Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Kwantitatieve beoordeling van Human migratie van neutrofielen door een Gekweekte blaas epitheel

Published: November 7, 2013 doi: 10.3791/50919

Summary

We ontwikkelden een in vitro model dat een belangrijke component van de acute ontstekingsreactie tijdens infectie van de blaas uropathogene Escherichia coli nabootst. De transuroepithelial neutrofiel migratie assay maakt kwantitatieve beoordeling van menselijke neutrofiel migratie over blaas epitheel, gekweekt op permeabele dragers, in reactie op bacteriële infectie of chemoattractant stoffen.

Abstract

De rekrutering van immuuncellen van de periferie naar de plaats van ontsteking is een essentiële stap in de aangeboren immuunrespons op elk slijmvliesoppervlak. Tijdens infectie van de urineblaas, polymorfonucleaire leukocyten (PMN, neutrofielen) migreren van de bloedsomloop en beweeg de blaas epitheel. Het niet-infectie op te lossen in de afwezigheid van een neutrofiele respons toont het belang van PMN in blaas verdediging. Kolonisatie van de blaas epitheel, uropathogene Escherichia coli (UPEC) te vergemakkelijken, de verwekker van de meerderheid van urineweginfecties (UWI), temperen de acute ontstekingsreactie behulp van een verscheidenheid van gedeeltelijk gedefinieerd mechanismen. Om de wisselwerking tussen gastheer en bacteriële pathogenen te onderzoeken, een in vitro model van dit aspect van de aangeboren immuunrespons op UPEC ontwikkeld. In de transuroepithelial neutrofielen migratie assay, een variatie op de Boyden-kamer, gekweekte blaas epithElial cellen worden gekweekt tot confluentie op de onderzijde van een doorlaatbare drager. PMN worden geïsoleerd uit menselijk veneus bloed en worden toegepast op de basolaterale zijde van de blaas epitheel cellagen. PMN migratie die de fysiologisch relevante basolaterale naar apicale richting in reactie op bacteriële infectie of chemo-aantrekkende moleculen opgesomd met behulp van een hemocytometer. Dit model kan worden gebruikt om de interacties tussen UPEC en eukaryotische cellen te onderzoeken alsook de moleculaire vereisten voor traversal van blaas epitheel ondervragen door PMN. De transuroepithelial neutrofiel migratiemodel ons begrip van de initiële ontstekingsreactie op UPEC in de blaas bevorderen.

Introduction

De beweging van cellen in het lichaam, vaak over grote afstanden, is nodig voor de groei en ontwikkeling, wondgenezing en immuunrespons. Celmigratie is complex en vereist de coördinatie van verschillende processen, waaronder signaal transductie en herschikking van cytoskelet componenten. Cellen kunnen willekeurig evenals bewegen (chemokinesis) richting gedefinieerde chemische gradiënten (chemotaxis). Vele technieken zijn ontwikkeld om celmigratie in vitro bestuderen. De oudste en meest gebruikte techniek, de Boyden-kamer, bestaande uit een verticaal tweekamersysteem waarbij een chemoattractant stof wordt in de onderste kamer en cellen van belang worden geplaatst in de bovenste kamer 1. De beweging van cellen in de permeabele filter met poriën van gedefinieerde grootte, die de twee kamers wordt bewaakt. Aanvullende technieken ontwikkeld om celmigratie te onderzoeken, waaronder Zigmond kamer 2 en kamer Dunn3. Deze collectieve benaderingen hebben aanzienlijke inzicht in de beweging van vele verschillende celtypes opgeleverd.

Naast ondervragen de basisprincipes van chemokinesis en chemotaxis, zijn twee kamers assays onderzoek van celmigratie door extracellulaire matrixcomponenten en zowel endotheliale en epitheliale lagen vergemakkelijkt. Een voordeel van twee-kamer systemen via andere technieken is dat het poreuze membraan kan worden bekleed met eiwitten zoals collageen of fibrinogeen, en celmigratie in een extracellulaire matrix-achtige barrière kan worden beoordeeld. Daarnaast kunnen gekweekte cellijnen worden gekweekt en gedifferentieerd op permeabele steunen. Om de beweging van cellen in de endotheliale barrière te onderzoeken, worden gekweekte endotheelcellen gezaaid en gekweekt in het bovenste reservoir van de permeabele steunen. Beweeglijke cellen, zoals immuuncellen, toegevoegd aan het bovenste reservoir en migratie in het onderste reservoir en in dedothelial barrière in de fysiologische apicale-to-basolaterale richting wordt waargenomen. Dit model is van onschatbare waarde geweest bij het begrijpen van extravasatie van immuuncellen uit het bloed. In tegenstelling tot transendotheliale migratie, de beweging van cellen in een epitheliale barrière treedt meestal in de basolaterale naar apicale richting. Om modelleren deze gebeurtenissen in vitro onderzoekers zaad en groeien gekweekte epitheelcellen aan de onderzijde van de permeabele steunen. Beweeglijke cellen worden toegevoegd aan het bovenste reservoir en migratie over de epitheliale barrière, die de basolaterale naar apicale richting bewaakt. Dergelijke modellen van transepitheliaal migratie hebben aanzienlijk bijgedragen aan ons begrip van ontstekingsreacties op mucosale oppervlakken, in het bijzonder die van de long en darm 4,5.

