Summary
Crescita delle piante truncatula Medicago in simbiosi con i batteri azoto-fissatori meliloti Sinorhizobium nei singoli, microcosmi sterili fatto da lastre di laboratorio standard consente l'esame frequente dei sistemi di radici e noduli senza compromettere la sterilità. Le piante possono essere mantenuti in queste camere di crescita fino a 9 settimane.
Abstract
Batteri rhizobial formano simbiotici, noduli azoto-fissatori sulle radici delle piante leguminose host compatibili. Uno dei sistemi modello più ben sviluppati per lo studio di queste interazioni è la pianta Medicago truncatula cv. Jemalong A17 e la rhizobial batterio Sinorhizobium meliloti 1021. L'imaging ripetuta delle radici delle piante e punteggio della fenotipi simbiotici richiede metodi che non sono distruttive per piante o batteri. I fenotipi simbiotici di alcuni impianti e mutanti batterici si manifestano dopo periodi relativamente brevi di crescita, e non necessitano di osservazione a lungo termine delle interazioni ospite / simbionte. Tuttavia, sottili differenze di efficienza e di nodulo senescenza fenotipi simbiotici che non sono evidenti nelle prime fasi del processo di nodulazione richiedono periodi di crescita relativamente lunghi prima di poter essere segnato. Diversi metodi sono stati sviluppati per la crescita a lungo termine e l'osservazione di questa coppia host / simbionte.Tuttavia, molti di questi metodi richiedono annaffiature ripetuto, che aumenta la possibilità di contaminazione da parte di altri microbi. Altri metodi richiedono uno spazio relativamente grande per la crescita di un gran numero di piante. Il metodo qui descritto, la crescita simbiotica di M. truncatula / S. meliloti in sterili, microcosmi singolo impianto, ha diversi vantaggi. Piante in questi microcosmi sono l'umidità e le sostanze nutrienti sufficienti a garantire che l'irrigazione non è richiesto per un massimo di nove settimane, impedendo la contaminazione incrociata durante l'irrigazione. Questo permette di fenotipi da quantificare che potrebbero essere mancati in sistemi di crescita a breve termine, come i ritardi sottili nello sviluppo del nodulo e all'inizio nodulo senescenza. Inoltre, le radici e noduli nel microcosmo vengono visualizzati facilmente attraverso il coperchio piatto, quindi non è necessario fino radicazione delle piante per l'osservazione.
Introduction
L'interazione tra la pianta ospite legume Medicago truncatula A17 e il batterio rhizobial Sinorhizobium meliloti 1021 è uno dei sistemi modello più trattabili per lo studio di radice sviluppo nodulo e azotofissatrice simbiosi. I genomi di entrambi i partner simbiotici sono stati sequenziati 1,2 e vegetali e batteri sono suscettibili di manipolazione genetica 3,4. Analisi dei fenotipi di vegetali e mutanti batterici richiede la capacità di osservare le fasi di sviluppo del nodulo e per quantificare la produttività simbiotico nel tempo. Qui si descrive un metodo per l'osservazione dello sviluppo radicale nodulo di M. truncatula cv. Jemalong A17 inoculati con S. meliloti 1021 all'interno dei singoli microcosmi fatti dallo standard, rotonda diametro 100 millimetri, 15 millimetri piastre di laboratorio profondi (Figura 1A). La ripresa viene esposto e cresce attraverso un portale dentata sul lato della piastra (Figures 1B, 1C e 1E). Radici sono contenuti all'interno dei microcosmi e mantenuti sterili, mentre permette l'osservazione attraverso il coperchio della piastra (Figura 1D). Poiché il tiro è accessibile, la sua crescita non è vincolato e può essere misurata ad intervalli periodici senza compromettere la sterilità della radice. Il metodo di creazione di microcosmi dentellato-targa è stato originariamente sviluppato da Leigh, et al. 5 per la coltivazione di piante di erba medica, ma non è stato largamente adottato a dispetto dei suoi numerosi vantaggi rispetto ad altri metodi. Una variante di questo metodo è stato sviluppato anche per l'analisi dell'interazione tra le radici delle piante e micorrize 6. Abbiamo ora adattato e ottimizzato questo metodo per la crescita di M. piante truncatula. I vantaggi di questo protocollo oltre più comunemente utilizzati metodi sono descritti di seguito.
