Summary
نمو النباتات truncatula Medicago في التعايش مع البكتيريا المثبتة للنيتروجين meliloti Sinorhizobium في الفردية، عوالم مصغرة معقمة مصنوعة من لوحات المختبر القياسية يسمح الفحص المتكرر للأنظمة الجذر والعقيدات دون المساس العقم. يمكن الحفاظ على النباتات في هذه الغرف النمو لمدة تصل إلى 9 أسابيع.
Abstract
البكتيريا التكافلية بالريزوبيا تشكل عقيدات المثبتة للنيتروجين على جذور النباتات البقولية المضيف متوافق. أحد أنظمة النموذج الأكثر متطورة لدراسة هذه التفاعلات هو المصنع Medicago truncatula السيرة الذاتية. Jemalong A17 وبالريزوبيا بكتيريا Sinorhizobium meliloti 1021. التصوير المتكرر من جذور النباتات والتهديف من الظواهر التكافلية يتطلب الأساليب التي هي غير مدمرة إما النباتات أو البكتيريا. الظواهر التكافلية من بعض النباتات والمسوخ البكتيرية تصبح واضحة بعد فترات قصيرة نسبيا من النمو، ولا تتطلب مراقبة طويلة الأجل للتفاعل المضيف / المتكافل. ومع ذلك، فإن الاختلافات الطفيفة في تكافلية الكفاءة والعقيدات الشيخوخة الظواهر التي ليست واضحة في المراحل المبكرة من عملية nodulation تتطلب فترات النمو طويلة نسبيا قبل أن يتم وسجل. وقد تم تطوير العديد من الطرق للنمو على المدى الطويل ومراقبة هذا الزوج المضيف / المتكافل.ومع ذلك، فإن العديد من هذه الأساليب تتطلب سقي متكررة، مما يزيد من إمكانية تلوث الميكروبات الأخرى. أساليب أخرى تتطلب مساحة كبيرة نسبيا للنمو أعداد كبيرة من النباتات. وصف الأسلوب هنا، والنمو التكافلية من M. truncatula / س. meliloti في العقيمة، عوالم مصغرة نبات واحد، لديه العديد من المزايا. النباتات في هذه عوالم مصغرة لها الرطوبة والمواد المغذية كافية لضمان ليس مطلوبا أن سقي لمدة تصل إلى 9 أسابيع، ومنع انتقال التلوث أثناء الري. وهذا يسمح الظواهر ليكون كميا التي قد تضيع في أنظمة النمو على المدى القصير، مثل التأخير خفية في التنمية العقيدات العقيدات وأوائل الشيخوخة. أيضا، وينظر إلى جذور والعقيدات في مصغرا بسهولة من خلال لوحة غطاء، لذلك ليس مطلوبا يصل تأصيل النباتات للمراقبة.
Introduction
التفاعل بين النبات العائل البقوليات Medicago truncatula A17 والبكتيريا بالريزوبيا Sinorhizobium meliloti 1021 هو واحد من أنظمة النموذج الأكثر لين العريكة لدراسة جذور التنمية العقيدات والمثبتة للنيتروجين التعايش. وقد تسلسل الجينوم من كلا الشريكين التكافلية 1،2 و كل من النبات والبكتيريا قابلة للتلاعب الجيني 3،4. تحليل الظواهر من بشقيه النباتي والمسوخ البكتيرية تتطلب القدرة على مراقبة مراحل التنمية والعقيدات لقياس الإنتاجية تكافلية مع مرور الوقت. نحن هنا تصف طريقة لمراقبة تطور العقيدات الجذرية للM. truncatula السيرة الذاتية. Jemalong A17 تلقيح مع S. meliloti 1021 ضمن عوالم مصغرة الفردية المقدمة من معيار، على مدار 100 مم، 15 مم لوحات المختبر العميقة (الشكل 1A). يتعرض تبادل لاطلاق النار وينمو من خلال بوابة حقق في الجانب من لوحة (الارقام ..وفاق 1B، 1C، و1E). وترد جذور داخل عوالم مصغرة وأبقى عقيمة، في حين يسمح للمراقبة من خلال غطاء اللوحة (الشكل 1D). منذ تبادل لاطلاق النار يمكن الوصول إليه، ليست مقيدة نموها، ويمكن أن يقاس على فترات دورية دون المساس عقم جذورها. طريقة خلق عوالم مصغرة حقق لوحة وضعت أصلا من قبل لي، وآخرون. 5 لزراعة نباتات البرسيم، ولكن لم يعتمد على نطاق واسع على الرغم من العديد من المزايا على مدى أساليب أخرى. وقد وضعت وهناك تباين على هذا الأسلوب أيضا لتحليل التفاعل بين جذور النباتات وفطر 6. تكيفنا الآن وهذا الأسلوب الأمثل لنمو M. النباتات truncatula. وصفت مزايا هذا البروتوكول على أكثر شيوعا الأساليب أدناه.
هناك العديد من الطرق التي هي حاليا في استخدام واسع للدراسات nodulation من M. truncatula inocuذا الصلة مع S. meliloti 7. الأسلوب الأكثر شيوعا لإعداد واسعة النطاق من جذور nodulated هو النمو في قيسونات aeroponic 7. في هذه الطريقة، يتم تعليق النباتات على سفينة كبيرة وتتم تهوية الجذور مع خليط من S. meliloti والمحلول المغذي 7. هذا الأسلوب هو عملي إذا راثى واحد فقط من S. meliloti هو لفحصها. لأنه يتطلب هباء من تركيزات عالية من البكتيريا، وهناك احتمال كبير للتلوث المتبادل بين قيسونات تلقيح مع سلالات بكتيرية مختلفة. طريقة أخرى التي غالبا ما تستخدم لإعداد كميات كبيرة من النباتات الملقحة هو النمو في أحواض أو أواني من البيرلايت، الخس، والرمل أو الطين المكلس التي غرست مع المحلول المغذي وتلقيح مع S. meliloti 7. يتطلب هذا الأسلوب استخدام أحواض المياه المفتوحة أو الأواني، ويتطلب الري وتجديد المحلول المغذي. وثمة عيب آخر من الأواني هو أن النباتاتيجب إزالة هذه المصفوفة من الجسيمات لفحص الجذور والعقيدات. عيب آخر من هذا الأسلوب هو أن مساحة كبيرة من الفضاء حاضنة مطلوب عند العديد من مختلف S. المورثات meliloti وينبغي مقارنة، لأن وعاء منفصل يجب استخدام لكل الوراثي الجرثومي. في "جرة ليونارد" هو الاختلاف على هذا الأسلوب 8،9. يتكون جرة يونارد سفينتين تعقيمها مكدسة واحدة فوق الأخرى، ومتصلة بواسطة الفتيل. يتم وضع متوسط النمو في السفينة أقل وتعادل عن طريق الفتيل قبل عمل شعري في مصفوفة النمو من البيرلايت، الخس، والرمل أو الطين المكلس في السفينة العلوي. يتم وضع الشتلات (ق) في مصفوفة النمو وتلقيح مع S. meliloti. هذه الطريقة لا تتطلب الري، ولكن فحص الجذور والعقيدات يتطلب أن الشتلات إزالتها من مصفوفة النمو الجسيمات.