In tegenstelling, is immuun cel mensenhandel door het epitheel van de urinewegen veel minder aandacht gekregen. Om onze understandi verderng aangeboren immuunrespons bij de urinewegen tijdens infectie met uropathogene Escherichia coli (UPEC), ontwikkelden we een in vitro test, de transuroepithelial neutrofielen migratie assay, dat onderzoek van polymorfonucleaire leukocyten maakt (PMN; neutrofielen) beweging over een blaas epitheelbarrière 6 -8. Zoals bij andere twee kamers modellen transepitheliale migratie worden gekweekte menselijke blaas epitheelcellen gegroeid op de onderzijde van een doorlaatbare steun en vormen confluente epitheliale lagen. Menselijke neutrofielen, geïsoleerd uit veneus bloed, worden aangebracht op de basolaterale zijde van de epitheliale laag en migratie over het epitheel van de fysiologisch relevante basolaterale naar apicale richting wordt gekwantificeerd in reactie op infectie door verschillende stammen van E. coli of de aanwezigheid van chemoattractant moleculen. Veel onderzoek was gericht op neutrofielen beweging, zowel chemokinesis en chemotaxis, bij het ontbreken van extra celtypes. De transuroepithelial neutrofielen migratie test is voordelig omdat het rekening houdt met de complexe interacties tussen de blaas epitheel cellen en immuuncellen tijdens infectie. Deze soepele in vitro model heeft het potentieel om de gedetailleerde onderzoek immuunrespons uroepithelial oppervlakken mogelijk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Het kweken van 5637 Blaas epitheelcellen

Voer de volgende stappen in een laminaire stroming weefselkweek kap bereid met UV-bestraling en afgeveegd met 70% ethanol.

  1. Bereid RPMI-1640 medium dat 10% foetaal runderserum (FBS) [genoemd RPMI +], filter gesteriliseerd met een 0,22 urn poriegrootte en opwarmen tot 37 ° C in een waterbad.
  2. Ontdooi een Cryovial van 5637 cellen (American Type Culture Collection HTB-9, afgeleid van blaascarcinoom) in een 37 ° C waterbad. Snel overbrengen van de ontdooide cellen om een 75 cm 2 weefselkweek kolf met 20 ml RPMI +.
  3. Incubeer de kolf bij 37 ° C in een vochtige atmosfeer met 5% CO2 totdat de cellen ongeveer 95% confluent (~ 6 x 10 6 cellen per kolf), ongeveer 4 dagen.
  4. Om de 5637 cellen subcultuur:
    1. Verwijder het medium uit de kolf. Was de cellen met 10 ml Dulbecco's fosfaat-gebufferde Saline (DPBS) bij kamertemperatuur.
    2. Voeg 6 ml warm (37 ° C) 0,05% trypsine, 0,02% EDTA-oplossing aan de kolf en incubeer bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende 15 minuten.
    3. Breng de cellen om een ​​15 ml conische buis en pellet door centrifugeren bij 300 g gedurende 5 minuten. Verwijder de trypsine / EDTA-oplossing.
    4. Resuspendeer de cellen in 6 ml RPMI + (10 6 cellen / ml) en breng 1 ml (10 6 cellen) in nieuw 75 cm2 kolf met 20 ml RPMI +.
  5. Herhaal stap 1.4 tot cellen subcultuur om de 4 dagen of wanneer de cellen te bereiken 95% samenvloeiing.

2. Zaaien en Growing 5637 Cellen op Permeable Supports

Voer de volgende stappen in een weefselkweek kap onder aseptische omstandigheden. Voor optimale resultaten gebruikt u 5.637 cellen die minder dan 10 subculturen hebben ondergaan.

