Summary
قمنا بتطوير نموذج في المختبر الذي يحاكي عنصرا هاما من عناصر الاستجابة الالتهابية الحادة خلال العدوى من المثانة مع uropathogenic القولونية. وtransuroepithelial فحص الهجرة العدلة يتيح التقييم الكمي للهجرة العدلات الإنسان عبر المثانة ظهائر، مثقف على دعامات قابلة للاختراق، واستجابة لعدوى بكتيرية أو مواد جاذب كيميائي.
Abstract
تجنيد الخلايا المناعية من المحيط إلى موقع الالتهاب هو خطوة ضرورية في الاستجابة المناعية الفطرية في أي سطح الغشاء المخاطي. خلال العدوى في المثانة البولية، والكريات البيض النوى (السوداء؛ العدلات) ترحيل من مجرى الدم واجتياز ظهارة المثانة. الفشل في حل العدوى في حالة عدم وجود استجابة عدلة يدل على أهمية PMN في الدفاع المثانة. لتسهيل استعمار ظهارة المثانة، uropathogenic القولونية (UPEC)، العامل المسبب لغالبية التهابات المسالك البولية (عدوى المسالك البولية)، يثبط الاستجابة الالتهابية الحادة باستخدام مجموعة متنوعة من الآليات المحددة جزئيا. لمزيد من التحقيق في التفاعل بين المضيف والممرض الجرثومي، وضعنا نموذجا في المختبر من هذا الجانب من الاستجابة المناعية الفطرية لUPEC. في مقايسة transuroepithelial الهجرة العدلة، والاختلاف على غرفة بويدن والمثانة مثقف epithتزرع الخلايا الليل إلى نقطة التقاء على الجانب السفلي من دعم منفذة. يتم عزل PMN من الدم الوريدي الإنسان ويتم تطبيقها على الجانب basolateral من طبقات الخلايا الظهارية المثانة. الهجرة PMN تمثل الاتجاه basolateral-لقمية ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية في استجابة لعدوى بكتيرية أو الجزيئات جاذب كيميائي يتم تعداد باستخدام عدادة الكريات. هذا النموذج يمكن استخدامها لتحقيق التفاعل بين UPEC والخلايا حقيقية النواة وكذلك لاستجواب المتطلبات الجزيئية لاجتياز المثانة بواسطة ظهائر PMN. فإن نموذج الهجرة العدلة transuroepithelial تعزيز فهمنا للاستجابة التهابية الأولي لUPEC في المثانة.
Introduction
حركة الخلايا في جميع أنحاء الجسم، وغالبا عبر مسافات طويلة، ومطلوب من أجل النمو والتنمية، التئام الجروح، والاستجابة المناعية. الهجرة الخلية معقد ويتطلب تنسيق العديد من الإجراءات المختلفة، بما في ذلك إشارة الشلالات وإعادة ترتيب مكونات هيكل الخلية. الخلايا يمكن ان تتحرك بشكل عشوائي (تنشيط كيميائي)، وكذلك نحو التدرجات الكيميائية المحددة (الكيميائي). وقد تم تطوير العديد من التقنيات لدراسة الهجرة خلية في المختبر. توضع هذه التقنية الأقدم والأكثر شيوعا، وغرفة بويدن، يتكون من نظام من مجلسين الرأسي حيث يتم وضع مادة جاذب كيميائي في الغرفة السفلي وخلايا الفائدة في أعلى الغرفة 1. ويتم رصد حركة الخلايا عبر مرشح قابلة للاختراق، مع مسام حجم محددة، تفصل بين الغرفتين. وقد تم تطوير تقنيات إضافية لتحقيق الهجرة الخلية، بما في ذلك غرفة زيجموند 2 وغرفة دن3. وقد أسفرت هذه النهج الجماعي نظرة كبيرة في الحركة من العديد من أنواع مختلفة من الخلايا.
بالإضافة إلى استجواب المبادئ الأساسية لتنشيط كيميائي والكيميائي، والمقايسات من مجلسين سهلت التحقيق الهجرة الخلية من خلال مكونات المصفوفة خارج الخلية وكل من طبقات الخلايا البطانية والظهارية. ميزة النظم من مجلسين أكثر من غيرها من التقنيات هو أن غشاء مسامي يمكن المغلفة مع البروتينات مثل الكولاجين أو الفيبرينوجين، والهجرة الخلية عبر الجدار مثل المصفوفة خارج الخلية يمكن تقييمها. بالإضافة إلى ذلك، خطوط خلايا مستنبتة يمكن زراعتها ومتباينة على دعامات قابلة للاختراق. للتحقيق في حركة الخلايا عبر حاجز غشائي، هي المصنفة الخلايا البطانية مثقف ونمت في الخزان العلوي من دعامات قابلة للاختراق. خلايا متحركة، مثل الخلايا المناعية، تضاف إلى الخزان العلوي والهجرة إلى الخزان السفلي عبر ENويلاحظ الحاجز dothelial في القمي، لbasolateral اتجاه الفسيولوجية. وكان هذا النموذج لا تقدر بثمن في فهم التسرب من الخلايا المناعية من مجرى الدم. وعلى النقيض من transendothelial الهجرة، وحركة الخلايا عبر حاجز الظهارية يحدث عادة في الاتجاه basolateral-إلى القمي. من أجل نمذجة هذه الأحداث في المختبر، والبذور الباحثين وتنمو الخلايا الظهارية مثقف على الجانب السفلي من دعامات قابلة للاختراق. تضاف خلايا متحركة إلى الخزان العلوي والهجرة عبر حاجز الظهارية، وتمثل الاتجاه basolateral-إلى القمي، يتم رصدها. وقد ساهمت هذه النماذج من الهجرة بطريق الظهارة بشكل كبير في فهمنا للالاستجابات الالتهابية في الأسطح المخاطية، وخاصة تلك التي في الرئة والأمعاء 4،5.
في المقابل، الاتجار الخلايا المناعية من خلال ظهارة المسالك البولية تلقت اهتماما أقل بكثير. لمزيد من understandi لدينانانوغرام من الاستجابات المناعية الفطرية في المسالك البولية خلال العدوى مع uropathogenic القولونية (UPEC)، ونحن وضعت في المختبر فحص، وtransuroepithelial فحص الهجرة العدلة، التي تمكن التحقيق من النوى الكريات البيض (السوداء؛ العدلة) التنقل عبر حاجز المثانة الظهارية 6 -8. كما هو الحال مع نماذج من مجلسين أخرى من الهجرة بطريق الظهارة، وتزرع الخلايا المستزرعة المثانة الإنسان الظهارية على الجانب السفلي من دعم نفاذية وتشكل طبقات متموجة الظهارية. العدلات الإنسان، معزولة عن الدم الوريدي، يتم تطبيقها على الجانب basolateral من الطبقة الظهارية، وكميا الهجرة عبر ظهارة في الاتجاه basolateral-لقمية ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية في الاستجابة للعدوى مع سلالات مختلفة من E. كولاي أو وجود جزيئات جاذب كيميائي. وكانت أبحاث بكثير تركز على حركة العدلة، سواء تنشيط كيميائي والكيميائي، في ظل غياب أنواع الخلايا إضافية. وtransuroepithelial العدلة فحص الهجرة هو مفيد لأنه يأخذ بعين الاعتبار التفاعلات المعقدة بين الخلايا الظهارية المثانة والخلايا المناعية أثناء العدوى. هذا لين العريكة في المختبر نموذج لديه القدرة للسماح تحقيق مفصل من الاستجابات المناعية على السطوح uroepithelial.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. زراعة خلايا المثانة الظهارية 5637
نفذ الخطوات التالية في تدفق الصفحي هود الأنسجة الثقافة أعدت مع الأشعة فوق البنفسجية ومسحت أسفل مع الايثانول 70٪.
- إعداد المتوسطة RPMI-1640 تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) [وصف RPMI +]، فلتر تعقيم باستخدام فلتر 0.22 ميكرون حجم المسام، ودافئة إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي.
- ذوبان الجليد على cryovial من 5637 الخلايا (أميركية نوع كوكتيل الثقافة HTB-9؛ المستمدة من سرطان المثانة) في 37 ° C حمام الماء. بسرعة نقل الخلايا إذابة إلى 75 سم 2 الأنسجة قارورة الثقافة تحتوي على 20 مل RPMI +.
- احتضان القارورة عند 37 درجة مئوية في جو مرطب مع 5٪ CO 2 حتى الخلايا ما يقرب من 95٪ متموجة (~ 6 × 10 6 خلايا في قارورة)، حوالي 4 أيام.
- إلى ثقافة فرعية الخلايا 5637:
- إزالة المتوسطة من القارورة. غسل الخلايا مع 10 مل Dulbecco والفوسفات مخزنة سالينه (DPBS) في درجة حرارة الغرفة.
- إضافة 6 مل دافئ (37 درجة مئوية) 0.05٪ التربسين، 0.02٪ محلول EDTA إلى القارورة، واحتضان عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 لمدة 15 دقيقة.
- نقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 15 مل، وبيليه بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق. إزالة الحل التربسين / EDTA.
- resuspend الخلايا في 6 مل RPMI + (10 6 خلية / مل)، ونقل 1 مل (10 6 خلايا) إلى 75 سم 2 الجديدة قارورة تحتوي على 20 مل RPMI +.
- كرر الخطوة 1.4 إلى ثقافة فرعية الخلايا كل 4 أيام أو عندما تصل خلايا التقاء 95٪.
2. بذر وزراعة خلايا في 5637 يدعم نافذ
نفذ الخطوات التالية في نسيج الثقافة هود باستخدام تقنية العقيم. لأفضل النتائج، استخدم 5637 الخلايا التي خضعت أقل من 10 ثقافات فرعية.
- باستخدام ملقط معقم، عكس الدعم نفاذية في العقيمة 25 ملم صحن زراعة الأنسجة العميقة.
- باستخدام ماصة ميكرولتر 1،000، resuspend بلطف الخلايا في ~ 2 مل RPMI + إلى تركيز 3 × 10 6 خلية / مل، والتي تحددها خلية العد باستخدام عدادة الكريات.
- تطبيق 50 ميكرولتر من تعليق خلية (1.5 × 10 5 خلايا) إلى كل الدعم نفاذية دون لمس الغشاء. وضع غطاء على طبق، ووضع بعناية الطبق عند 37 درجة مئوية مع نسبة 5٪ CO 2 لمدة لا تتجاوز 16 ساعة.
- باستخدام ملقط معقم، والحق يدعم نفاذية في لوحة 24 أيضا تحتوي على 0.6 مل لكل بئر RPMI +. إضافة 0.1 مل RPMI + إلى الخزان العلوي من كل الدعم منفذة. احتضان عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.
- استبدال المتوسطة كل أيام 2. الأولى والمتوسطة نضح من الخزان العلوي يليه الخزان السفلي، ومن ثم تطبيق الطازجة RPMI + في ترتيب عكسي، إلى انخفاض الخزان (0.6 مل) ثم الجزء العلوي RESErvoir (0.1 مل).
- سبعة أيام بعد البذر يدعم نفاذية الخلايا مع 5637، تقييم التقاء الخلايا. ملء الخزان العلوي مع RPMI + (~ 0.35 مل). متموجة الخلايا بما فيه الكفاية عندما لا تتوازن المتوسط بين الخزانات العلوية والسفلية.
3. إعداد اللقاح البكتيري
- باستخدام تقنية العقيم، إضافة 20 مل من مرق الثقافة المناسبة لقارورة 250 مل مع غطاء. استخدام لوريا، BERTANI (LB) مرق لE. القولونية الثقافات، وإضافة المضادات الحيوية إلى مرق عند الاقتضاء.
- باستخدام التلقيح حلقة عقيمة، تطعيم المرق مع البكتيريا من مخزون الجلسرين أو لوحة متتالية. لسلالات UPEC، واحتضان ثقافة البكتيرية عند 37 درجة مئوية لمدة حوالي 16 ساعة، دون أن تهتز (لتعزيز إنتاج نوع الشعرة 1).
- نقل ثقافة البكتيرية إلى أنبوب الطرد المركزي. بيليه البكتيريا عن طريق الطرد المركزي في 8000 x ج لمدة 10 دقيقة.
- صب طاف، و resuspend البكتيريا في برنامج تلفزيوني لOD 600 = 1.000، أي ما يعادل 10 ~ 9 كفو / مل.
- لتوليد التحفيز قتلت الحرارة البكتيرية، واحتضان قسامة (على سبيل المثال ~ 1.5 × 10 8 كفو في 150 ميكرولتر) من البكتيريا معلق على 55 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. لوحة قسامة لتعليق قتلوا الحرارة لتأكيد الوفاة البكتيرية.
- فورا قبل الاستخدام، تمييع البكتيريا معلق (حية أو قتلوا الحرارة) 10 أضعاف إلى 10 8 كفو / مل في الحارة خالية من المصل RPMI [وصف RPMI] في أنبوب microfuge.
4. عزل العدلات الإنسان من الدم المحيطي
جمع الدم من المتطوعين الكبار يتطلب مراجعة والموافقة عليها مسبقا من مجلس المراجعة المؤسسية. ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة والتخلص السليم من المواد الخطرة لتجنب التعرض للدم الإنسان.
- حوالي 25 مل من الدم الوريدي من الخامس البالغين الأصحاءolunteer يجب الانتباه الى 3 الصوديوم العقيمة التي تحتوي على الهيبارين أنابيب جمع الدم عن طريق الموظفين المدربين في الفصد.
- التفاف بإحكام وقف النزف المطاط حول الذراع العليا، فوق الكوع.
- تطهير الموقع الدخول، والحفرة المرفقية، وذلك باستخدام العقيمة 70٪ كحول قضاء.
- إرفاق حامل أنبوب بلاستيكي إلى نظام فراشة إبرة المجنح.
- إدراج الإبرة في الوريد المرفقية في 30 ° زاوية أو أقل، شطبة مواجهة. الإبرة قد ثقب الوريد عند ظهور طفرة الدم في أنابيب بلاستيكية.
- إدراج أنبوب جمع الدم في حامل أنبوب بلاستيكي. عند أول أنبوب جمع هو كامل، مع استبدال أنبوب جمع الثانية. أكرر مع أنبوب ثالث.
- عندما أنبوب جمع الثالثة ما يقرب من نصف كاملة، وإزالة عاصبة.
- تغطية موقع البزل مع كرة القطن المعقم وسحب ببطء الإبرة من الوريد. حرك درعا واقيا خلال إبرة ومكان طغ بيولوجية الأدوات الحادة الحاوية.
- ممارسة الضغط على لموقع الثقب. تغطية موقع الوخز والقطن الكرة مع ضمادة لاصقة.
- عكس بلطف أنابيب جمع الدم لتفريق الهيبارين.
نفذ الخطوات التالية في نسيج الثقافة هود باستخدام تقنية العقيم.
- باستخدام ماصة 10 مل، ونقل بلطف الدم إلى 50 مل أنبوب مخروطي العقيمة الطازجة. إضافة حجم يعادل 3٪ (ث / ت) في ديكستران 0.9٪ كلوريد الصوديوم وتخلط بواسطة انقلاب. احتضان أنبوب تستقيم في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
- دون تعطيل الطبقة السفلى، ونضح بعناية الطبقة العليا وتحويلها إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل الجديد. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة. تجاهل طاف.
- resuspend الكرية خلية في حجم كلوريد الصوديوم 0.9٪ أي ما يعادل حجم الانطلاق من الدم.
- طبقة 10 مل من كثافة الحل الطرد المركزي في إطار التعليق الخلية، صحجز واجهة بين المرحلتين. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 30 دقيقة مع عدم وجود الفرامل. تجاهل طاف.
- لليز المتبقية خلايا الدم الحمراء، resuspend الكرية خلية في 10 مل الباردة 0.2٪ كلوريد الصوديوم. احتضان لمدة 30 ثانية، ثم على الفور إضافة 10 مل الباردة 1.6٪ كلوريد الصوديوم لاستعادة تساوي التوتر.
- بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 6 دقائق. تجاهل طاف.
- كرر الخطوات من 4،6-4،7 حتى يظهر بيليه الخلية لتكون خالية من خلايا الدم الحمراء، وعادة 3 جولات من تحلل.
- باستخدام ماصة ميكرولتر 1،000، resuspend الكرية الخلية، في المقام الأول PMN، في الحارة (37 درجة مئوية) RPMI إلى تركيز 10 7 خلية / مل، والتي تحددها خلية العد باستخدام عدادة الكريات. الحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية حتى الاستخدام. عادة، PMN الجدوى والنقاء هي> 99٪ وفقا لتقييم الاستبعاد التريبان الأزرق والتصور مورفولوجيا النووية بعد تلطيخ، على التوالي.
5. Transuroepithelial العدلات الهجرة وقول
نفذ الخطوات التالية في نسيج الثقافة هود باستخدام تقنية العقيم. فقط استخدام دعامات قابلة للاختراق تحمل متموجة 5637 طبقات الخلية، كما هو محدد في الخطوة 2.7. في 24 لوحات جيدة تحتوي على RPMI يمكن أن تكون معدة مسبقا والاحتفاظ بها في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 حتى الاستخدام.
- قسامة 1 مل RPMI الحارة لكل بئر في لوحة 24 جيدا، وإعداد 3 آبار في دعم منفذة.
- نضح المتوسطة من الخزانات العلوية والسفلية من دعامات قابلة للاختراق.
- باستخدام ملقط معقم، ونقل الدعم نفاذية إلى 24 لوحة جيدا أعدت في الخطوة 5.1. غسل الدعم نفاذية ثلاث مرات عن طريق نقل الدعم من بئر إلى بئر.
- إذا كان اللقاح الجرثومي هو للاستخدام، عكس الدعم نفاذية في العقيمة 25 ملم صحن زراعة الأنسجة العميقة. إذا كان جاذب كيميائي (على سبيل المثال، N-فورميل-الأرصاد-ليو-الفنيل ألانين (fMLF) أو IL-8) لاستخدامه، انتقل إلى الخطوة 5.6.
- لإجراء التجارب مع جرثومة حية أو قتلالمحفزات يريال، تطعيم الجانب قمية كل الدعم نفاذية مع 60 ميكرولتر RPMI (العدوى وهمية) أو مع اللقاح البكتيري (6 × 10 6 كفو) التي أعدت في الخطوة 3.5. وضع غطاء على طبق واحتضان عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 لمدة 1 ساعة.
- إضافة 0.6 مل RPMI لكل جيدا إلى 24 لوحة جيدا مرفق منخفضة؛ إعداد 1 جيدا في دعم منفذة. إعداد 3 آبار تحتوي على 0.5 مل RPMI لتعداد المدخلات PMN.
- إذا كان يتم استخدام جاذب كيميائي بدلا من البكتيريا، إضافة إلى 0.6 مل جاذب كيميائي RPMI في 24 لوحة جيدا أعدت في الخطوة 5.6.
- حق دعامات قابلة للاختراق في 24 لوحة جيدا مرفق منخفضة.
- إضافة 0.1 مل PMN (10 6 السوداء)، التي أعدت في الخطوة 4.9، إلى الخزان العلوي (الجانب basolateral) كل الدعم منفذة. إضافة 100 ميكرولتر PMN مباشرة إلى الآبار تحتوي على 500 ميكرولتر RPMI. احتضان عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 لمدة 1 ساعة.
- باستخدام ملقط معقم، كشط بلطفغشاء من الدعم نفاذية ضد حافة البئر لإزالة PMN إضافية من الجانب قمية ومن ثم التخلص من الدعم.
- جمع PMN عن طريق كشط بلطف أسفل كل جيدا مع 1،000 ميكرولتر ماصة الحافة، ونقل إلى تعليق PMN microfuge الأنابيب.
- تعداد PMN باستخدام عدادة الكريات.
- لحساب مجموع عدد PMN في الخزان السفلي، مضاعفة عدد PMN في 1 مم 2 (100 NL) من خلال 6،000. ويمكن الإبلاغ عن البيانات كنسبة مئوية من المدخلات PMN، أو كأرقام PMN تطبيع 6 إلى 10 المدخلات PMN.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وtransuroepithelial فحص الهجرة العدلة تمكن التقييم الكمي للهجرة PMN الإنسان عبر مثقف طبقات الخلايا الظهارية المثانة استجابة لمختلف المحفزات (الشكل 1B). في حين أن بروتوكول واضح ومباشر، وهناك عدد من المتغيرات التي يمكن أن تؤثر الهجرة PMN وبالتالي تؤثر على استنساخ هذا الاختبار. وينبغي اتخاذ تدابير أثناء إعداد دعامات قابلة للاختراق وPMN للحد من التباين بين مكررات التقنية والبيولوجية. على سبيل المثال، فقط الدعم نفاذية تحتوي على متكدسة بما فيه الكفاية 5637 طبقات الخلايا ينبغي أن تستخدم في تجربة. ويتم تقييم التقاء الخلايا 5637 باستخدام مقايسة الوظيفية التي يقيس الكتامة إلى سائل. إذا المتوسطة يضاف إلى الخزان العلوي equilibrates عبر دعم نفاذية، ثم الخلايا 5637 ليست متكدسة بما فيه الكفاية لإجراء التجربة. إذا تم الحفاظ على وحدة التخزين في الخزان العلوي، ثم permeويمكن استخدام الدعم قادرة على تقييم الهجرة PMN. قمنا بقياس المقاومة الكهربائية بطريق الظهارة في هذا النظام، والتي ترتفع بشكل متواضع على التقاء الخلايا، وإذا ما تم اختيار هذه الطريقة، ينبغي الحرص على عدم تلويث الإعداد العقيمة خلاف ذلك. التقاء الخلايا 5637 بعد 7 أيام بذر يمكن أن تتأثر بعوامل متعددة، بما في ذلك عدد مرور الخلايا وعدد الخلايا المصنفة على دعم منفذة. بالإضافة إلى ذلك، يجب أن لا يتجاوز مقدار الوقت الذي يتم تحضين الخلايا 5637 على دعم نفاذية في موقف مقلوب خلال 16 ساعة البذر (الشكل 1A). لاستنساخ الأمثل، ينبغي اتباع البروتوكول بدقة. أخيرا، ويدعم نفاذية تحتوي على طبقات الخلايا متموجة 5637 ينبغي أن تستخدم في غضون 1-2 أيام، ويجب عدم لمس الأغشية من خلال الدعم إما نمو الخلايا 5637 أو خلال transuroepithelial العدلة فحص الهجرة.
فيddition إلى الخلايا 5637، ويمكن أيضا إدخال تقلب أثناء إعداد PMN. باستخدام بروتوكول المفصلة أعلاه لعزل PMN، 1 مل من الدم البشري ينتج عادة حوالي 10 6 PMN، على الرغم من أن هذا الرقم يختلف من فرد إلى آخر. مرة واحدة ومن المعروف أن العائد نموذجية من الدم متبرع الفرد، يمكن زيادتها بروتوكول العزلة صعودا أو هبوطا وفقا لذلك. وينبغي تجنب PMN من الأفراد غير الصحية أو سوء، وينبغي أن تستخدم الجهات المانحة PMN مختلفة لمكررات البيولوجية للتأكد من أن النتائج لوحظ واستنساخه. PMN ينبغي التعامل معها بلطف وجو معقم و مطهر لتجنب التنشيط أثناء العزلة. وأخيرا، فإن توقيت الإجراءات التجريبية أمر بالغ الأهمية، كما PMN لا البقاء على قيد الحياة لفترات طويلة من الوقت مرة واحدة إزالتها من الجسم. نحن نستخدم PMN في حدود 1 ساعة من الانتهاء من إجراء العزل. ونظرا لهذه الاعتبارات، ينبغي أن تدرج على الأقل 3 مكررات التقنية في كل تكرار البيولوجية.
عددويرد PMN في الجزء الأسفل من الخزان بعد 1 ساعة في (الشكل 2) تطبيع إلى 10 6 مدخلات PMN. بدلا من ذلك، أرقام PMN يمكن مقارنة إلى الرقابة الداخلية بعد التطبيع لPMN المدخلات، والتي قد تقلل من الاختلاف بين مكررات البيولوجية. الانضمام إلى البروتوكول المشار إليها أعلاه مع الاهتمام بالتفاصيل تمكن التعداد الهجرة PMN استجابة لمحفزات بما في ذلك البكتيريا (الشكل 2A) والمواد جاذب كيميائي (الشكل 2B).
الشكل 1. التخطيطي من التصميم التجريبي. (A) هي المصنفة الخلايا الظهارية 5637 المثانة على دعامات قابلة للاختراق مقلوب، يتم تصحيحها والدعم إلى 24 لوحة جيدا، وتزرع الخلايا لالتقاء. (B) Permeaومقلوب يدعم بلي تحتوي على خلايا متكدسة 5637 والمصابين E. القولونية على الجانب قمية من الطبقات الظهارية. بدلا من ذلك، chemoattractants يمكن وضعها في الخزان السفلي. يتم تصحيحها يدعم نفاذية إلى لوحة مرفق منخفضة، ويتم تطبيقها المعزولة حديثا PMN الإنسان إلى الخزان العلوي (تمثل الجانب basolateral من الطبقات الظهارية). PMN تهاجر عبر ظهارة ويتم تعداد من الخزان السفلي باستخدام عدادة الكريات.
الشكل 2. PMN تهاجر عبر المثانة ظهائر استجابة لمختلف المحفزات. (A) مع العدوى غير إمراضية E. كولاي سلالة MG1655، MG1655 (HKMG) أو متحولة UPEC UTI89 ybcL قتلت الحرارة :: القط يثير أكثر بكثير PMN migratioن من العدوى وهمية أو الإصابة بفيروس من نوع السلالة البرية UPEC UTI89، والتهاب المثانة عزل (*، ع <0.001). (ب) إضافة fMLF (100 نانومتر) أو IL-8 (100 نانوغرام / مل) إلى انخفاض النتائج في الخزان أكثر بكثير الهجرة PMN من العلاج وهمية (*، ع <0.001). تمثل البيانات المتوسط والانحراف المعياري من لا يقل عن 3 مكررات البيولوجية. تم تحديد فروق ذات دلالة إحصائيا باستخدام اختبار (ت) لطالب في المفردة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
باستخدام خط الخلية الظهارية المثانة مثقف والمعزولة حديثا PMN الإنسان، أنشأنا نموذجا في المختبر للهجرة العدلات transuroepithelial. وكان هذا النموذج فعال في بداية لتشريح تعقيدات الاستجابة المناعية الفطرية أثناء التهاب المسالك البولية (UTI)، وهو عدوى بكتيرية شائعة جدا تسبب عادة عن طريق UPEC 9. خلال العدوى في المثانة، أو التهاب المثانة، وتجنيد PMN إلى التجويف المثانة أمر ضروري لإزالة البكتيريا 10. لإيجاد موطئ قدم لها في مواجهة استجابة التهابية، UPEC تأخير وصول PMN إلى المثانة، الذي يطيل الفترة التي يمكن أن تغزو UPEC ظهارة المثانة في غياب المناعة ضغط 6،11. هذا النمط الظاهري، وقمع الهجرة PMN بواسطة UPEC في نقاط زمنية في وقت مبكر، لوحظ في نموذجنا في المختبر الهجرة PMN transuroepithelial. عدوى غير إمراضية E. يتسبب القولونية MG1655الأهم من الهجرة PMN من الإصابة بفيروس uropathogenic E. القولونية UTI89 (الشكل 2A)؛ حالات عدوى متزامنة مع MG1655 وUTI89 ينتج النمط الظاهري uropathogenic (أي مستويات منخفضة من الهجرة السوداء) 6. وعلاوة على ذلك، حددنا بروتين UPEC، YbcL، الذي يسهم في النمط الظاهري القمعية، كما أدى حذف ybcL في أكثر بكثير PMN في الخزان أقل بالمقارنة مع من النوع البري UTI89 (الشكل 2A) 7. وأثارت مستويات عالية من الهجرة PMN أيضا قتلت الحرارة MG1655، fMLF وIL-8 (أرقام 2A وباء). بالمقارنة مع العدوى البكتيرية مع التحفيز الحية، واستخدام chemoattractants قد تبسيط كل من بروتوكول التجريبية وتفسير النتائج. فمن المرجح أن chemoattractants الأخرى (مثل المنتجات البكتيرية أو كيموكينات) من شأنه أيضا أن تثير PMN في هذا النموذج. حتى الآن، وtransuroepithelial العدلة الحمار الهجرةوقد سهلت المنعم يوسف التحقيقات في قمع استجابة التهابية في وقت مبكر عن طريق UPEC، وكشف عن الظواهر التي تم التحقق منها في الجسم الحي النماذج 6-8، وستكون أداة لا تقدر بثمن في مساعيه المستقبلية.
في حين أن هذا الفحص لديه القدرة على معالجة عدد من المسائل، وهناك عدد قليل من القيود. نظرا لعدد من المتغيرات الملازمة لهذا الاختبار، يجب توخي الحذر أثناء إعداد وإجراء التجارب لضمان التكاثر بين مكررات. تعداد PMN بواسطة العد هو عرضة للخطأ، والعد يمكن أن يكون الوقت مكثفة وPMN قصيرة الأجل مرة واحدة إزالتها من الجسم، وخصوصا في وجود البكتيريا. سوف تقليل الوقت بين PMN جمع العينات وPMN التعداد يؤدي إلى جمع بيانات أكثر دقة. ووصف الباحثون فحوصات اللونية التي تقيس الميلوبيروكسيداز (MPO) نشاط انزيم كبديل للPMN 12،13. المقايسات استخدام ركائز اللونية مثل 3،3 و# 39؛، 5،5 '،-tetramethylbenzidine (TMB) أو 2،2'-azino مكرر (3 ethylbenzothiazoline-6-السلفونيك حمض) (ABTS) ليست حساسة بما فيه الكفاية للكشف عن تركيزات PMN موجودة في انخفاض الخزانات باستخدام بروتوكول transuroepithelial الهجرة العدلة المفصلة أعلاه (لاو وHunstad، بيانات غير منشورة). يمكن التلاعب المعلمات للمقايسة الهجرة لزيادة كثافة PMN في الجزء الأسفل من عينات الخزان. بدلا من ذلك، مقايسة MPO مع حساسية أكبر، ويحتمل أن تستخدم ركيزة الفلورسنت، ويمكن إنشاء. قياس النشاط MPO يمثل بديلا لPMN العد والتعداد قد تمكن أكثر دقة من PMN في الجزء الأسفل من عينات الخزان. بالإضافة إلى ذلك، قد مثل هذا الفحص أيضا السماح تعداد PMN تمسكا الطبقات الظهارية والمتبقية في الخزان العلوي. ومن شأن البروتوكول استنادا MPO-المصادق تمثل أداة قوية التي يمكن أن يتوسع في مقدار ونوع البيانات التي يمكن جمعها من transuroepithelial العدلة فحص الهجرة.
بطريق الظهارة المقايسات الهجرة العدلة نمذجة الاستجابة المناعية الفطرية في الجهاز الهضمي والرئة على نطاق واسع، وهي المسؤولة عن الفهم الحالي لاجتياز الحواجز الظهارية بواسطة PMN 4،5 دينا. في المقابل، تلقت حركة PMN عبر الحواجز uroepithelial اهتماما أقل بكثير. وأفادت حفظ والزملاء نموذجا يستخدم ظهارة الاستقطاب يتألف من خلايا UROtsa متباينة، خط خلية خلد المستمدة من الأنسجة الحالب، ونمت إلى نقطة التقاء على نفاذية يدعم 14. وأفادت Agace وزملاؤه استخدام المثانة غير متمايزة (J82) والكلى (A498) الخلايا الظهارية في نموذج مماثل 15. في نموذج الهجرة العدلة transuroepithelial المفصلة هنا، على الرغم من طبقات الخلايا 5637 ليست طبقية، ومن المرجح ألا الاستقطاب رسميا، وشكلت منعطفات ضيقة، المقررة من قبل الكتامة إلى الجزيئاتتدفق والتعبير وتوطين البروتينات مفرق ضيق (لاو وHunstad، بيانات غير منشورة). من المذكرة، وطبقة الظهارية يحافظ أيضا مثل الكتامة خلال ظروف الإصابة التي وصفناها. البروتوكولات التي أبلغ عنها وحفظ Agace نموذج الاستجابة الالتهابية بعد الإصابة مع UPEC يعزل لمدة 24 ساعة. في هذه النماذج، UPEC انتزاع الهجرة PMN قوية. في المقابل، تتعرض الطبقات الظهارية في نموذجنا لUPEC لفترة قصيرة نسبيا من الزمن، 1 ساعة، من أجل دراسة التفاعلات الأولية بين المضيف والممرض. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام خط الخلية الظهارية المثانة والتهاب المثانة UPEC المستمدة عزل تمكن من ترجمة إمكانات في المختبر النتائج إلى نموذج الفئران التهاب المثانة 16. وأخيرا، فإن الدراسات المذكورة أعلاه تستخدم دعامات كبيرة نفاذية التي تتطلب 6 جيدا الأطباق زراعة الأنسجة. استخدام دعامات قابلة للاختراق أصغر، كما في نموذجنا، ويقلل من استخدام كاشف ويزيد عدد إدراجق التي يمكن التلاعب بها في التجربة. على الرغم من أن كل واحد من هذه النظم نموذج مزاياه وعيوبه، وإمكانات الجماعية من هذه النماذج لتحديد الأحداث المطلوبة للهجرة PMN إلى أنسجة المسالك البولية كبير.
على الرغم من أن أقل مفهومة جيدا من الهجرة عبر الحواجز البطانية، تلقت مرور عبر الجهاز الهضمي PMN والحواجز الظهارية الرئوي بكثير الدراسة 4،5. وقد كشفت نماذج الهجرة العدلة بطريق الظهارة التي توظف الدعم وقابلة للاختراق الخلايا الظهارية مثقف بعض الأحداث إشارات وجزيئات الالتصاق المشاركة في حركة PMN من خلال هذه ظهائر. الدراسات الأولية باستخدام الخلايا الظهارية البولية مثقف تشير إلى تورط التصاق بين الخلايا جزيء-1 (ICAM-1) وCD11b/CD18-β إنتغرين (ماك 1) في الهجرة PMN عبر الأنسجة البولية 15. ومن غير الواضح ما الذي تشارك مسارات إشارات إضافية والجزيئات اللاصقةفي هذه العمليات المعقدة في المسالك البولية. باستخدام نموذج الهجرة العدلة transuroepithelial الموصوفة هنا، وربما مع زيادة الفحص المجهري 14،15، هذه الأسئلة الأساسية وغيرها الكثير يمكن استجوابه. بالإضافة إلى ذلك، جنبا إلى جنب مع علم الوراثة البكتيرية، وهذا النموذج يمكن استخدامه لمزيد من تقييم الظواهر الممرض محددة مثل قمع الهجرة PMN بواسطة UPEC. من غير الواضح عند هذه النقطة في عملية متعددة الخطوات الهجرة PMN UPEC يمارس تأثيره القمعية. أيضا، لم يتم بعد توضيح الآلية التي يؤثر YbcL الهجرة PMN. من خلال فهم أول المتطلبات الأساسية لمرور PMN عبر ظهارة المثانة، ثم يمكننا أن نبدأ في بحث كيفية UPEC تعالج هذه العمليات لتسهيل المرض.
باختصار، في حين توجد العديد من التقنيات لدراسة حركة الخلايا، تتوفر لاستجواب الهجرة الخلية عبر الحواجز الخلوية نهج أقل. Modificatioكانت نانوثانية إلى غرفة بويدن جزءا لا يتجزأ من التحقيق الهجرة الخلية عبر الحواجز البطانية والظهارية. ولين العريكة في المختبر نموذج للاستجابة التهابية حادة في المسالك البولية، مثل transuroepithelial فحص الهجرة العدلة المفصلة هنا، هو أداة قيمة لاستجواب هذه العمليات المعقدة. أخيرا، يمكن إدخال تعديلات على هذا الاختبار تسهيل التحقيقات في الحالات المرضية الأخرى في المسالك البولية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
والكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIH) يمنح R01-P50-DK080752 وDK064540. نشكر J. Loughman لجهودها في إنشاء هذا الاختبار.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transwell Inserts (i.e. permeable supports) | Corning | 3472 | 6.5 mm, 3 μm pore, polyester membrane insert |
| BD Vacutainer Blood Collection Tubes | Becton, Dickinson and Company (BD) | 366480 | 16 mm x 100 mm x 10 ml green cap tubes containing sodium heparin |
| BD Safety-Lok Blood Collection and Infusion Set | Becton, Dickinson and Company (BD) | 367281 | 21 G x 0.75 in needle x 12 in tubing |
| BD Vacutainer one-use, nonstackable holder | Becton, Dickinson and Company (BD) | 364815 | |
| Dextran | Sigma-Aldrich | D4876 | From Leuconostoc mesenteroides |
| Ficoll-Paque PLUS density centrifugation solution | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Ultra-Low Attachment Plates | Corning | 3473 | 24-well, clear flat bottom |
| N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLF) | Sigma-Aldrich | F3506 | Reconstituted in DMSO to 10 mM |
| Recombinant Human CXCL8/IL-8 | R&D Systems | 208-IL | Reconstituted in PBS to 100 μg/ml |
References
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
- Zigmond, S. H. Orientation chamber in chemotaxis. Methods Enzymol. 162, 65-72 (1988).
- Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. A new direct-viewing chemotaxis chamber. J. Cell Sci. 99 (Pt. 4), 769-775 (1991).
- Chin, A. C., Parkos, C. A. Pathobiology of neutrophil transepithelial migration: implications in mediating epithelial injury. Annu. Rev. Pathol. 2, 111-143 (2007).
- Zemans, R. L., Colgan, S. P., Downey, G. P. Transepithelial migration of neutrophils: mechanisms and implications for acute lung injury. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 40, 519-535 (2009).
- Loughman, J. A., Hunstad, D. A. Attenuation of human neutrophil migration and function by uropathogenic bacteria. Microbes Infect. 13, 555-565 (2011).
- Lau, M. E., Loughman, J. A., Hunstad, D. A. YbcL of uropathogenic Escherichia coli suppresses transepithelial neutrophil migration. Infect. Immun. 80, 4123-4132 (2012).
- Loughman, J. A., Hunstad, D. A. Induction of indoleamine 2,3-dioxygenase by uropathogenic bacteria attenuates innate responses to epithelial infection. J. Infect. Dis. 205, 1830-1839 (2012).
- Foxman, B. The epidemiology of urinary tract infection. Nat. Rev. Urol. 7, 653-660 (1038).
- Haraoka, M., et al. Neutrophil recruitment and resistance to urinary tract infection. J. Infect. Dis. 180, 1220-1229 (1999).
- Billips, B. K., et al. Modulation of host innate immune response in the bladder by uropathogenic Escherichia coli. Infect. Immun. 75, 5353-5360 (2007).
- Bozeman, P. M., Learn, D. B., Thomas, E. L. Assay of the human leukocyte enzymes myeloperoxidase and eosinophil peroxidase. J. Immunol. Methods. 126, 125-133 (1990).
- Lee, W. Y., Chin, A. C., Voss, S., Parkos, C. A. In vitro neutrophil transepithelial migration. Methods Mol. Biol. 341, 205-215 (2006).
- Säve, S., Mohlin, C., Vumma, R., Persson, K. Activation of adenosine A2A receptors inhibits neutrophil transuroepithelial migration. Infect. Immun. 79, 3431-3437 (2011).
- Agace, W. W., Patarroyo, M., Svensson, M., Carlemalm, E., Svanborg, C. Escherichia coli induces transuroepithelial neutrophil migration by an intercellular adhesion molecule-1-dependent mechanism. Infect. Immun. 63, 4054-4062 (1995).
- Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. A murine model of urinary tract infection. Nat. Protoc. 4, 1230-1243 (2009).