هناك العديد من الطرق التي لا يسمح فحص سهل من رونهاية الخبر. واحدة من هذه هي شفافة "الحقيبة النمو" البلاستيك 7. عيوب هذا الأسلوب هو أن سقي متكررة مطلوب فقط منذ ≤ 10 مل المتوسطة السائل هو الأمثل لزراعة M. truncatula في الحقائب 7. والتجارب الحقيبة أيضا عادة ما تقتصر على ~ 2 أسابيع 7، وذلك بسبب انهيار الفتيل ورقة داخل الحقيبة. طريقتين الأخرى التي تستخدم عادة هي مماثلة لطريقتنا في أن النباتات التي تزرع على أجار والجذور واضحة، ولكن هذه الأساليب أيضا أن يتجنب عيوب الإجراء لدينا. في هذه الأساليب، وترد النباتات تماما في غضون 24.5 سم x 24.5 سم لوحات أجار مختومة حول الجزء العلوي مع الشريط الجراحية التي يسهل اختراقها أو تزرع في أنابيب أجار مائل مقفول مع المقابس القطن أو القبعات البلاستيكية 7. كل من هذه الأساليب تسمح الفحص سهلة من الجذور ويمكن أن تظل عقيمة. ومع ذلك، وعادة ما يزرع أنابيب مائل أجار مع 20 مل فقط أجار المتوسطة 7 وتتطلب الري والمغذيات وddition للنمو على المدى الطويل من النباتات. النباتات التي تزرع داخل 24.5 سم x 24.5 سم أجار عوالم مصغرة لوحة لها الرطوبة والمواد المغذية للنمو على المدى الطويل كافية، ولكن تبادل لاطلاق النار ينمو بسرعة ويصبح مقيدا داخل مصغرا لوحة المغلقة وغاز الاثيلين يمكن أن تتراكم تثبيط nodulation 7. في الإجراء وصفها هنا، تتعرض تبادل لاطلاق النار وينمو بحرية خارج مصغرا والذي يحتوي على 70 ~ مل من وسائل الإعلام، مما يتيح النمو على المدى الطويل.
الإجراء الموضح هنا قد يكون مفيدا ليس فقط لدراسة nodulation من النباتات البقولية، ولكن أيضا لدراسة الظواهر جذور النباتات الأخرى متوسطة الحجم. الفرق بين هذه عوالم مصغرة ومصنع البولي التقليدية الأنسجة الثقافة جرة هو أن جذور في عوالم مصغرة لوحة الموصوفة هنا تنمو على السطح الرأسي للأجار بدلا من أسفل إلى طبقة الأفقي للأجار في الجزء السفلي من الجرة. وهذا يسمح الجذر إلى أن يرفع من على سطح أجار مع الحد الأدنى من دamage إلى جذور الشعر، والحد الأدنى التصاق أجار إلى سطح الجذر، مما يسهل فحص جذور الشعر بواسطة المجهر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تنفيذ الخطوات 1 و 2 و 4، و 6 في العقيمة غطاء تدفق الصفحي ينصح.
1. إعداد م. truncatula A17 الشتلات
ملاحظة: م. ويتم إنتاج truncatula A17 البذور المستخدمة في هذه الدراسات في ظل ظروف الدفيئة في تبريد ~ 22 درجة مئوية، أو في غرفة نمو النبات الحفاظ على 22-26 درجة مئوية مع ~ 150-400 مليمول / م -2 ث -1 الضوء.
- صب لوحات إنبات البذور: استخدام 100 ملم لوحات مربعة (15 ملم العميق) وتصب تعقيمها 1،1-1،2٪ ث / ت تنقيته أجار 10 إلى عمق 3-5 ملم. وسوف تستخدم كل لوحة لتنبت ~ 0.25-0.5 غرام من البذور (أي ما يعادل 63-125 البذور / لوحة).
ملاحظة: إنه أمر بالغ الأهمية لاستخدام محطة خلية اختبار الثقافة، أجار تنقيته لجميع لوحات وصفها في هذا البروتوكول. يتم سرد البائعين والمعلومات رقم الكتالوج للأجار في جدول الكواشف والمعدات الخاصة. - يخدش / تعقيم M. truncatula A17 البذورق: وزن البذور كافية لعدد المطلوب من الشتلات. (M. truncatula A17 البذور هي ~ 4 ملغ لكل منهما) البذور العقيمة مكان في 125 مل قوارير معقمة مع أغطية احباط (0.25-0.5 ز البذور / قارورة، وهذا هو ~ 63-125 البذور) وماصة 20 مل من المركز (96٪) H 2 SO 4 على طول الجانبين من القارورة.
ملاحظة: سوف تخديش حمض تعقيم البذور. أيضا، من قبل pipetting الحامض على طول جانبي القارورة، فإنه سيتم إعادة تعقيم داخل القارورة التي تتلامس مع البذور غير المعقمة. - تفريق كتل من البذور مع ماصة زجاجية معقمة. عباب كل قارورة في كثير من الأحيان لمدة 10-12 دقيقة. و، حفر البني الصغيرة تصبح مرئية على البذور. وهذه هي ثقوب صغيرة في غلاف البذرة 11.
