Summary
Tillväxt av Medicago truncatula växter i symbios med kvävefixerande bakterier Sinorhizobium meliloti i enskilda, sterila mikrokosmos gjorda av vanliga laboratorieplattor tillåter frekvent granskning av rotsystem och knölar utan att kompromissa med sterilitet. Växter kan upprätthållas i dessa tillväxtkammare under upp till nio veckor.
Abstract
Baljväxtbakterier bildar symbiotiska, kvävefixerande knölar på rötterna av kompatibla värd baljväxter växter. En av de mest välutvecklade modellsystem för att studera dessa interaktioner är växten Medicago truncatula cv. Jemalong A17 och baljväxtbakterier bakterie Sinorhizobium meliloti 1021. Upprepad avbildning av växternas rötter och poängsättning av symbiotiska fenotyper kräver metoder som är icke-förstörande antingen växter eller bakterier. Den symbiotiska fenotyper av vissa växt-och bakterie mutanter blivit uppenbart efter relativt korta perioder av tillväxt, och inte kräver långsiktig observation av värd / symbiont interaktion. Men subtila skillnader i symbiotiska effektivitet och knöl hudåldrande fenotyper som inte är uppenbara i de tidiga stadierna av nodulation processen kräver relativt långa tillväxtperioder innan de kan görs. Flera metoder har utvecklats för långsiktig tillväxt och observation av denna värd / symbiont par.Emellertid är många av dessa metoder kräver upprepad vattning, vilket ökar möjligheten för kontaminering av andra mikrober. Andra metoder kräver ett relativt stort utrymme för tillväxt av ett stort antal växter. Den metod som beskrivs här, symbiotiska tillväxten av M. truncatula / S. meliloti i sterila, enda växtmikrokosmos, har flera fördelar. Växter i dessa mikrokosmos har tillräcklig fukt och näringsämnen för att säkerställa att vattning krävs inte för upp till 9 veckor, förhindra korskontaminering under vattning. Detta gör fenotyper som ska kvantifieras som kan missas i kortsiktiga tillväxtsystem, såsom subtila förseningar i knöl utveckling och tidig knöl åldrande. Dessutom är de rötter och knölar i mikrokosmos lätt ses genom locket plattan, så upp-böka av växterna för observation inte behövs.
Introduction
Samspelet mellan legume värdväxten Medicago truncatula A17 och baljväxtbakterier bakterie Sinorhizobium meliloti 1021 är en av de mest tractable modellsystem för studium av rot knöl utveckling och kvävefixerande symbios. Genom av både symbiotiska parter har sekvense 1,2 och både växt-och bakterie kan bli föremål för genetisk manipulation 3,4. Analys av fenotyper av både växt-och bakterie mutanter kräver förmåga att observera stadier knöl utveckling och för att kvantifiera den symbiotiska produktivitet över tid. Här beskriver vi en metod för att observation av rot knöl utveckling av M. truncatula cv. Jemalong A17 inokulerade med S. meliloti 1021 inom enskilda mikrokosmos gjorda av standard, rund 100 mm diameter, 15 mm djupa laboratorieplattor (Figur 1A). Den skjuta exponeras och växer genom en tandad portal i sidan av plattan (Figures 1B, 1C och 1E). Rötter är inrymda i de mikrokosmos och hållas sterilt, samtidigt som observation genom locket hos plattan (figur 1D). Eftersom skjuta är åtkomlig, är dess tillväxt begränsas inte och den kan mätas vid periodiska intervall utan att äventyra steriliteten hos roten. Den metod för att skapa hack-platta mikrokosmos utvecklades ursprungligen av Leigh, et al. 5 för att odla alfalfa växter, men det var inte allmänt antagits trots sina många fördelar jämfört med andra metoder. En variant av denna metod har också utvecklats för att analysera samspelet mellan växtrötter och mykorrhiza 6. Vi har nu anpassas och optimeras denna metod för tillväxt av M. truncatula växter. Fördelarna med detta protokoll över mer vanligaste metoderna beskrivs nedan.
Det finns flera metoder som för närvarande används i stor utsträckning för nodulation studier av M. truncatula inocurade med S. meliloti 7. Den vanligaste metoden för storskalig framställning av nodulerade rötter är tillväxten i aeroponic kassuner 7. I denna metod är växter upphängd över ett stort kärl och rötter är luftades med en blandning av S. meliloti och näringslösning 7. Denna metod är praktiskt om bara en genotyp av S. meliloti ska testas. Eftersom det kräver aerosolisering av höga koncentrationer av bakterier, finns det en hög sannolikhet för korskontaminering mellan kassuner inokulerade med olika bakteriestammar. En annan metod som ofta används för att framställa stora mängder av inokulerade plantorna är tillväxt i baljor eller krukor av perlit, vermikulit, sand eller kalcinerad lera som är infunderas med näringslösning och inokulerades med S. meliloti 7. Denna metod kräver användning av öppna baljor eller krukor, och kräver vattning och förvaltning av den näringslösning. En annan nackdel med krukor är att växtermåste tas bort från denna partikelmatris för granskning av rötter och knölar. En annan nackdel med denna metod är att ett stort område av inkubatorn utrymme behövs då många olika S. meliloti genotyper skall jämföras, eftersom en separat kruka måste användas för varje bakterie genotyp. Den "Leonard burk" är en variation på denna metod 8,9. En Leonard burk består av två steriliserade kärl staplade den ena ovanpå den andra och förbundna med en veke. Tillväxtmedium är placerad i den undre kärlet och dras genom veken genom kapillärverkan in i en tillväxt matris av perlit, vermikulit, sand eller kalcinerad lera, i det övre kärlet. Plantan (er) är placerade i tillväxtmatris och inokulerades med S. meliloti. Denna metod kräver inte vattning, men undersökning av rötter och knölar kräver att plantan tas ur partikeltillväxtmatrisen.