  1. Met behulp van een steriel pincet, keren de doorlaatbare dragers in een steriele 25 mm diep weefselkweek schotel.
  2. 2 kolf van 5.637 cellen bij 95% samenvloeiing volgens stappen 1.4.1-1.4.3.
  3. Met een 1.000 III pipet voorzichtig resuspendeer de cellen in ~ 2 ml RPMI + tot een concentratie van 3 x 10 6 cellen / ml, bepaald met celtelling behulp van een hemocytometer.
  4. Breng 50 pl van de celsuspensie (1,5 x 10 5 cellen) aan elke doorlaatbare ondersteunen zonder het membraan. Plaats de deksel op de schaal en zorgvuldig plaats de schaal bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende ten hoogste 16 uur.
  5. Met behulp van een steriel pincet, rechts de doorlaatbare dragers in een 24-wells plaat met 0,6 ml RPMI + per putje. Voeg 0,1 ml RPMI + het bovenste reservoir van elke doorlaatbare drager. Incubeer bij 37 ° C met 5% CO2.
  6. Vervang het medium om de 2 dagen. Eerste, aspireren medium uit het bovenste reservoir gevolgd door de onderste reservoir, en breng verse RPMI + in omgekeerde volgorde, naar het onderste reservoir (0,6 ml) en vervolgens de bovenste reservoir (0,1 ml).
  7. Zeven dagen na zaaien het permeabele steunen met 5637 cellen beoordelen samenvloeiing van de cellen. Vul het bovenste reservoir met RPMI + (~ 0,35 ml). De cellen voldoende confluent wanneer het medium niet in evenwicht tussen de bovenste en onderste reservoirs.

3. Bereiding van het bacterieel inoculum

  1. Met behulp van aseptische techniek, voeg 20 ml van de juiste cultuur bouillon in een 250 ml kolf met een dop. Gebruik Luria-Bertani (LB) bouillon voor E. coli culturen en antibiotica aan de bouillon waar nodig.
  2. Met behulp van een steriele inenting lus, te enten de bouillon met bacteriën uit een glycerol voorraad of een streep plaat. Voor UPEC stammen, incubeer de bacteriële kweek bij 37 ° C gedurende ongeveer 16 uur zonder schudden (productie van type 1 pili bevorderen).
  3. Breng de bacteriecultuur een centrifugebuis. Pellet de bacteriën door centrifugeren bij 8000 xg gedurende 10 minuten.
  4. Schenk de bovenstaande vloeistofEn resuspendeer de bacteriën in PBS bij OD 600 = 1,000, equivalent aan ~ 10 9 CFU / ml.
    1. Een verhitting gedode bacteriële stimulus genereren incubeer een hoeveelheid (bijv. ~ 1,5 x 10 8 CFU in 150 pl) van de geresuspendeerde bacteriën bij 55 ° C gedurende 30 minuten. Plaat een hoeveelheid van de door hitte gedode suspensie om bacteriële dood te bevestigen.
  5. Vlak voor het gebruik, verdunnen de geresuspendeerd bacteriën (live of hitte gedode) 10-voudig tot 10 8 CFU / ml in warme serum-vrij RPMI [genoemd RPMI-] in een microfugebuis.

4. Isolatie van humane neutrofielen uit perifeer bloed

De collectie van het bloed van volwassen vrijwilligers nodig vooraf beoordeling en goedkeuring van een Institutional Review Board. Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen en op de juiste verwijdering van gevaarlijke materialen om blootstelling aan menselijk bloed voorkomen.

  1. Ongeveer 25 ml veneus bloed van gezonde volwassenen volunteer moeten in 3 steriele natrium-heparine bevattende bloedafnamebuisjes worden getrokken door personeel dat is opgeleid in aderlaten.
    1. Wikkel een rubber tourniquet rond de bovenarm, boven de elleboog.
    2. Ontsmet de ingangsplaats, de antecubitale fossa, met behulp van een steriele 70% alcohol schoon te vegen.
    3. Bevestig een plastic buis houder op een gevleugelde vlinder naald systeem.
    4. Steek de naald in een ader antecubitale bij een hoek van 30 ° of minder, schuine naar boven. De naald de ader doorboord wanneer een spurt van bloed in de plastic buis.
    5. Plaats een bloedafname in de plastic buis houder. Wanneer de eerste collectie buis vol is, te vervangen door de tweede collectie buis. Herhaal dit met de derde buis.
    6. Wanneer de derde collectie buis is ongeveer half vol, verwijder de tourniquet.
    7. Bedek de prikplaats met een steriele katoenen bal en langzaam trek de naald uit de ader. Schuif het beschermend schild over de naald en plaats ina biohazard naaldcontainer.
    8. Oefen druk uit op de prikplaats. Bedek de prikplaats en katoenen bal met een pleister.
    9. Keer de bloedafnamebuisjes aan de heparine verspreiden.

Voer de volgende stappen in een weefselkweek kap onder aseptische omstandigheden.

  1. Met behulp van een pipet 10 ml, zachtjes het bloed over te dragen aan een nieuwe, steriele 50 ml conische buis. Voeg een gelijkwaardige hoeveelheid 3% (w / v) dextraan in 0,9% NaCl en meng door omkeren. Incubeer de buis wordt bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten.
  2. Zonder verstoring van de onderlaag voorzichtig zuigen de bovenlaag en overbrengen naar een nieuwe 50 ml conische buis. Pellet de cellen door centrifugatie bij 300 xg gedurende 10 minuten. Verwijder het supernatant.
  3. Resuspendeer de celpellet in een hoeveelheid 0,9% NaCl gelijk aan het uitgangsvolume bloed.
  4. Laag 10 ml-centrifugatie oplossing onder de celsuspensie, preserveren van het grensvlak tussen de twee fasen. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 30 min zonder remmen. Verwijder het supernatant.
  5. Achtergebleven rode bloedcellen lyseren, resuspendeer de celpellet in 10 ml koude 0,2% NaCl. Incubeer gedurende 30 sec, en vervolgens onmiddellijk voeg 10 ml koud 1,6% NaCl tot isotoniciteit herstellen.
  6. Pellet de cellen door centrifugatie bij 300 xg gedurende 6 minuten. Verwijder het supernatant.
  7. Herhaal stap 4,6-4,7 totdat de celpellet duidelijk vrij van rode bloedcellen, typisch 3 rondes van lysis te zijn.
  8. Met behulp van een pipet 1.000 III, resuspendeer de celpellet, voornamelijk PMN in warm (37 ° C) RPMI-een concentratie van 10 7 cellen / ml, bepaald met celtelling behulp van een hemocytometer. Laat de cellen bij 37 ° C tot gebruik. Kenmerkend PMN levensvatbaarheid en zuiverheid> 99% zoals bepaald door trypan blauw exclusie en visualisatie van nucleaire morfologie na kleuren respectievelijk.

5. Transuroepithelial neutrofielen migratiezeggen

Voer de volgende stappen in een weefselkweek kap onder aseptische omstandigheden. Gebruik alleen doorlaatbaar steunen dragende samenvloeiing 5637 cellagen, zoals bepaald in stap 2.7. De 24-well platen met RPMI-kan worden voorbereid en bij 37 ° C gehouden met 5% CO 2 tot gebruik.

  1. Aliquot 1 ml warm RPMI per putje in een 24-well plaat; bereiden 3 putten per doorlaatbare ondersteuning.
  2. Zuig het medium van de bovenste en onderste reservoirs van de permeabele steunen.
  3. Met behulp van een steriel pincet, overdracht van de doorlatende steunen aan de 24-well plaat bereid in stap 5.1. Was de doorlaatbare dragers driemaal in door de steunen uit goed goed.
  4. Als een bacterieel inoculum wordt gebruikt, keren de doorlaatbare dragers in een steriele 25 mm diep weefselkweekplaat. Als een chemoattractant (bijv. N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLF) of IL-8) wordt gebruikt, ga dan naar stap 5.6.
  5. Voor experimenten met levende of gedode bacterial stimuli, te enten de apicale zijde van elke doorlaatbare steun met 60 ul RPMI-(pseudo-infectie) of met de bacteriële inoculum (6 x 10 6 CFU) bereid in stap 3.5. Plaats de deksel op de schaal en incubeer bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende 1 uur.
  6. Voeg 0,6 ml RPMI per-goed op een 24-well laag-bevestigingsplaat, goed voor te bereiden 1 per doorlaatbare ondersteuning. Bereid 3 putjes die 0,5 ml RPMI-PMN ingang sommen.
    1. Als een chemoattractant wordt gebruikt in plaats van bacteriën, voeg de chemoattractant tot 0,6 ml RPMI-in 24-well plaat bereid in stap 5.6.
  7. Rechts de doorlaatbare dragers in de 24-well laag-bevestigingsplaat.
  8. Voeg 0,1 ml PMN (10 6 PMN), bereid in stap 4.9, naar de bovenste reservoir (basolaterale zijde) van elke doorlaatbare ondersteuning. Voeg 100 ul PMN direct aan putjes die 500 ul RPMI-. Incubeer bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende 1 uur.
  9. Met behulp van een steriel pincet voorzichtig schrapen dedoorlaatbare membraan van de steun tegen de rand van de put om extra PMN van de apicale kant verwijderen en afvoeren van de drager.
  10. Verzamel PMN door voorzichtig schrapen de bodem van elk putje met 1000 ul pipetpunt en dragen PMN suspensies microfuge buizen.
  11. Opsommen PMN behulp van een hemocytometer.
  12. Om het totale aantal PMN in het onderste reservoir berekenen, vermenigvuldigt het aantal PMN in 1 mm 2 (100 nl) van 6000. Gegevens worden gerapporteerd als een percentage van de input PMN, of PMN getallen genormaliseerd tot 10 6 ingang PMN.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De transuroepithelial neutrofiel migratie assay maakt de kwantitatieve beoordeling van menselijke PMN migratie over blaas gekweekte epitheelcellen lagen in reactie op verschillende stimuli (Figuur 1B). Terwijl het protocol is eenvoudig, er een aantal variabelen die PMN migratie beïnvloeden en bijgevolg invloed op de reproduceerbaarheid van deze test. Maatregelen moeten worden genomen, terwijl de voorbereiding van de doorlatende steunen en de PMN variabiliteit te verminderen tussen de technische en biologische herhalingen. Bijvoorbeeld zouden alleen doorlaatbaar dragers die voldoende confluente 5637 cellagen worden gebruikt in een experiment. Samenvloeiing van de 5637 cellen wordt beoordeeld op basis van een functionele test die ondoordringbaarheid meet aan een vloeistof. Als medium wordt toegevoegd aan het bovenste reservoir in evenwicht over de permeabele steun dan de 5637 cellen onvoldoende samenvloeiende het experiment. Indien het volume van het bovenste reservoir wordt gehandhaafd, dan de doorlaatbaarheidkunnen ondersteuning kan worden gebruikt om PMN migratie te beoordelen. We hebben transepitheliale elektrische weerstand gemeten in dit systeem, dat bescheiden toeneemt bij samenvloeiing van de cellen, als deze methode wordt gekozen, moet erop worden gelet de anders steriele setup besmetten. Samenvloeiing van 5637 cellen 7 dagen na zaaien kan worden beïnvloed door verschillende factoren, zoals het aantal passage van de cellen en het aantal cellen gezaaid op de doorlaatbare drager. Bovendien moet de hoeveelheid tijd dat de 5637 cellen worden geïncubeerd op het permeabele ondersteuning in de omgekeerde positie tijdens enten maximaal 16 uur (Figuur 1A). Voor een optimale reproduceerbaarheid, moet het protocol precies gevolgd worden. Tenslotte moet permeabele dragers die confluente 5637 cellagen worden gebruikt binnen 1-2 dagen en de membranen van de dragers nooit zowel gedurende de groei van de cellen of 5637 tijdens de transuroepithelial neutrofiel migratie assay worden aangeraakt.

In eenddition de 5637 cellen variabiliteit kan ook tijdens de bereiding PMN geïntroduceerd. Met het hierboven beschreven protocol het isoleren PMN, 1 ml humaan bloed levert typisch ongeveer 10 6 PMN, hoewel dit aantal varieert van individu tot individu. Zodra de typische opbrengst van bloed van een donor is bekend, kan de isolatie protocol worden vergroot of verkleind dienovereenkomstig. PMN van ongezonde of zieke personen moeten worden vermeden, en verschillende PMN donoren moet worden gebruikt voor biologische herhalingen om ervoor te zorgen dat de resultaten reproduceerbaar zijn waargenomen. PMN moet voorzichtig en aseptisch behandeld activering tijdens isolatie voorkomen. Tenslotte, de timing van de experimentele procedures is essentieel, aangezien PMN niet overleven gedurende langere tijd nadat het is verwijderd uit het lichaam. Wij maken gebruik van PMN binnen 1 uur van de voltooiing van de isolatie procedure. Gezien deze overwegingen, moet op zijn minst 3 technische duplo worden opgenomen in elke biologische repliceren.

Het aantalPMN in het onderste reservoir na 1 uur wordt weergegeven in (figuur 2) genormaliseerd tot 10 6 ingang PMN. Alternatief kan PMN aantallen te vergelijken met een interne controle na normalisatie invoeren PMN die variatie tussen biologische replicaten verminderen. De naleving van het protocol hierboven beschreven met aandacht voor detail maakt de opsomming van PMN migratie in reactie op prikkels waaronder bacteriën (Figuur 2A) en chemoaantrekkende stoffen (Figuur 2B).

Figuur 1
Figuur 1. Schematische voorstelling van experimentele opzet. (A) 5637 blaas epitheliale cellen uitgezaaid omgekeerd doorlaatbare dragers, worden de steunen rechtgezet in een 24-well plaat, en de cellen worden gekweekt tot confluentie. (B) Permeable dragers met confluerende 5637 cellen worden omgekeerd en besmet met E. coli aan de apicale zijde van de epitheliale lagen. Als alternatief kan chemoattractanten in het onderste reservoir worden geplaatst. De doorlatende steunen worden rechtgezet in een low-bevestigingsplaat, en vers geïsoleerde menselijke PMN worden toegepast op de bovenste reservoir (die de basolaterale zijde van de epitheliale lagen). PMN migreren over het epitheel en worden opgesomd uit het onderste reservoir met behulp van een hemocytometer.