ملاحظة: ارتداء حماية العين وقفازات عند العمل مع H 2 SO 4 المركزة. - إزالة H 2 SO 4 وشطف البذور: عندما لا يقل عن 10٪ من البذور وحفر البني الصغيرة، أو 12 دقيقة مرت، أيهمايأتي أولا، وإزالة كل حمض من القوارير مع ماصة زجاجية معقمة. (حمض مكان النفايات في كوب 1-2 L يحتوي على 300 مل على الأقل ماء الصنبور. هذا سوف يخفف من حمض ومنع ارتفاع درجة الحرارة.) بإمالة قارورة لجمع حمض المتبقية في منحنى القارورة واستخدام ماصة زجاجية صغيرة ل إزالة كافة حمض المتبقية. إذا يبقى حمض المتبقية، وسوف تتفاعل مع ماء الشطف، تسخين البذور وقتلهم.
- شطف البذور بسرعة صب 100 مل من الماء عالى النقاء العقيمة في كل قارورة. فإن حجم الفائض من الماء يخفف من حمض ومنع الانهاك والبذور الضرر أثناء رد فعل حمض مع الماء. تخلصي من الماء واللهب تعقيم الشفة القارورة.
- شطف البذور 8-10X مع 50 مل من الماء عالى النقاء العقيمة. دوامة القارورة خلال كل الشطف. ينبغي النظر في قارورة معقمة في هذه المرحلة، وينبغي ملتهب الشفة القارورة قبل كل الشطف.
- اسمحوا بذور تشرب بين عشية وضحاها: بعدشطف الماضي، صب 50 مل من الماء عالى النقاء العقيمة في كل قارورة، استبدال الغطاء احباط العقيمة على كل قارورة والمكان في 4 درجات مئوية في الظلام بين عشية وضحاها.
- بذور مكان على لوحة الإنبات: بعد السماح تشرب البذور بين عشية وضحاها، صب الماء خارج، وشطف 2X مع ~ 25 مل عالى النقاء الماء، ثم إضافة 20 مل من الماء عالى النقاء العقيمة، ودوامة ل resuspend البذور وتصب لهم على 1،1-1،2٪ لوحة آغار من الإنبات الخطوة 1.1. إذا تبقى البذور في قارورة، إضافة المزيد من الماء ويسكب مرة أخرى. توزيع البذور من كل قارورة لوحة واحدة (63-125 البذور / لوحة).
- دوامة لوحة لتوزيع البذور. وينبغي توزيع بذور بالتساوي في 4-5 سم الفرقة في نهاية واحدة من لوحة. وستكون هذه "القمة" من لوحة. يجب أن تبقى في "القاع" 5-6 سم خالية من البذور (الشكل 2A).
- رسم قبالة المياه مع ماصة معقمة. إمالة لوحة في زاوية 45 درجة إلى السماح للاستنزاف المياه المتبقية في الجزء السفلي من لوحة. استبدال غطاء على سمسمتيد لوحة وحمايتها من الضوء. وينبغي أن يسمح لوحات لاستنزاف 10-20 دقيقة. (الشكل 2B).
- إعداد الإنبات: إزالة جميع المياه التي جمعت في الجزء السفلي من لوحة مائلة مع ماصة معقمة.
- استبدال الغطاء وختم لوحة مع parafilm. ارتداء قفازات معقمة والحفاظ على (الشكل 2C).
- كومة لوحات الإنبات ومن ثم تحويل كل منهم حتى في زاوية 90 درجة. سيتم بذور الكذب على السطح الرأسي للأجار. يجب بذور تشربوا بالكامل تلتزم بسهولة إلى أجار. سوف تنمو الجذور أسفل (الشكل 2D).
- التفاف كومة من ألواح الإنبات في احباط لمنع الضوء والحفاظ على 25 درجة مئوية لمدة 3 أيام.
ملاحظة: إذا عائدات الإنبات لمدة تقل عن 3 أيام، قد تكون جذور قصيرة جدا للوصول إلى أجار في عوالم مصغرة. إذا العائدات الإنبات قبل نقلها إلى لوحات مصغرة أكثر من 4 أيام، بقاء الشتلات سوفتكون فقيرة. إذا M. الطرز البيئية truncatula أو المسوخ مع تباطؤ معدلات الإنبات وينبغي مقارنة، ينبغي أن يسمح للنوع إيكولوجي الإنبات ببطء لتنبت أطول من 3 أيام.
2. إعداد عوالم مصغرة لوحة الفردية
- إعداد جنسن المتوسطة 12 (انظر الجدول رقم 1 لتكوين)، مما يسمح ~ 70 مل المتوسطة لكل مصغرا. إعداد في أباريق أو القوارير التي هي مريحة للصب السريع (لا يزيد عن 1-2 لكل إبريق L) وترك شريط مغناطيسي في الإبريق أثناء التعقيم.
- بعد أن يبرد المتوسطة إلى ~ 55-65 درجة مئوية، وقد أضيفت ملاحق، ووقد تم التحقق من الرقم الهيدروجيني (انظر الجدول 1)، تصب في الجولة 100 مم، 15 مم لوحات عميقة. يجب سكب لوحات ~ 0،9-1 سم العميق (~ 70 مل / لوحة).
- يمكن مكونات المتوسطة جنسن تشكيل راسب غائم، ولذلك فمن المهم أن يرجع الإبريق إلى لوحة تحريك مغناطيسي بشكل دوري لمنع عناصر من الاستقرار بها. قد تكون رواسب تجاهإيبل في لوحة بعد أن يصلب، ولا يؤثر على أدائها طالما أنها توزع بالتساوي بين لوحات.
- كومة لوحات أثناء صب لمنع تشكيل التكثيف على أغطية لوحة.
- بعد أن عزز لوحات جنسن، تحقيقها على حد سواء لوحات والأغطية مع ملعقة وزنها الذي تم عازمة إلى الشكل U-5 (الشكل 3A). تسخين منعطف من ملعقة مع الموقد حتى أحمر حار، الشق 5-6 لوحات ثم تسخين مرة أخرى. عندما يتم وضع غطاء على لوحة حقق حقق، وهذا سوف إنشاء بوابة البيضاوي من خلالها تبادل لاطلاق النار من الشتلات ستنمو (الشكل 3B). إذا حقق لوحات هي ليتم تخزينها، والتفاف على انفراد مع فيلم البارافين ..
