Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Количественная оценка миграции нейтрофилов человека во культурный мочевого эпителия

Published: November 7, 2013 doi: 10.3791/50919
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Pediatrics, Washington University School of Medicine, 2Department of Molecular Microbiology, Washington University School of Medicine

Summary

Мы разработали модель в пробирке, который имитирует важный компонент острой воспалительной реакции во время инфекции мочевого пузыря с уропатогенных кишечной палочки. Transuroepithelial миграции нейтрофилов анализ позволяет количественно оценить человеческие миграции нейтрофилов через эпителий мочевого пузыря, культивировали на проницаемыми опор, в ответ на бактериальной инфекции или хемоаттрактант веществ.

Abstract

Вербовка иммунных клеток от периферии к месту воспаления является важным шагом в врожденного иммунного ответа на любой поверхности слизистой оболочки. Во время инфекции мочевого пузыря, полиморфноядерных лейкоцитов (ПМН; нейтрофилы) мигрируют из крови и пройдите через эпителий мочевого пузыря. Неспособность решить инфекции в отсутствие нейтрофильного ответ демонстрирует важность ПМН в защиту мочевого пузыря. Для облегчения колонизацию эпителия пузыря, уропатогенных кишечной палочки (УПЭК), возбудителем большинства инфекций мочевыводящих путей (ИМП), смочить острую воспалительную реакцию, используя различные частично определенных механизмов. Для дальнейшего исследования взаимосвязи между хостом и бактериальным патогеном, мы разработали модель в пробирке этого аспекта врожденного иммунного ответа к УПЭК. В transuroepithelial нейтрофилов анализа миграции, вариация на камеры Бойдена, культивируют epith мочевого пузыряelial клетки выращивают до слияния на нижней стороне проницаемой поддержки. PMN изолированы от венозной крови человека и применяются к базолатеральной стороне слоев эпителиальных клеток мочевого пузыря. PMN миграция, представляющая соответствующие физиологически базолатеральной к апикальной-направление в ответ на бактериальной инфекции или хемоаттрактант молекул перечисленных помощью гемоцитометра. Эта модель может быть использована для исследования взаимодействия между УПЭК и эукариотических клеток, а также допросить молекулярные требования к обхода эпителия мочевого пузыря по ПМН. Transuroepithelial миграции нейтрофилов модель будет углубить наше понимание начальной воспалительной реакции на УПЭК в мочевом пузыре.

Introduction

Движение клеток по всему организму, часто на большие расстояния, требуется для роста и развития, заживления ран и иммунного ответа. Миграция клеток является сложным и требует координации различных процессов, в том числе сигнальных каскадов и перестройка компонентов цитоскелета. Клетки могут двигаться случайным образом (хемокинез), а также к определенных химических градиентов (хемотаксиса). Многие методы были разработаны для изучения миграции клеток в пробирке. Самый старый и наиболее распространенный метод, камера Бойден, состоит из вертикального двухпалатной системы, где хемоаттрактант вещество помещается в нижнюю камеру и клеток, представляющих интерес размещены в верхней камере 1. Движение клеток через проницаемый фильтр с порами определенного размера, отделяя две камеры контролируется. Дополнительные методы были разработаны, чтобы исследовать миграцию клеток, в том числе камеры Zigmond 2 и камерой Dunn3. Эти коллективные подходы дали значительно углубить понимание движения различных типов клеток.

В дополнение к опрашивая основные принципы хемокинез и хемотаксис, двухкамерные анализы способствовали исследование миграции клеток через компонентами внеклеточного матрикса, и оба эндотелиальных и эпителиальных слоев клеток. Преимущество двухкамерных систем по сравнению с другими методами является то, что пористая мембрана может быть покрыта белков, таких как коллаген или фибриногена и миграции клеток через внеклеточного матрикса, как барьер может быть оценена. Кроме того, культивируемые клеточные линии могут быть выращены и дифференцированы на проницаемых опор. Чтобы исследовать движение клеток через барьер эндотелиальных, культивируемые эндотелиальные клетки высевают и выращивают в верхний резервуар проницаемых опор. Подвижные клетки, такие как клетки иммунной системы, будут добавлены в верхний резервуар и миграции в нижний резервуар через анэндотелиальных барьер в физиологическом направлении верхушечный-на-базолатеральная наблюдается. Эта модель была неоценима в понимании экстравазацию иммунных клеток из крови. В отличие от трансэндотелиальной миграцию, движение клеток через эпителиальный барьер обычно происходит в базолатеральной к апикальной-направлении. Для моделирования этих событий в пробирке, исследователи семян и растут культивируемых эпителиальных клеток на нижней проницаемых опор. Подвижных клеток добавляют в верхний резервуар и миграции через эпителиальный барьер, представляющий базолатеральной к апикальной направлении, находится под контролем. Такие модели трансэпителиальной миграции внесли значительный вклад в наше понимание воспалительных реакций в слизистых поверхностях, особенно легких и кишки 4,5.

В противоположность этому, оборот иммунных клеток через эпителий мочевых путей получила гораздо меньше внимания. Чтобы углубить наше understandiнг врожденных иммунных реакций в мочевых путях во время инфекции с уропатогенных кишечной палочки (УПЭК), мы разработали анализ в пробирке, transuroepithelial миграции нейтрофилов анализ, который позволяет исследовать полиморфноядерных лейкоцитов (ПМН; нейтрофилов) движение через эпителия мочевого пузыря барьер 6 -8. Как и с другими двухкамерных моделей трансэпителиальной миграции, культивированные эпителиальных клеток мочевого пузыря человека выращивают на нижней стороне проницаемой поддержки и образуют сливные эпителиальных слоев. Нейтрофилы человека, выделенные из венозной крови, применяются к базолатеральной стороне эпителиального пласта и миграции через эпителий в физиологически соответствующего базолатеральной к апикальной-направлении количественно в ответ на инфицирование различных штаммов Е. палочки или присутствие хемоаттрактант молекул. Многие исследования были сосредоточены на движения нейтрофилов, как хемокинез и хемотаксис, в отсутствие дополнительных типов клеток. Transuroepithelial миграции нейтрофилов анализ является предпочтительным, поскольку он учитывает сложные взаимодействия между эпителиальных клеток мочевого пузыря и иммунных клеток во время инфекции. Это послушный модель в пробирке имеет потенциал, чтобы разрешить детальное исследование иммунного ответа на uroepithelial поверхностей.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Культивирование 5637 эпителиальных клеток мочевого пузыря

Выполните следующие шаги в ламинарного потока ткани капот культуры, приготовленной с УФ-облучения и протереть 70% этанола.

  1. Подготовка RPMI-1640, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) [называют RPMI +], фильтр стерилизуют, используя 0,22 мкм размер пор фильтра с, и тепло до 37 ° C в водяной бане.
  2. Оттепель криопробирку из 5637 клеток (American Type Culture Collection НТВ-9; происходит от рака мочевого пузыря) в водяной бане при 37 °. Быстро передавать размороженные клетки в тканевой культуральной колбы 75 см 2, содержащей 20 мл RPMI +.
  3. Инкубируйте колбы при 37 ° С в увлажненной атмосфере с 5% CO 2 пока клетки, примерно 95% сливной (~ 6 × 10 6 клеток на колбу), 4 дней.
  4. Для субкультуры 5637 клеток:
    1. Извлеките носитель из колбы. Вымойте клетки с 10 мл Дульбекко фосфатным буфером Салине (DPBS) при комнатной температуре.
    2. Добавить 6 мл теплой (37 ° С) 0,05% трипсина, 0,02% ЭДТА в колбу, и инкубируют при 37 ° С с 5% CO 2 в течение 15 мин.
    3. Передача клеток в 15 мл коническую пробирку, и гранулу центрифугированием при 300 х г в течение 5 мин. Снимите трипсин / ЭДТА решение.
    4. Ресуспендируют клеток в 6 мл RPMI + (10 6 клеток / мл) и передачи 1 мл (10 6 клеток) к новому 75 см 2 колбу, содержащую 20 мл RPMI +.
  5. Повторите шаг 1,4 к субкультура клетки каждые 4 дня или когда клетки достигают 95% слияния.

2. Сеялки и растущий 5637 Ячейки проницаемых Поддерживает

Выполните следующие шаги в капот культуры ткани с помощью асептической техники. Для получения оптимальных результатов используйте 5637 клеток, которые подверглись менее 10 субкультур.