Det finns flera metoder som inte tillåter enkel undersökning av roots. En av dessa är den transparenta plast "tillväxt påse" 7. En nackdel med denna metod är att täta vattning krävs eftersom endast ≤ 10 ml vätskemedium är optimal för att odla M. truncatula i påsar 7. Pouch experiment också vanligtvis begränsad till ~ 2 veckor 7, på grund av nedbrytning av pappers veken i påsen. Två andra metoder som allmänt används liknar vår metod att växterna odlas på agar och rötterna är synliga, men dessa metoder har också nackdelar som vår procedur undviker. I dessa metoder är växter helt innesluten i 24.5 cm x 24.5 cm agarplattor förseglade runt toppen med porös kirurgisk tejp eller odlas i agar-vinkling rör igenkorkade med bomullsproppar eller plastlock 7. Båda dessa metoder möjliggör enkel undersökning av rötter och kan hållas sterila. Men de agarsluttning rören vanligtvis odlas med endast 20 ml agar medel 7 och kräver vattning och näringsämnen enddition för långsiktig tillväxt av växter. Växter som odlas inom de 24,5 cm x 24,5 cm agarplatta mikrokosmos har tillräckligt med fukt och näringsämnen för långsiktig tillväxt, men den växande skjuta snabbt blir begränsad inom den slutna plattan mikrokosmos och etengasen kan bygga upp hämmande nodulation 7. I det förfarande som beskrivs här, är fotograferingen exponeras och växer fritt utanför det mikrokosmos som innehåller ~ 70 ml av media, vilket gör att den långsiktiga tillväxten.
Det förfarande som beskrivs här kan vara användbara inte bara för studier av nodulation av baljväxter växter, men också för att studera bakom fenotyper av andra medelstora anläggningar. Skillnaden mellan dessa mikrokosmos och en traditionell polykarbonat växtvävnadsodlings burk är att rötter i de platt microcosms beskrivs här växa på den vertikala ytan av agar i stället för nedåt till ett horisontellt skikt av agar vid botten av burken. Detta tillåter roten att lyftas bort av agarytan med minimal dkada på rothår och minimal vidhäftning av agar till rotytan, vilket underlättar undersökning av rothår genom mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Utför steg 1, 2, 4 och 6 i en steril huv med laminärt flöde är att rekommendera.
1. Beredning av M. truncatula A17 Plantor
Notera: M. truncatula A17 frön som används i dessa studier produceras under kylda växthusförhållanden vid ~ 22 ° C, eller i ett växtodlingsrum hålls vid 22-26 ° C med ~ 150-400 mmol / m -2 s -1 ljus.
- Häll frögroning plattor: Använd 100 mm kvadratiska plattor (15 mm djupa) och häll autoklaveras 1.1-1.2% vikt / volym renat agar 10 till ett djup av 3-5 mm. Varje platta kommer att användas för att gro ~ 0,25-0,5 g frön (ekvivalent med 63 till 125 frön / platta).
OBS: Det är viktigt att använda växtcellkultur-testad, renad agar för alla plattor som beskrivs i detta protokoll. Säljaren och katalognummer informationen för agar finns med i Tabell över specifika reagenser och utrustning. - Scarify / sterilisera M. truncatula A17 frös: Väg tillräckligt med frön för önskat antal plantor. (M. truncatula A17 frön är ~ 4 mg vardera) Placera frön i sterila 125 ml kolvar med sterila folie omslag (0,25-0,5 g frö / kolv, det är ~ 63-125 frön) och pipett 20 ml koncentrerad (96%) H 2 SO 4 längs sidorna av kolven.
OBS: Acid markberedning kommer sterilisera fröna. Också genom att pipettera syran längs sidorna av kolven, kommer det att åter sterilisera insidan av kolven som har kommit i kontakt med osteriliserade frön. - Bryt upp klumpar av utsäde med en steril glas pipett. Snurra varje kolv ofta för 10-12 min. Små, bruna gropar kommer att bli synliga på fröna. Dessa är små hål i fröskalet 11.
Anm: Använd skyddsglasögon och handskar vid arbete med koncentrerad H 2 SO 4. - Ta H 2 SO 4 och skölj fröna: När minst 10% av fröna har små bruna gropar, eller 12 minuter har gått, beroende på vilketkommer först, ta bort ALL syra från flaskorna med en steril glas pipett. (Place avfallssyror i en 1-2 liter bägare innehållande åtminstone 300 ml kranvatten. Detta kommer att späda ut syran och förhindra överhettning.) Vippa kolv för uppsamling av resterande syra i kurvan för kolven och använda en liten glaspipett att avlägsna all kvarvarande syra. Om återstående syra kvarstår, kommer den att reagera med sköljvattnet, värm fröna och döda dem.