3. إعداد Sinorhizobium meliloti الثقافات
قبل يومين من التطعيمات النبات، تبدأ الثقافات من جميع S. meliloti سلالات ليتم تلقيح على الشتلات. Cultuيجب أن تزرع الدقة في LBMC (لوريا، BERTANI [ميلر]) المتوسطة 13 تستكمل مع 2.5 ملي MgSO 4، 2.5 مم CaCl 2، والمضادات الحيوية المناسبة (تاي المتوسطة أيضا يعمل بشكل جيد). سوف اقل من 2-3 مل من كل ثقافة تكون كافية.
- ينمو بمعدل 30 درجة مئوية مع الهز لمدة 2 أيام حتى الخلايا الكثيفة.
- بالنسبة لمعظم التطعيمات النبات، مرحلة نمو S. meliloti ليست حرجة. عادة، تسجيل في وقت متأخر أو تستخدم الخلايا مرحلة ثابتة في وقت مبكر.
4. بطرح M. truncatula الشتلات على الفردية عوالم مصغرة
- بعد 3 أيام، وفتح لوحة إنبات (المعد في الخطوة 1) والفيضانات على الفور مع الماء عالى النقاء العقيمة. تراجع ملقط في الإيثانول واللهب لفترة وجيزة لتعقيم. استخدام ملقط معقم لدفع بلطف نصائح أصل كل الشتلات تحت الماء لمنع جفاف. سوف جذور تتراوح 2-6 سم طويلة. وسوف تكون الأغلبية 3-4 سم. حدد الشتلات مع جذور مستقيمة واضحة لاالعيوب.
- تحقق من الأغطية عوالم مصغرة المتوسطة وجنسن لتراكم التكثيف. نفض الغبار غطاء لإزالة التكثيف أو استبدالها مع غطاء جديد حقق. إذا كان هناك وجود فائض من التكثيف على الغطاء، جذور الشتلات قد التمسك الغطاء ثم يموت بعد يجف التكثيف.
- باستخدام الملقط، واختيار الشتلات بلطف من لوحة الإنبات من النبتات ووضع الجذر على مصغرا المتوسطة وجنسن. تأكد من غيض الجذر هو على اتصال مع أجار.
- بلطف إزالة غلاف البذرة إذا كانت لا تزال موجودة. يجب أن تكون فضفاضة المعاطف البذور بعد النقع في الماء لمدة 5-10 دقيقة. ندف بلطف معطف البذور مع ملقط حتى يعطي وسيلة، وتجاهل. يجب على النبتات وحوالي 0.5 سم من تبادل لاطلاق النار تبرز من تحت الشق في لوحة (الشكل 4A). استبدال بعناية غطاء لوحة مع U-الشق من غطاء على الشتلات، وخلق بوابة لالشتلات (الشكل 4B).مجموعة لوحات جانبا في أكوام الأفقي حتى يتم وضع كل شتلة على عوالم مصغرة.
- استخدام جميع شتلات من كل لوحة الإنبات التي تبدو قابلة للحياة ولها جذور التوالي. (إذا كان ذلك ممكنا، وترك لوحة واحدة من الشتلات فتحها للاستخدام كبديل لشتلات ذابلة قبل التلقيح.)
- بعد أن وضع خارج عن الشتلات والسماح لهم الجلوس على عوالم مصغرة لجنسن الأفقية في حين أن S. ويجري حاليا إعداد تعليق اللقاح meliloti.
5. إعداد S. meliloti اللقاح معلقات
- تحقق S. meliloti الثقافات دوريا بعد التلقيح للتأكد من أنها آخذة في النمو. بعد النمو 2 أيام، يجب أن يكون OD 600 بين 2 و 4.
- ماصة 0.5 مل من كل ثقافة إلى 1.5 مل أنبوب العقيمة وأجهزة الطرد المركزي لبيليه. إزالة طاف.
- غسل الخلايا مرتين في أي 0.85٪ العقيمة الماء عالى النقاء كلوريد الصوديوم أو معقمة. الخلايا resuspend في 0.5 مل 0.85٪ الظريفيغضب كلوريد الصوديوم أو الماء عالى النقاء.
- قياس OD 600 من التخفيف 1/10 من معلق S. meliloti الثقافات من الخطوة 5.3. بناء على هذه القراءة، وجعل وقف كل ثقافة في الماء عالى النقاء العقيمة في OD 600 = 0.05. إذا كانت كثافة الخلية مرتفعة جدا، ويمكن تثبيط nodulation. تقديم ما يكفي من تعليق تمييع 100 ميكرولتر بحيث يمكن تلقيح على كل الشتلات. يجب أن تكون الغيوم من OD 600 = 0.05 تعليق بالكاد محسوسة من قبل العين.
6. التلقيح وختم عوالم مصغرة
- مباشرة قبل بداية التطعيمات، وتحقق لشتلات ذابلة التي لم نجا نقل إلى عوالم مصغرة المتوسطة وجنسن. تحل محل تلك الشتلات مع شتلات جديدة من لوحات الإنبات.
- فتح كل مصغرا وتطعيم 100 ميكرولتر من S. المناسبة meliloti التعليق على جذور الشتلات. استبدال الغطاء وتوضع جانبا في STAC الأفقيكانساس من 6-10 عوالم مصغرة. لكل S. سلالة meliloti يمكن مقارنتها، تطعيم ما لا يقل عن 15 النباتات. لسلالات أن يكون الفروق الدقيقة في الإنتاجية تكافلية، تطعيم النباتات 30-35. ترك ما لا يقل عن 10 النباتات uninoculated كعنصر تحكم السلبية. تطعيم النباتات 30-35 مع S. meliloti 1021 أو غيرها من سلالة المناسبة النوع البري لتكون بمثابة مراقبة إيجابية.
- بعد S. تمت زيارتها التعليق meliloti الوقت لكثف على سطح الجذر وغارقة في السائل التعليق في أجار (لا يقل عن 20 دقيقة)، والتفاف كل لوحة على حدة مع فيلم البارافين. ينبغي أن تكون ملفوفة لوحات تصل إلى حافة جدا من الدرجة الأولى، ولكن الفيلم البارافين لا ينبغي منع نمو الشتلات (الشكل 4C).
- في وقت التغليف، وجعل الاختيار النهائي للجذور انضمت إلى داخل لوحة غطاء. لإزالة جذور الالتزام من الغطاء، ووضع لوحة مسطحة على مقاعد البدلاء والاستفادة أو نفض الغبار غطاء لضرب جذور التراجع على أجار سوrface.
