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Immunology and Infection

एक सभ्य मूत्राशय उपकला भर में मानव न्युट्रोफिल प्रवास के गुणात्मक मूल्यांकन

Published: November 7, 2013 doi: 10.3791/50919
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Pediatrics, Washington University School of Medicine, 2Department of Molecular Microbiology, Washington University School of Medicine

Summary

हम uropathogenic कोलाई के साथ मूत्राशय के संक्रमण के दौरान तीव्र भड़काऊ प्रतिक्रिया का एक महत्वपूर्ण घटक है कि mimics इन विट्रो मॉडल विकसित किया है. transuroepithelial न्युट्रोफिल प्रवास परख जीवाणु संक्रमण या chemoattractant पदार्थों के जवाब में, पारगम्य समर्थन करता है पर सुसंस्कृत, मूत्राशय epithelia भर में मानव न्युट्रोफिल प्रवास के मात्रात्मक आकलन सक्षम बनाता है.

Abstract

सूजन की साइट के लिए परिधि से प्रतिरक्षा कोशिकाओं की भर्ती किसी भी mucosal सतह पर सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में एक आवश्यक कदम है. मूत्राशय के संक्रमण के दौरान, polymorphonuclear leukocytes (PMN, neutrophils) खून से विस्थापित और मूत्राशय उपकला पार. एक neutrophilic प्रतिक्रिया के अभाव में संक्रमण को हल करने में विफलता मूत्राशय बचाव में PMN के महत्व को दर्शाता है. मूत्राशय उपकला, uropathogenic Escherichia कोलाई (UPEC) के औपनिवेशीकरण की सुविधा, मूत्र पथ के संक्रमण (UTIs) के बहुमत की प्रेरणा का एजेंट, आंशिक रूप से परिभाषित तंत्र की एक किस्म का उपयोग तीव्र भड़काऊ प्रतिक्रिया गीला हो जाना. आगे मेजबान और जीवाणु रोगज़नक़ के बीच परस्पर क्रिया की जांच, हम UPEC को सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के इस पहलू की इन विट्रो मॉडल विकसित किया है. Transuroepithelial न्युट्रोफिल प्रवास परख में, Boyden कक्ष पर एक बदलाव, सुसंस्कृत मूत्राशय epithelial कोशिकाओं एक पारगम्य समर्थन के नीचे पर संगम बड़े हो रहे हैं. PMN मानव शिरापरक रक्त से अलग कर रहे हैं और मूत्राशय उपकला सेल परतों के basolateral ओर करने के लिए लागू कर रहे हैं. जीवाणु संक्रमण या chemoattractant अणुओं के जवाब में physiologically प्रासंगिक basolateral करने वाली शिखर दिशा का प्रतिनिधित्व PMN प्रवास एक hemocytometer का उपयोग प्रगणित है. इस मॉडल UPEC और कोशिकाओं के बीच बातचीत की जांच करने के साथ ही PMN से मूत्राशय epithelia की चंक्रमण के लिए आणविक आवश्यकताओं को पूछताछ के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. transuroepithelial न्युट्रोफिल प्रवास मॉडल मूत्राशय में UPEC को प्रारंभिक भड़काऊ प्रतिक्रिया के बारे में हमारी समझ को आगे होगा.

Introduction

पूरे शरीर में कोशिकाओं का आंदोलन, अक्सर लंबी दूरी पार, वृद्धि और विकास, घाव भरने, और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक है. सेल प्रवास जटिल है और संकेत cascades और cytoskeletal घटकों के पुनर्निर्माण सहित कई विभिन्न प्रक्रियाओं के समन्वय की आवश्यकता है. प्रकोष्ठों परिभाषित रासायनिक ढ़ाल (कीमोटैक्सिस) की ओर बेतरतीब ढंग से (किसी रासायनिक पदार्थ द्वारा किसी जीव की क्रियाशीलता का बढ़ जाना) को स्थानांतरित करने के साथ ही कर सकते हैं. कई तकनीक इन विट्रो में सेल प्रवास अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है. सबसे पुराना और सबसे आम तकनीक, Boyden कक्ष, एक chemoattractant पदार्थ नीचे कक्ष और ब्याज की कोशिकाओं में रखा गया है जहां एक खड़ी दो कक्ष प्रणाली के होते हैं शीर्ष कक्ष 1 में रखा जाता है. दो कक्षों को अलग परिभाषित आकार के pores के साथ पारगम्य फिल्टर भर में कोशिकाओं के आंदोलन पर नजर रखी जाती है. अतिरिक्त तकनीक Zigmond कक्ष 2 और डन कक्ष सहित सेल प्रवास जांच करने के लिए विकसित किया गया है3. ये सामूहिक दृष्टिकोण कई अलग अलग प्रकार की कोशिकाओं के आंदोलन में महत्वपूर्ण जानकारी प्राप्त हुए है.

किसी रासायनिक पदार्थ द्वारा किसी जीव की क्रियाशीलता का बढ़ जाना और chemotaxis के बुनियादी सिद्धांतों से पूछताछ करने के अलावा, दो कक्ष assays के बाह्य मैट्रिक्स घटकों और दोनों endothelial और उपकला सेल परतों के माध्यम से सेल प्रवास की जांच में मदद की है. अन्य तकनीकों पर दो कक्ष सिस्टम का एक फायदा झरझरा झिल्ली ऐसे कोलेजन या फाइब्रिनोजेन के रूप में प्रोटीन के साथ लेपित किया जा सकता है, और एक बाह्य मैट्रिक्स की तरह बाधा पार सेल प्रवास का आकलन किया जा सकता है. इसके अतिरिक्त, सभ्य सेल लाइनों से बढ़ा है और पारगम्य समर्थन करता है पर भेदभाव किया जा सकता है. एक endothelial बाधा पार कोशिकाओं के आंदोलन की जांच करने के लिए, सुसंस्कृत endothelial कोशिकाओं पारगम्य समर्थन के ऊपरी जलाशय में वरीयता प्राप्त और बड़े हो रहे हैं. ऐसे प्रतिरक्षा कोशिकाओं के रूप में चलता - फिरता कोशिकाओं, एन भर में कम जलाशय में ऊपरी जलाशय और प्रवास के लिए जोड़ रहे हैंशारीरिक शिखर करने वाली basolateral दिशा में dothelial बाधा मनाया जाता है. इस मॉडल को रक्त प्रवाह से बाहर प्रतिरक्षा कोशिकाओं के परिस्त्राव समझने में अमूल्य किया गया है. माइग्रेशन transendothelial के विपरीत, एक उपकला बाधा पार कोशिकाओं के आंदोलन को आम तौर पर basolateral करने वाली शिखर दिशा में होता है. इन विट्रो में इन घटनाओं मॉडल के क्रम में, शोधकर्ताओं बीज और पारगम्य समर्थन के नीचे पर सुसंस्कृत उपकला कोशिकाओं को विकसित. चलता - फिरता कोशिकाओं basolateral करने वाली शिखर दिशा का प्रतिनिधित्व उपकला बाधा पार ऊपरी जलाशय और प्रवास, के लिए जोड़ रहे हैं, पर नजर रखी है. Transepithelial प्रवास के इस तरह के मॉडल काफी mucosal सतहों पर भड़काऊ प्रतिक्रियाओं, विशेष रूप से फेफड़ों के उन और 4,5 पेट की हमारी समझ के लिए योगदान दिया है.

इसके विपरीत, मूत्र पथ के उपकला के माध्यम से प्रतिरक्षा सेल की तस्करी काफी कम ध्यान दिया गया है. हमारे understandi आगे करने के लिएएक मूत्राशय उपकला बाधा 6 भर में आंदोलन, (न्युट्रोफिल PMN) एनजी uropathogenic Escherichia कोलाई (UPEC) के साथ संक्रमण के दौरान मूत्र मार्ग में सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के कारण, हम polymorphonuclear ल्युकोसैट की जांच में सक्षम बनाता है कि इन विट्रो परख, transuroepithelial न्युट्रोफिल प्रवास परख, विकसित -8. Transepithelial प्रवास के अन्य दो कक्ष मॉडल के रूप में, सुसंस्कृत मानव मूत्राशय उपकला कोशिकाओं एक पारगम्य समर्थन के नीचे पर वृद्धि हुई है और मिला हुआ उपकला परतों रूप कर रहे हैं. शिरापरक रक्त से अलग मानव neutrophils, उपकला परत की basolateral ओर करने के लिए लागू कर रहे हैं, और physiologically प्रासंगिक basolateral करने वाली शिखर दिशा में उपकला भर में प्रवास ई. के विभिन्न प्रकारों के साथ संक्रमण के जवाब में मात्रा निर्धारित है कोली या chemoattractant अणुओं की उपस्थिति. अधिक से अधिक शोध अतिरिक्त प्रकार की कोशिकाओं के अभाव में, न्युट्रोफिल आंदोलन पर किसी रासायनिक पदार्थ द्वारा किसी जीव की क्रियाशीलता का बढ़ जाना और chemotaxis दोनों ध्यान केंद्रित किया था. यह खाते में संक्रमण के दौरान मूत्राशय उपकला कोशिकाओं और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के बीच जटिल संबंधों के रूप में लेता transuroepithelial न्युट्रोफिल प्रवास परख फायदेमंद है. इस विनयशील में इन विट्रो मॉडल uroepithelial सतहों पर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की विस्तृत जांच की अनुमति की क्षमता है.

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Protocol

1. 5637 मूत्राशय उपकला संवर्धन कोशिकाओं

एक लामिना का प्रवाह ऊतक संस्कृति हुड पराबैंगनी विकिरण के साथ तैयार है और 70% इथेनॉल के साथ नीचे साफ में निम्नलिखित चरणों का प्रदर्शन.

  1. 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) [करार दिया RPMI +] युक्त RPMI 1640 मध्यम तैयार, फिल्टर एक पानी के स्नान में 0.22 सुक्ष्ममापी ताकना आकार फिल्टर का उपयोग बाँझ, और गर्म करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस.
  2. 5637 कोशिकाओं की एक cryovial पिघलना (अमेरिकी प्रकार संस्कृति संग्रह HTB-9, मूत्राशय कार्सिनोमा से प्राप्त) एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में. जल्दी से 20 मिलीलीटर RPMI + युक्त एक 75 सेमी 2 टिशू कल्चर कुप्पी thawed कोशिकाओं को हस्तांतरण.
  3. कोशिकाओं लगभग 95% मिला हुआ (फ्लास्क प्रति ~ 6 x 10 6 कोशिकाओं), के बारे में 4 दिनों के हैं जब तक 5% सीओ 2 के साथ एक humidified वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर फ्लास्क सेते हैं.
  4. 5637 कोशिकाओं उपसंस्कृति के लिए:
    1. कुप्पी से मध्यम निकालें. 10 मिलीलीटर है Dulbecco फॉस्फेट बफर सलिन साथ कोशिकाओं को धो लेंकमरे के तापमान पर ई (DPBS).
    2. 6 मिलीलीटर गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) 0.05% trypsin, फ्लास्क को 0.02% EDTA समाधान जोड़ें, और 15 मिनट के लिए 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
    3. 5 मिनट के लिए 300 XG पर centrifugation द्वारा एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब, और गोली कोशिकाओं स्थानांतरण. Trypsin / EDTA समाधान निकालें.
    4. 20 मिलीलीटर RPMI + युक्त एक नया 75 सेमी 2 फ्लास्क 6 मिलीलीटर RPMI + (10 6 कोशिकाओं / एमएल), और स्थानांतरण 1 मिलीलीटर (10 6 कोशिकाओं) में कोशिकाओं Resuspend.
  5. कोशिकाओं 95% संगम तक पहुँचने जब हर 4 दिनों कोशिकाओं उपसंस्कृति के लिए 1.4 कदम दोहराने या.

2. पारगम्य समर्थन करता है पर 5637 कोशिकाओं सीडिंग और बढ़ते

सड़न रोकनेवाला तकनीक का उपयोग कर एक टिशू कल्चर हुड में निम्नलिखित चरणों का प्रदर्शन. इष्टतम परिणामों के लिए, कम से कम 10 उपसंस्कृतियाँ आया है कि 5637 की कोशिकाओं का उपयोग करें.

  1. बाँझ संदंश का प्रयोग, एक बाँझ 25 मिमी गहरी ऊतक संस्कृति डिश में पारगम्य समर्थन पलटना.
    2. 2 फ्लास्क Trypsinize.
  2. एक 1000 μl विंदुक का प्रयोग, धीरे से एक hemocytometer का उपयोग गिनती सेल द्वारा निर्धारित 3 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल के एक एकाग्रता के लिए ~ 2 मिलीलीटर RPMI + में कोशिकाओं resuspend.
  3. झिल्ली को छूने के बिना प्रत्येक पारगम्य समर्थन करने के लिए सेल निलंबन (1.5 x 10 5 कोशिकाओं) का 50 μl लागू करें. डिश पर ढक्कन प्लेस, और ध्यान से अधिक नहीं 16 से अधिक घंटे के लिए 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर पकवान.
  4. अच्छी तरह से प्रति 0.6 मिलीलीटर RPMI + युक्त एक 24 अच्छी तरह से थाली में बाँझ संदंश, सही पारगम्य समर्थन करता है का उपयोग करना. प्रत्येक पारगम्य समर्थन के ऊपरी जलाशय में 0.1 मिलीलीटर RPMI + जोड़ें. 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
  5. हर 2 दिनों के माध्यम से बदलें. तो सबसे पहले, महाप्राण निचले जलाशय के द्वारा पीछा ऊपरी जलाशय से मध्यम और निचले जलाशय (0.6 मिलीलीटर) के लिए, उल्टे क्रम में ताजा RPMI + लागू करते हैं और फिर ऊपरी अनुसंधान कौशलrvoir (0.1 मिलीलीटर).
  6. सात दिनों 5637 कोशिकाओं के साथ पारगम्य समर्थन बोने के बाद, कोशिकाओं के संगम का आकलन करें. RPMI + (~ 0.35 मिलीग्राम) के साथ ऊपरी जलाशय भरें. मध्यम ऊपरी और निचले जलाशय के बीच संतुलित नहीं है जब कोशिकाओं को पर्याप्त मिला हुआ हैं.

3. बैक्टीरियल inoculum की तैयारी

  1. सड़न रोकनेवाला तकनीक का उपयोग करना, एक टोपी के साथ एक 250 मिलीलीटर कुप्पी को उचित संस्कृति शोरबा के 20 मिलीलीटर जोड़ें. ई. के लिए Luria-Bertani (पौंड) शोरबा का प्रयोग करें कोली संस्कृतियों, और जहां उचित शोरबा के लिए एंटीबायोटिक दवाओं जोड़ने.
  2. एक बाँझ टीका पाश का उपयोग करना, एक ग्लिसरॉल स्टॉक से बैक्टीरिया या एक लकीर थाली के साथ शोरबा टीका लगाना. UPEC उपभेदों के लिए, (टाइप 1 पिली के उत्पादन को बढ़ावा देने के लिए) मिलाते हुए बिना, लगभग 16 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर बैक्टीरिया संस्कृति सेते हैं.
  3. एक अपकेंद्रित्र ट्यूब जीवाणु संस्कृति स्थानांतरण. 10 मिनट के लिए 8000 XG पर centrifugation द्वारा बैक्टीरिया गोली.
  4. सतह पर तैरनेवाला छानना, और ~ 10 9 CFU / एमएल के बराबर, = 1.000 600 आयुध डिपो पीबीएस में बैक्टीरिया resuspend.
    1. एक गर्मी मारे बैक्टीरियल उत्तेजना उत्पन्न करने के लिए, एक विभाज्य 30 मिनट के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर resuspended बैक्टीरिया की (150 μl में जैसे ~ 1.5 x 10 8 CFU) सेते हैं. बैक्टीरियल मौत की पुष्टि करने के लिए गर्मी के मारे निलंबन के एक विभाज्य प्लेट.
  5. तुरंत उपयोग से पहले, resuspended बैक्टीरिया (लाइव या गर्मी मारे) 10 गुना गर्म सीरम मुक्त RPMI में 8 CFU / एमएल 10 के एक microfuge ट्यूब में [RPMI करार दिया] पतला.

4. परिधीय रक्त से मानव neutrophils के अलगाव

वयस्क स्वयंसेवकों से रक्त का संग्रह अग्रिम समीक्षा और एक संस्थागत समीक्षा बोर्ड से अनुमोदन की आवश्यकता है. उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनें और ठीक से मानव रक्त के लिए जोखिम से बचने के लिए खतरनाक पदार्थों के निपटान के.

  1. एक स्वस्थ वयस्क वी से शिरापरक रक्त के लगभग 25 मिलीलीटरolunteer शिराछदन में प्रशिक्षित कर्मचारियों द्वारा 3 बाँझ सोडियम हेपरिन युक्त रक्त संग्रह ट्यूबों में तैयार किया जाना चाहिए.
    1. कसकर कोहनी से ऊपर, ऊपरी बांह के चारों ओर एक रबर बंधन लपेटो.
    2. एक बाँझ 70% शराब पोंछे का उपयोग कर, प्रवेश साइट, कोहनी के सामने खात कीटाणुरहित.
    3. एक पंख तितली सुई प्रणाली के लिए एक प्लास्टिक की ट्यूब धारक संलग्न करें.
    4. सामना करना पड़ रहा एक 30 डिग्री के कोण या कम, बेवल में एक कोहनी के सामने नस में सुई डालें. रक्त की एक उछाल प्लास्टिक टयूबिंग में प्रकट होता है जब सुई नस की हवा निकाल दी है.
    5. प्लास्टिक ट्यूब धारक में एक रक्त संग्रह ट्यूब डालें. पहला संग्रह ट्यूब भरा हुआ है, दूसरा संग्रह ट्यूब के साथ बदलें. तीसरे ट्यूब के साथ दोहराएँ.
    6. तीसरी संग्रह ट्यूब लगभग आधा भरा हुआ है, बंधन हटा दें.
    7. एक बाँझ कपास की गेंद के साथ पंचर साइट को कवर किया और धीरे धीरे नस से सुई वापस ले लें. सुई और जगह मैं अधिक रक्षात्मक ढाल स्लाइडNA biohazard कंटेनर sharps.
    8. पंचर साइट के लिए दबाव लागू करें. एक चिपकने वाली पट्टी के साथ पंचर साइट और कपास की गेंद को कवर किया.
    9. धीरे हेपरिन फैलाने के लिए रक्त संग्रह ट्यूबों पलटना.

सड़न रोकनेवाला तकनीक का उपयोग कर एक टिशू कल्चर हुड में निम्नलिखित चरणों का प्रदर्शन.

  1. एक 10 एमएल पिपेट का उपयोग, धीरे से एक ताजा, बाँझ 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब रक्त हस्तांतरण. 3% के एक बराबर मात्रा (w / v) dextran 0.9% NaCl में जोड़ें और उलटा द्वारा मिश्रण. 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ईमानदार ट्यूब सेते हैं.
  2. निचली परत बाधा पहुँचा के बिना, ध्यान से ऊपरी परत aspirate और एक नया 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब को हस्तांतरण. 10 मिनट के लिए 300 XG पर centrifugation द्वारा गोली कोशिकाओं. सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
  3. रक्त का मूल्य उस मात्रा के बराबर 0.9% NaCl के एक मात्रा में सेल गोली Resuspend.
  4. सेल निलंबन, पी के तहत घनत्व centrifugation के समाधान के 10 एमएल परतदो चरणों के बीच इंटरफेस के आरक्षण. कोई ब्रेक के साथ 30 मिनट के लिए 400 XG पर अपकेंद्रित्र. सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
  5. शेष लाल रक्त कोशिकाओं lyse करने के लिए, 10 मिलीलीटर ठंड 0.2% NaCl में सेल गोली resuspend. 30 सेकंड के लिए सेते हैं, और फिर तुरंत isotonicity बहाल करने के लिए 10 मिलीलीटर ठंड 1.6% NaCl जोड़ें.
  6. 6 मिनट के लिए 300 XG पर centrifugation द्वारा गोली कोशिकाओं. सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
  7. सेल गोली लाल रक्त कोशिकाओं, सेल के आम तौर पर 3 राउंड से मुक्त हो गया लगता है जब तक दोहराएँ 4.6-4.7 कदम.
  8. एक 1000 μl विंदुक का प्रयोग, में, सेल गोली, मुख्य रूप से PMN resuspend गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) RPMI से सेल एक hemocytometer का उपयोग गणना के द्वारा निर्धारित 10 7 कोशिकाओं / एमएल के एक एकाग्रता,. उपयोग तक 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं रखें. क्रमशः, धुंधला के बाद परमाणु आकारिकी की trypan नीले बहिष्कार और दृश्य द्वारा मूल्यांकन के रूप में आमतौर पर, PMN व्यवहार्यता और पवित्रता> 99% हैं.

5. Transuroepithelial न्युट्रोफिल प्रवास के रूप मेंकहना

सड़न रोकनेवाला तकनीक का उपयोग कर एक टिशू कल्चर हुड में निम्नलिखित चरणों का प्रदर्शन. कदम 2.7 में निर्धारित के रूप में, मिला हुआ 5637 सेल परतों असर केवल पारगम्य समर्थन करें. जिसमें 24 अच्छी तरह प्लेटें RPMI कर सकते हैं पहले से तैयार और 5% सीओ 2 का उपयोग करें जब तक साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाना.

  1. विभाज्य 1 एक 24 अच्छी तरह से थाली में RPMI प्रति अच्छी तरह से गर्म एमएल, पारगम्य समर्थन प्रति 3 कुओं तैयार करते हैं.
  2. पारगम्य समर्थन के ऊपरी और निचले जलाशय से मध्यम Aspirate.
  3. बाँझ संदंश का प्रयोग, कदम 5.1 में तैयार 24 अच्छी तरह से थाली करने के लिए पारगम्य समर्थन हस्तांतरण. अच्छी तरह से अच्छी तरह से करने के लिए समर्थन के हस्तांतरण से पारगम्य समर्थन तीन बार धोएं.
  4. एक जीवाणु inoculum इस्तेमाल किया जा रहा है, एक बाँझ 25 मिमी गहरी ऊतक संस्कृति डिश में पारगम्य समर्थन पलटना. एक chemoattractant (जैसे, एन formyl-मिले-लियू-Phe (fMLF) या आईएल -8) का इस्तेमाल किया जा रहा है, 5.6 कदम आगे बढ़ना.
  5. लाइव या मारे BACT साथ प्रयोगों के लिएerial उत्तेजनाओं, 60 μl RPMI-(नकली संक्रमण) के साथ या बैक्टीरियल inoculum 3.5 चरण में तैयार (6 x 10 6 CFU) के साथ प्रत्येक पारगम्य समर्थन के शिखर की ओर टीका लगाना. डिश पर ढक्कन प्लेस और 1 घंटे के लिए 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
  6. 24 अच्छी तरह से कम लगाव थाली करने के लिए अच्छी तरह से RPMI प्रति 0.6 मिलीलीटर जोड़ें, पारगम्य समर्थन प्रति अच्छी तरह से 1 तैयार करते हैं. RPMI करने PMN इनपुट गिनना 0.5 मिलीलीटर युक्त 3 कुओं को तैयार है.
    1. एक chemoattractant बैक्टीरिया के स्थान पर प्रयोग किया जा रहा है, तो चरण 5.6 में तैयार 24 अच्छी तरह से थाली RPMI में 0.6 मिलीलीटर chemoattractant जोड़ें.
  7. 24 अच्छी तरह से कम लगाव थाली में राइट पारगम्य समर्थन करता है.
  8. प्रत्येक पारगम्य समर्थन के ऊपरी जलाशय (basolateral पक्ष) के लिए, कदम 4.9 में तैयार 0.1 मिलीलीटर PMN (10 6 PMN), जोड़ें. सीधे 500 μl युक्त कुओं को 100 μl PMN जोड़ें RPMI-. 1 घंटे के लिए 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
  9. बाँझ संदंश का प्रयोग, धीरे परिमार्जनअच्छी तरह से किनारे के खिलाफ पारगम्य समर्थन की झिल्ली शिखर की ओर से अतिरिक्त PMN हटाने और फिर समर्थन के निपटान के लिए.
  10. धीरे 1000 μl विंदुक टिप के साथ अच्छी तरह से प्रत्येक के नीचे scraping द्वारा PMN लीजिए, और ट्यूब microfuge को PMN निलंबन हस्तांतरण.
  11. एक hemocytometer का उपयोग PMN की गणना करें.
  12. निचले जलाशय में PMN की कुल संख्या की गणना करने के लिए, 6000 से 1 मिमी 2 में PMN की संख्या (100 NL) गुणा. PMN संख्या 10 6 इनपुट PMN को समान्य रूप डाटा इनपुट PMN के प्रतिशत के रूप में सूचित किया जा सकता है या.

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Representative Results

transuroepithelial न्युट्रोफिल प्रवास परख विभिन्न उत्तेजनाओं (चित्रा 1 बी) के जवाब में सुसंस्कृत मूत्राशय उपकला सेल परतों में मानव PMN प्रवास के मात्रात्मक आकलन सक्षम बनाता है. प्रोटोकॉल सरल है, PMN प्रवास को प्रभावित करने और फलस्वरूप इस परख के reproducibility प्रभावित कर सकते हैं कि चर के एक नंबर रहे हैं. तकनीकी और जैविक प्रतिकृति के बीच परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए पारगम्य समर्थन करता है और PMN तैयार करते समय उपाय किए जाने चाहिए. उदाहरण के लिए, पर्याप्त मिला हुआ 5637 सेल परतों से युक्त केवल पारगम्य समर्थन करता है एक प्रयोग में इस्तेमाल किया जाना चाहिए. 5637 कोशिकाओं के संगम तरल को अभेद्य उपाय है कि एक कार्यात्मक परख का उपयोग मूल्यांकन किया है. ऊपरी जलाशय में जोड़ा मध्यम पारगम्य समर्थन भर equilibrates, तो 5637 कोशिकाओं प्रयोग आचरण करने के लिए पर्याप्त रूप से मिला हुआ नहीं कर रहे हैं. ऊपरी जलाशय में मात्रा बनाए रखा है, तो permeसक्षम समर्थन PMN प्रवास का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हम कोशिकाओं के संगम पर विनय बढ़ जाता है जो इस प्रणाली में transepithelial विद्युत प्रतिरोध मापा है, इस विधि चुना है, देखभाल अन्यथा बाँझ सेटअप को दूषित करने के लिए नहीं लिया जाना चाहिए. 7 दिनों बोने के बाद 5637 कोशिकाओं के संगम कोशिकाओं के पारित होने संख्या और पारगम्य समर्थन पर वरीयता प्राप्त कोशिकाओं की संख्या सहित कई कारकों से प्रभावित किया जा सकता है. इसके अलावा, 5637 कोशिकाओं बोने के दौरान उलट स्थिति में पारगम्य समर्थन पर incubated हैं कि समय की राशि 16 घंटा (चित्रा 1 ए) से अधिक नहीं होनी चाहिए. इष्टतम reproducibility के लिए, प्रोटोकॉल ठीक से पालन किया जाना चाहिए. अंत में, मिला हुआ 5637 सेल परतों से युक्त पारगम्य समर्थन 1-2 दिनों के भीतर किया जाना चाहिए, और समर्थन की झिल्ली 5637 कोशिकाओं के विकास या transuroepithelial न्युट्रोफिल प्रवास परख के दौरान या तो दौरान छुआ नहीं किया जाना चाहिए.

एक में5637 कोशिकाओं को ddition, परिवर्तनशीलता भी PMN तैयारी के दौरान पेश किया जा सकता है. इस संख्या में व्यक्ति से व्यक्ति को बदलता है, हालांकि PMN अलग करने के लिए ऊपर विस्तृत प्रोटोकॉल का उपयोग करना, मानव रक्त का 1 मिलीलीटर आमतौर पर, के बारे में 10 6 PMN पैदावार. एक व्यक्ति दाता के रक्त की ठेठ उपज जाना जाता है, एक बार अलगाव प्रोटोकॉल नीचे तदनुसार से पहुंचा जा सकता है. अस्वस्थ या बीमार व्यक्तियों से PMN से बचा जाना चाहिए, और अलग PMN दाताओं मनाया परिणामों प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हैं यह सुनिश्चित करने के लिए जैविक प्रतिकृति के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. PMN अलगाव के दौरान सक्रियण से बचने के लिए धीरे और aseptically नियंत्रित किया जाना चाहिए. PMN एक बार शरीर से निकाल समय की विस्तारित अवधि के लिए जीवित नहीं है के रूप में अंत में, प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं का समय महत्वपूर्ण है. हम अलगाव की प्रक्रिया को पूरा करने के 1 घंटे के भीतर PMN उपयोग. इन बातों को देखते हुए कम से कम 3 तकनीकी replicates प्रत्येक जैविक को दोहराने में शामिल किया जाना चाहिए.

की संख्या1 घंटा बाद निचले जलाशय में PMN 10 6 इनपुट PMN के लिए सामान्यीकृत (चित्रा 2) में दिखाया गया है. वैकल्पिक रूप से, PMN संख्या जैविक प्रतिकृति के बीच भिन्नता को कम कर सकते हैं, जो इनपुट PMN, को सामान्य बनाने के बाद एक आंतरिक नियंत्रण की तुलना में किया जा सकता है. विस्तार पर ध्यान के साथ ऊपर उल्लिखित प्रोटोकॉल का पालन बैक्टीरिया (2A चित्रा) और chemoattractant पदार्थ (चित्रा 2B) सहित उत्तेजनाओं के जवाब में PMN प्रवास की गणना में सक्षम बनाता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. प्रयोगात्मक डिजाइन के योजनाबद्ध. (ए) 5637 मूत्राशय उपकला कोशिकाओं उल्टे पारगम्य समर्थन करता है पर वरीयता प्राप्त कर रहे हैं, का समर्थन करता है एक 24 अच्छी तरह से थाली में righted कर रहे हैं, और कोशिकाओं संगम बड़े हो रहे हैं. (बी) Permeaमिला हुआ 5637 कोशिकाओं से युक्त ble समर्थन ई. के साथ उल्टे और संक्रमित हैं उपकला परतों के शिखर ओर कोलाई. वैकल्पिक रूप से, chemoattractants निचले जलाशय में रखा जा सकता है. पारगम्य समर्थन करता है एक कम लगाव थाली में righted कर रहे हैं, और हौसले से अलग मानव PMN (उपकला परतों के basolateral पक्ष का प्रतिनिधित्व) ऊपरी जलाशय को लागू कर रहे हैं. PMN उपकला में प्रवास और एक hemocytometer का उपयोग कम जलाशय से enumerated हैं.

चित्रा 2
चित्रा 2. PMN विभिन्न उत्तेजनाओं के जवाब में मूत्राशय epithelia में प्रवास. Nonpathogenic ई. के साथ (ए) के संक्रमण कोलाई तनाव MG1655, गर्मी मारे MG1655 (HKMG) या UPEC उत्परिवर्ती UTI89 ybcL :: बिल्ली काफी अधिक PMN migratio elicitsn जंगली प्रकार UPEC तनाव UTI89 साथ नकली संक्रमण या संक्रमण से, एक cystitis (*, पी <0.001) को अलग. (बी) के नकली उपचार (*, पी <0.001) की तुलना में काफी अधिक PMN प्रवास में निचले जलाशय के परिणाम को fMLF (100 एनएम) या आईएल -8 (100 एनजी / एमएल) के अलावा के. डेटा कम से कम 3 जैविक प्रतिकृति से मतलब है और मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं. सांख्यिकीय महत्वपूर्ण अंतर एक unpaired छात्र टी परीक्षण का उपयोग कर निर्धारित किया गया है.

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Discussion

एक सुसंस्कृत मूत्राशय उपकला कोशिका लाइन और हौसले से अलग मानव PMN का उपयोग करना, हम transuroepithelial न्युट्रोफिल प्रवास के इन विट्रो मॉडल की स्थापना की. इस मॉडल मूत्र मार्ग के संक्रमण (यूटीआई) के दौरान सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, आम तौर पर UPEC 9 की वजह से एक बहुत ही आम जीवाणु संक्रमण की जटिलताओं को काटना करने के लिए शुरुआत में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है. मूत्राशय, या cystitis के संक्रमण के दौरान, मूत्राशय लुमेन को PMN की भर्ती बैक्टीरियल निकासी 10 के लिए आवश्यक है. एक भड़काऊ प्रतिक्रिया के चेहरे में एक पैर जमाने की स्थापना, UPEC UPEC प्रतिरक्षा दबाव 6,11 के अभाव में मूत्राशय उपकला आक्रमण कर सकते हैं अवधि के दौरान जो prolongs जो मूत्राशय, को PMN के आगमन में देरी. इस phenotype, जल्दी समय बिंदुओं पर UPEC द्वारा PMN प्रवास का दमन, transuroepithelial PMN प्रवास के बारे में हमारी इन विट्रो मॉडल में मनाया जाता है. Nonpathogenic ई. के साथ संक्रमण कोलाई MG1655 elicitsuropathogenic ई. के साथ संक्रमण की तुलना में काफी अधिक PMN माइग्रेशन कोली UTI89 (2A चित्रा), MG1655 और UTI89 साथ सह संक्रमण uropathogenic फेनोटाइप (PMN प्रवास का यानी निम्न स्तर) पैदावार 6. YbcL का विलोपन 7 जंगली प्रकार UTI89 (2A चित्रा) की तुलना में कम जलाशय में काफी अधिक PMN के परिणामस्वरूप के रूप में इसके अलावा, हम दमनकारी phenotype के लिए योगदान देता है कि एक UPEC प्रोटीन, YbcL,, की पहचान की. PMN प्रवास के उच्च स्तर को भी गर्मी मारे MG1655, fMLF और आईएल -8 (आंकड़े 2A और बी) द्वारा हासिल किए गए थे. एक जीवित बैक्टीरिया प्रोत्साहन के साथ संक्रमण की तुलना में, chemoattractants का उपयोग प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल और परिणामों की व्याख्या दोनों को आसान बनाने में हो सकता है. यह अन्य chemoattractants (जैसे बैक्टीरियल उत्पादों या chemokines) भी इस मॉडल में PMN प्रकाश में लाना होगा कि संभावना है. इस प्रकार अब तक, transuroepithelial न्युट्रोफिल प्रवास गधाप्र में vivo मॉडल 6-8 में सत्यापित किया गया है कि phenotypes खुलासा UPEC से जल्दी भड़काऊ प्रतिक्रिया के दमन की जांच में मदद की है, और भविष्य के प्रयासों में एक अमूल्य उपकरण होगा.

इस परख सवालों का एक नंबर का पता करने की क्षमता है, वहीं कुछ सीमाएं हैं. तैयारी और प्रतिकृति के बीच reproducibility सुनिश्चित करने के लिए प्रयोगों का आयोजन करते हुए इस परख के लिए निहित चर की संख्या को देखते हुए, ध्यान रखा जाना चाहिए. गिनती गहन समय हो सकता है और PMN अल्पकालिक विशेष रूप से बैक्टीरिया की उपस्थिति में, शरीर से निकाल दिया जाता है एक बार कर रहे हैं के रूप में गिनती से PMN गणना, त्रुटि की संभावना है. PMN नमूना संग्रह और PMN गणन के बीच के समय को कम ज्यादा सटीक डेटा संग्रह का परिणाम देगा. शोधकर्ताओं PMN 12,13 के लिए एक किराए के रूप में myeloperoxidase (MPO) एंजाइम की गतिविधि को मापने कि वर्णमिति assays का वर्णन किया है. ऐसे 3,3 व रूप वर्णमिति substrates उपयोग assays# 39;, 5,5 ', tetramethylbenzidine (TMB) या 2,2'-azino बीआईएस (3 ethylbenzothiazoline-6 ​​Sulphonic एसिड) (ABTS) के निचले हिस्से में PMN वर्तमान की सांद्रता का पता लगाने के लिए पर्याप्त संवेदनशील नहीं हैं (लाउ और HUNSTAD, अप्रकाशित डेटा) ऊपर विस्तृत transuroepithelial न्युट्रोफिल प्रवास प्रोटोकॉल का उपयोग जलाशयों. माइग्रेशन परख के मापदंडों के निचले जलाशय के नमूनों में PMN घनत्व बढ़ाने के लिए चालाकी से किया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, संभवतः एक फ्लोरोसेंट सब्सट्रेट का उपयोग अधिक से अधिक संवेदनशीलता के साथ एक MPO परख,, स्थापित किया जा सकता है. MPO गतिविधि की माप PMN गिनती के लिए एक विकल्प का प्रतिनिधित्व करता है और निचले जलाशय के नमूनों में PMN की अधिक सटीक गणना के लिए सक्षम हो सकता है. साथ ही, इस तरह के एक परख भी उपकला परतों के लिए और ऊपरी जलाशय में शेष PMN पक्षपाती की गणना अनुमति दे सकता है. एक मान्य MPO आधारित प्रोटोकॉल transuroep से एकत्र किया जा सकता है कि डेटा की मात्रा और प्रकार का विस्तार कर सकता है कि एक शक्तिशाली उपकरण का प्रतिनिधित्व करेंगेithelial न्युट्रोफिल प्रवास परख.

जठरांत्र संबंधी मार्ग और फेफड़ों में सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया मॉडलिंग Transepithelial न्युट्रोफिल प्रवास assays व्यापक हैं और PMN 4,5 द्वारा उपकला बाधाओं के चंक्रमण के हमारे वर्तमान को समझने के लिए जिम्मेदार हैं. इसके विपरीत, uroepithelial बाधाओं को पार PMN आंदोलन में अब तक कम ध्यान दिया गया है. बचाने के लिए और उनके सहयोगियों ने भेदभाव UROtsa कोशिकाओं से बना एक polarized उपकला का उपयोग करता है कि एक मॉडल की सूचना दी है, पारगम्य पर संगम उगाया मूत्रवाहिनी ऊतकों से निकाली गई एक अमर सेल लाइन, 14 का समर्थन करता है. Agace और उनके सहयोगियों ने एक ऐसी ही मॉडल 15 में अविभाजित मूत्राशय (J82) और गुर्दे (A498) उपकला कोशिकाओं के उपयोग की सूचना है. 5637 सेल परतों स्तरीकृत और संभावना औपचारिक रूप से polarized नहीं नहीं कर रहे हैं, हालांकि इस के साथ साथ विस्तृत transuroepithelial न्युट्रोफिल प्रवास मॉडल में, तंग जंक्शनों macromolecular को अभेद्य द्वारा मूल्यांकन, बनते हैंप्रवाह और चुस्त जंक्शन प्रोटीन (लाउ और HUNSTAD, अप्रकाशित डेटा) की अभिव्यक्ति और स्थानीयकरण. ध्यान से, उपकला परत भी हम वर्णन किया है संक्रमण की स्थिति के दौरान इस तरह अभेद्य बनाए रखता है. बचाने के लिए और Agace द्वारा रिपोर्ट प्रोटोकॉल UPEC 24 घंटे के लिए आइसोलेट्स के साथ संक्रमण के बाद भड़काऊ प्रतिक्रिया मॉडल. इन मॉडलों में, UPEC मजबूत PMN प्रवास को प्रकाश में लाना. इसके विपरीत, हमारे मॉडल में उपकला परतों मेजबान और रोगज़नक़ के बीच प्रारंभिक बातचीत की जांच के क्रम में, समय, 1 घंटा की एक अपेक्षाकृत छोटी अवधि के लिए UPEC के संपर्क में हैं. इसके अलावा, एक मूत्राशय उपकला सेल लाइन का उपयोग और एक cystitis व्युत्पन्न UPEC अलग murine cystitis मॉडल 16 के लिए इन विट्रो निष्कर्षों के संभावित अनुवाद सक्षम बनाता है. अन्त में, अध्ययनों से 6 अच्छी तरह से टिशू कल्चर व्यंजन की आवश्यकता है कि उपयोग बड़े पारगम्य समर्थन करता है ऊपर उल्लेख किया है. छोटे पारगम्य समर्थन का उपयोग करते हैं, हमारे मॉडल के रूप में, अभिकर्मक उपयोग कम कर देता है और सम्मिलित की संख्या बढ़ जाती हैप्रयोग के प्रति चालाकी से किया जा सकता है कि एस. इन मॉडल प्रणालियों में से प्रत्येक फायदे और नुकसान है हालांकि, इन मॉडलों की सामूहिक क्षमता मूत्र पथ के ऊतकों में PMN प्रवास के लिए आवश्यक घटनाओं पर्याप्त है परिभाषित करने के लिए.

कम अच्छी तरह endothelial बाधाओं को पार प्रवास से समझ में आ रहा है, जठरांत्र और फेफड़े उपकला बाधाओं को पार PMN के पारित होने में ज्यादा अध्ययन 4,5 प्राप्त हुआ है. पारगम्य समर्थन करता है और सुसंस्कृत उपकला कोशिकाओं कि रोजगार Transepithelial न्युट्रोफिल प्रवास मॉडल संकेत घटनाओं और इन epithelia के माध्यम से PMN के आंदोलन में शामिल आसंजन अणुओं का कुछ पता चला है. सुसंस्कृत मूत्र उपकला कोशिकाओं का उपयोग प्रारंभिक अध्ययन कहनेवाला आसंजन अणु -1 (ICAM-1) की भागीदारी और मूत्र ऊतकों 15 के पार PMN प्रवास में β-integrin CD11b/CD18 (मैक-1) का सुझाव है. यह अतिरिक्त संकेत दे रास्ते और चिपकने वाला अणुओं को शामिल किया जाता है, जो स्पष्ट नहीं हैमूत्र पथ में इन जटिल प्रक्रियाओं में. यहाँ बताया transuroepithelial न्युट्रोफिल प्रवास मॉडल का उपयोग करना, शायद सूक्ष्म परीक्षण 14,15 के साथ संवर्धित, इन बुनियादी सवालों और कई अन्य लोगों से पूछताछ की जा सकती है. इसके अतिरिक्त, बैक्टीरियल आनुवंशिकी के साथ संयोजन के रूप में, इस मॉडल आगे इस तरह UPEC द्वारा PMN प्रवास के दमन के रूप में रोगज़नक़ विशिष्ट phenotypes का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह UPEC अपनी दमनकारी प्रभाव डालती PMN प्रवास के बहु कदम प्रक्रिया में जो बात स्पष्ट नहीं है. इसके अलावा, YbcL PMN प्रवास को प्रभावित करती है जो व्यवस्था के द्वारा अभी तक स्पष्ट हो गया है. पहला मूत्राशय उपकला भर PMN के पारित होने के लिए बुनियादी आवश्यकताओं को समझने करके, हम तो UPEC रोग की सुविधा के लिए इन प्रक्रियाओं manipulates कैसे जांच शुरू कर सकते हैं.

कई तकनीकों कोशिकाओं के आंदोलन का अध्ययन करने के लिए मौजूद हैं संक्षेप में, कम दृष्टिकोण सेलुलर बाधाओं को पार सेल प्रवास पूछताछ के लिए उपलब्ध हैं. ModificatioBoyden कक्ष को एनएस endothelial और उपकला बाधाओं को पार सेल प्रवास की जांच का अभिन्न अंग रहा है. इस तरह इस के साथ साथ विस्तृत transuroepithelial न्युट्रोफिल प्रवास परख के रूप में मूत्र पथ, में तीव्र भड़काऊ प्रतिक्रिया की विनयशील में इन विट्रो मॉडल, इन जटिल प्रक्रियाओं से पूछताछ के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है. अन्त में, इस परख के लिए संशोधन मूत्र पथ के अन्य रोग राज्यों में जांच की सुविधा सकता है.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

इस काम के स्वास्थ्य (NIH) के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा समर्थित किया गया R01-DK080752 और P50-DK064540 अनुदान. हम इस परख की स्थापना में उनके प्रयासों के लिए जे Loughman धन्यवाद.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Transwell Inserts (i.e. permeable supports) Corning 3472 6.5 mm, 3 μm pore, polyester membrane insert
BD Vacutainer Blood Collection Tubes Becton, Dickinson and Company (BD) 366480 16 mm x 100 mm x 10 ml green cap tubes containing sodium heparin
BD Safety-Lok Blood Collection and Infusion Set Becton, Dickinson and Company (BD) 367281 21 G x 0.75 in needle x 12 in tubing
BD Vacutainer one-use, nonstackable holder Becton, Dickinson and Company (BD) 364815
Dextran Sigma-Aldrich D4876 From Leuconostoc mesenteroides
Ficoll-Paque PLUS density centrifugation solution GE Healthcare 17-1440-02
Ultra-Low Attachment Plates Corning 3473 24-well, clear flat bottom
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLF) Sigma-Aldrich F3506 Reconstituted in DMSO to 10 mM
Recombinant Human CXCL8/IL-8 R&D Systems 208-IL Reconstituted in PBS to 100 μg/ml

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References

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इम्यूनोलॉजी अंक 81 uropathogenic न्युट्रोफिल मूत्राशय उपकला न्युट्रोफिल प्रवास सहज प्रतिरक्षा मूत्र पथ के संक्रमण
एक सभ्य मूत्राशय उपकला भर में मानव न्युट्रोफिल प्रवास के गुणात्मक मूल्यांकन
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Lau, M. E., Hunstad, D. A.… More

Lau, M. E., Hunstad, D. A. Quantitative Assessment of Human Neutrophil Migration Across a Cultured Bladder Epithelium. J. Vis. Exp. (81), e50919, doi:10.3791/50919 (2013).

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