- Skölj fröna genom att snabbt hälla 100 ml sterilt ultrarent vatten i varje kolv. Överskottet av vattenvolymen kommer att späda ut syran och förhindra överhettning och frö skada under reaktionen av syran med vatten. Häll av vattnet och flam-sterilisera läppen av kolven.
- Skölj frön 8-10x med 50 ml sterilt ultrarent vatten. Snurra flaskan under varje sköljning. Kolven bör vara steril vid denna punkt och den utskjutande kanten av kolven bör flammig före varje sköljning.
- Låt frön insupa natten: Eftersista sköljning, häll 50 ml sterilt ultrarent vatten i varje kolv, ersätta den sterila folielocket på varje kolv och plats vid 4 ° C i mörker över natten.
- Placera frön på groning Platta: Efter att låta fröna insupa över natten, häll av vattnet, skölj 2x med ~ 25 ml ultrarent vatten, tillsätt sedan 20 ml sterilt ultrarent vatten, snurra för att resuspendera frön och häll dem på en 1.1-1.2% agar grobarhet platta från steg 1.1. Om frön kvar i flaskan, tillsätt mer vatten och häll på nytt. Fördela fröna från varje kolv till en platta (63 till 125 frön / plåt).
- Snurra plattan att dela ut fröna. Fröna skall fördelas jämnt i en 4-5 cm band vid en ände av plattan. Detta kommer att vara "toppen" av plattan. "Botten" 5-6 cm ska hållas fria från frön (Figur 2A).
- Sug upp vattnet med en steril pipett. Vippa plattan vid en vinkel av 45 ° för att låta den återstående vattendräneringen till botten av plattan. Sätt tillbaka locket på tilted plattan och skydda mot ljus. Plattorna bör tillåtas rinna 10-20 min. (Figur 2B).
- Ställ in groning: Ta bort allt vatten som samlats på botten av den lutande plattan med en steril pipett.
- Sätt tillbaka locket och försegla plattan med parafilm. Använd handskar och hålla steril (figur 2C).
- Stapla grobarhet tallrikar och slå sedan på dem alla upp i 90 ° vinkel. Fröna kommer att ligga på den vertikala ytan av agar. Fullt insupit frön bör lätt hålla sig till agar. Rötterna växer nedåt (figur 2D).
- Vira bunten grobarhet plattor i folie för att blockera ljus och hålls vid 25 ° C under 3 dagar.
OBS: Om grobarhet intäkterna för mindre än 3 dagar, kan rötterna vara för kort för att nå agar i mikrokosmos. Om grobarheten fortsätter mer än 4 dagar innan överföring till mikrokosmos plattor, överlevnad av plantor kommervara dålig. Om M. truncatula ekotyper eller mutanter med långsammare grobarhet satser skall jämföras bör långsamt groende ekotyp tillåtas att gro längre än 3 dagar.
2. Beredning av enskilda Plate mikrokosmos
- Förbered Jensen medium 12 (se tabell 1 för sammansättningen), vilket gör att ~ 70 ml medium för varje mikrokosmos. Framställes på kannor eller flaskor, som är bekväm för snabb gjutning (inte mer än 1 till 2 L per kanna) och lämnar en magnetisk omrörarstav i kannan under autoklavering.
- Efter medel har svalnat till ~ 55-65 ° C, kosttillskott har lagts till, och pH-värdet har kontrollerats (se tabell 1), häll i rund 100 mm diameter, 15 mm djupa tallrikar. Bör hällas Plattor ~ 0,9-1 cm djup (~ 70 ml / platta).
- Komponenter i Jensen medium kan bilda en grumlig fällning, så det är viktigt att återföra kannan till den magnetiska omrörningsplatta periodvis för att förhindra att komponenter från att sedimentera ut. Utfällningar kan vara emotligt i plattan efter att de stelnar, och inte påverka prestanda så länge som de är jämnt fördelade bland plattorna.
- Stack plattor under hälla för att förhindra bildandet av kondens på plåtlock.
- Efter Jensens plattorna har stelnat, notch båda plattorna och lock med en vägnings spatel som har böjts till en U-form 5 (figur 3A). Värm böjen av spateln med en brännare tills glödheta, hack 5-6 tallrikar och sedan värma upp igen. När den skårade locket är placerat på den skårförsedda plattan, kommer detta att skapa en oval portal genom vilken skott av plantan kommer att växa (Figur 3B). Om skårade plattor skall lagras, slå in individuellt med paraffin film ..
3. Beredning av Sinorhizobium meliloti kulturer
Två dagar före växt vaccinationer, börja kulturer av alla S. meliloti stammar som ska ympas på plantor. Cultures bör odlas i LBMC (Luria-Bertani [Miller]) medium 13 kompletterat med 2,5 mM MgSO 4, 2,5 mM CaCl2, och lämpliga antibiotika (TY mediet fungerar också bra). Så lite som 2-3 ml av varje kultur kommer att vara tillräcklig.