Figuur 2
Figuur 2. PMN worden verdeeld over de blaas epitheel in reactie op verschillende stimuli. (A) Infectie met pathogene E. coli-stam MG1655, hitte gedode MG1655 (HKMG) of UPEC mutant UTI89 ybcL :: cat lokt aanzienlijk meer PMN MIGRATIEn dan pseudo-infectie of een infectie met wild-type UPEC stam UTI89, een blaasontsteking te isoleren (*, p <0,001). (B) De toevoeging van fMLF (100 nM) of IL-8 (100 ng / ml) aan het onderste reservoir resulteert in significant meer PMN migratie dan mock behandeling (*, p <0,001). Gegevens stellen het gemiddelde en de standaardafwijking van ten minste 3 biologische repliceert. Statistisch significante verschillen werden bepaald met behulp van ongepaarde Student's t-test.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Met behulp van een gekweekte blaas epitheelcellijn en vers geïsoleerde humane PMN, hebben we een in vitro model van transuroepithelial neutrofielmigratie. Dit model is behulpzaam geweest bij het ​​begin tot de complexiteit van de aangeboren immuunrespons tijdens infectie van de urinewegen (UTI), een zeer veel voorkomende bacteriële infectie meestal veroorzaakt door UPEC 9 ontleden geweest. Tijdens blaasontsteking of cystitis, werving van PMN aan de blaas lumen is essentieel voor bacteriële verwijdering 10. Om een positie in het gezicht van een ontstekingsreactie tot stand, UPEC vertragen de komst van PMN naar de blaas, waardoor de periode waarin UPEC de blaas epitheel kan binnendringen in de afwezigheid van immuniteitsdruk 6,11 verlengt. Dit fenotype, onderdrukking van PMN migratie door UPEC op vroege tijdstippen, wordt waargenomen in onze in vitro model van transuroepithelial PMN migratie. Infectie met niet-pathogene E. coli MG1655 loktsignificant meer PMN migratie dan infectie met E. uropathogenic coli UTI89 (Figuur 2A), co-infectie met MG1655 en UTI89 levert de uropathogene fenotype (dwz lage niveaus van PMN migratie) 6. Bovendien identificeerden we een UPEC eiwit YbcL, dat bijdraagt ​​aan de suppressieve fenotype, als deletie van ybcL in significant meer PMN in het onderste reservoir vergeleken met wildtype UTI89 (Figuur 2A) 7. Hoge niveaus van PMN migratie werden opgewekt door verhitting gedode MG1655, fMLF en IL-8 (fig. 2A en B). In vergelijking met een infectie met een levende bacteriële stimulus, kan het gebruik van chemoattractanten zowel de experimentele protocol en de interpretatie van de resultaten te vereenvoudigen. Het is waarschijnlijk dat andere chemoattractanten (bv. bacteriële producten of chemokines) ook PMN zou wekken in dit model. Tot nu toe, de transuroepithelial neutrofielmigratie kontay heeft onderzoek vergemakkelijkt in onderdrukking van de vroege ontstekingsreactie door UPEC, onthullen fenotypes die zijn geverifieerd in in vivo modellen 6-8 en zal een waardevol instrument in de toekomst inspanningen.

Hoewel deze test heeft de potentie om een ​​aantal vragen te beantwoorden, zijn er enkele beperkingen. Gezien het aantal variabelen die inherent zijn aan deze test, moet erop worden gelet, terwijl de voorbereiding en het uitvoeren van experimenten om de reproduceerbaarheid tussen herhalingen te garanderen. Opsommen van PMN door tellen is gevoelig voor fouten, het tellen kan tijd intensief en PMN zijn van korte duur nadat het is verwijderd uit het lichaam, vooral in de aanwezigheid van bacteriën. Het verminderen van de tijd tussen PMN monstername en PMN opsomming leidt tot nauwkeurigere dataverzameling. Onderzoekers hebben colorimetrische assays dat myeloperoxidase (MPO) enzymactiviteit te meten als een surrogaat voor PMN 12,13 beschreven. Testen met behulp van colorimetrische substraten zoals 3,3 &# 39, 5,5 '-tetramethylbenzidine (TMB) of 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonzuur) (ABTS) niet gevoelig genoeg om de concentratie van PMN aanwezige sporen in de onderste reservoirs met de transuroepithelial neutrofielmigratie protocol hierboven (Lau en Hunstad, ongepubliceerde gegevens) beschreven. De parameters van de migratie assay kan worden gemanipuleerd om de PMN dichtheid in het onderste reservoir monsters te verhogen. Als alternatief kan een MPO bepaling met een grotere gevoeligheid mogelijk gebruik van een fluorescent substraat, kon worden vastgesteld. Meting van MPO-activiteit is een alternatief voor PMN tellen en kan nauwkeuriger opsomming van PMN in het onderste reservoir monsters mogelijk. Bovendien kan een dergelijke test ook opsomming van PMN hechtende laten de epitheliale lagen en nog in het bovenste reservoir. Een gevalideerde MPO-gebaseerd protocol zou een krachtig instrument dat de hoeveelheid en de aard van de gegevens die kunnen worden verzameld uit de transuroep kon uitbreiden vertegenwoordigenithelial neutrofielmigratie assay.