Ci sono diversi metodi che sono attualmente in uso largo per gli studi nodulazione di M. truncatula inoculolata con S. meliloti 7. Il metodo più comunemente usato per la preparazione su larga scala di radici nodulated è la crescita in cassoni aeroponic 7. In questo metodo, le piante sono sospese su una grande nave e radici sono aerati con una miscela di S. meliloti e soluzione nutritiva 7. Questo metodo è pratico se solo un genotipo di S. meliloti è da testare. Poiché richiede aerosol di elevate concentrazioni di batteri, c'è un'alta probabilità di contaminazione incrociata tra cassoni inoculati con differenti ceppi batterici. Un altro metodo che viene spesso utilizzato per preparare grandi quantità di piante inoculate è la crescita in tini o in vasi di perlite, vermiculite, sabbia o argilla calcinata che sono infuso con soluzione nutritiva e inoculato con S. meliloti 7. Questo metodo richiede l'utilizzo di vasche aperte o in vasi, e richiede irrigazione e la ricarica della soluzione nutritiva. Un altro svantaggio di pentole è che le piantedeve essere rimosso da questa matrice di particolato per l'esame delle radici e noduli. Un altro inconveniente di questo metodo è che una vasta area di spazio incubatore è necessaria quando molti differenti S. genotipi meliloti devono essere confrontati, perché una pentola a parte deve essere utilizzato per ogni genotipo batterico. Il "vaso Leonard" è una variante di questo metodo di 8,9. Un vaso Leonard è composto di due vasi sterilizzati impilati uno sopra l'altro e collegati da uno stoppino. Terreno di coltura viene inserito nel recipiente inferiore ed aspirata attraverso lo stoppino per capillarità in una matrice di crescita di perlite, vermiculite, sabbia o argilla calcinata nel recipiente superiore. La piantina (s) sono posti nella matrice crescita e inoculato con S. meliloti. Questo metodo non richiede irrigazione, ma l'esame delle radici e noduli richiede che la piantina essere rimosso dalla matrice crescita particolato.
Ci sono diversi metodi che consentono un facile esame della roots. Uno di questi è il transparent "sacchetto di crescita" plastica 7. Uno svantaggio di questo metodo è che l'irrigazione frequente è necessaria poiché solo ≤ 10 ml di terreno liquido è ottimale per la crescita di M. truncatula in sacchetti 7. Esperimenti Pouch sono di solito limitati a ~ 2 settimane 7, grazie alla ripartizione dello stoppino di carta all'interno del sacchetto. Altri due metodi comunemente utilizzati sono simili al nostro metodo dal fatto che le piante sono coltivate su agar e le radici sono visibili, ma questi metodi hanno anche svantaggi che la nostra procedura evita. In questi metodi, le piante sono completamente contenute all'interno di 24,5 centimetri x 24,5 cm piastre di agar sigillate intorno alla parte superiore con del nastro adesivo chirurgico poroso o coltivate in tubi di agar-slant tappate con tappi di cotone o tappi di plastica 7. Entrambi questi metodi consentono un facile esame delle radici e può essere conservato sterile. Tuttavia, i tubi slant agar sono di solito coltivate con solo 20 ml di agar 7 e richiedono di acqua e nutrienti addition per la crescita a lungo termine delle piante. Le piante coltivate entro i 24,5 centimetri x 24,5 centimetri di agar microcosmi piastre hanno umidità e sostanze nutritive per la crescita a lungo termine sufficiente, ma il germoglio che cresce rapidamente diventa vincolati all'interno del microcosmo piastra chiusa e il gas etilene possono accumularsi inibendo nodulazione 7. Nella procedura qui descritta, la ripresa è esposto e cresce liberamente al di fuori del microcosmo che contiene ~ 70 ml di mezzi di comunicazione, permettendo la crescita a lungo termine.
La procedura descritta può essere utile non solo per lo studio di nodulation di piante leguminose, ma anche per lo studio dei fenotipi radici di altre piante di medie dimensioni. La differenza tra questi microcosmi e un tradizionale impianto policarbonato tessuto-cultura vaso è che radici nei microcosmi piastra qui descritti crescono sulla superficie verticale della agar piuttosto che verso il basso in uno strato orizzontale di agar al fondo del vaso. Questo permette la radice da sollevare dalla superficie agar con minima dAmage ai peli radicali e spessore ridotto agar alla superficie della radice, che facilita l'esame dei peli radicali al microscopio.
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Protocol
Eseguito le fasi 1, 2, 4, e 6 in una cappa a flusso laminare sterile è raccomandato.
1. Preparazione di M. truncatula A17 Piantine
Nota: M. truncatula A17 semi utilizzati in questi studi sono prodotti in condizioni di serra raffreddate a ~ 22 ° C, o in una stanza crescita delle piante mantenuta a 22-26 ° C con ~ 150-400 mmol / m -2 s -1 luce.
- Versare in piastre germinazione dei semi: Usa 100 millimetri piatti quadrati (15 mm di profondità) e versare autoclavato 1,1-1,2% w / v di agar purificato 10 ad una profondità di 3-5 mm. Ogni piatto sarà utilizzato per germinare ~ 0,25-0,5 g di seme (equivalente a 63-125 semi / piastra).
Nota: E 'fondamentale utilizzare impianti coltura cellulare testato, agar purificato per tutti i piatti descritti in questo protocollo. Il venditore e le informazioni il numero di catalogo per l'agar è elencato nella tabella dei reagenti e attrezzature specifiche. - Scarify / sterilizzare l'M. truncatula A17 semes: Pesare semi sufficienti per il numero desiderato di piantine. (M. truncatula A17 semi sono ~ 4 mg ciascuna) Luogo semi sterili 125 ml flaconi con le coperture foglio sterili (0,25-0,5 g di semi / boccetta, questo è ~ 63-125 semi) e pipetta 20 ml di concentrato (96%) H 2 SO 4 lungo le pareti del pallone.
