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Immunology and Infection

Avaliação quantitativa de neutrófilos humanos migração através de um Cultivadas bexiga Epitélio

Published: November 7, 2013 doi: 10.3791/50919

Abstract

O recrutamento de células do sistema imunológico da periferia para o local da inflamação é um passo essencial na resposta imune inata a qualquer superfície mucosa. Durante a infecção da bexiga urinária, os leucócitos polimorfonucleares (PMN; neutrófilos) migram da corrente sanguínea e atravessar o epitélio da bexiga. A incapacidade de resolver a infecção, na ausência de uma resposta neutrofílica demonstra a importância de PMN em defesa da bexiga. Para facilitar a colonização do epitélio da bexiga, uropathogenic Escherichia coli (UPEC), o agente causador da maioria das infecções do tracto urinário (ITU), atenuar a resposta inflamatória aguda, utilizando uma variedade de mecanismos parcialmente definidas. Para investigar ainda mais a interacção entre o hospedeiro eo agente patogénico bacteriano, foi desenvolvido um modelo in vitro do presente aspecto da resposta imune inata a UPEC. No ensaio de migração de neutrófilos transuroepithelial, uma variação na câmara de Boyden, epith bexiga cultivadasElial células são cultivadas até à confluência na parte inferior de um suporte permeável. PMN são isolados a partir de sangue venoso humano e são aplicados para o lado basolateral das camadas de células epiteliais da bexiga. Migração PMN representando a direcção basolateral-para-apical fisiologicamente relevante, em resposta a uma infecção bacteriana ou moléculas quimioatratantes é enumerada utilizando um hemocitómetro. Este modelo pode ser usado para investigar interacções entre UPEC e células eucarióticas, bem como para interrogar os requisitos moleculares para a passagem do epitélio da bexiga por PMN. O modelo de migração de neutrófilos transuroepithelial irá promover nossa compreensão da resposta inflamatória inicial para UPEC na bexiga.

Introduction

O movimento das células através do corpo, muitas vezes através de longas distâncias, é necessário para o crescimento e desenvolvimento, a cicatrização de feridas, e a resposta imune. A migração celular é complexo e requer coordenação de muitos processos diferentes, incluindo cascatas de sinalização e o rearranjo dos componentes do citoesqueleto. As células podem se mover de forma aleatória (quimiocinese), bem como para gradientes químicos definidos (quimiotaxia). Muitas técnicas têm sido desenvolvidas para estudar a migração celular in vitro. A técnica mais antiga e mais comum, a câmara de Boyden, que consiste num sistema de duas câmaras verticais, onde uma substância quimioatractiva é colocada na câmara inferior e as células de interesse são colocados na parte superior da câmara 1. O movimento das células através do filtro permeável, com poros de tamanho definido, que separa as duas câmaras é controlada. Outras técnicas têm sido desenvolvidas para investigar a migração de células, incluindo a câmara de Zigmond 2 e a câmara de Dunn3. Estas abordagens coletivas produziram um panorama significativo para o movimento de muitos tipos celulares diferentes.

Além interrogar os princípios básicos da quimiocinese e quimiotaxia, ensaios de duas câmaras têm facilitado a investigação da migração de células através de componentes da matriz extracelular e as duas camadas de células endoteliais e epiteliais. Uma vantagem de sistemas de duas câmaras em relação a outras técnicas é que a membrana porosa pode ser revestida com proteínas tais como colagénio ou fibrinogénio, e a migração de células através de uma barreira de matriz extracelular, como pode ser apreciado. Além disso, as linhas de células cultivadas pode ser cultivada e diferenciado sobre os suportes permeáveis. Para investigar o movimento das células através de uma barreira endotelial, células endoteliais cultivadas são semeadas e cultivadas no reservatório superior dos suportes permeáveis. Células móveis, tais como células do sistema imunológico, são adicionados ao reservatório superior e a migração para dentro do reservatório inferior do outro lado da enbarreira endotelial no sentido fisiológico apical-para-basolateral é observada. Este modelo tem sido inestimável na compreensão de extravasamento de células do sistema imunológico para fora da corrente sanguínea. Em contraste com a migração transendotelial, o movimento das células através de uma barreira epitelial ocorre tipicamente no sentido basolateral-para-apical. A fim de modelar estas eventos in vitro, os investigadores sementes e crescer as células epiteliais cultivadas na parte inferior dos suportes permeáveis. Células móveis são adicionados ao reservatório superior e da migração através da barreira epitelial, que representa a direcção basolateral-para-apical, é monitorado. Tais modelos de migração transepitelial têm contribuído significativamente para a nossa compreensão de respostas inflamatórias na superfície das mucosas, principalmente os de pulmão e intestino 4,5.

Em contraste, o tráfico de células imunitárias através do epitélio do tracto urinário tem recebido menos atenção. Para reforçar ainda mais a nossa understanding de respostas imune inata no trato urinário durante a infecção com uropatogênica Escherichia coli (UPEC), desenvolvemos um ensaio in vitro, o ensaio de migração de neutrófilos transuroepithelial, que permite a investigação de leucócitos polimorfonucleares (PMN; neutrófilos) o movimento através de uma barreira epitelial da bexiga 6 -8. Tal como com outros modelos de duas câmaras de migração transepitelial, bexiga células epiteliais humanas cultivadas são crescidas na parte inferior de um suporte permeável e formar camadas epiteliais confluentes. Os neutrófilos humanos, isolados a partir de sangue venoso, são aplicados para o lado basolateral da camada epitelial, e migração através do epitélio na direcção basolateral-para-apical fisiologicamente relevante é quantificada em resposta à infecção por diferentes estirpes de E. coli ou a presença de moléculas de quimioatratantes. Muita investigação focou no movimento de neutrófilos, tanto quimiocinese e quimiotaxia, na ausência de tipos de células adicionais. O ensaio de migração de neutrófilos transuroepithelial é vantajosa, uma vez que leva em conta as interações complexas entre as células epiteliais da bexiga e células do sistema imunológico durante a infecção. Este modelo in vitro tratável tem o potencial de permitir a investigação aprofundada das respostas imunitárias em superfícies uroepiteliais.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Transwell Inserts (i.e. permeable supports) Corning 3472 6.5 mm, 3 μm pore, polyester membrane insert
BD Vacutainer Blood Collection Tubes Becton, Dickinson and Company (BD) 366480 16 mm x 100 mm x 10 ml green cap tubes containing sodium heparin
BD Safety-Lok Blood Collection and Infusion Set Becton, Dickinson and Company (BD) 367281 21 G x 0.75 in needle x 12 in tubing
BD Vacutainer one-use, nonstackable holder Becton, Dickinson and Company (BD) 364815
Dextran Sigma-Aldrich D4876 From Leuconostoc mesenteroides
Ficoll-Paque PLUS density centrifugation solution GE Healthcare 17-1440-02
Ultra-Low Attachment Plates Corning 3473 24-well, clear flat bottom
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLF) Sigma-Aldrich F3506 Reconstituted in DMSO to 10 mM
Recombinant Human CXCL8/IL-8 R&D Systems 208-IL Reconstituted in PBS to 100 μg/ml

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References

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Avaliação quantitativa de neutrófilos humanos migração através de um Cultivadas bexiga Epitélio
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Lau, M. E., Hunstad, D. A.More

Lau, M. E., Hunstad, D. A. Quantitative Assessment of Human Neutrophil Migration Across a Cultured Bladder Epithelium. J. Vis. Exp. (81), e50919, doi:10.3791/50919 (2013).

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