- يصطف البوابات الشتلات من كل كومة من 6-10 لوحات. وضع كومة في زاوية 90 درجة مع الشتلات مشيرا التصاعدي (الشكل 4D). فإن الالتصاق من الفيلم البارافين عقد لوحات في مكان طويلة بما يكفي للالتفاف مكدس كامل في احباط، وترك 1-2 سم ملفوف الشريط حيث تظهر الشتلات (الشكل 4E). سوف احباط حماية الجذور من الضوء.
- وضع رقائق ملفوفة مداخن في غرفة مضاءة النمو أو النمو في الغرفة 21-25 درجة مئوية، والرطوبة النسبية 60-70٪ و100-175 ميكرومول / م -2 ث -1 الضوء على دورة الظلام 16 ساعة ضوء / 8 ساعة ( الشكل 1A). في ظل هذه الظروف النمو، الحضانة لفترات طويلة في ضوء المستويات أعلى من 200 ميكرومول / م -2 ث -1 يمكن أن يكون لها تأثير ضار على نمو النبات.
7. فحص أنظمة الجذر والكميات من الظواهر التكافلية
يمكن الحفاظ على النباتات فيعوالم مصغرة لمدة تصل إلى 9 أسابيع.
- يمكن قياسها كميا عدد العقيدات في سلسلة من نقاط الوقت عن طريق إزالة التغليف احباط من كل كومة والعد العقيدات. تطوير عقيدات على النباتات تلقيح مع S. meliloti 1021 النوع البري واضحة من قبل 10-14 يوما بعد التلقيح.
- كما يمكن قياس الإنتاجية تكافلية في كل نقطة زمنية عن طريق قياس طول تبادل لاطلاق النار الناشئة.
- عادة ما يتم إجراء الكميات النهائية للإنتاجية التكافلية في 7 أسابيع بعد التلقيح عن طريق فصل تبادل لاطلاق النار وقياس الوزن الطازج من تبادل لاطلاق النار. هذه الخطوة لا يمكن أن يؤديها في وقت متأخر من 9 أسابيع إذا كان المطلوب النمو لفترة أطول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
إعداد والتلقيح هذه عوالم مصغرة لوحة بسيطة نسبيا بالمقارنة مع معظم الطرق الأخرى الموضحة في المقدمة. استخدام هذه عوالم مصغرة يسمح أيضا نمو النبات لفترات طويلة (تصل إلى 9 أسابيع) دون سقي أو مكملات المغذيات، وصيانة العقم الجذرية، سواء الفحص سهلة من الجذور وحماية الجذور من الضوء، والنمو غير المقيد من النباتات يطلق النار، وسهولة الوصول إلى تبادل لاطلاق النار ل قياس الطول، وإزالة النباتات من عوالم مصغرة مع الحد الأدنى من الضرر لجذور الشعر. يبين الشكل 1A شتلات الشباب المتنامية في عوالم مصغرة في حاضنة. الصور في أرقام 1B-1E المعرض العديد من وجهات نظر مختلفة من عوالم مصغرة تحتوي على M. truncatula A17 النباتات البرية تلقيح مع نوع S. meliloti 1021. إذا معبأة بإحكام، و> 220 عوالم مصغرة تناسب على 73.8 سم x 67.5 سم حاضنة الرف. أرقام 1B 1C وتظهر عوالم مصغرة فيمكدس مع النباتات الخارجة من البوابات في عوالم مصغرة احباط الملفوفة. ويبين الشكل 1D صورة مصغرة واحدة مع إزالة احباط، والجذر والعقيدات تظهر من خلال الجزء الأمامي من اللوحة. يبين الشكل 1E نفس مصغرا الاستلقاء مع النبات الناشئة من المدخل في اللوحة. يمكن قياس طول الساق من وجهة ظهور من مصغرا (الشكل 1C) من دون إزعاج النبات. يبين الشكل 5A البيانات طول الساق لM. truncatula A17 النباتات البرية تلقيح مع نوع S. meliloti 1021 مقارنة مع النباتات uninoculated في 7 أسابيع و 9 أسابيع بعد التلقيح. النمو في عوالم مصغرة مثالية لجمع سلسلة من timepoints التنمية العقيدات وطول الساق. في timepoint النهائي، يتم قص يطلق النار قبالة لقياس الوزن الطازج تبادل لاطلاق النار (الشكل 5B). يبين الشكل 6 أمثلة على 3 الظواهر التكافلية في 7 أسابيع نقاط البيعتي التلقيح. إنتاجية التكافلية النسبية M. truncatula A17 النباتات تلقيح مع مختلف S. وكميا سلالات meliloti بواسطة طول الساق (الشكل 6A) واطلاق النار على الوزن الطازج (الشكل 6B). يظهر عدد من العقد الجذرية على النباتات تلقيح مع هذه السلالات في الشكل 6C. A اللون الوردي ويرجع ذلك إلى إنتاج ليغيموغلوبين يشير إلى أن العقيدات وظيفية وقادرة على تثبيت النيتروجين، في حين عقيدات بيضاء صغيرة عادة ما تكون غير وظيفي و / أو إحباط والعقيدات البني هي هرمة ونخرية 14-18. المقارنة في الشكل 6 يبين أن الإنتاجية التكافلية من M. truncatula A17 النباتات تلقيح مع S. meliloti 1021 تحمل البلازميد pstb-LAFR5-exoY التي overexpresses في ExoY undecaprenyl فوسفات الجالاكتوز ناقلة الفسفات، هو أكبر من النوع البري S. meliloti 1021 وسلالات تحمل ج السلبية ontrol البلازميد pstb-LAFR5. هذه ExoY الإفراط في التعبير عن سلالات إنتاج أكثر من exopolysaccharide التكافلية succinoglycan من سلالات السيطرة. القدرة على قياس الاختلافات في الظواهر التكافلية التي تستغرق عدة أسابيع لتظهر هي الميزة الرئيسية لهذا الأسلوب. لجميع تدابير الإنتاجية تكافلية على M. truncatula A17، وSinorhizobium medicae سلالات WSM419 وABS7 أداء أفضل من S. meliloti 1021 (أرقام 6A-6C). (البيانات من الشكل (6) ظهر أصلا في جونز (2012) 19.) وفي الوقت الذي مصغرا يتم تفكيكها واطلاق النار على أوزان جديدة يتم قياسها، ويمكن أيضا جذور يمكن تصوير بواسطة المجهر. الشكل 7 يبين وجهات النظر ممثل م. truncatula A17 الجذور بعد إزالة من عوالم مصغرة. شهدت جذور الشعر الحد الأدنى من الضرر منذ جذور وضع على سطح أجار وليست من طبقة أفقية من الجذور حتى أجار.
_content "> النباتات يمكن المحافظة لمدة تصل إلى 9 أسابيع في هذه عوالم مصغرة لأن هناك ~ 70 مل من أجار المتوسطة النمو في اللوحة. بعد فترات النمو لفترة أطول، قد تبدأ بعض النباتات لتجف. سبعة أسابيع من النمو هو الأمثل للتكافل مع جرثومة S. meliloti 1021. للتكافل أكثر كفاءة من M. truncatula A17 مع S. medicae WSM419 أو S. medicae ABS7، وهي فترة نمو أقصر من 4-5 أسابيع هو الأمثل.| تركيز النهائي لكل L | كمية من محلول المخزون | تركيز الأسهم |
| 1 ز CaHPO 4 | NA | NA |
| 0.2 ز MgSO 4 · 7H 2 0 | 1 مل | 0.2 جم / مل |
| 0.2 ز K 2 HP0 4 | 1 مل | 0.2 جم / مل |
| 0.2 غرام كلوريد الصوديوم | 1 مل | 0.2ز / مل |
| 0.1 ز FeCl 3 · 6H20 | 1 مل | 0.1 جم / مل |
| 11.5 ز تنقية أجار (انظر الجدول من الكواشف محددة لمواصفات أجار) | ||
| milliQ H 2 0-1 L |
الجدول 1. بروتوكول المتوسطة أجار جنسن للعوالم مصغرة لوحة. تعليمات الإعداد لجنسن المتوسطة.
الخطوات التالية:
- إضافة المكونات أعلاه، وتخلط مع شريط مغناطيسي.
- الأوتوكلاف 45 دقيقة، دورة السائل، بقضيب في الإبريق.
ملاحظة: سوف CaHPO 4 و FeCl 3 تترسب أثناء التعقيم. يحرك المزيج حتى نعيدهم إلى تعليق، وسوف وسائل الاعلام لا تزال غائمة - تبرد مع التحريك حتى أنها ليست مؤلمة لالتقاط جرة بيديك العاريتين.
- إضافة 1 مل المعادن النادرة في L (انظر أدناه للحصول على صفة) ملحقالتحريك إيل
ملاحظة: تأكد من resuspend ويعجل في المعادن النادرة قبل الاستغناء. - إضافة 0.25 مل 4 N هيدروكسيد الصوديوم لكل لتر، مع التحريك.
- تحقق عن طريق إزالة الحموضة ~ 100 ميكرولتر مع وسائل الإعلام ماصة معقمة وتطبيق على ورقة الرقم الهيدروجيني
ملاحظة: يعمل درجة الحموضة 5-10 رقة مجموعة جيدا. يجب أن يكون الرقم الهيدروجيني ~ 7 السماح لبضع ثوان للتنمية بالألوان الكاملة. إذا درجة الحموضة غير صحيحة، قد يكون هناك خطأ في التحضير. - صب لوحات سميكة قدر الإمكان، التعديل قارورة من خلال العودة إلى لوحة تحريك مغناطيسي
ملاحظة: إذا تم مملوء لوحة (أي السائل تمتص على الجزء السفلي من غطاء)،
ملاحظة: نتوقع الحصول على 15 ~ لوحات للتر الواحد.
المعادن الخفيفة الأسهم 1 L (تعقيم بواسطة التعقيم)
| 1 ز H 3 BO 3 |
| 1 ز ZnSO 4 · 7H 2 0 |
| 0.5 غرام كبريتات النحاس 4 · 5H 2 0 |
| 0.5 ز 2 MnCl · 4H 2 0 |
| 1 ز NaMoO 4 · 2H 2 0 |
| ميلى-Q H 2 0-1 L |
الشكل 1. آراء عوالم مصغرة تحتوي على النباتات تلقيح مع S. meliloti 1021 A) النباتات في لوحات مصغرة المتزايد في حاضنة. ب) م. truncatula A17 النباتات تلقيح مع S. meliloti 1021 نوع البرية المتنامية من خلال الشق في الجزء العلوي من عوالم مصغرة أجار جنسن. C) جهة نظر عن قرب إضافية من لوحات في B تظهر النباتات التي تنمو من خلال الشقوق في عوالم مصغرة. D) واحدة من لوحات مصغرة من B و C مع الجذر العقيدات تصويرها من خلال الغطاء. E) لوحة جيئة وذهابام D الاستلقاء مع تبادل لاطلاق النار الخارجة من الشق.
الشكل 2. بذور الإنبات لوحة انشاء. أ) يتم توزيع البذور عبر نصف واحد من 100 ملم لوحة مربع. B) يتم تصريف سطح آجار عن طريق السماح لجمع المياه في الجزء السفلي من لوحة مائلة. C) يتم تغليف لوحات في فيلم البارافين، مكدسة وD) مكدس تحول في زاوية 90 س وملفوفة في احباط.
الرقم 3. بناء عوالم مصغرة بتسجيلها لوحات جنسن مع ملعقة عازمة. A) A معدنية وزنها ملعقة الذي تم عازمة على تشكيل بيضاوية التهب ساخنة وتستخدم لتحقيقها حفرة على شكل حرف U في جانب منلوحة وفي جانب من الغطاء. يجب أن يكون الجزء السفلي من U-الشق في لوحة في أعلى سطح أجار. يجب أن يكون الجزء السفلي من U-الشق في الغطاء على طول الطريق في الجزء العلوي من الغطاء. ب) استبدال غطاء على طبق يخلق بوابة بيضاوية الشكل الذي من خلاله يمكن أن تبرز الشتلات.
الشكل 4. الإدراج من الشتلات في عوالم مصغرة. A) وجهتا نظر إظهار الكيفية التي ينبغي إرساء جذور الشتلات على سطح أجار مع النبتات و~ 0.5 سم من تبادل لاطلاق النار جاحظ من U-الشق في اللوحة. B) وC) وضع غطاء على لوحة مع الشقوق اصطف سيتم إنشاء بوابة البيضاوي للالشتلات. سوف التفاف لوحة بإحكام مع فيلم البارافين حفاظ على الغطاء من التحرك ومنع جفاف. D) لوحات ويمكن بعد ذلك أن تكون مكدسة معا في مجموعات من 6-10، وE) ملفوفة بورق. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
الرقم 5. الظواهر التكافلية ممثل بعد نمو 7 أسابيع وأسابيع من النمو 9 م. truncatula A17 في عوالم مصغرة الفردية. A) طول تبادل لاطلاق النار من النباتات الملقحة مع S. meliloti 1021، وطول الساق من النباتات uninoculated قيست في 7 أسابيع دون إزالة النباتات من عوالم مصغرة. في 9 أسابيع بعد التلقيح، وقد تم قياس طول الساق (A)، ومن ثم تم قص يطلق النار على وزنه (B).
. JPG "/>
الرقم 6. الظواهر التكافلية ممثل بعد 7 أسابيع من النمو M. truncatula A17 في عوالم مصغرة الفردية. سلالات S. exoY-overexpressing meliloti 1021 عززت التعايش على النبات المضيف Medicago truncatula A17. إنتاجية التكافلية من S. meliloti 1021 على M. تم تحسين truncatula A17 في السلالات التي overexpress والجالاكتوز ناقلة الفسفات-undecaprenyl الفوسفات المشفرة بواسطة exoY. يتم قياس الإنتاجية تكافلية كما (A) طول الساق في الطول و(B) تبادل لاطلاق النار في الوزن الطازج غرام. وترد والبني، والعقيدات نخرية (أعلى شريط الرسم البياني) في (C)، وأعداد الوردي، والعقيدات وظيفية (شريط الرسم البياني السفلي)، أبيض، عقيدات غير فعالة (شريط الرسم البياني وسط). الإنتاجية والعقيدات عدد تكافلية مع النباتات تلقيح S. وتبين ايضا medicae سلالات WSM419 وABS7. العلامات النجمية على القضبان الرسم البياني دلالة إحصائيةفرق كبير لاي من نوع السلالة البرية إشارة 1021 في المفردة اختبار t. كان تلقيح النباتات مع متحولة فارغة exoY :: Tn5 التي لا تنتج أي succinoglycan أطوال تبادل لاطلاق النار مماثلة والوزن الطازج للنباتات uninoculated، وتنتج سوى الأبيض وعقيدات غير فعالة. الرسوم البيانية في (أ) و (ب) ونشرت في الأصل في 19. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
الرقم 7. جذور تصوير على مجهر تشريح بعد إزالة من عوالم مصغرة. يمكن إزالتها بسهولة الجذور من عوالم مصغرة للتصوير مع الحد الأدنى من الضرر لجذور الشعر لأنها تقع على سطح أجار. تظهر الصور جذور M. truncatula A17 في 10 يوما بعد التلقيح (A، B) (C). تم تلقيح جذور تظهر مع S. meliloti 1021 نوع البرية (A)، وهو S. سلالة meliloti يحمل الانصهار eglC :: المكتب المركزي للاحصاءات (B)، وS. سلالة meliloti يحمل SMc00911 :: المكتب المركزي للاحصاءات الانصهار 20 (C). المكتب المركزي للاحصاءات تلطيخ S. خلايا meliloti تحمل الانصهار SMc00911 :: المكتب المركزي للاحصاءات مرئيا على جذور الشعر وسطح الجذر في E. بار يتوافق مع 100 ميكرومتر. اضغط هنا لعرض أكبر شخصية .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هناك العديد من الخطوات من البروتوكول التي تعتبر بالغة الأهمية لتحقيق النجاح: 1) اختبار ضرورة استخدام النقى النبات خلية ثقافة لا يمكن المبالغة أجار. هذه ليست حرجة لشتلات البرسيم، ولكن من الأهمية بمكان لنمو M. truncatula A17. 2) ومن المهم أن تنبت شتلة على لوحات أجار الرأسي كما هو موضح في الخطوة 1. لا ينصح التقنية المستخدمة على نطاق واسع من الإنبات الشتلات على سطح أفقي مقلوب في 15 ملم صحن عميق 7 لهذا البروتوكول لأن جذور الشتلات ستكون قصيرة جدا و / أو غير مباشرة. الشتلات مع الجذور على التوالي نموا من 2-4 سم في الطول هي مثالية لنقل لوحات من الإنبات إلى عوالم مصغرة. ثلاثة أيام من النمو في لوحات إنبات العمودي هو عادة مثالية للجذور لتحقيق هذا الطول. 3) ومن الأهمية بمكان أيضا لتجنب التلوث من الشتلات مع الريزوبيا قبل التلقيح. قبل نقل الشتلات من لوحات لإنبات microcoالرسائل القصيرة، ومجال عمل يجب تنظيفها مع الايثانول وينبغي لجميع الأدوات المستخدمة في نقل كثير من الأحيان يكون لهب تعقيمها. آخر مصدر محتمل للتلوث يمكن تجنبها عن طريق إعداد S. تعليق سلالة meliloti للتلقيح عوالم مصغرة في منطقة عمل منفصلة عن تلك المستخدمة لإعداد الشتلات. ويمكن أيضا تلوث الفطرية للعوالم مصغرة يمكن تجنبها عن طريق إزالة جميع بقايا من معطف البذور من الداخل للمصغرا، لأن الجراثيم الفطرية قد تكون جزءا لا يتجزأ في معطف. 4) يمكن تعظيم بقاء الشتلات عن طريق الحفاظ على جذور الشتلات ورطبة في اتصال مع أجار في جميع الأوقات، والعلاج لطيف جدا أثناء النقل. وينبغي رفعه أي الشتلات مع الجذر المحاصرين في أجار في لوحة إنبات بعناية لتجنب الأضرار التي لحقت الجذر. ويمكن تحقيق عائد مرتفع من النباتات قادرة على البقاء من خلال جعل الاختيار النهائي لشتلات ذابلة في أكوام من عوالم مصغرة قبل بداية التطعيمات، والاستعاضة عنها الطرافةح شتلات جديدة. إذا الشتلات فى حالة جيدة ولم تنضم إلى داخل لوحة الغطاء، ينبغي أن تحتاج إلى استبداله في هذه المرحلة أقل من 5٪ من الشتلات. إعاقة النمو تبادل لاطلاق النار من مصغرا يمكن الوقاية عن طريق التأكد من عدم وجود بقايا من معطف البذور والنبتات وتقييد أن مصغرا هو بعناية بحيث لن يتم عرقلة تبادل لاطلاق النار ملفوفة parafilm.
نحن عادة استخدام هذا الأسلوب لدراسة التعايش في النباتات المضيفة M. truncatula A17 والبرسيم، ونحن حاليا تحسين تقنية لنمو أخرى M. أصناف truncatula، والأنواع الأخرى من Medicago والأنواع من إكليل الملك (sweetclovers). نحن لم تختبر حتى الآن هذا الأسلوب مع م. truncatula A20، وهو نوع إيكولوجي التي يتم استخدامها كشريك رسم الخرائط الوراثية مع A17. لقد وجدنا أن M. truncatula السيرة الذاتية. R108 لا تنمو بشكل جيد على النبات خلية ثقافة اختبار المنقى AGع أننا تستخدم حاليا ونحن نحاول تحديد إعداد أجار آخر أو بديلا أجار لاستخدامها بوصفها نموذجا مصغرا النمو الركيزة لهذا الصنف.
في المقارنة بين الطريقة الموصوفة هنا مع وسائل أخرى تستخدم عادة لتحليل M. truncatula A17 / س. meliloti التعايش، وجدنا أن هذا حتى الآن أفضل طريقة لمقارنة الأداء في وقت واحد التكافلية من عدد كبير من S. meliloti السلالات. وضعناها بشكل روتيني حتى 250 عوالم مصغرة في كل مرة (10 سلالات مختلفة من جرثومة S. meliloti تلقيح النباتات على 25 لكل منهما.) عندما راثى واحد فقط من S. meliloti أو S. medicae لاستخدامه، وانتقال التلوث لا يشكل خطرا، قيسونات aeroponic أو الحقائب النمو قد تكون وسيلة أكثر ملاءمة. هذه الطريقة لوحة مصغرة هو أيضا أفضل طريقة لجعل الملاحظات الدورية للتطور العقيدات التنمية والإنتاجية تكافلية على مدى فترة طويلة منالوقت. الظواهر التي تظهر في مراحل لاحقة من التعايش، مثل العقيدات الشيخوخة، يمكن دراستها بشكل أكثر سهولة مع هذا الأسلوب مع من البروتوكولات الأخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
والكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعهد الوطني للوزارة الزراعة الأميركية للأغذية والزراعة، الزراعة ومنحة مبادرة بحوث الأغذية 2010-65108 - 20582 لKMJ نشكر بريان K. اشبورن للمراجعة نقدية للمخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar purified, plant cell culture-tested | Sigma | A7921 |
References
- Galibert, F., et al. The composite genome of the legume symbiont Sinorhizobium meliloti. Science. 293, 668-672 (2001).
- Young, N. D., et al. The Medicago genome provides insight into the evolution of rhizobial symbioses. Nature. 480, 520-524 (2011).
- Glazebrook, J., Walker, G. C. Genetic techniques in Rhizobium meliloti. Methods Enzymol. 204, 398-418 (1991).
- Cheng, X., Wen, J., Tadege, M., Ratet, P., Mysore, K. S. Reverse genetics in medicago truncatula using Tnt1 insertion mutants. Methods Mol Biol. 678, 179-190 (2011).
- Leigh, J. A., Signer, E. R., Walker, G. C. Exopolysaccharide-deficient mutants of Rhizobium meliloti that form ineffective nodules. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 6231-6235 (1985).
- Wong, K. K. Y., Fortin, J. A. A Petri Dish Technique for the Aseptic Synthesis of Ectomycorrhizae. Canadian Journal of Botany-Revue Canadienne De Botanique. 67, 1713-1716 (1989).
- Barker, D. G., et al. The Medicago truncatula handbook. Mathesius, U., Journet, E. P., Sumner, L. W. , (2006).
- Leonard, L. T. A Simple Assembly for Use in the Testing of Cultures of Rhizobia. J Bacteriol. 45, 523-527 (1943).
- Trung, B. C., Yoshida, S. Improvement of Leonard jar assembly for screening of effective rhizobium. Soil Sci Plant Nutr. 29, 97-100 (1983).
- Penmetsa, R. V., Cook, D. R. Production and characterization of diverse developmental mutants of Medicago truncatula. Plant Physiol. 123, 1387-1398 (2000).
- Garcia, J., Barker, D. G., Journet, E. P. The Medicago truncatula handbook. Mathesius, U., Journet, E. P., Sumner, L. W. , (2006).
- Vincent, J. M. A Manual for the Practical Study of the Root-Nodule Bacteria. , Blackwell. (1970).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1982).
- Pladys, D., Vance, C. P. Proteolysis during Development and Senescence of Effective and Plant Gene-Controlled Ineffective Alfalfa Nodules. Plant Physiology. 103, 379-384 (1993).
- Vasse, J., de Billy, F., Truchet, G. Abortion of infection during the Rhizobium meliloti-alfalfa symbiotic interaction is accompanied by a hypersensitive reaction. The Plant J. 4, 555-566 (1993).
- Johnson, L. E. B., Vance, C. P. Histological and Biochemical Comparisons of Plant Induced Ineffective Nodules. Phytopathology. 71, 884 (1981).
- Vance, C. P., Johnson, L. E. B., Hardarson, G. Histological Comparisons of Plant and Rhizobium Induced Ineffective Nodules in Alfalfa. Physiological Plant Pathology. 17, 167 (1980).
- Van de Velde, W., et al. Aging in legume symbiosis. A molecular view on nodule senescence in Medicago truncatula. Plant Physiol. 141, 711-720 (2006).
- Jones, K. M. Increased production of the exopolysaccharide succinoglycan enhances Sinorhizobium meliloti 1021 symbiosis with the host plant Medicago truncatula. J Bacteriol. 194, 4322-4331 (2012).
- Queiroux, C., et al. A comparative genomics screen identifies a Sinorhizobium meliloti 1021 sodM-like gene strongly expressed within host plant nodules. BMC Microbiol. 12, 74 (2012).