Nota: scarificazione Acid sterilizzare i semi. Inoltre, l'acido pipettando lungo le pareti del pallone, esso ri-sterilizzare l'interno del pallone che è venuto a contatto con i semi sterilizzati. - Break up ciuffi di sementi con una pipetta di vetro sterile. Agitare ogni boccetta di frequente per 10-12 min. Piccolo, pozzi marroni saranno visibili sui semi. Questi sono piccoli fori nel cappotto di seme 11.
Nota: quando si lavora con H 2 SO 4 concentrato Indossare occhiali di protezione e guanti. - Rimuovere H 2 SO 4 e sciacquare i semi: quando almeno il 10% dei semi hanno piccoli pozzi marrone, o 12 min sono passati, a seconda di qualeviene in primo luogo, rimuovere tutti l'acido dai palloni con una pipetta di vetro sterile. (Acido rifiuti posto in un beaker 1-2 L contenente almeno 300 ml di acqua di rubinetto. Ciò diluire l'acido ed evitarne il surriscaldamento.) Inclinare il pallone per raccogliere l'acido residuo in curva del pallone e utilizzare una piccola pipetta di vetro a eliminare tutto l'acido residuo. Se l'acido residua, che reagisce con l'acqua di risciacquo, scaldare i semi e li uccidono.
- Risciacquare semi versando rapidamente 100 ml di acqua ultrapura sterile in ogni pallone. Il volume in eccesso di acqua diluire l'acido e prevenire il surriscaldamento e sementi danni durante la reazione dell'acido con l'acqua. Versare l'acqua e fiamma sterilizzare il labbro del pallone.
- Sciacquare i semi 8-10x con 50 ml di acqua ultrapura sterile. Agitare il pallone durante ogni lavaggio. Il pallone deve essere considerato sterile a questo punto e il labbro del pallone deve essere fiammato prima di ogni risciacquo.
- Lasciate che i semi assorbono durante la notte: dopo laultimo risciacquo, versare 50 ml di acqua ultrapura sterile in ogni pallone, sostituire la pellicola di copertura sterile su ogni pallone e posto a 4 ° C al buio durante la notte.
- Luogo semi su piastra germinazione: Dopo semi di locazione assorbono durante la notte, versare l'acqua, sciacquare con 2x ~ 25 ml di acqua ultrapura, quindi aggiungere 20 ml di acqua ultrapura sterile, turbinio per risospendere semi e versare su una piastra di agar germinazione 1,1-1,2% da punto 1.1. Se semi rimangono nel pallone, aggiungere più acqua e versare di nuovo. Distribuire i semi da ogni pallone a una piastra (63-125 semi / piastra).
- Agitare la piastra per distribuire i semi. I semi devono essere distribuiti in modo uniforme in una banda di 4-5 cm ad una estremità della piastra. Questo sarà il "top" della piastra. Il "fondo" 5-6 cm dovrebbe essere mantenuto privo di semi (Figura 2A).
- Aspirare l'acqua con una pipetta sterile. La piastra a 45 ° per far colare l'acqua rimasta al fondo della piastra. Riposizionare il coperchio sul tilPiastra ted e proteggere dalla luce. Piatti dovrebbe essere consentito di drenare 10-20 min. (Figura 2B).
- Montato germinazione: Rimuovere tutta l'acqua che si è raccolto nella parte inferiore della piastra inclinata con una pipetta sterile.
- Riposizionare il coperchio e sigillare il piatto con parafilm. Indossare guanti e mantenere sterile (Figura 2C).
- Stack le piastre di germinazione e poi girare tutti loro fino ad un angolo di 90 °. I semi vengono stesi sulla superficie verticale della agar. Semi completamente imbibiti dovrebbe facilmente aderire al agar. Le radici cresceranno verso il basso (Figura 2D).
- Avvolgere la pila di lastre di germinazione in fogli di bloccare la luce e mantenerlo a 25 ° C per 3 giorni.
Nota: Se il provento di germinazione per meno di 3 giorni, le radici possono essere troppo breve per raggiungere l'agar-agar in microcosmi. Se la germinazione procede più di 4 giorni prima del trasferimento a piastre microcosmo, la sopravvivenza delle piantine sarannoessere poveri. Se M. ecotipi truncatula o mutanti con tassi di germinazione più lenti devono essere confrontati, l'ecotipo lentamente germinazione dovrebbe essere consentito di germinare più di 3 giorni.
2. Preparazione dei singoli Microcosmi Piatto
- Preparare medio 12 (cfr. tabella 1 per la composizione), consentendo ~ 70 ml di mezzo di Jensen per ogni microcosmo. Preparare in brocche o bottiglie che sono convenienti per un rapido versamento (non più di 1-2 litri per ogni lanciatore) e lasciare un ancoretta magnetica nella brocca durante la sterilizzazione in autoclave.