Transepitheliaal neutrofielmigratie assays modelleren van de aangeboren immuunrespons in het maagdarmkanaal en de longen zijn wijdverspreid en zijn verantwoordelijk voor onze huidige kennis van de traversal van epitheliale barrières door PMN 4,5. In tegenstelling, heeft PMN beweging over uroepithelial barrières veel minder aandacht gekregen. Säve en collega's hebben een model dat een gepolariseerde epitheel bestaat uit gedifferentieerde UROtsa cellen gebruikt gemeld, een onsterfelijk cellijn afgeleid van ureterweefsel, tot confluentie gegroeid op doorlatende ondersteunt 14. Agace en collega's hebben melding gemaakt van het gebruik van ongedifferentieerde blaas (J82) en nieren (A498) epitheelcellen in een soortgelijk model 15. In de transuroepithelial neutrofielmigratie model hierin beschreven, hoewel de 5637 cel lagen zijn niet gelaagd en waarschijnlijk niet formeel gepolariseerd, tight junctions worden gevormd, beoordeeld door ondoordringbaarheid macromoleculaireflux en de expressie en lokalisatie van tight junction eiwitten (Lau en Hunstad, ongepubliceerde gegevens). Van de nota, de epitheellaag onderhoudt ook dergelijke ondoordringbaarheid tijdens de infectie voorwaarden die wij hebben beschreven. De protocollen gemeld door Säve en Agace modelleren de ontstekingsreactie na infectie met UPEC isolaten gedurende 24 uur. In deze modellen, UPEC ontlokken robuuste PMN migratie. Daarentegen worden de epitheliale lagen in ons model blootgesteld aan UPEC voor een relatief korte tijd, 1 uur, teneinde de initiële interacties tussen gastheer en pathogeen te onderzoeken. Bovendien is het gebruik van een blaas epitheel cellijn en een cystitis afgeleide UPEC isoleren kunnen potentieel vertaling van in vitro bevindingen aan de murine blaasontsteking model 16. Ten slotte is de studies hierboven gebruikt groot doorlatend steunen die 6 well weefselkweek gerechten vereisen genoemd. Het gebruik van kleinere permeabele dragers, zoals in ons voorbeeld, vermindert reagens gebruik en verhoogt het aantal inzetstuks die kunnen worden gemanipuleerd per experiment. Hoewel elk van deze modelsystemen heeft voordelen en nadelen, collectieve potentieel van deze modellen te bepalen die vereist zijn voor PMN migratie in urinewegen weefsels aanzienlijk.

Hoewel minder goed begrepen dan migratie over endotheliale barrières, heeft de passage van PMN over maag-en pulmonale epitheliale barrières veel studie 4,5 ontvangen. Transepitheliaal neutrofielmigratie modellen die permeabel ondersteunt en gekweekte epitheelcellen dienst is gebleken een aantal van de signalering evenementen en adhesie moleculen betrokken bij de beweging van PMN via deze epitheel. Voorlopige studies met gekweekte epitheelcellen urine suggereren de betrokkenheid van intercellulaire adhesiemolecuul-1 (ICAM-1) en β-integrine CD11b/CD18 (Mac-1) in PMN migratie via urine weefsels 15. Het is onduidelijk welke extra signaalwegen en lijm moleculen betrokken zijnin deze complexe processen in de urinewegen. Met behulp van de transuroepithelial neutrofielmigratie model hierin beschreven, misschien aangevuld met microscopisch onderzoek 14,15, kan deze fundamentele en vele andere vragen worden ondervraagd. Bovendien, in samenhang met bacteriële genetica, kan dit model worden gebruikt om verder te evalueren pathogeen-specifieke fenotypes, zoals onderdrukking van PMN migratie UPEC. Het is onduidelijk op welk punt in de multi-stap proces van PMN migratie UPEC oefent zijn onderdrukkend effect. Ook het mechanisme waardoor YbcL beïnvloedt PMN migratie nog worden opgehelderd. Door eerst begrijpen van de fundamentele eisen voor de passage van PMN in de blaas epitheel, kunnen we dan beginnen gepeild hoe UPEC manipuleert deze processen ziekte vergemakkelijken.