- Odla vid 30 ° C med skakning under två dagar, tills cellerna är tät.
- För de flesta växt vaccinationer, tillväxtfasen av S. meliloti är inte kritisk. Typiskt sen log eller tidig stationär fas celler används.
4. Att lägga ut M. truncatula Plantor på enskilda mikrokosmos
- Efter 3 dagar, öppna en grobarhet platta (framställd i steg 1) och omedelbart översvämma med sterilt ultrarent vatten. Doppa pincett i etanol och lågan snabbt att sterilisera. Använd steril pincett för att försiktigt skjuta rot tips av alla plantor under vattnet för att förhindra uttorkning. Rötter kommer att sträcka sig 2-6 cm långa. De flesta kommer att vara 3-4 cm. Välj plantor med raka rötter och ingen uppenbardefekter.
- Kontrollera locken på Jensens medelmikrokosmos för uppbyggnad av kondens. Snärta locket för att avlägsna kondens eller ersätta det med ett nytt hack lock. Om det finns ett överskott av kondensation på locket kan det plantroten häfta vid locket och sedan dö efter kondensationen torkar.
- Med hjälp av pincett, försiktigt plocka en planta från groning plattan med hjärtbladen och lägg roten på Jensens medelmikrokosmos. Se till roten spets är i kontakt med agar.
- Ta försiktigt bort fröskalet om det fortfarande är närvarande. Fröskalen bör vara löst efter blötläggning i vatten under 5 till 10 min. Retas försiktigt fröhöljet med pincetten tills det ger vika, och kasta. Hjärtbladen och ca 0,5 cm i shoot bör sticka ut ur U-notch i plattan (Figur 4A). Försiktigt på locket på plattan med den U-notch av locket över plantan, skapa en portal för plantan (Figur 4B).Ställ tallrikar åt sidan i horisontella staplar tills alla plantor har placerats på mikrokosmos.
- Använd alla plantor från varje groning platta som ser livskraftiga och har en rak rot. (Om möjligt, lämna en platta av plantor oöppnade att använda som ersättning för vissnade plantor strax före ympning.)
- Efter att lägga ut alla plantor, låta dem sitta på den horisontella Jensens mikrokosmos medan S. meliloti inokulat suspensioner förbereds.
5. Framställning av S. meliloti Vaccin Suspensioner
- Kontrollera S. meliloti kulturer regelbundet efter ympning för att vara säkra på att de växer. Efter två dagars tillväxt bör OD 600 vara mellan 2 och 4.
- Pipettera 0,5 ml av varje kultur i ett sterilt 1,5 ml rör och centrifugera för att pelletera. Avlägsna supernatanten.
- Tvätta cellerna två gånger i antingen 0,85% steril NaCl eller sterilt ultrarent vatten. Återsuspendera cellerna i 0,5 ml 0,85% sterile NaCl eller ultrarent vatten.
- Mät OD 600 av en 1/10 utspädning av suspenderas S. meliloti kulturer från steg 5.3. Baserat på denna läsning, gör en suspension av varje kultur i sterilt ultrarent vatten vid OD 600 = 0,05. Om celltätheten är för hög, kan nodulation hämmas. Gör nog av den utspädda suspensionen så att 100 l kan ympas på varje planta. Den grumlighet av OD 600 = 0.05 fjädring ska vara bara knappt märkbar med ögat.
6. Ympning och Tätning av mikrokosmos
- Omedelbart före början vaccinationer, kontrollera vissnade plantor som inte har överlevt övergången till Jensens medelmikrokosmos. Byt ut de plantor med färska plantor från grobarhet plattor.
- Öppna varje mikrokosmos och inokulera 100 ^ il av den lämpliga S. meliloti suspension på plantan roten. Sätt på locket och ställ åt sidan i horisontell STACks av 6-10 mikrokosmos. För vart och S. meliloti stam som skall jämföras, ympa åtminstone 15 plantor. För stammar som har subtila skillnader i symbiotisk produktivitet, inympa 30-35 plantor. Lämna minst 10 plantor oympade som en negativ kontroll. Inokulera 30-35 plantor med S. meliloti 1021 eller annan lämplig vildtypsstammen att fungera som den positiva kontrollen.
- Efter S. meliloti suspensionen har haft tid att adsorbera på rotytan och suspensionen vätska har absorberats in i ägarn (åtminstone 20 min.), linda in varje platta individuellt med paraffinfilm. Plattorna bör insvept till själva kanten av spåret, men paraffinfilmen bör inte blockera tillväxten av plantan (Figur 4C).
- Vid tiden för omslag, gör en sista kontroll för rötter fastna på insidan av locket plattan. För att ta bort vidhäftade rötter från locket, lägg plattan plant på bänken och knacka eller snärta locket för att slå rot tillbaka ner på agar surface.
- Rada upp plantan portaler för varje stapel av 6-10 tallrikar. Lay stapeln vid en 90 ° vinkel med groddplantorna pekande uppåt (Figur 4D). Klibbighet paraffinfilmen kommer att hålla plattorna på plats tillräckligt länge för att svepa hela stapeln i folie, vilket lämnar en 1-2 cm remsa oförpackade där plantorna växa (Figur 4E). Folien kommer att skydda rötterna från ljus.
- Placera folie inslagna staplar i ett tänt tillväxtkammare eller odlingsrum vid 21-25 ° C, 60-70% relativ fuktighet och 100 till 175 | imol / m -2 s -1 ljus på en mörker-cykel 16 h ljus / 8 h ( Figur 1A). Under dessa tillväxtförhållanden, förlängd inkubation vid ljusnivåer högre än 200 mikromol / m -2 s -1 kan ha en skadlig effekt på växternas tillväxt.
7. Granskning av rotsystem och kvantifiering av Symbiotiska Fenotyper
Växter kan bibehållas imikrokosmos för upp till 9 veckor.
- Knuta antal kan kvantifieras vid en serie tidpunkter efter uppackning av folien från varje stapel och räkning knölar. Utveckling av knölar på växter som inokulerats med S. meliloti 1021 vildtyp är uppenbara med 10-14 dagar efter ympning.
- Symbiotiska produktivitet kan också mätas vid varje tidpunkt genom att mäta längden på den framväxande skjuta.
- Slut kvantifiering av symbiotiska produktivitet utförs vanligtvis vid 7 veckor efter ympning genom att lossa skott och mätning av färskvikten av skott. Detta steg kan utföras så sent som 9 veckor om man önskar längre tillväxt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Beredningen och ympning av dessa plattmikrokosmos är relativt enkel jämfört med de flesta andra metoder som beskrivs i inledningen. Användning av dessa mikrokosmos tillåter också långvarig växtligheten (upp till 9 veckor) utan vattning eller näringstillskott, underhåll av rot sterilitet, både enkel undersökning av rötter och skydda rötterna från ljus, obegränsad tillväxt av växtskott, enkel tillgång till fotograferingen för längdmätning, och borttagning av växter från mikrokosmos med minimal skada på rothår. Figur 1A visar unga plantor som växer i mikrokosmos i en inkubator. Bilderna i figur 1B-1E visar flera olika vyer av mikrokosmos som innehåller M. truncatula A17 plantor ympade med vildtyp S. meliloti 1021. Om packade tätt, kommer> 220 mikrokosmos passar på en 73.8 cm x 67.5 cm inkubator hylla. Figurerna 1B och 1C visar mikrokosmos i enfolie förpackade stack med växter som dyker upp från de portaler i mikrokosmos. Figur 1D visar en enda mikrokosmos med folien bort och roten och knölar som visar genom framsidan av plattan. Figur 1E visar samma mikrokosmos liggande med växten växer fram ur portalen i plattan. Skottets längd kan mätas med utgångspunkt från uppkomst från mikrokosmos (Figur 1C) utan att störa växten. Figur 5A visar data Skottlängd för M. truncatula A17 plantor ympade med vildtyp S. meliloti 1021 jämfört med icke-inympade växter på 7 veckor och 9 veckor efter ympning. Tillväxten i mikrokosmos är perfekt för att samla en rad tidpunkter för knöl utveckling och skjuta längd. Vid den sista tidpunkt, är skotten klipps av för mätning av skjuta färskvikt (Figur 5B). Figur 6 visar exempel på 3 symbiotiska fenotyper vid 7 veckor post-inokulering. Den relativa symbiotiska produktivitet M. truncatula A17 växter som inokulerats med olika S. meliloti stammar kvantifieras genom shoot längd (figur 6A) och skjuta färskvikt (Figur 6B). Antalet rotknölar av växter som inokulerats med dessa stammar visas i figur 6C. En rosa färg på grund av produktionen av leghemoglobin visar att knölar är funktionella och kan kvävefixering, medan små vita knölar är oftast icke-funktionell och / eller avbrytas och bruna knölar är senescent och nekrotisk 14-18. Jämförelsen i fig. 6 visar att det symbiotiska produktivitet M. truncatula A17 plantor inokulerade med S. meliloti 1021 uppbär PSTB-LAFR5-exoY plasmid, som överuttrycker den ExoY undecaprenyl-fosfat galaktos fosfotransferas, är större än den för vildtypen S. meliloti 1021 och stammar som bär den negativa c ONTROL plasmid PSTB-LAFR5. Dessa ExoY över-uttryckande stammar producerar mer av det symbiotiska exopolysackarid succinoglykan än kontrollstammar. Förmågan att kvantifiera skillnader i symbiotiska fenotyper som tar flera veckor att manifestera är en stor fördel med denna metod. För alla åtgärder av symbiotisk produktivitet på M. truncatula A17, den Sinorhizobium medicae stammarna WSM419 och ABS7 prestera bättre än S. meliloti 1021 (Figurerna 6A-6C). (Uppgifterna från Figur 6 visades ursprungligen i Jones (2012) 19.) Vid den tidpunkt som mikrokosmos demonteras och skjuta nya vikter mäts, rötter kan också avbildas med mikroskopi figur. 7 visar representativa vyer av M. truncatula A17 rötter efter avlägsnande från mikrokosmos. De rothår har upplevt minimal skada eftersom rötterna ligga på ytan av ägarn och är inte upp rotade från ett horisontellt skikt av agar.
_content "> Växter kan bibehållas i upp till 9 veckor i dessa mikrokosmos, eftersom det finns ~ 70 ml agar tillväxtmedium i plattan. Efter en längre tillväxtperioder, kan vissa växter börjar torka. Sju veckors tillväxt är optimal för den symbios med S. meliloti 1021. För den mer effektiv symbios av M. truncatula A17 med S. medicae WSM419 eller S. medicae ABS7, en kortare tillväxtperiod på 4-5 veckor är optimal.| Slutlig koncentration per L | Mängd stamlösning | Stock koncentration |
| 1 g CaHPO 4 | NA | NA |
| 0,2 g MgSO 4 · 7H 2 0 | 1 ml | 0,2 g / ml |
| 0,2 g K 2 HP0 4 | 1 ml | 0,2 g / ml |
| 0,2 g NaCl | 1 ml | 0,2g / ml |
| 0,1 g FeCl 3 · 6H20 | 1 ml | 0,1 g / ml |
| 11,5 g agar-renad (se Tabell över specifika reagenser för agar specifikationer) | ||
| milliQ H 2 0 till 1 L |
Tabell 1. Jensens medel agar protokoll för plattmikrokosmos. Beredningsanvisningar för Jensens medium.
Steg:
- Lägg ovan ingredienser och blanda med en magnetisk omrörarstav.
- Autoklav 45 min, flytande cykel, med omrörare i kannan.
Anmärkning: CaHPO 4 och FeCl3 fälls ut under autoklavering. Rör om för att få dem tillbaka in fjädring, media kommer fortfarande grumlig - Svalka under omrörning tills den är inte smärtsamt att plocka upp kannan med dina bara händer.
- Tillsätt 1 ml spårämnen per L (se nedan för recept) while omröring
OBS: Se till att suspendera fällningen i spårämnen före dispensering. - Lägg till 0,25 ml 4 N NaOH per L, under omrörning.
- Kontrollera pH-värdet genom att avlägsna ~ 100 | il medium med steril pipett och applicering till pH-papper
Anm: pH 5-10 intervall papper fungerar bra. pH-värdet bör vara ~ 7 Låt ett par sekunder för full färgutveckling. Om pH-värdet inte är korrekt, kan det ha varit en förberedelse fel. - Häll ut på plattor så tjock som möjligt, remixa kolv genom att återvända till den magnetiska omrörarplatta
Obs: Om en platta är för fullt (dvs. vätskan suger upp på botten av locket),
OBS: Räkna med att få ~ 15 plåtar per liter.
Trace mineraler lager 1 L (sterilisera i autoklav)
| 1 g H 3 BO 3 |
| 1 g ZnSO 4 · 7H 2 0 |
| 0,5 g CUSO4 · 5H 2 0 |
| 0,5 g MnCl2 · 4H 2 0 |
| 1 g NaMoO 4 · 2H 2 0 |
| Mili-Q H 2 0 till 1 L |
Figur 1. Visningar av mikrokosmos som innehåller plantor inokulerade med S. meliloti 1021 A) Växter i mikrokosmos plattor växer i en inkubator. B) M. truncatula A17 plantor inokulerade med S. meliloti 1021 vildtyp växer genom skåran på toppen av Jensens agar mikrokosmos. C) Extra närbild av plattorna i B visar växter som växer genom skårorna i mikrokosmos. D) En av mikrokosmos plattorna från B och C med roten knölar avbildas genom locket. E) Plattan tillbakam D ligger plant med shoot dyker upp från skåran.
Figur 2. Frögroning plåtsammansättningen. A) Källor är fördelade över en halva av en 100 mm kvadratisk platta. B) agarytan dräneras genom att tillåta vatten att samlas på botten av en lutande platta. C) Plattorna inslagna i paraffinfilm, staplade och D) på stapeln vrids i 90 ° vinkel och insvept i folie.
Figur 3. Konstruktion av mikrokosmos genom hack Jensens plattor med en böjd spatel. A) En metall vägning spatel som har böjts för att bilda en oval är flam-uppvärmd och används till hack ett U-format hål i sidan avplattan och i sidan av locket. Den nedre delen av den U-skåra i plattan bör vara högst upp på agarytan. Den nedre delen av den U-skåran i locket bör vara hela vägen på toppen av locket. B) Byte av locket på plattan skapar en oval portal genom vilken plantan kan sticka ut.
Figur 4. Insättning av plantor i mikrokosmos. A) Två vyer visar hur den plantroten bör lägga på agarytan med hjärtbladen och ~ 0,5 cm av shoot utskjutande ut ur U-skåra i plattan. B) och C) Placera locket på plattan med skåror uppradade kommer att skapa en oval portal för plantan. Inslagning plattan tätt med paraffin film kommer att hålla locket från att röra sig och förhindra uttorkning. D) Plattorna kan sedan staplas ihop i grupper om 6-10, och E) lindade med folie. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 5. Representativa symbiotiska fenotyper efter 7 veckors tillväxt och 9 veckor tillväxten av M. truncatula A17 i enskilda mikrokosmos. A) Shoot längd plantor inokulerade med S. meliloti 1021, och skjuta längd oympade plantor uppmättes vid 7 veckor utan att ta bort växterna från mikrokosmos. Vid 9 veckor efter inokulering var shoot längd mätt (A), och sedan skjuter klipptes och vägdes (B).
. Jpg "/>
Figur 6. Representativa symbiotiska fenotyper efter 7 veckors tillväxt på M. truncatula A17 i enskilda mikrokosmos. exoY-överuttryck stammar av S. meliloti 1021 har förbättrat symbios på värdväxten Medicago truncatula A17. Den symbiotiska produktivitet S. meliloti 1021 på M. truncatula A17 förbättras i stammar som överuttrycker det undecaprenyl-fosfat galaktos fosfotransferas kodas av exoY. Symbiotiskt produktiviteten mäts som (A) Skottlängd i cm och (B) skjuta färskvikt i gram. Antalet rosa, funktionella knölar (nedre grafen bar), vit, ineffektiva knölar (mellersta grafen bar), och bruna, nekrotiska härdarna (övre grafen bar) visas i (C). Den symbiotiska produktivitet och knöl antal plantor inokulerade med S. medicae stammar WSM419 och ABS7 visas också. Asterisker över graf barer beteckna en statistiskly signifikant skillnad från 1021 vildtyp referensstam i ett oparat t-test. Växter inokulerade med en exoY :: Tn5 null mutant som inte producerar någon succinoglykan hade liknande shoot längder och färskvikt till icke-inympade växter, och producerade bara vita, ineffektiva knölar. Diagrammen i (A) och (B) var ursprungligen publicerades i 19. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 7. Rötter avbildas på en dissekera mikroskop efter avlägsnande från mikrokosmos. Kan Rötter enkelt avlägsnas från mikrokosmos för avbildning med minimal skada på rot hår, eftersom de ligger på ytan av agar. Bilder visar rötter M. truncatula A17 vid 10 dagar efter inokulering (A, B) (C). Rötterna visas ympades med S. meliloti 1021 vildtyp (A), en S. meliloti stam som bär en EGLC :: GUS fusion (B), och ett S. meliloti stam som bär en SMc00911 :: GUS fusion 20 (C). GUS-färgning av S. meliloti celler som bär SMc00911 :: GUS fusion syns på roth och rotytan i E. Bar motsvarar 100 nm. Klicka här för att visa en större bild .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det finns flera steg i protokollet som är avgörande för framgång: 1) Nödvändigheten av att använda renat, växtcellkultur testade agar kan inte nog understrykas. Detta är inte kritiskt för alfalfa plantor, men det är kritiskt för tillväxt av M. truncatula A17. 2) Det är viktigt att gro plantor på vertikala agarplattor som beskrivs i steg 1. Den utbredd teknik för groende plantor på en inverterad horisontell yta i en 15 mm djup tallrik 7 rekommenderas inte för detta protokoll eftersom plantan rötter blir för kort och / eller inte rak. Plantor med rak växande rötter 2-4 cm i längd är idealiska för överföring från grobarhet plattor till mikrokosmos. Tre dagar av tillväxt i de vertikala grobarhet plattorna vanligtvis är idealisk för rötterna att uppnå denna längd. 3) Det är också viktigt att undvika kontaminering av plantor med Rhizobia före ympning. Före överföring av plantor från grobarhet plattor till microcoSMS, ska arbetsområdet rengöras noggrant med etanol och alla instrument som används i överföringen bör vara ofta flamma steriliseras. En annan möjlig källa till kontaminering kan undvikas genom framställning av S. meliloti stam suspensioner för ympning av mikrokosmos i en separat arbetsplats från det som används för plantor beredning. Svampkontaminering av de mikrokosmos kan också undvikas genom att ta bort alla rester av fröskal från det inre av mikrokosmos, eftersom svampsporer kan vara inbäddade i pälsen. 4) Plantor överlevnad kan maximeras genom att hålla plantrötter fuktig och i kontakt med agar hela tiden, och med mycket varsam behandling under överföringen. Varje planta med roten fångade i agar till groning plattan bör skäras noggrant för att undvika skador på roten. Ett högt utbyte av livskraftiga växter kan uppnås genom att göra en sista kontroll för vissnade plantor i buntarna av mikrokosmos innan börjar vaccinationer, och ersätta dem kvickheth nya plantor. Om plantorna är i gott skick och har inte anslutit sig till insidan av locket plattan, bör mindre än 5% av plantorna behöver bytas ut i detta skede. Hindrande av skottillväxt från mikrokosmos kan förhindras genom att se till att inga rester av fröskalet är begränsande hjärtbladen och det mikrokosmos är parafilm-lindade försiktigt så att fotograferingen inte kommer att hindras.
Vi använder rutinmässigt den här metoden för att studera symbios i värdväxter M. truncatula A17 och alfalfa, och vi för närvarande att optimera tekniken för tillväxten av andra M. truncatula sorter, andra arter av Medicago och arter av Melilotus (sweetclovers). Vi har ännu inte testat denna metod med M. truncatula A20, vilket är en ekotyp som används som en genetisk kartläggning partner med A17. Vi har funnit att M. truncatula cv. R108 växer inte bra på det renade växtcellkultur testade agar som vi använder för närvarande och vi försöker hitta en annan agar beredning eller en agar-substitut för att användas som ett mikrokosmos tillväxt-substrat för denna sort.
Vid jämförelse av den metod som beskrivits här med andra vanligen förekommande metoder för analys av M. truncatula A17 / S. meliloti symbios, har vi funnit att det är den absolut bästa metoden för att samtidigt jämföra det symbiotiska prestanda för ett stort antal S. meliloti stammar. Vi rutinmässigt inrättat 250 mikrokosmos åt gången (10 olika stammar av S. meliloti ympades på 25 plantor i varje.) När endast en genotyp av S. meliloti eller S. medicae ska användas, och korskontaminering inte är en risk, kan aeroponic kassuner eller tillväxt påsar vara en lämpligare metod. Denna platta mikrokosmos metod är också den bästa metoden för att göra regelbundna observationer av progressionen av knutan utveckling och symbiotiskt produktivitet under en lång period avtid. Fenotyper som manifesteras i de senare stadierna av symbios, såsom knöl åldrande, kan studeras lättare med denna metod än med andra protokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats av USDA National Institute of livsmedel och jordbruk, jordbruk och livsmedel Research Initiative bidrag 2010 till 65.108 - 20582 till KMJ Vi tackar Brian K. Washburn för kritisk granskning av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar purified, plant cell culture-tested | Sigma | A7921 |
References
- Galibert, F., et al. The composite genome of the legume symbiont Sinorhizobium meliloti. Science. 293, 668-672 (2001).
- Young, N. D., et al. The Medicago genome provides insight into the evolution of rhizobial symbioses. Nature. 480, 520-524 (2011).
- Glazebrook, J., Walker, G. C. Genetic techniques in Rhizobium meliloti. Methods Enzymol. 204, 398-418 (1991).
- Cheng, X., Wen, J., Tadege, M., Ratet, P., Mysore, K. S. Reverse genetics in medicago truncatula using Tnt1 insertion mutants. Methods Mol Biol. 678, 179-190 (2011).
- Leigh, J. A., Signer, E. R., Walker, G. C. Exopolysaccharide-deficient mutants of Rhizobium meliloti that form ineffective nodules. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 6231-6235 (1985).
- Wong, K. K. Y., Fortin, J. A. A Petri Dish Technique for the Aseptic Synthesis of Ectomycorrhizae. Canadian Journal of Botany-Revue Canadienne De Botanique. 67, 1713-1716 (1989).
- Barker, D. G., et al. The Medicago truncatula handbook. Mathesius, U., Journet, E. P., Sumner, L. W. , (2006).
- Leonard, L. T. A Simple Assembly for Use in the Testing of Cultures of Rhizobia. J Bacteriol. 45, 523-527 (1943).
- Trung, B. C., Yoshida, S. Improvement of Leonard jar assembly for screening of effective rhizobium. Soil Sci Plant Nutr. 29, 97-100 (1983).
- Penmetsa, R. V., Cook, D. R. Production and characterization of diverse developmental mutants of Medicago truncatula. Plant Physiol. 123, 1387-1398 (2000).
- Garcia, J., Barker, D. G., Journet, E. P. The Medicago truncatula handbook. Mathesius, U., Journet, E. P., Sumner, L. W. , (2006).
- Vincent, J. M. A Manual for the Practical Study of the Root-Nodule Bacteria. , Blackwell. (1970).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1982).
- Pladys, D., Vance, C. P. Proteolysis during Development and Senescence of Effective and Plant Gene-Controlled Ineffective Alfalfa Nodules. Plant Physiology. 103, 379-384 (1993).
- Vasse, J., de Billy, F., Truchet, G. Abortion of infection during the Rhizobium meliloti-alfalfa symbiotic interaction is accompanied by a hypersensitive reaction. The Plant J. 4, 555-566 (1993).
- Johnson, L. E. B., Vance, C. P. Histological and Biochemical Comparisons of Plant Induced Ineffective Nodules. Phytopathology. 71, 884 (1981).
- Vance, C. P., Johnson, L. E. B., Hardarson, G. Histological Comparisons of Plant and Rhizobium Induced Ineffective Nodules in Alfalfa. Physiological Plant Pathology. 17, 167 (1980).
- Van de Velde, W., et al. Aging in legume symbiosis. A molecular view on nodule senescence in Medicago truncatula. Plant Physiol. 141, 711-720 (2006).
- Jones, K. M. Increased production of the exopolysaccharide succinoglycan enhances Sinorhizobium meliloti 1021 symbiosis with the host plant Medicago truncatula. J Bacteriol. 194, 4322-4331 (2012).
- Queiroux, C., et al. A comparative genomics screen identifies a Sinorhizobium meliloti 1021 sodM-like gene strongly expressed within host plant nodules. BMC Microbiol. 12, 74 (2012).