- Dopo medio è raffreddato a ~ 55-65 ° C, sono stati aggiunti integratori, e il pH è stato controllato (cfr. tabella 1), versare nella rotonda diametro 100 millimetri, 15 millimetri piatti fondi. Le lastre devono essere versati ~ 0,9-1 cm di profondità (~ 70 ml / piastra).
- Componenti di mezzo di Jensen possono formare un precipitato nuvoloso, quindi è importante per restituire il lanciatore alla piastra magnetica mescolare periodicamente per evitare che i componenti di stabilirsi fuori. Precipitati possono essere vispatibile nel piatto dopo che solidificano, e non influisce sulle prestazioni, purché siano equamente distribuiti tra i piatti.
- Impilare piastre durante il getto per evitare la formazione di condensa sui coperchi piastra.
- Dopo piastre di Jensen solidifica, tacca entrambe le piastre e coperchi con una spatola di pesatura che è stato piegato a U 5 (Figura 3A). Riscaldare la curva della spatola con un bruciatore fino al rosso caldo, tacca 5-6 piatti e poi riscaldare di nuovo. Quando il coperchio dentellato è collocata sulla piastra dentata, questo creerà un portale ovale attraverso il quale la ripresa della piantina crescerà (Figura 3B). Se le piastre dentellate devono essere conservati, avvolgere singolarmente con film paraffina ..
3. Preparazione di Sinorhizobium meliloti Culture
Due giorni prima inoculazioni di piante, iniziare culture di tutto S. meliloti ceppi essere inoculate sulle piantine. Culres dovrebbero essere coltivate in LBMC (Luria-Bertani [Miller]) medio 13 supplementato con 2.5 MgSO mm 4, 2,5 mM CaCl 2, e antibiotici appropriati (TY medio funziona anche bene). Appena 2-3 ml di ogni cultura saranno sufficienti.
- Coltivare a 30 ° C con agitazione per 2 giorni fino a quando le cellule sono densi.
- Per la maggior parte inoculazioni vegetali, la fase di crescita del S. meliloti non è critica. Di solito, in ritardo log o sono utilizzate cellule in fase stazionaria precoce.
4. Posa su M. truncatula Piantine sui singoli Microcosmi
- Dopo 3 giorni, aprire un piatto di germinazione (preparato nella fase 1) e inondare immediatamente con acqua ultrapura sterile. Dip pinza in etanolo e brevemente fiamma per sterilizzare. Utilizzare pinze sterili per spingere delicatamente le punte delle radici di tutte le piantine sotto l'acqua per evitare l'essiccazione. Radici spazieranno 2-6 cm di lunghezza. La maggioranza sarà 3-4 cm. Selezionare piantine con radici diritte e non evidentedifetti.
- Controllare i coperchi dei microcosmi medie del Jensen per la formazione di condensa. Flick il coperchio per rimuovere la condensa o sostituirlo con un nuovo coperchio dentellato. Se vi è un eccesso di condensa sul coperchio, la radice piantina può aderire al coperchio e poi muoiono dopo la condensazione asciuga.
- Utilizzando le pinze, prendere delicatamente una piantina dalla piastra germinazione dai cotiledoni e laici la radice su mezzo il microcosmo di un Jensen. Assicurarsi che la punta della radice è in contatto con l'agar.
- Rimuovere delicatamente il cappotto di seme se è ancora presente. I cappotti di seme dovrebbero essere sciolti dopo ammollo in acqua per 5-10 min. Stuzzicare delicatamente il cappotto di seme con la pinza fino a quando non cede, e scartare. I cotiledoni e circa 0,5 cm di ripresa devono sporgere fuori dalla U-tacca nella piastra (Figura 4A). Ricollocare accuratamente il coperchio della piastra con l'U-tacca del coperchio sopra la piantina, creando un portale per la piantina (Figura 4B).Set piastre da parte in pile orizzontali fino a quando tutti piantine sono stati immessi sul microcosmi.
- Utilizzare tutte le piantine da ogni piatto germinazione quello sguardo vitale e hanno una radice diritta. (Se possibile, lasciare un piatto di piantine non aperti da utilizzare in sostituzione di piantine avvizzite poco prima inoculazione.)
- Dopo aver posato tutte piantine, permettere loro di sedersi sul microcosmi orizzontale di Jensen, mentre la S. sospensioni di inoculo meliloti sono in preparazione.
5. Preparazione di S. meliloti inoculo Sospensioni
- Controllare S. meliloti culture periodicamente dopo l'inoculazione per essere sicuri che stanno crescendo. Dopo 2 giorni di crescita, il diametro esterno 600 deve essere compresa tra 2 e 4.
- Pipettare 0,5 ml di ogni cultura in una sterile provetta da 1,5 ml e centrifugare a pellet. Rimuovere il surnatante.
- Lavare le cellule due volte in entrambi 0,85% di acqua sterile di NaCl sterile o ultrapura. Risospendere le cellule in 0,5 ml 0,85% sterile NaCl o acqua ultrapura.
- Misurare il diametro esterno 600 di una diluizione 1/10 di risospeso S. meliloti culture dal punto 5.3. Sulla base di questa lettura, fare una sospensione di ogni cultura in acqua ultrapura sterile a OD 600 = 0,05. Se la densità cellulare è troppo alta, nodulation può essere inibito. Fare abbastanza della sospensione diluita in modo che 100 ml possono essere inoculati su ogni piantina. La nuvolosità della OD 600 = 0.05 sospensione deve essere appena percettibile ad occhio.
6. Inoculazione e tenuta di Microcosmi
- Immediatamente prima di vaccinazioni iniziano, verificare la presenza di piantine avvizzite che non sono sopravvissuti al trasferimento di microcosmi medie del Jensen. Sostituire quelle piantine con piantine fresche da lastre di germinazione.
- Aprire ogni microcosmo e inoculare 100 ml di adeguata S. meliloti sospensione sulla radice piantina. Riposizionare il coperchio e mettere da parte in stac orizzontaleks di 6-10 microcosmi. Per ogni S. ceppo meliloti da confrontare, inoculare almeno 15 piante. Per i ceppi che presentano sottili differenze di produttività simbiotico, inoculare 30-35 piante. Lasciare almeno 10 piante non inoculate come controllo negativo. Inoculare 30-35 piante con S. meliloti 1021 o altra appropriata ceppo selvatico per servire come controllo positivo.
- Dopo la S. sospensione meliloti ha avuto il tempo di assorbire sulla superficie della radice e il liquido di sospensione ha inzuppato nel agar (almeno 20 min.), avvolgere ogni piatto singolarmente con film paraffina. Piastre devono essere avvolti fino al confine della tacca, ma il film paraffina non devono bloccare la crescita della piantina (Figura 4C).
- Al momento del confezionamento, eseguire un controllo finale per radici attaccate alla parte interna del coperchio piastra. Per rimuovere le radici attaccate dal coperchio, porre la lastra piana in panchina e toccare o sfogliare il coperchio a bussare alla radice indietro sulla agar surface.
- Allineare i portali piantine di ciascuna pila di 6-10 piatti. Posare lo stack ad un angolo di 90 ° con le piantine punta verso l'alto (Figura 4D). La vischiosità del film paraffina terrà le piastre in luogo abbastanza a lungo per avvolgere l'intero stack in un foglio, lasciando una striscia di 1-2 cm scartato dove le piantine emergono (Figura 4E). La pellicola protegge le radici dalla luce.
- Inserire la pellicola avvolta stack in una camera di crescita illuminata o camera di crescita a 21-25 ° C, 60-70% di umidità relativa e 100-175 mmol / m -2 s -1 luce su un ciclo di buio 16 ore di luce / 8 ore ( Figura 1A). In queste condizioni di crescita, incubazione prolungato a livelli di luce maggiore di 200 pmol / m -2 s -1 può avere un effetto negativo sulla crescita delle piante.
7. Esame di Root Sistemi e quantitativa di simbiotiche fenotipi
Le piante possono essere mantenuti inmicrocosmi fino a 9 settimane.
- Numero nodulo può essere quantificata in una serie di punti di sempre da scartare il foglio di ogni risma e contando noduli. Lo sviluppo di noduli sulle piante inoculate con S. meliloti 1021 tipo selvatico sono evidenti da 10-14 giorni dopo l'inoculazione.
- Produttività simbiotico può anche essere misurata ad ogni tempo misurando la lunghezza delle riprese emergente.
- Quantificazione finale della produttività simbiotico viene di solito eseguita a 7 settimane dopo l'inoculazione staccando il tiro e la misurazione del peso fresco del germoglio. Questa operazione può essere eseguita più tardi nove settimane se la crescita è più desiderato.
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Representative Results
La preparazione e inoculazione di questi microcosmi piatto è relativamente semplice rispetto alla maggior parte degli altri metodi descritti nell'introduzione. L'uso di questi microcosmi consente anche la crescita delle piante prolungata (fino a 9 settimane) senza annaffiature o supplementazione dei nutrienti, la manutenzione di radice di sterilità, sia semplice esame delle radici e la protezione di radici dalla luce, la crescita incontrollata di germogli di piante, di facile accesso per le riprese misura della lunghezza, e la rimozione di piante dalle microcosmi con minimo danno al peli radicali. Figura 1A mostra giovani piantine che crescono in microcosmi in un incubatore. Le immagini in figure 1B-1E mostra diversi punti di vista di microcosmi contenenti M. truncatula A17 piante inoculate con il tipo selvatico S. meliloti 1021. Se compattamente,> 220 microcosmi si inserisce su un 73,8 centimetri x 67,5 cm mensola incubatrice. Figure 1B e 1C mostrano microcosmi in unimballati in pellicola pila con piante emergenti dai portali in microcosmi. Figura 1D mostra un singolo microcosmo con la lamina rimosso e la radice e noduli visibili attraverso la parte anteriore della piastra. Figura 1E mostra lo stesso microcosmo sdraiato con la pianta che emerge dalla il portale nella piastra. La lunghezza del germoglio può essere misurata dal punto di emersione dal microcosmo (Figura 1C) senza disturbare la pianta. Figura 5A mostra i dati di lunghezza tiro di M. truncatula A17 piante inoculate con il tipo selvatico S. meliloti 1021 a confronto con piante non inoculate a 7 settimane e nove settimane di post-inoculazione. La crescita nei microcosmi è ideale per la raccolta di una serie di timepoints di sviluppo nodulo e la lunghezza sparare. Al tempo di valutazione finale, i germogli sono tagliati fuori per la misura del tiro peso fresco (Figura 5B). Figura 6 illustra esempi di tre fenotipi simbiotici a 7 settimane post-inoculo. La produttività simbiotico relativa di M. truncatula A17 piante inoculate con differenti S. ceppi meliloti è quantificato in base alla lunghezza ripresa (Figura 6A) e sparare peso fresco (Figura 6B). Il numero di noduli radicali sulle piante inoculate con questi ceppi è illustrato nella Figura 6C. Un colore rosa dovuto alla produzione di leghemoglobin indica che noduli sono funzionali e capaci di fissazione dell'azoto, mentre piccoli noduli bianchi sono generalmente non funzionale e / o interrotta e noduli marrone sono senescente e necrotico 14-18. Il confronto nella Figura 6 mostra che la produttività simbiotico di M. truncatula A17 piante inoculate con S. meliloti 1021 portando il plasmide PSTB-LAFR5-exoY, che overexpresses il ExoY undecaprenyl-fosfato galattosio phosphotransferase, è maggiore di quella di tipo selvaggio S. meliloti 1021 e le tensioni che portano il c negativo ontrol plasmide PSTB-LAFR5. Questi ExoY over-esprimono ceppi producono più del esopolisaccaride simbiotico succinoglycan rispetto ai ceppi di controllo. La possibilità di quantificare le differenze in fenotipi simbiotici che prendono diverse settimane per manifestare è un grande vantaggio di questo metodo. Per tutte le misure di produttività simbiotico su M. truncatula A17, il Sinorhizobium medicae ceppi WSM419 e ABS7 svolgere meglio di S. meliloti 1021 (figure 6A-6C). (I dati di Figura 6 originariamente apparso in Jones (2012) 19.) Nel momento in cui il microcosmo è smontato e sparare pesi freschi sono misurate, radici possono anche essere ripreso al microscopio. Figura 7 mostra una vista rappresentativi di M. truncatula A17 radici dopo la rimozione da microcosmi. I peli radicali hanno subito danni minimi poiché le radici giacevano sulla superficie dell'agar e non sono sradicate da uno strato orizzontale di agar.
_content "> Le piante possono essere mantenuti fino a 9 settimane in questi microcosmi perché c'è ~ 70 ml di terreno di coltura agar nel piatto. Dopo periodi di crescita più lunghi, alcune piante possono iniziare ad asciugare. Sette settimane di crescita è ottimale per la simbiosi con S. meliloti 1021. Per la simbiosi più efficiente di M. truncatula A17 con S. medicae WSM419 o S. medicae ABS7, un periodo di crescita più breve di 4-5 settimane è ottimale.| Concentrazione finale per L | Quantità di soluzione | Concentrazione della |
| 1 g CaHPO 4 | NA | NA |
| 0,2 g MgSO 4 · 7H 2 0 | 1 ml | 0,2 g / ml |
| 0.2 g K 2 HP0 4 | 1 ml | 0,2 g / ml |
| 0,2 g NaCl | 1 ml | 0.2g / ml |
| 0.1 g FeCl 3 · 6H20 | 1 ml | 0,1 g / ml |
| 11,5 g di agar-purificata (vedi Tabella di reagenti specifici per le specifiche agar) | ||
| milliQ H 2 0 a 1 L |
Tabella 1. Protocollo terreno agar di Jensen per microcosmi piatto. Istruzioni di preparazione per mezzo di Jensen.
Passi:
- Aggiungere sopra gli ingredienti e mescolare con ancoretta magnetica.
- Autoclave 45 min, ciclo di liquido, con ancoretta nella brocca.
Nota: CaHPO 4 e FeCl 3 precipitano durante la sterilizzazione in autoclave. Mescolare per farli tornare in sospensione; supporti rimarrà comunque nuvoloso - Raffreddare con agitazione fino a quando non è doloroso per prendere la brocca con le mani nude.
- Aggiungere 1 ml tracce di minerali per L (vedi sotto per ricetta) whagitazione ile
Nota: Assicurati di risospendere il precipitato nei minerali traccia prima di dispensare. - Aggiungere 0,25 ml 4 N NaOH a L, mescolando.
- Controllare il pH rimuovendo ~ 100 microlitri mezzi con pipetta sterile e applicare alla carta pH
Nota: pH 5-10 gamma di carta funziona bene. pH dovrebbe essere ~ 7 Attendere alcuni secondi per lo sviluppo del colore pieno. Se il pH non è corretto, ci può essere stato un errore di preparazione. - Versare in piastre spesse come possibile, remix pallone con il ritorno alla piastra di agitazione magnetica
Nota: Se un piatto è sovraccarico (cioè il liquido aspira sul fondo del coperchio),
Nota: Si aspettano di ottenere ~ 15 tavole per litro.
Trace minerali stock 1 L (sterilizzare in autoclave)
| 1 g di H 3 BO 3 |
| 1 g ZnSO 4 · 7H 2 0 |
| 0,5 g CuSO 4 · 5H 2 0 |
| 0,5 g MnCl 2 · 4H 2 0 |
| 1 g Namoo 4 · 2H 2 0 |
| mili-Q H 2 0 a 1 L |
Figura 1. Vedute di microcosmi contenenti piante inoculate con S. meliloti 1021 A) Piante in lastre di microcosmo che crescono in un incubatore. B) M. truncatula A17 piante inoculate con S. meliloti 1021 tipo selvatico che cresce attraverso la tacca nella parte superiore della microcosmi agar di Jensen. C) close-up Ulteriore visualizzazione delle piastre in B mostra la crescita delle piante attraverso tacche microcosmi. D) Uno dei piatti microcosmo da B e C con la radice noduli impressi attraverso il coperchio. E) La piastra from D sdraiato con le riprese che emerge dalla tacca.
Figura 2. Piastra di germinazione dei semi di set-up. A) I semi sono distribuiti su una metà di un 100 millimetri piatto quadrato. B) Superficie Agar viene drenata permettendo all'acqua di raccogliere sul fondo di un piatto inclinato. C) Le piastre sono avvolti in pellicola di paraffina, impilati e D) della pila trasformato in un angolo di 90 ° e avvolto in carta stagnola.
Figura 3. Costruzione di microcosmi da intaglio piastre di Jensen con una spatola piegato. A) Una spatola metallica pesatura che è stato piegato a formare un ovale di fiamma è riscaldata e utilizzata per intaccare un foro a forma di U nel lato delpiastra e nel lato del coperchio. Il fondo della U-tacca nella piastra dovrebbe essere nella parte superiore della superficie dell'agar. Il fondo della U-tacca nel coperchio deve essere fino alla parte superiore del coperchio. B) Sostituzione del coperchio sulla piastra crea un portale ovale attraverso cui la piantina può sporgere.
Figura 4. Inserimento di piantine in microcosmi. A) Due viste mostrano come la radice piantina dovrebbe porre sulla superficie agar con i cotiledoni e ~ 0,5 centimetri di ripresa sporgenti fuori della U-tacca nella piastra. B) e C) Appoggiare il coperchio sulla piastra con tacche allineate creerà un portale ovale per la piantina. Avvolgere il piatto forte con la pellicola di paraffina non mancherà di tenere il coperchio di muoversi e prevenire l'essiccazione. D) Le piastre possono essere impilati insieme in gruppi di 6-10, ed E), avvolto con pellicola. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 5. Fenotipi simbiotici Rappresentante dopo 7 settimane di crescita e di nove settimane la crescita di M. truncatula A17 nei singoli microcosmi. A) Lunghezza Spara di piante inoculate con S. meliloti 1021, e la lunghezza tiro di piante non inoculate sono stati misurati a 7 settimane senza rimuovere le piante da microcosmi. A nove settimane post-inoculazione, lunghezza ripresa è stata misurata (A), e poi spara stati ritagliato e pesato (B).
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Figura 6. Fenotipi simbiotici Rappresentante dopo 7 settimane di crescita di M. truncatula A17 nei singoli microcosmi. ceppi di S. exoY-sovraespressione meliloti 1021 hanno migliorato simbiosi sulla pianta ospite Medicago truncatula A17. La produttività simbiotico di S. meliloti 1021 su M. truncatula A17 è migliorata in ceppi che iperesprimono il galattosio phosphotransferase undecaprenyl-fosfato codificata da exoY. Produttività simbiotica è misurata come (A) Lunghezza sparare in cm e (B) sparare peso fresco in grammi. I numeri di rosa, noduli funzionali (bar grafico in basso), bianchi, noduli inefficaci (bar centrale del grafico), e marrone, noduli necrotiche (bar grafico in alto) sono mostrati in (C). La produttività e il nodulo numero simbiotica di piante inoculate con S. sono indicate anche medicae ceppi WSM419 e ABS7. Asterischi oltre barre del grafico indicano una statisticaly differenza significativa dal 1021 wild type ceppo di riferimento in un t-test spaiato. Piante inoculate con una mutante nullo exoY :: Tn5 che non produce alcun succinoglycan avevano lunghezze sparare simili e peso fresco alle piante non inoculate, e prodotte solo bianche, noduli inefficaci. I grafici in (A) e (B) sono stati originariamente pubblicati nel 19. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 7. Radici impressi su un microscopio da dissezione dopo la rimozione dal microcosmi. Roots possono essere facilmente rimossi dal microcosmi per l'imaging con danneggiamento minimo peli radicali perché giacciono sulla superficie dell'agar. Le immagini mostrano radici di M. truncatula A17 a 10 giorni dopo l'inoculazione (A, B) (C). Le radici visualizzati sono stati inoculati con S. meliloti 1021 selvaggio di tipo (A), un S. ceppo meliloti trasporta una fusione EGLC :: GUS (B), e un S. ceppo meliloti trasporta un SMc00911 :: GUS fusion 20 (C). GUS colorazione di S. meliloti cellule che trasportano la fusione SMc00911 :: GUS è visibile sui peli radicali e la superficie della radice di E. Bar corrisponde a 100 micron. Clicca qui per ingrandire la figura .
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Discussion
Ci sono diversi passaggi del protocollo che sono fondamentali per il successo: 1) La necessità di usare purificato, pianta coltura cellulare testato agar non può essere sottovalutata. Questo non è critica per piantine di erba medica, ma è fondamentale per la crescita di M. truncatula A17. 2) E 'importante germinare piantine su piastre di agar verticali come descritto nella Fase 1. La tecnica ampiamente usata di germinazione piantine su una superficie orizzontale rovesciato in un piatto fondo 15 millimetri 7 non è consigliato per questo protocollo perché le radici di piantine saranno troppo brevi e / o non diritto. Piantine con dritto crescita radici di 2-4 cm di lunghezza sono ideali per il trasferimento da lastre di germinazione di microcosmi. Tre giorni di crescita nelle piastre di germinazione verticali di solito è l'ideale per le radici per raggiungere questa lunghezza. 3) E 'anche fondamentale per evitare la contaminazione delle piantine con rhizobia prima dell'inoculazione. Prima del trasferimento delle piantine da lastre di germinazione a microcosms, l'area di lavoro deve essere accuratamente pulito con etanolo e tutti gli strumenti utilizzati per il trasferimento deve essere frequentemente infiammi sterilizzato. Un'altra fonte potenziale di contaminazione può essere evitato preparando il S. sospensioni deformazione meliloti per inoculazione di microcosmi in un'area di lavoro diversa da quella utilizzata per la preparazione piantina. Contaminazione fungina dei microcosmi può anche essere evitato eliminando tutti i resti del cappotto di seme dall'interno del microcosmo, dal momento che le spore fungine possono essere incorporati nel cappotto. 4) sopravvivenza Germogli può essere massimizzato mantenendo radici di piantine umido ed a contatto con agar in ogni momento, e da un trattamento molto delicato durante il trasferimento. Qualsiasi piantina con la radice intrappolati in agar nella piastra germinazione deve essere asportata con attenzione per evitare danni alla radice. Un elevato rendimento delle piante vitali può essere raggiunto facendo un controllo finale di piantine avvizzite nelle pile di microcosmi prima inoculazioni inizio, e la loro sostituzione spiritoh nuove piantine. Se piantine sono in buone condizioni e non hanno aderito alla parte interna del coperchio piatto, meno del 5% di piantine dovrebbe essere necessario sostituire in questa fase. Ostruzione della crescita sparare dal microcosmo può essere prevenuta facendo attenzione che non resti del cappotto di seme sono vincolanti cotiledoni e che il microcosmo è parafilm avvolto con cura in modo che le riprese non venga ostacolato.
Usiamo abitualmente questo metodo per studiare simbiosi nelle piante ospiti M. truncatula A17 ed erba medica, e attualmente stiamo ottimizzando la tecnica per la crescita di altri M. cultivar truncatula, altre specie di Medicago e delle specie di Melilotus (sweetclovers). Non abbiamo ancora testato questo metodo con M. truncatula A20, che è un ecotipo che viene utilizzato come un partner mappatura genetica con A17. Abbiamo scoperto che M. truncatula cv. R108 non cresce bene sulla pianta coltura cellulare testato purificata agar che stiamo attualmente utilizzando e stiamo cercando di identificare un'altra preparazione agar o agar-sostituto per l'uso come un microcosmo crescita substrato per questa cultivar.
Nel confrontare il metodo descritto qui con altri metodi comunemente utilizzati per l'analisi del M. truncatula A17 / S. meliloti simbiosi, abbiamo trovato che questo è di gran lunga il metodo migliore per simultaneamente confrontare le prestazioni simbiotico di un gran numero di S. meliloti ceppi. Noi abitualmente istituito 250 microcosmi alla volta (10 diversi ceppi di S. meliloti inoculato su 25 piante ciascuno.) Quando una sola genotipo di S. meliloti o S. medicae deve essere utilizzato, e la contaminazione incrociata non è un rischio, cassoni aeroponic o sacchetti crescita può essere un metodo più appropriato. Questo metodo piastra microcosmo è anche il metodo migliore per fare osservazioni periodiche della progressione di sviluppo nodulo e produttività simbiotico per un lungo periodo ditempo. Fenotipi che si manifestano nelle fasi successive di simbiosi, come nodulo senescenza, possono essere studiati più facilmente con questo metodo che con altri protocolli.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato dall'Istituto USDA Nazionale di alimentazione e l'agricoltura, agricoltura e alimentazione Research Initiative concessione 2010-65.108 - 20582 a KMJ Ringraziamo Brian K. Washburn per la revisione critica del manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar purified, plant cell culture-tested | Sigma | A7921 |
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