Samengevat, terwijl talrijke technieken bestaan ​​om de beweging van cellen te bestuderen, minder benaderingen beschikbaar voor celmigratie ondervragen over cellulaire barrières. WIJZIGIns naar de Boyden-kamer hebben een integraal onderdeel van het onderzoek naar cel migratie over endotheliale en epitheliale barrières geweest. Een handelbaar in vitro model van de acute ontstekingsreactie in de urinewegen, zoals de transuroepithelial neutrofielen migratieanalyse hierin beschreven, is een waardevol instrument voor het uitlezen van deze complexe processen. Tenslotte zouden wijzigingen in deze assay onderzoek naar andere ziekten van de urinewegen te vergemakkelijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) verleent R01-DK080752 en P50-DK064540. Wij danken J. Loughman voor haar inspanningen bij de vaststelling van deze test.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Transwell Inserts (i.e. permeable supports) Corning 3472 6.5 mm, 3 μm pore, polyester membrane insert
BD Vacutainer Blood Collection Tubes Becton, Dickinson and Company (BD) 366480 16 mm x 100 mm x 10 ml green cap tubes containing sodium heparin
BD Safety-Lok Blood Collection and Infusion Set Becton, Dickinson and Company (BD) 367281 21 G x 0.75 in needle x 12 in tubing
BD Vacutainer one-use, nonstackable holder Becton, Dickinson and Company (BD) 364815
Dextran Sigma-Aldrich D4876 From Leuconostoc mesenteroides
Ficoll-Paque PLUS density centrifugation solution GE Healthcare 17-1440-02
Ultra-Low Attachment Plates Corning 3473 24-well, clear flat bottom
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLF) Sigma-Aldrich F3506 Reconstituted in DMSO to 10 mM
Recombinant Human CXCL8/IL-8 R&D Systems 208-IL Reconstituted in PBS to 100 μg/ml

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
  2. Zigmond, S. H. Orientation chamber in chemotaxis. Methods Enzymol. 162, 65-72 (1988).
  3. Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. A new direct-viewing chemotaxis chamber. J. Cell Sci. 99 (Pt. 4), 769-775 (1991).
  4. Chin, A. C., Parkos, C. A. Pathobiology of neutrophil transepithelial migration: implications in mediating epithelial injury. Annu. Rev. Pathol. 2, 111-143 (2007).
  5. Zemans, R. L., Colgan, S. P., Downey, G. P. Transepithelial migration of neutrophils: mechanisms and implications for acute lung injury. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 40, 519-535 (2009).
  6. Loughman, J. A., Hunstad, D. A. Attenuation of human neutrophil migration and function by uropathogenic bacteria. Microbes Infect. 13, 555-565 (2011).
  7. Lau, M. E., Loughman, J. A., Hunstad, D. A. YbcL of uropathogenic Escherichia coli suppresses transepithelial neutrophil migration. Infect. Immun. 80, 4123-4132 (2012).
  8. Loughman, J. A., Hunstad, D. A. Induction of indoleamine 2,3-dioxygenase by uropathogenic bacteria attenuates innate responses to epithelial infection. J. Infect. Dis. 205, 1830-1839 (2012).
  9. Foxman, B. The epidemiology of urinary tract infection. Nat. Rev. Urol. 7, 653-660 (1038).
  10. Haraoka, M., et al. Neutrophil recruitment and resistance to urinary tract infection. J. Infect. Dis. 180, 1220-1229 (1999).
  11. Billips, B. K., et al. Modulation of host innate immune response in the bladder by uropathogenic Escherichia coli. Infect. Immun. 75, 5353-5360 (2007).
  12. Bozeman, P. M., Learn, D. B., Thomas, E. L. Assay of the human leukocyte enzymes myeloperoxidase and eosinophil peroxidase. J. Immunol. Methods. 126, 125-133 (1990).
  13. Lee, W. Y., Chin, A. C., Voss, S., Parkos, C. A. In vitro neutrophil transepithelial migration. Methods Mol. Biol. 341, 205-215 (2006).
  14. Säve, S., Mohlin, C., Vumma, R., Persson, K. Activation of adenosine A2A receptors inhibits neutrophil transuroepithelial migration. Infect. Immun. 79, 3431-3437 (2011).
  15. Agace, W. W., Patarroyo, M., Svensson, M., Carlemalm, E., Svanborg, C. Escherichia coli induces transuroepithelial neutrophil migration by an intercellular adhesion molecule-1-dependent mechanism. Infect. Immun. 63, 4054-4062 (1995).
  16. Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. A murine model of urinary tract infection. Nat. Protoc. 4, 1230-1243 (2009).

Tags

Immunologie uropathogene Neutrofielen blaas epitheel de migratie van neutrofielen aangeboren immuniteit urineweginfectie
Kwantitatieve beoordeling van Human migratie van neutrofielen door een Gekweekte blaas epitheel
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lau, M. E., Hunstad, D. A.More

Lau, M. E., Hunstad, D. A. Quantitative Assessment of Human Neutrophil Migration Across a Cultured Bladder Epithelium. J. Vis. Exp. (81), e50919, doi:10.3791/50919 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter