть в верхней части поверхности агара. В нижней части U-паз в крышке должны быть полностью в верхней части крышки. B) Замена крышку на тарелку создает овальной формы портал, через который могут выступать саженец.
Рисунок 4. Размещение рассады в микрокосм. А) Два взгляда показать, как корень рассады должна лежать на поверхность агара с семядолей и ~ 0,5 см стрелять выступающие из U-паз в пластине. B) и C) Размещение крышку на табличке с вырезами выстроились создаст овальную портал для рассады. Упаковочная тарелку плотно с парафиновой пленки будет держать крышку от перемещения и предотвращения высыхания. D) Плиты могут быть сложены вместе в группах по 6-10 и Е) оборачивают пленкой. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Рисунок 5. Представительства симбиотические фенотипы после роста 7 недель и роста 9 недель М. truncatula А17 в отдельных микрокосм.) Длина Стрелять из растений, зараженных S. meliloti 1021, а длина стрелять из неинокулированных растений были измерены в 7 недель без удаления растений из микрокосмах. На 9 недель после инокуляции, длина съемки была измерена (А), а затем побеги были обрезаны и взвешивают (B).
. JPG "/>
Рисунок 6. Представительства симбиотические фенотипы после роста 7 недель М. truncatula А17 в отдельных микрокосм. exoY сверхэкспрессирующих штаммов S. meliloti 1021 повысили симбиоз на растения-хозяина Medicago truncatula A17. Симбиотические производительность S. meliloti 1021 на М. truncatula A17 улучшается в штаммах, которые сверхэкспрессируют на undecaprenyl-фосфат галактозы фосфотрансферазу кодируемый exoY. Симбиотическая производительность измеряется как (А) высота побегов в см (В) веса свежих в граммах. Цифры розовых, функциональных конкреций (нижняя гистограмма), белый, неэффективных конкреций (штрих Средний график) и коричневых, некротических узелков (верхняя гистограмма) показаны в (С). Симбиотические производительность и узелок количество растений, зараженных S. medicae штаммы WSM419 и ABS7 также показаны. Звездочки более графа баров обозначим статистическийлы Существенное отличие от 1021 дикого типа эталонного штамма в непарным т-тест. Растения Инокулированные с нулевой мутанта exoY :: Tn5, которая не производит никаких сукциногликан были подобные длины побегов и свежий вес в неинокулированных растений, и производится только белые, неэффективные узелки. Графики на (А) и (Б) были первоначально опубликованы в 19. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Рисунок 7. Корни отображается на вскрытии микроскопом после снятия с микрокосм. Корни могут быть легко удалены из микрокосмах для изображений с минимальным ущербом для корневых волосков, потому что они лежат на поверхности агара. Изображения показывают корни М. truncatula А17 на 10 дней после прививки (А, В) (C). Корни показано инокулировали S. meliloti 1021 дикого типа (А), С. meliloti штамм, несущий слияние EGLC :: GUS (B), и С. meliloti штамм, несущий SMc00911 :: GUS фьюжн 20 (С). GUS окрашивание S. meliloti клетки, несущие слияние SMc00911 :: GUS виден на корневых волосков и поверхность корня в E. Бар соответствует 100 мкм. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Есть несколько шагов, протокола, которые имеют решающее для успеха: 1) Необходимость использования очищенной, завод клеточной культуры проходят агар не может быть переоценена. Это не является критическим для проростков люцерны, но это имеет решающее значение для роста M. truncatula A17. 2) важно, чтобы прорасти рассаду на вертикальных чашках с агаром, как описано в шаге 1. Широко используется методика проращивания рассады на перевернутой горизонтальной поверхности в 15 мм глубокую тарелку 7 не рекомендуется для этого протокола, потому что корни рассады будет слишком коротким и / или не прямо. Саженцы с прямой растущих корней 2-4 см в длину идеально подходят для перевода с прорастания плит к микрокосм. Три дня роста в вертикальных прорастания пластин, как правило, идеально подходит для корней для достижения этой длины. 3) Важно также, чтобы избежать загрязнения саженцев с ризобий до прививки. До перевода сеянцев от прорастания пластин microcoсмс, рабочая зона должны быть тщательно очищены этанолом и все инструменты, используемые в передаче должен часто пламени стерилизовать. Другим потенциальным источником загрязнения можно избежать, подготовке S. meliloti суспензии штамма для прививки микрокосм в отдельной области работы от используемого для рассады подготовку. Грибковые загрязнение микрокосмах также можно избежать, удалив все остатки семенной оболочки с внутренней стороны микромира, так как грибковые споры могут быть встроены в пальто. 4) выживание рассады можно увеличить, сохраняя корни рассады влажной и в контакте с агар во все времена, и очень нежный лечения во время передачи. Любой рассады с корнем в ловушке агара в прорастания пластины должны быть изъяты тщательно, чтобы избежать повреждения корня. Высокий выход жизнеспособных растений может быть достигнуто путем принятия окончательного чек на увядших рассады в штабеля микрокосмах перед началом прививок, и замены им остроумиеч новые саженцы. Если саженцы находятся в хорошем состоянии и не присоединились к внутренней стороне крышки пластины, менее 5% саженцев должны должны быть заменены на данном этапе. Воспрепятствование роста побегов от микромира можно предотвратить, убедившись, что никаких следов семенной кожуры не сдерживая семядоли и что микрокосм парафильм обернутый так тщательно, что стрелять не будут закрыты.
Мы обычно используют этот метод для изучения симбиоз в принимающих растений М. truncatula A17 и люцерна, и мы в настоящее время оптимизации технику для роста другой М. truncatula сорта, другие виды люцерны и видов Донник (sweetclovers). Мы еще не проверял этот метод с М. truncatula A20, который является экотип, который используется в качестве генетического партнера отображения с A17. Мы обнаружили, что M. truncatula резюме. R108 не хорошо растут на очищенном AG растений клеточной культуры испытанияар, что мы в настоящее время используют, и мы пытаемся определить другой агар подготовку или агар-заменитель для использования в качестве микромира роста-субстрата для этого сорта.
При сравнении методом, описанным здесь с другими часто используемых методов анализа М. truncatula А17 / С. meliloti симбиоз, мы обнаружили, что это, безусловно, лучший метод для одновременного сравнения симбиотические производительность большого количества S. meliloti штаммов. Мы регулярно настроить 250 микрокосм в то время (10 различных штаммов S. meliloti высевают на 25 растений в каждом.) Когда только один генотип S. meliloti или S. medicae будет использоваться, и перекрестное загрязнение не является риском, аэропонного кессоны или мешочки роста может быть более подходящим методом. Этот метод пластина микрокосм также лучший способ получения периодических наблюдений прогрессировании развития узелков и симбиотической производительности в течение длительного периодаВремя. Фенотипы, которые проявляются на более поздних стадиях симбиоза, такие как конкреций старения, могут быть изучены более легко с помощью этого метода, чем с другими протоколами.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась по USDA Национального института сельского хозяйства и продовольствия, сельского хозяйства и исследовательской инициативы Еда гранта 2010-65108 - 20582 в KMJ Мы благодарим Брайан К. Washburn для критического обзора рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar purified, plant cell culture-tested | Sigma | A7921 |
References
- Galibert, F., et al. The composite genome of the legume symbiont Sinorhizobium meliloti. Science. 293, 668-672 (2001).
- Young, N. D., et al. The Medicago genome provides insight into the evolution of rhizobial symbioses. Nature. 480, 520-524 (2011).
- Glazebrook, J., Walker, G. C. Genetic techniques in Rhizobium meliloti. Methods Enzymol. 204, 398-418 (1991).
- Cheng, X., Wen, J., Tadege, M., Ratet, P., Mysore, K. S. Reverse genetics in medicago truncatula using Tnt1 insertion mutants. Methods Mol Biol. 678, 179-190 (2011).
- Leigh, J. A., Signer, E. R., Walker, G. C. Exopolysaccharide-deficient mutants of Rhizobium meliloti that form ineffective nodules. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 6231-6235 (1985).
- Wong, K. K. Y., Fortin, J. A. A Petri Dish Technique for the Aseptic Synthesis of Ectomycorrhizae. Canadian Journal of Botany-Revue Canadienne De Botanique. 67, 1713-1716 (1989).
- Barker, D. G., et al. The Medicago truncatula handbook. Mathesius, U., Journet, E. P., Sumner, L. W. , (2006).
- Leonard, L. T. A Simple Assembly for Use in the Testing of Cultures of Rhizobia. J Bacteriol. 45, 523-527 (1943).
- Trung, B. C., Yoshida, S. Improvement of Leonard jar assembly for screening of effective rhizobium. Soil Sci Plant Nutr. 29, 97-100 (1983).
- Penmetsa, R. V., Cook, D. R. Production and characterization of diverse developmental mutants of Medicago truncatula. Plant Physiol. 123, 1387-1398 (2000).
- Garcia, J., Barker, D. G., Journet, E. P. The Medicago truncatula handbook. Mathesius, U., Journet, E. P., Sumner, L. W. , (2006).
- Vincent, J. M. A Manual for the Practical Study of the Root-Nodule Bacteria. , Blackwell. (1970).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1982).
- Pladys, D., Vance, C. P. Proteolysis during Development and Senescence of Effective and Plant Gene-Controlled Ineffective Alfalfa Nodules. Plant Physiology. 103, 379-384 (1993).
- Vasse, J., de Billy, F., Truchet, G. Abortion of infection during the Rhizobium meliloti-alfalfa symbiotic interaction is accompanied by a hypersensitive reaction. The Plant J. 4, 555-566 (1993).
- Johnson, L. E. B., Vance, C. P. Histological and Biochemical Comparisons of Plant Induced Ineffective Nodules. Phytopathology. 71, 884 (1981).
- Vance, C. P., Johnson, L. E. B., Hardarson, G. Histological Comparisons of Plant and Rhizobium Induced Ineffective Nodules in Alfalfa. Physiological Plant Pathology. 17, 167 (1980).
- Van de Velde, W., et al. Aging in legume symbiosis. A molecular view on nodule senescence in Medicago truncatula. Plant Physiol. 141, 711-720 (2006).
- Jones, K. M. Increased production of the exopolysaccharide succinoglycan enhances Sinorhizobium meliloti 1021 symbiosis with the host plant Medicago truncatula. J Bacteriol. 194, 4322-4331 (2012).
- Queiroux, C., et al. A comparative genomics screen identifies a Sinorhizobium meliloti 1021 sodM-like gene strongly expressed within host plant nodules. BMC Microbiol. 12, 74 (2012).