  1. Использование стерильного пинцета, инвертировать проницаемые опоры в стерильной 25 мм культуры глубоких тканей блюдо.
    2. 2 колбу 5637 клеток на 95% слияния в соответствии с шагами 1.4.1-1.4.3.
  2. Использование 1000 мкл пипетки осторожно ресуспендирования клеток в ~ 2 мл RPMI + до концентрации 3 × 10 6 клеток / мл, определяемых в расчете клетки с помощью гемоцитометра.
  3. Применить 50 мкл клеточной суспензии (1,5 х 10 5 клеток) к каждому проницаемой поддержки, не касаясь мембрану. Поместите крышку на блюдо и осторожно поместите блюдо при 37 ° С с 5% CO 2 в течение не более 16 часов.
  4. Использование стерильного пинцета, право проницаемые опоры в 24-луночный планшет, содержащий 0,6 мл RPMI + на лунку. Добавить 0,1 мл RPMI + в верхний резервуар каждой проницаемой поддержки. Инкубируют при 37 ° С с 5% CO 2.
  5. Замените среду каждые 2 дня. Во-первых, аспирации среды из верхнего резервуара с последующим нижним резервуаром, а затем применить свежий RPMI + в обратном порядке, в нижний резервуар (0,6 мл) и затем верхний Reservoir (0,1 мл).
  6. Через семь дней после посева проницаемые опоры с 5637 клеток, оценивать слияния клеток. Заполните верхний резервуар с RPMI + (~ 0,35 мл). Клетки достаточно сливающийся, когда среда не в равновесие между верхним и нижним резервуарами.

3. Приготовление бактериального инокулята

  1. С помощью асептической техники, добавляют 20 мл соответствующей культуральной жидкости в колбу на 250 мл с крышкой. Используйте Лурия-Бертани (LB) бульон для Е. палочки культур и добавить антибиотики в бульон при необходимости.
  2. Используя стерильный инокуляционную петлю, привить бульон с бактериями из глицерина складе или разводов пластины. Для штаммов УПЭК, инкубировать бактериальной культуры при 37 ° С в течение примерно 16 ч, без встряхивания (содействовать производство типа 1 пили).
  3. Передача бактериальной культуры в центрифужную пробирку. Гранул бактерий центрифугированием при 8000 х г в течение 10 мин.
  4. Слейте супернатантИ ресуспендируют в PBS бактерий к OD 600 = 1,000, что соответствует ~ 10 9 КОЕ / мл.
    1. Для генерации убитых нагреванием бактерий стимул, инкубировать аликвоту (например, ~ 1,5 × 10 8 КОЕ в 150 мкл) ресуспендировали бактерий при 55 ° С в течение 30 мин. Пластинчатый аликвоту убитых нагреванием суспензии бактерий для подтверждения смерти.
  5. Непосредственно перед использованием разбавить ресуспендировали бактерии (живые или убитых нагреванием) в 10 раз до 10 8 КОЕ / мл в теплой бессывороточной среде RPMI [называют RPMI-] в пробирке.

4. Выделение нейтрофилов человека из периферической крови

Сбор крови от взрослых добровольцев требует предварительного рассмотрения и согласования с этическими комитетами. Носите соответствующие средства индивидуальной защиты и правильно распоряжаться опасных материалов, чтобы избежать контакта с человеческой кровью.

  1. Примерно 25 мл венозной крови от здорового взрослого Volunteer должны быть вовлечены в 3 стерильных гепарина содержащих сбора крови труб натрия сотрудниками подготовку в кровопускания.
    1. Плотно оберните резиновую жгут вокруг плеча, выше локтя.
    2. Лечить сайт въезд, локтевой ямки, с помощью стерильного 70% спиртом протереть.
    3. Прикрепите пластиковый держатель трубки для крылатого системы бабочка иглы.
    4. Вставьте иглу в локтевой вены под углом 30 ° или менее, скос вверх. Игла проколол вену, когда рывок крови появляется в пластиковой трубки.
    5. Вставьте пробирку для сбора крови в держатель пластиковой трубки. Когда первый комплект камера заполнена, замените второй пробирку. Повторите с третьей трубкой.
    6. Когда третий комплект камера примерно наполовину, снимите жгут.
    7. Накройте место прокола стерильным ватным тампоном и медленно извлеките иглу из вены. Наденьте защитный щит над иглой и место, которое япа биологической контейнер для острых предметов.
    8. Надавите на месте прокола. Накройте месте прокола и ватным тампоном с клеевой повязка.
    9. Аккуратно переверните пробирки для сбора крови, чтобы рассеять гепарин.

Выполните следующие шаги в капот культуры ткани с помощью асептической техники.

  1. Использование 10 мл пипетку осторожно переносить кровь в свежем, стерильные 50 мл коническую пробирку. Добавить эквивалентный объем 3% (вес / объем) декстран в 0,9% NaCl и перемешивают при инверсии. Инкубируйте пробирку вертикально при комнатной температуре в течение 20 мин.
  2. Без нарушения нижний слой, тщательно аспирации верхний слой и перенести его на новый 50 мл коническую трубку. Гранул клетки центрифугированием при 300 х г в течение 10 мин. Удалите супернатант.
  3. Ресуспендируют осадок клеток в объеме 0,9% NaCl эквивалент исходного объема крови.
  4. Слой 10 мл раствора центрифугирования плотности под клеточной суспензии, составляя за собой интерфейс между двумя фазами. Центрифуга при 400 х г в течение 30 мин, без тормоза. Удалите супернатант.
  5. Для лизиса оставшихся эритроцитов, ресуспендируют осадок клеток в 10 мл холодной 0,2% NaCl. Инкубировать в течение 30 сек, а затем быстро добавляют 10 мл холодной 1,6% NaCl для восстановления изотоничности.
  6. Гранул клетки центрифугированием при 300 х г в течение 6 мин. Удалите супернатант.
  7. Повторите шаги 4.6-4.7, пока осадок клеток не появится, чтобы быть свободным от красных кровяных клеток, как правило, 3 раундов лизиса.
  8. Использование 1000 мкл пипетки, ресуспендируют осадок клеток, в первую очередь ПМН, в теплой (37 ° С) в среде RPMI-концентрации 10 7 клеток / мл, определяемой клеток подсчет с помощью гемоцитометра. Хранить клетки при 37 ° С до использования. Как правило, ПМН жизнеспособность и чистота> 99% по оценке трипанового синего и визуализации ядерной морфологии после окрашивания, соответственно.

5. Transuroepithelial миграции нейтрофилов Каксказать

Выполните следующие шаги в капот культуры ткани с помощью асептической техники. Используйте только проницаемые опоры подшипников сливные 5637 слоев клеток, как определено на этапе 2.7. 24-луночные планшеты, содержащие RPMI-, могут быть получены заранее и выдерживают при 37 ° С с 5% CO 2 до использования.

  1. Алиготе 1 мл согреть RPMI-на лунку в 24-луночный планшет, приготовьте 3 скважины на проницаемой поддержки.
  2. Аспирируйте среды из верхних и нижних резервуаров проницаемых опор.
  3. Использование стерильного пинцета, передавать проницаемые опоры в 24-луночный планшет, полученного на стадии 5.1. Промыть проницаемой поддерживает три раза путем переноса опоры от скважины к скважине.
  4. Если бактериального инокулята должен быть использован, инвертировать проницаемые опоры в стерильной культуре 25 мм глубоких тканей блюдо. Если хемоаттрактант (например, N-формил-Met-Leu-Phe (fMLF) или IL-8) должен быть использован, перейти к этапу 5.6.
  5. Для экспериментов с живой или убитой BactПерс стимулы, привить апикальной стороне каждой проницаемой поддержки с 60 мкл RPMI-(макет инфекция) или с бактериальной посевного (6 х 10 6 КОЕ), полученного на стадии 3.5. Поместите крышку на блюдо и инкубировать при 37 ° С с 5% CO 2 в течение 1 часа.
  6. Добавить 0,6 мл RPMI-на лунку в 24-луночный низкой монтажной пластине; подготовить один за хорошо проницаемой поддержки. Подготовьте 3 лунки, содержащие 0,5 мл RPMI-перечислить вход ПМН.
    1. Если хемоаттрактант используется вместо бактерий, добавьте хемоаттрактант в 0,6 мл RPMI-в 24-луночный планшет, полученного на стадии 5.6.
  7. Справа проницаемые опоры в 24-а с низким уровнем монтажной пластине.
  8. Добавить 0,1 мл ПМН (10 6 ПМН), полученного на стадии 4.9, в верхний резервуар (базолатеральная сторона) каждого проницаемой поддержки. Добавить 100 мкл ПМН непосредственно в лунки, содержащие 500 мкл RPMI-. Инкубируют при 37 ° С с 5% CO 2 в течение 1 часа.
  9. Использование стерильного пинцета, мягко очиститьМембрана из проницаемого по отношению к поддержке край колодца, чтобы удалить дополнительный ПМН от апикальной стороне, а затем утилизировать поддержки.
  10. Сбор ПМН, осторожно очищая дно каждой лунки с кончика пипетки 1000 мкл, и передавать PMN суспензий в микроцентрифужные пробирки.
  11. Перечислять ПМН помощью гемоцитометра.
  12. Для расчета общего количества ПМН в нижний резервуар, умножьте количество ПМН в 1 мм 2 (100 NL) на 6000. Данные могут быть представлены в виде процента от входного PMN, или как число PMN нормализованы до 10 входного 6 PMN.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Transuroepithelial миграции нейтрофилов анализ позволяет количественно оценить человеческие PMN миграции через культивируемых слоев мочевого пузыря эпителиальных клеток в ответ на различные стимулы (рис. 1б). В то время как протокол является простым, существует ряд переменных, которые могут влиять PMN миграцию и, следовательно, влияют на воспроизводимость этого анализа. Должны быть приняты меры при подготовке проницаемые опоры и ПМН, чтобы уменьшить изменчивость между техническими и биологических повторяет. Например, только проницаемые носители, содержащие достаточно сливной 5637 клеточные слои должны быть использованы в эксперименте. Слияние из 5637 клеток оценивали с помощью функциональный анализ, который измеряет непроницаемость для жидкости. Если средний добавлены в верхний резервуар уравновешивает через проницаемую поддержки, то 5637 клетки не являются достаточно сливной проводить эксперимент. Если объем в верхний резервуар поддерживается, то пронивозможность поддержки может быть использована для оценки PMN миграции. Мы измерили трансэпителиальный электрическое сопротивление в этой системе, которая поднимается скромно на слиянии клеток; если этот метод будет выбран, следует позаботиться, чтобы не загрязнить иначе стерильную установки. Слияние из 5637 клеток через 7 дней после посева может зависеть от множества факторов, в том числе числом пассажей клеток и количество клеток, посеянных на проницаемой поддержки. Кроме того, количество времени, которое в 5637 Клетки инкубируют на проницаемой поддержки в перевернутом положении во время посева не должна превышать 16 часов (рис. 1а). Для оптимальной воспроизводимости, протокол должен строго выполняться. Наконец, проницаемые носители, содержащие сливающийся 5637 слоев клеток следует использовать в течение 1-2 дней, а мембраны опор никогда не должны быть затронуты во время или роста 5637 клеток или во время transuroepithelial нейтрофилов анализа миграции.

Вddition на 5637 клеток, изменчивость также могут быть введены в процессе подготовки PMN. Использование протокола, подробно описанную выше, чтобы изолировать ПМН, 1 мл крови человека, как правило, дает около 10 6 ПМН, хотя это число варьируется от человека к человеку. После того как типичный выход крови отдельного донора, как известно, протокол изоляция может быть увеличен или уменьшен соответственно. PMN из нездоровых или больных людей следует избегать, и различные доноры PMN должны использоваться для биологических повторяет чтобы гарантировать, что результаты, наблюдаемые воспроизводимы. ПМН следует обращаться осторожно и в асептических условиях, чтобы избежать активации в процессе выделения. Наконец, выбор времени экспериментальных процедур имеет решающее значение, так как PMN не выживают в течение длительных периодов времени после удаления из организма. Мы используем ПМН в течение 1 часа прохождения процедуры изоляции. С учетом этих соображений, по крайней мере, три повторности технические должны быть включены в каждой биологической репликации.

КоличествоПМН в нижний резервуар после 1 часа показана на (рис. 2), нормированной на 10 6 входного ПМН. Кроме того, число PMN можно сравнить с внутренним контролем после нормализации до ввода PMN, что может уменьшить различия между биологических повторностях. Соблюдение протокола, описанной выше с вниманием к деталям позволяет перечисление ПМН миграции в ответ на раздражители в том числе бактерий (рис. 2а) и хемоаттрактант веществ (рис. 2б).

Рисунок 1
Рисунок 1. Схема эксперимента. (A) 5637 мочевого пузыря эпителиальные клетки высевают на инвертированных проницаемых опор, опоры имеют исправлено в 24-луночный планшет, и клетки выращивали до слияния. (B) PermeaBLE носители, содержащие сливные 5637 клеток обращены и заражены E. палочки на апикальной стороне эпителиальных слоев. Кроме того, хемоаттрактанты могут быть помещены в нижнем резервуаре. В проницаемые опоры исправлено в низкой монтажной пластине, и недавно изолированный человеческий PMN применяются для верхнего резервуара (представляющего базолатеральной стороне эпителиальных слоев). PMN мигрировать через эпителий и нумеруются от нижнего резервуара с помощью гемоцитометра.

Рисунок 2
Рисунок 2. ПМН мигрируют через эпителий мочевого пузыря в ответ на различные стимулы. (А) Заражение непатогенного Е. Штамм MG1655, убитых нагреванием MG1655 (HKMG) или УПЭК мутант UTI89 YbCl :: кошка вызывает значительно больше ПМН migratioн, чем макет инфекции или инфекции штамма дикого типа УПЭК UTI89, цистит изолировать (*, р <0,001). (B) Добавление fMLF (100 нМ) или IL-8 (100 нг / мл) в нижние результатов водохранилища в значительно более ПМН миграции, чем макет лечения (*, р <0,001). Данные представляют собой среднее и стандартное отклонение от по крайней мере 3 биологических повторностях. Статистически значимые различия были определены с использованием теста непарный Стьюдента.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Использование культурный клеточной линии эпителиальной мочевого пузыря и Свежевыделенные человека ПМН, мы создали модель в пробирке transuroepithelial миграции нейтрофилов. Эта модель сыграла важную роль в начинают препарировать сложности врожденного иммунного ответа во время инфекции мочевыводящих путей (ИМП), чрезвычайно общей бактериальной инфекции обычно вызванного УПЭК 9. Во время инфекции мочевого пузыря, или цистит, вербовка ПМН на просвет мочевого пузыря имеет важное значение для бактериальной оформления 10. Чтобы закрепиться в лице воспалительной реакции, УПЭК задержать приход ПМН в мочевой пузырь, что продлевает срок, в течение которого УПЭК может вторгнуться эпителий мочевого пузыря при отсутствии 6,11 иммунной давления. Этот фенотип, подавление ПМН миграции по УПЭК на ранних временных точках, наблюдается в нашей модели в пробирке transuroepithelial миграции ПМН. Заражение непатогенного Е. палочка MG1655 вызываетзначительно более ПМН миграции, чем инфекции уропатогенных Е. палочка UTI89 (рис. 2А); ко-инфекции с MG1655 и UTI89 дает Uropathogenic фенотип (т.е. низкий уровень ПМН миграции) 6. Кроме того, мы идентифицировали белок УПЭК YbCl, что вносит свой ​​вклад в супрессивной фенотипа, а удаление YbCl привело к значительно больше PMN в нижней резервуара по сравнению с дикого типа UTI89 (рис. 2а) 7. Высокие уровни PMN миграции также вызванное убитых нагреванием MG1655, fMLF и ИЛ-8 (фиг. 2A и B). По сравнению с инфекцией с живой бактериальной стимула, использование хемоаттрактанты может упростить как экспериментальный протокол и интерпретацию результатов. Вполне вероятно, что другие хемоаттрактанты (например, бактериальные продукты или хемокины) будет также вызывать PMN в этой модели. До сих пор, transuroepithelial миграции нейтрофилов задницуай способствовало расследования подавления ранней воспалительной реакции на УПЭК, открывая фенотипы, которые были проверены в естественных моделей в 6-8, и будет бесценным инструментом в будущих начинаниях.

В то время как этот анализ имеет потенциал для решения ряд вопросов, есть несколько ограничений. Учитывая количество переменных, присущих этом анализе, необходимо позаботиться во время подготовки и проведения экспериментов для обеспечения воспроизводимости между повторами. Перечисление ПМН путем подсчета склонна к ошибке, так как подсчет может быть время интенсивного и PMN недолговечны после удаления из организма, особенно в присутствии бактерий. Сокращение времени между ПМН отбора проб и ПМН перечисления приведет к более точного сбора данных. Исследователи описали колориметрических анализов, которые измеряют миелопероксидаза (МПО) активность фермента в качестве суррогата ПМН 12,13. Анализы, использующие колориметрических подложки, такие как 3,3 &# 39;, 5,5 ',-тетраметилбензидин (ТМВ) или 2,2'-азино-бис (3-этилбензотиазолин-6-сульфоновой кислоты) (ABTS) не являются достаточно чувствительны, чтобы обнаружить концентрацию PMN, присутствующего в нижней резервуары, используя transuroepithelial протокол миграции нейтрофилов, подробно описанную выше (Лау и Hunstad, неопубликованные данные). Параметры анализа миграции можно манипулировать, чтобы повысить плотность PMN в нижних образцов пластовых. Кроме того, анализ MPO с большей чувствительностью, потенциально с использованием флуоресцентного субстрата, может быть установлено. Измерение МРО-активности представляет собой альтернативу подсчета PMN и может позволить более точное перечисление PMN в нижних образцов пластовых. Кроме того, подобный анализ может также позволить перечисление PMN прилегает к эпителиальных слоев и оставаясь в верхний резервуар. Подтверждено протоколом МПО основе будет представлять собой мощный инструмент, который может расширить количество и тип данных, которые могут быть собраны из transuroepithelial миграции нейтрофилов анализ.

Трансэпителиальной миграции нейтрофилов анализы модельные врожденную иммунную реакцию в желудочно-кишечном тракте и легких широко распространены и отвечают за современного понимания обхода эпителиальных барьеров ПМН 4,5. Напротив, движение ПМН через uroepithelial барьеров получил гораздо меньше внимания. Сохранить и его коллеги сообщили, модель, которая использует поляризованный эпителий, состоящий из дифференцированных клеток UROtsa, увековечена линия клеток, полученную из мочеточника ткани, выращивают до слияния на проницаемой поддерживает 14. Agace и его коллеги сообщили об использовании недифференцированной пузыря (J82) и почек (A498) эпителиальных клеток в аналогичной модели 15. В transuroepithelial миграции нейтрофилов модели, подробно здесь, хотя клеточные слои 5637 не расслаиваются и, вероятно, формально не поляризован, плотные соединения образуются, оценивается непроницаемость для макромолекулярныхпоток и выражение и локализация плотного контакта белков (Лау и Hunstad, неопубликованные данные). Следует отметить, что эпителиальный слой также поддерживает такую ​​герметичность в течение условиях инфекции мы описали. Протоколы о которых сообщили сохранить и Agace моделировать воспалительный ответ после заражения УПЭК изолирует в течение 24 часов. В этих моделях, УПЭК вызывают надежную миграцию ПМН. В противоположность этому, эпителиальные слои в нашей модели подвергаются УПЭК в течение относительно короткого периода времени, 1 ч, для того чтобы исследовать начальные взаимодействия между хостом и патогена. Кроме того, использование линии эпителиальных клеток мочевого пузыря и цистит, полученных UPEC изолировать позволяет потенциальную перевод выводов в пробирке в мышиной модели цистит 16. Наконец, исследования упоминалось выше, используемых крупными проницаемыми опор, которые требуют 6 чашках для культуры ткани также. Использование меньших проницаемых опор, как в нашей модели, уменьшает использование реагентов и увеличивает количество вставкис которыми можно манипулировать в эксперименте. Хотя каждый из этих модельных систем имеет свои преимущества и недостатки, коллектив потенциал этих моделей для определения события, необходимые для ПМН миграции в ткани мочевых путей является существенным.

Хотя менее понятны, чем миграция через эндотелиальные барьеры, прохождение ПМН через желудочно-кишечных и легочных эпителиальных барьеров получил много исследования 4,5. Трансэпителиальной модели миграции нейтрофилов, которые используют проницаемые опоры и культивируемые эпителиальные клетки выявили некоторые из сигнальных событий и молекул адгезии, участвующих в движении ПМН через эти эпителия. Предварительные исследования с использованием культивируемых мочевых эпителиальные клетки свидетельствуют о причастности межклеточной адгезии молекулы-1 (ICAM-1) и β-интегрину CD11b/CD18 (Mac-1) в ПМН миграции через мочевыводящих тканей 15. Неясно, которые участвуют дополнительные сигнальные пути и клейкие молекулыв этих сложных процессов в мочевыводящих путях. Использование transuroepithelial миграции нейтрофилов модели, описанной в данном документе, может быть дополнен микроскопического исследования 14,15, эти основные вопросы и многие другие могут быть опрошены. Кроме того, в сочетании с бактериальной генетики, эта модель может быть использована для дальнейшей оценки патогенных конкретных фенотипов, таких как подавление ПМН миграции по УПЭК. Неясно, в какой момент в многоступенчатом процессе ПМН миграции УПЭК оказывает свое подавляющее действие. Кроме того, механизм, по которому YbCl влияет ПМН миграции до сих пор не выяснены. По первым понимания основные требования к прохождению ПМН через эпителий мочевого пузыря, мы можем начать исследовать, как УПЭК манипулирует этими процессами, чтобы облегчить болезнь.

Таким образом, в то время как многочисленные методы существуют, чтобы изучить движение клеток, меньше подходы можно опросить миграцию клеток через клеточные барьеры. Modificatioнс до камеры Бойдена были неотъемлемой частью расследования миграцию клеток через эндотелиальные и эпителиальные барьеры. Сговорчивым в пробирке модель острой воспалительной реакции в мочевых путях, таких как transuroepithelial нейтрофилов анализа миграции подробно здесь, является ценным инструментом для допроса этих сложных процессов. Наконец, изменения в этом анализе может облегчить расследование других болезненных состояний мочевыводящих путей.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Национальными Институтами Здоровья (NIH) предоставляет R01-DK080752 и P50-DK064540. Мы благодарим J. Loughman за ее усилия в создании этого анализа.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Transwell Inserts (i.e. permeable supports) Corning 3472 6.5 mm, 3 μm pore, polyester membrane insert
BD Vacutainer Blood Collection Tubes Becton, Dickinson and Company (BD) 366480 16 mm x 100 mm x 10 ml green cap tubes containing sodium heparin
BD Safety-Lok Blood Collection and Infusion Set Becton, Dickinson and Company (BD) 367281 21 G x 0.75 in needle x 12 in tubing
BD Vacutainer one-use, nonstackable holder Becton, Dickinson and Company (BD) 364815
Dextran Sigma-Aldrich D4876 From Leuconostoc mesenteroides
Ficoll-Paque PLUS density centrifugation solution GE Healthcare 17-1440-02
Ultra-Low Attachment Plates Corning 3473 24-well, clear flat bottom
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLF) Sigma-Aldrich F3506 Reconstituted in DMSO to 10 mM
Recombinant Human CXCL8/IL-8 R&D Systems 208-IL Reconstituted in PBS to 100 μg/ml

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
  2. Zigmond, S. H. Orientation chamber in chemotaxis. Methods Enzymol. 162, 65-72 (1988).
  3. Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. A new direct-viewing chemotaxis chamber. J. Cell Sci. 99 (Pt. 4), 769-775 (1991).
  4. Chin, A. C., Parkos, C. A. Pathobiology of neutrophil transepithelial migration: implications in mediating epithelial injury. Annu. Rev. Pathol. 2, 111-143 (2007).
  5. Zemans, R. L., Colgan, S. P., Downey, G. P. Transepithelial migration of neutrophils: mechanisms and implications for acute lung injury. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 40, 519-535 (2009).
  6. Loughman, J. A., Hunstad, D. A. Attenuation of human neutrophil migration and function by uropathogenic bacteria. Microbes Infect. 13, 555-565 (2011).
  7. Lau, M. E., Loughman, J. A., Hunstad, D. A. YbcL of uropathogenic Escherichia coli suppresses transepithelial neutrophil migration. Infect. Immun. 80, 4123-4132 (2012).
  8. Loughman, J. A., Hunstad, D. A. Induction of indoleamine 2,3-dioxygenase by uropathogenic bacteria attenuates innate responses to epithelial infection. J. Infect. Dis. 205, 1830-1839 (2012).
  9. Foxman, B. The epidemiology of urinary tract infection. Nat. Rev. Urol. 7, 653-660 (1038).
  10. Haraoka, M., et al. Neutrophil recruitment and resistance to urinary tract infection. J. Infect. Dis. 180, 1220-1229 (1999).
  11. Billips, B. K., et al. Modulation of host innate immune response in the bladder by uropathogenic Escherichia coli. Infect. Immun. 75, 5353-5360 (2007).
  12. Bozeman, P. M., Learn, D. B., Thomas, E. L. Assay of the human leukocyte enzymes myeloperoxidase and eosinophil peroxidase. J. Immunol. Methods. 126, 125-133 (1990).
  13. Lee, W. Y., Chin, A. C., Voss, S., Parkos, C. A. In vitro neutrophil transepithelial migration. Methods Mol. Biol. 341, 205-215 (2006).
  14. Säve, S., Mohlin, C., Vumma, R., Persson, K. Activation of adenosine A2A receptors inhibits neutrophil transuroepithelial migration. Infect. Immun. 79, 3431-3437 (2011).
  15. Agace, W. W., Patarroyo, M., Svensson, M., Carlemalm, E., Svanborg, C. Escherichia coli induces transuroepithelial neutrophil migration by an intercellular adhesion molecule-1-dependent mechanism. Infect. Immun. 63, 4054-4062 (1995).
  16. Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. A murine model of urinary tract infection. Nat. Protoc. 4, 1230-1243 (2009).

Tags

Иммунологии выпуск 81 Uropathogenic Нейтрофилов эпителий мочевого пузыря миграции нейтрофилов врожденный иммунитет инфекции мочевыводящих путей
Количественная оценка миграции нейтрофилов человека во культурный мочевого эпителия
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lau, M. E., Hunstad, D. A.… More

Lau, M. E., Hunstad, D. A. Quantitative Assessment of Human Neutrophil Migration Across a Cultured Bladder Epithelium. J. Vis. Exp. (81), e50919, doi:10.3791/50919 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter