Summary
Este protocolo describe un método compatible con la microfabricación de patrón de células en SiO2. Un diseño parileno-C predefinido se fotolitográficamente impreso en SiO 2 obleas. Después de la incubación las células con suero (u otra solución de activación) se adhieren específicamente a (y crecen de acuerdo con la conformidad de) subyacente de parileno-C, mientras que siendo repelido por SiO 2 regiones.
Abstract
Plataformas de modelado celular apoyan las metas generales de la investigación, como la construcción de las redes neuronales predefinidos in vitro y la exploración de algunos aspectos centrales de la fisiología celular. Para combinar fácilmente los patrones de células con electrodos múltiples matrices (AMUMA) y basada en el silicio "laboratorio en un chip 'tecnologías, se requiere un protocolo compatible con la microfabricación. Se describe un método que utiliza la deposición del polímero de parileno-C en SiO 2 obleas. La fotolitografía permite patrón preciso y fiable de parileno-C en la resolución a nivel de micras. Activación posterior mediante inmersión en suero fetal bovino (u otra solución de activación específica) se traduce en un sustrato en el que las células cultivadas se adhieren a, o son rechazados por, parileno o SiO 2 regiones respectivamente. Esta técnica ha permitido a los patrones de una amplia gama de tipos de células (incluyendo células primarias del hipocampo murinos, células HEK 293 línea celular de teratocarcinoma, similares a neuronas humanalínea de células, las células granulares del cerebelo primaria murino y células-madre como glioma humanos derivados primarios). Curiosamente, sin embargo, la plataforma no es universal; que refleja la importancia de las moléculas de adhesión de células específicas. Este proceso de modelado celular es rentable, confiable, y esto es importante se puede incorporar en la microfabricación protocolos estándar (fabricación de chips), allanando el camino para la integración de la tecnología microelectrónica.
Introduction
La comprensión de los mecanismos que dictan la adhesión celular y los patrones en materiales sintéticos es importante para aplicaciones tales como la ingeniería de tejidos, el descubrimiento de fármacos, y la fabricación de biosensores 1-3. Muchas técnicas están disponibles y en evolución, cada uno tomando ventaja de los factores biológicos, químicos y físicos que influyen multitud de adhesión celular.
A continuación, describimos una técnica de células patrón que utiliza procesos desarrollados inicialmente para fines de fabricación microelectrónica. Como tal, la plataforma es una buena posición para permitir la integración aguas abajo de las tecnologías de la microelectrónica, como los acuerdos ambientales multilaterales, en la plataforma de modelado.
La interfaz entre una membrana celular y un material adyacente es bidireccional y compleja. In vivo, las proteínas de la matriz extracelular proporcionan estructura y resistencia y el impacto en el comportamiento celular a través de interacciones con receptores de adhesión celular. De manera similar, las células en vitro interactuar con sustratos sintéticos a través de capas de proteínas absorbidas 4 mientras influencias físico-químicas también modular la adhesión. Por ejemplo, una superficie de polímero puede hacerse más "humectable" (hidrofílico) por iones o irradiación de luz ultravioleta, o grabado por tratamiento con ácido o hidróxido de 5. Los métodos establecidos para el patrón celular se aprovechan de estos y otros mediadores de adhesión celular. Los ejemplos incluyen la impresión de inyección de tinta 6, 7 de estampado por microcontacto, la inmovilización física 8, 9 microfluídica, manipulación en tiempo real 10, y el patrón molecular selectiva de montaje (SMAP) 11. Cada uno tiene ventajas y limitaciones específicas. Un factor clave en nuestro trabajo, sin embargo, es la integración de los patrones de células con los sistemas microelectromecánicos (MEMS).
MEMS se refieren a extremadamente pequeños dispositivos mecánicos que funcionan con electricidad. Esto se superpone con la nanoescala equivalente, nanoelectromechsistemas mecánicos. Este concepto se convirtió en práctica sólo cuando las estrategias de semiconductores permitieron la fabricación que tendrá lugar en la microescala. Técnicas de microfabricación desarrollados originalmente para la electrónica de semiconductores inadvertidamente se han encontrado útiles para otros usos, como la electrofisiología celular, por ejemplo. Un objetivo clave es aguas abajo de combinar estas tecnologías microelectrónicos con un proceso de modelado de células de alta fidelidad (formando un dispositivo bioMEMS). Varias técnicas de modelado de células existentes y de otra manera fiables y prácticas son incompatibles con esta idea. Por ejemplo, la alineación precisa de ningún microelectrónica o biosensores integrados es fundamental para su eficacia, pero es extremadamente difícil de conseguir usando una técnica tal como estampado por microcontacto.
Para evitar este problema, estamos trabajando en una plataforma de modelado basado en 2 SiO que utiliza fotolitográficamente impresa parileno-C. La fotolitografía implica la transferencia de características geométricas deuna máscara a un sustrato a través de iluminación UV. Una máscara se ha diseñado utilizando un programa de diseño asistido por ordenador adecuado. Después de una placa de vidrio, una capa delgada de cromo no transparente representa el patrón geométrico deseado (una resolución característica de 1-2 mm es posible). El sustrato para ser modelado está recubierta con una fina capa de resina fotosensible (un polímero sensible a UV). El polímero recubierto se alinea entonces y se pone en estrecho contacto con la máscara. Una fuente de UV se aplica de tal manera que las áreas no protegidas son irradiados y por lo tanto se vuelven solubles y extraíble en el siguiente paso de desarrollo, dejando una representación de parileno-C del patrón de máscara detrás. Este proceso se originó durante el desarrollo de dispositivos semiconductores. Como tal, las obleas de silicio se utilizan con frecuencia como un sustrato. Deposición de fotolitografía de parileno-C sobre SiO2 es, por tanto, un proceso sencillo y confiable que se lleva a cabo de manera rutinaria en las instalaciones de sala blanca de microelectrónica.
Mientras parileno tienevarias características deseables de bioingeniería (químicamente inerte, no biodegradable), un factor de la restricción de su uso directo en la morfogénesis celular es su innata mala adhesividad celular, que se atribuye en parte a su extrema hidrofobicidad. Sin embargo, parileno-C se ha utilizado anteriormente indirectamente para el patrón de células, por ejemplo, como una plantilla de desprendimiento celular 12,13. Este enfoque está limitado por la mala resolución y requiere múltiples etapas. El proceso descrito aquí en lugar utiliza un paso de grabado ácido, seguido de la incubación de suero, para asegurar que las regiones de parileno-C se convierten en células-adhesivo, a través de una combinación de reducción de la hidrofobicidad de proteínas y suero de unión.
El resultado final es una construcción compuesta de dos sustratos diferentes que, después de la activación biológica, manifiestan respectivas características cito-adhesivas o cito-repulsivo y así representa una plataforma eficaz golpeteo celular. Es importante destacar que no hay necesidad de introducir AG biológicapadres en la instalación de sala blanca como los sustratos estructurados se pueden almacenar indefinidamente antes de su uso (después de lo cual se activan utilizando suero bovino fetal u otra solución de activación).
Por tanto, esta plataforma de modelado parylene-C/SiO 2 es un buen candidato para una coalición con componentes MEMS, como los procesos de fabricación por lo que reflejan de cerca las utilizadas para la fabricación microelectrónica.
Protocol
1. Fabricación de Patrones Parileno sobre SiO2: Flujo de procesos (Ver Figura 1)
- Diseño desea la configuración parileno-C utilizando un paquete de software editor de diseño, capaz de leer / escribir CIF (Caltech forma intermedia) o los archivos GDS-II (Base de Datos de gráfico System-II). CIF y GDS-II son formatos de archivo estándar de la industria para el diseño de obras de circuito integrado.
- Máscara foto Comisión fabricar a un centro de microelectrónica apropiadas, o hacer en casa si cuenta con instalaciones.
- Oxidar una oblea de silicio en un horno horizontal atmosférica (H 2 1.88 SLM y O 2 1.25 SLM) a 950 ° C durante 40 minutos para producir una capa de SiO2 200 nm (confirmar espesor con una pequeña mancha espectroscópica reflectómetro).
- Cebe la oblea oxidado con un promotor de adherencia de silano. Ahora depositar parileno-C a 22 ° C a una velocidad de 1.298 nm / mg de dímero utilizando un sistema de deposición al vacío diseñado específicamente para depositar parileno. Un 100recubrimiento nm de espesor de parileno-C se utiliza para todos los ejemplos que se muestran a continuación.
- Siguiente depósito hexametildisilazano (HMDS) promotor de la adhesión en la oblea parylene recubierto utilizando un sistema adecuado recubrimiento fotorresistente.
- Ahora girar la oblea a 4000 rpm durante 30 segundos mientras se aplica positivo fotorresistente (que resulta en un espesor teórico de 1 m), utilizando el mismo sistema de revestimiento de resina fotosensible como anteriormente.
- Soft hornear la oblea de 60 segundos a 90 ° C.
- Inserte tanto la oblea y la máscara de la foto prefabricada en un alineador de la máscara.
- Exponer la oblea de resina fotosensible recubierto con una representación negativa de UV de la configuración de parileno-C deseada.
- Hornee oblea expuesta durante 60 segundos a 110 ° C.
- Retire todos los expuestos fotorresistente de la oblea mediante el desarrollo de una solución de revelado adecuado.
- Grabe de la parylene sin protección. Utilizar un sistema de plasma de oxígeno de grabado (a una presión de la cámara 50 mTorr, 49 sccm O 2, 100 W de potencia de RF a 13,56 MHz, yuna velocidad de grabado de 100 nm / min) para revelar el SiO subyacente 2.
- Dice la oblea usando una sierra cortar en cubitos apropiado (velocidad del husillo de 30.000 rpm, velocidad de alimentación de 7 mm / s).
- Enjuague fichas en H2O desionizada y secar con nitrógeno.
- Tienda fichas (indefinidamente) en cajas libres de polvo hasta que sea necesario.
2. Limpiar las virutas y Activación: Protocolo
- Eliminar fotorresistente residual de virutas por lavado en acetona durante 10 seg.
- Enjuague con agua desionizada H 2 O destilada 3x.
- Maquillaje ácido piraña fresco (una relación de 05:03 de peróxido de hidrógeno al 30% y ácido sulfúrico al 98%).
PRECAUCIÓN: Prepare ácido piraña con gran cuidado. Es un oxidante muy potente, es fuertemente ácido, y la mezcla de peróxido de hidrógeno con ácido sulfúrico es una reacción exotérmica. Lleve a cabo esta etapa en una campana de extracción de ácido. Permita 2 min para pasar después de mezclar el ácido piraña pero utilizan menos de 20 min. - Virutas limpias y grabado por inmersión en piácido Ranha durante 10 min.
- Enjuague fichas 3x en H2O desionizada y se transfieren a una placa de cultivo estéril.
- Ahora active chips para modelar celular. Por ejemplo, agregue dos chips por pocillo de una placa de 6 pocillos y después agregue 2 ml de suero fetal bovino a fin de sumergirse completamente todos los chips. Realice esto, y todas las etapas posteriores de cultivo de células, en condiciones estériles en una campana de cultivo de tejido de flujo laminar.
- Incubar fichas en suero durante 3-12 horas a 37 ° C.
NOTA: Los pasos 2.4 hasta 2.7 se debe realizar de forma secuencial y sin demora entre los pasos. Si la activación de suero tiene un retraso de 24 horas después de ≥ piraña tratos, patrón celular se deteriora debido a la reducción de repulsión celular de SiO2 regiones.
Soluciones alternativas de activación que contienen proteínas específicas de adhesión celular pueden ser utilizados en lugar de suero bovino fetal. Tales soluciones alteran las características de adhesión celular de los dos sustratos contrastantes (ver resultados representativos para un ejemplo).3. Plating Líneas Celulares On-chip: Protocolo
- Quite las virutas de su solución de activación y lavar una vez durante 10 segundos en solución salina equilibrada de Hank.
- Coloque el chip en un pocillo de cultivo y la placa de tipo de célula elegida como una suspensión en su medio de crecimiento habitual. Óptima densidad de placas de células depende tanto del tipo de célula y el patrón geométrico de parileno-C en el chip. Una densidad de 5 x 10 4 células / ml es un punto de partida razonable.
- Imaging se adapta a la motivación subyacente para el patrón celular, pero el comportamiento de células en vivo puede ser fácilmente evaluada utilizando un microscopio de disección y una cámara digital con una lente de relé adecuado.
Representative Results
El proceso fotolitográfico de modelar SiO2 con parileno-C se ilustra en la Figura 1. Una vez preparada, la activación de los chips en el suero bovino fetal permite una amplia gama de tipos de células para ser modelados en la cultura. Nuestro grupo ha modelado con éxito las células del hipocampo primaria murino 14-16, la línea celular HEK 293 17, el teratocarcinoma neurona como humana (hNT) línea celular 18, las células granulares del cerebelo primaria murino y células-madre como glioma humanos derivados primarios.
La Figura 3 ilustra el patrón robusto de las células HEK 293 en un patrón de parileno que consiste en nodos circulares con extensiones retícula. La activación de la viruta en este ejemplo fue con suero bovino fetal. Por el contrario, la Figura 4 ilustra el potencial para aumentar la plataforma de patrón mediante el uso de soluciones de activación alternativa. El uso de una solución de albúmina de suero bovino (3 mg / ml) y se fibronectina (1 g / ml) en HBSS, el precepto patrón anterior ha sido invertida.
La Figura 5 ilustra un tipo de célula diferente (una línea primaria derivada de humanos de vástago celular derivada de un glioma de alto grado). Aquí, la geometría de la conducta celular impactos patrón subyacente, con el patrón que se muestra en la Figura 4A promover el crecimiento celular a lo largo de proceso delgada de parileno-C pistas como se muestra en las figuras 4B y 4C.
Algunos tipos de células no hacen patrón cuando se utiliza el protocolo de activación de suero bovino fetal establecida. Figura 6 ilustra células 3T3 L1 crecimiento hasta confluencia sin diferencia cito-repulsivo o cito-adhesivo discernible entre parileno-C y SiO 2 regiones.
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Figura 1. Diagrama de flujo que ilustra el proceso para la fabricación de los patrones de parileno-C sobre SiO2.
Figura 2. Diagrama de flujo que ilustra los cambios en el ángulo de contacto para estampadas parileno-C y SiO 2 dominios durante pasos de activación de chip.
Figura 3. Imágenes de células vivas de 293 células HEK cultivadas en parylene-C/SiO 2 después de tres días in vitro. Fichas incubaron durante 3 horas en el suero fetal bovino después de lo cual las células fueronchapado en suspensión a una concentración de 5 x 10 4 células / ml. Parylene-C promueve la adhesión celular mientras desnuda SiO2 repele las células. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Imágenes de células vivas de células HEK 293 cultivadas en parylene-C/SiO 2 después de tres días in vitro chips activados durante 3 horas en diferentes soluciones de activación racionalizada:. A: suero fetal bovino, B: vitronectina (1 mg / ml) en HBSS, C: albúmina de suero bovino (3 mg / ml) + vitronectina (1 mg / ml) en HBSS, D: albúmina de suero bovino (3 mg / ml) + fibronectina (156; g / ml) en HBSS. Las células en placas fueron en suspensión a una densidad de 5 x 10 4 células / ml. Tenga en cuenta lo diferente que el tratamiento del chip ha resultado en la inversión del dogma del patrón anterior, con SiO2 ahora adhesiva y parileno-C repulsivo. Parylene-C Diámetro del nodo 250 micras, adaptado de Hughes et al. 17 Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. Inmunofluorescencia imágenes de células-madre como glioma humanos derivados primarios cultivados en varios patrones de parileno-C sobre SiO2 A:. Esquemático que ilustra el diseño parylene reticular se muestra en B y C B:.. Fluorescencia micrografía de las células fijas (después de 4 días in vitro) se tiñeron para la proteína ácida glial fibrilar (GFAP) C:. Micrografía de luz de células vivas en mismo chip D: imagen de fluorescencia que muestra células con tinción de GFAP en un parylene diferente . Diseño E:. imagen de reflectancia del nodo y habló diseño parylene reflejado en D Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6. Imágenes de células vivas de células 3T3 L1 cultivadas en parylene-C/SiO 2 después de cuatro días in vitro. Fichas activados durante 3 horas en el suero fetal bovino después de wcélulas hich se sembraron en suspensión (3 x 10 4 células / ml). En este caso, la plataforma no permite modelar, con células confluentes convertirse igualmente en parileno-C y SiO2 regiones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Inmersión de virutas en ácido piraña sirve no sólo para eliminar cualquier material orgánico residual, pero también graba las superficies del substrato. Esto es clave para permitir la activación efectiva con suero fetal bovino. De no hacerlo, evita que la célula-patrón y altera profundamente el comportamiento de células en el chip. No hay ningún requisito para esterilizar los chips después de la limpieza con ácido pirañas. De hecho la esterilización por exposición a rayos UV se ha demostrado para socavar patrón celular de una manera dependiente de la dosis 13. Se debe tener cuidado al lavar toda fotoprotector residual después del proceso de fotolitografía. La persistencia de resina fotosensible puede actuar como una capa de cito-adhesivo no deseado que anula patrón dictado por parylene-C/SiO 2 geometría. La acetona es eficaz cuando se utiliza el proceso de fotolitografía se ha descrito anteriormente y con los reactivos especificados. Sin embargo, otros tipos de resina fotosensible pueden requerir un disolvente diferente.
Para evaluar el impacto y el éxito de la difereetapas de fabricación nt, el ángulo de contacto de los dos sustratos contrastantes se pueden medir. Figura 2 ilustra las alteraciones que se producen durante el proceso de activación de chip. Es probable, sin embargo, que el adhesivo específico y componentes de la proteína de repulsión en el suero en última instancia, permiten que el chip de parileno-modelado para ejercer sus respectivas características cito-adhesivas o cito-repulsiva.
Todos los resultados representativos utilizan los chips con un espesor parylene de 100 nm, aunque hemos modelado con éxito el uso de capas de parileno tanto más gruesas y más delgadas. Es importante destacar que esta técnica de grabado fotolitográfico permite un control mucho mayor de tres dimensiones de la configuración de parileno que la ilustrada aquí. Por ejemplo, utilizando una combinación de fotomáscaras, es posible crear regiones de parileno de espesor mixta. Esto abre el camino para la creación de cultivos celulares con la topografía tridimensional definida, va más allá de simplemente dictando las regiones de adhesión celular / repulsiónsión, que podría ofrecer un medio para integrar los canales de microfluidos en el constructo.
Como se muestra, sin embargo, esta plataforma patrón no es universalmente eficaz en todos los tipos de células. Diferentes líneas celulares, con sus variados perfiles de moléculas de adhesión celular, como era de esperar se comportan de manera diferente cuando se cultivan en esta plataforma. Todavía no hemos identificado los componentes clave en el suero, ni a los receptores de la membrana celular de cortesía, que se basa esta plataforma celular-patrón. Si lo hace, en el futuro promete ampliar su utilidad y especificidad. Por ejemplo, una línea celular de 'no-patrones' podría ser modificado genéticamente para expresar la molécula de adhesión necesaria y así promover patrones.
Disclosures
Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por una beca doctoral Wellcome Trust Clínica (ECAT).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Layout editor software package | CleWin 5.0 from WieWeb | Capable of reading/writing CIF or GDS-II files. Used to create parylene design for photo mask manufacture. http://www.wieweb.com/ns6/index.html | |
| Bespoke photo mask | Compugraphics International Ltd, Glenrothes, Scotland | Either fabricate in-house of facilities exist or commission. www.compugraphics-photomasks.com | |
| 3 in Silicon wafers | Siltronix, Archamps, France | http://www.siltronix.com | |
| Atmospheric horizontal furnace | Sandvik | For oxidizing silicon wafer. http://www.mrlind.com | |
| Small spot spectroscopic reflectometer | Nanometrics | To measure depth of silicon dioxide layer. www.nanometrics.com/ | |
| Silane adhesion promoter | Merck Chemicals | 1076730050 | Preapplied to wafer to encourage parylene deposition. www.merck-chemicals.de/ |
| Parylene-C | Ultra Electronics | www.ultra-cems.com | |
| SCS Labcoter 2 deposition Unit, Model PDS2010 | SCS Equipment, Surrye, UK | Model PDS2010 | www.scscoatings.com/ |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) adhesion promoter | SpiChem | www.2spi.com | |
| Automated track system for dispensing photoresist on wafers; 3 in photo-resist track | SVG (silicon Valley Group) | Automated track system for dispensing photoresist on wafers. A prime oven bakes the wafer and dispenses the adhesion promoter, HMDS. A combination spinner dispenses photoresist. Prebake oven cures the resist. | |
| Photo-resist | Rohm & Haas | SPR350-1.2 positive photo-resist | www.rohmhaas.com/ |
| MA/BA8 photo-mask aligner | Suss Microtech | www.suss.com | |
| Microchem MF-26A developer | Microchem | Removes exposed regions of photoresist. www.microchem.com | |
| JLS RIE80 plasma etch system | JLS Designs | Removes exposed regions of parylene. www.jlsdesigns.co.uk |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DISCO DAD 680 Wafer dicing saw | DISCO Corporation, Japan | www.disco.co.jp | |
| Acetone | Fisher Scientific | A929-4 | To wash off residual photoresist. |
| 30% Hydrogen Peroxide | Sigma-Aldrich | H1009 | www.sigmaaldrich.com |
| 98% Sulfuric Acid | Sigma-Aldrich | 435589 | www.sigmaaldrich.com |
| Fetal Bovine Serum | Gibco-Invitrogen | 10437 | Standard chip activation. www.invitrogen.com |
| Hank's Balanced Salt Solution | Gibco-Invitrogen | 14170 | www.invitrogen.com |
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