Summary
इस प्रोटोकॉल 2 Sio पर सेल patterning के लिए एक microfabrication संगत विधि का वर्णन करता है. एक पूर्वनिर्धारित parylene सी डिजाइन photolithographically Sio 2 वेफर्स पर छपा हुआ है. सीरम (या अन्य सक्रियण समाधान) के साथ ऊष्मायन के बाद कोशिकाओं को विशेष रूप से पालन करना (और के अनुरूप के अनुसार हो जाना) 2 Sio क्षेत्रों से खदेड़ा जा रहा whilst अंतर्निहित parylene सी.
Abstract
सेल patterning प्लेटफार्मों ऐसे पूर्वनिर्धारित इन विट्रो neuronal नेटवर्क के निर्माण और सेलुलर फिजियोलॉजी के कुछ केंद्रीय पहलुओं की खोज के रूप में व्यापक अनुसंधान लक्ष्यों का समर्थन करते हैं. आसानी से बहु इलेक्ट्रोड सरणियों (meas) के साथ सेल patterning गठबंधन करने के लिए और प्रौद्योगिकियों सिलिकॉन आधारित 'एक चिप पर प्रयोगशाला', एक microfabrication संगत प्रोटोकॉल की आवश्यकता है. हम Sio 2 वेफर्स पर बहुलक parylene सी के बयान का इस्तेमाल करता है कि एक विधि का वर्णन. Photolithography माइक्रोन स्तर के प्रस्ताव पर parylene सी की सटीक और विश्वसनीय patterning के लिए सक्षम बनाता है. भ्रूण गोजातीय सीरम (या किसी अन्य विशिष्ट सक्रियण समाधान) संवर्धित कोशिकाओं का पालन करना, या क्रमशः parylene या Sio 2 क्षेत्रों द्वारा repulsed हैं जिसमें एक सब्सट्रेट में परिणाम में विसर्जन द्वारा बाद में सक्रियण. इस तकनीक को प्राथमिक murine हिप्पोकैम्पस कोशिकाओं, HEK 293 सेल लाइन, मानव न्यूरॉन की तरह teratocarcinoma सहित प्रकार की कोशिकाओं (के एक विस्तृत रेंज के patterning अनुमति दी गई हैसेल लाइन, प्राथमिक murine अनुमस्तिष्क ग्रेन्युल कोशिकाओं, और प्राथमिक मानव glioma व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं की तरह). दिलचस्प है, हालांकि, मंच सार्वभौमिक नहीं है; सेल विशिष्ट आसंजन अणुओं के महत्व को दर्शाती है. इस सेल patterning प्रक्रिया विश्वसनीय, लागत प्रभावी है, और महत्वपूर्ण बात microelectronic प्रौद्योगिकी के एकीकरण का रास्ता साफ मानक microfabrication में (चिप निर्माण) प्रोटोकॉल शामिल किया जा सकता है.
Introduction
सिंथेटिक सामग्री पर सेल आसंजन और patterning हुक्म तंत्र समझ है कि इस तरह के ऊतक इंजीनियरिंग, दवाओं की खोज, और biosensors 1-3 के निर्माण के रूप में आवेदन के लिए महत्वपूर्ण है. कई तकनीक उपलब्ध है और विकसित कर रहे हैं, सेल आसंजन को प्रभावित करने वाले असंख्य, जैविक रासायनिक और भौतिक कारकों में से प्रत्येक लाभ लेने.
यहाँ, हम शुरू में microelectronic निर्माण उद्देश्यों के लिए विकसित प्रक्रियाओं का उपयोग एक सेल patterning तकनीक का वर्णन. जैसे, मंच patterning मंच में, इस तरह के Meas रूप microelectronic प्रौद्योगिकियों, के बहाव के एकीकरण सक्षम करने के लिए अच्छी तरह से रखा है.
एक कोशिका झिल्ली और एक बगल सामग्री के बीच इंटरफेस द्वि - दिशात्मक और जटिल है. विवो में, बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन संरचना और शक्ति और सेल आसंजन रिसेप्टर्स के साथ बातचीत के माध्यम से सेल व्यवहार पर प्रभाव प्रदान करते हैं. वी में इसी प्रकार की कोशिकाओंभौतिक रासायनिक प्रभावों भी आसंजन मिलाना, whilst itro प्रोटीन 4 से अवशोषित परतों के माध्यम से कृत्रिम substrates के साथ बातचीत. उदाहरण के लिए, एक बहुलक सतह एसिड या हाइड्रॉक्साइड 5 के साथ इलाज के द्वारा आयनों या पराबैंगनी प्रकाश विकिरण, या नक़्क़ाशी द्वारा (हाइड्रोफिलिक) अधिक "wettable" गाया जा सकता है. सेल patterning के लिए स्थापित तरीकों इन और अन्य सेल आसंजन मध्यस्थों का लाभ ले. उदाहरण 6 inkjet मुद्रण, microcontact 7 मुद्रांकन, शारीरिक स्थिरीकरण 8, microfluidics 9, वास्तविक समय हेरफेर 10, और चयनात्मक आणविक विधानसभा patterning (SMAP) 11 में शामिल हैं. प्रत्येक विशिष्ट लाभ और सीमाएं हैं. हमारे काम में एक प्रमुख ड्राइवर है, तथापि, microelectromechanical सिस्टम (MEMS) के साथ सेल patterning एकीकृत करने के लिए है.
MEMS बिजली द्वारा संचालित अत्यंत छोटे यांत्रिक उपकरणों को देखें. इस nanoscale बराबर, nanoelectromech ओव्हरलॅपanical प्रणालियों. इस अवधारणा अर्धचालक रणनीतियों microscale में जगह लेने के लिए निर्माण सक्षम केवल जब व्यावहारिक बन गया. अर्धचालक इलेक्ट्रॉनिक्स के लिए मूल रूप से विकसित तकनीक microfabrication अनजाने उदाहरण के लिए, ऐसे सेलुलर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के रूप में अन्य उपयोगों के लिए उपयोगी पाया गया है. एक प्रमुख बहाव के उद्देश्य (एक BioMEMS डिवाइस बनाने) एक उच्च निष्ठा सेल patterning प्रक्रिया के साथ इस तरह microelectronic प्रौद्योगिकियों गठबंधन है. कई मौजूदा और अन्यथा विश्वसनीय और व्यावहारिक सेल patterning तकनीक इस विचार के साथ असंगत हैं. उदाहरण के लिए, किसी भी एम्बेडेड माइक्रोइलेक्ट्रॉनिक या biosensors के सटीक संरेखण उनकी प्रभावकारिता के लिए मौलिक है, लेकिन इस तरह के microcontact मुद्रांकन के रूप में एक तकनीक का उपयोग कर प्राप्त करने के लिए बहुत मुश्किल है.
इस समस्या को दरकिनार करने के लिए, हम photolithographically मुद्रित parylene सी का उपयोग करता है कि एक 2 Sio आधारित patterning मंच पर काम कर रहे हैं. Photolithography से ज्यामितीय सुविधाओं के हस्तांतरण शामिलयूवी रोशनी के माध्यम से एक सब्सट्रेट करने के लिए एक मुखौटा. एक मुखौटा एक उपयुक्त कंप्यूटर एडेड डिजाइन कार्यक्रम का उपयोग कर बनाया गया है. एक गिलास प्लेट पर, nontransparent क्रोमियम की एक पतली परत वांछित ज्यामितीय पैटर्न (1-2 मिमी की एक विशेषता यह संकल्प संभव है) का प्रतिनिधित्व करता है. नमूनों किया जाना सब्सट्रेट photoresist की एक पतली परत (एक यूवी संवेदनशील पॉलिमर) के साथ लेपित है. लेपित बहुलक तो गठबंधन और नकाब के साथ निकट संपर्क में लाया जाता है. एक यूवी स्रोत असुरक्षित क्षेत्रों विकिरणित हैं कि इस तरह के आवेदन किया है और इसलिए पीछे मुखौटा पैटर्न के एक parylene सी प्रतिनिधित्व छोड़ने के अगले विकास कदम में घुलनशील और हटाने योग्य बन जाता है. इस प्रक्रिया अर्धचालक उपकरणों के विकास के दौरान जन्म लिया है. जैसे, सिलिकॉन वेफर्स अक्सर एक सब्सट्रेट के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं. 2 Sio पर parylene सी के photolithographic बयान इसलिए नियमित microelectronic cleanroom सुविधाओं में जगह लेता है कि एक ईमानदार और विश्वसनीय प्रक्रिया है.
Parylene है Whilstकई वांछनीय बायोइन्जिनियरिंग विशेषताओं (रासायनिक निष्क्रिय, गैर जैव degradable), सेल patterning में अपनी प्रत्यक्ष उपयोग सीमित एक कारक अपने चरम hydrophobicity हिस्से में जिम्मेदार ठहराया इसकी सहज रूप से गरीब सेल चिपचिपाहट, है. फिर भी, parylene सी में पहले एक छील दूर सेलुलर टेम्पलेट 12,13 के रूप में उदाहरण के लिए, सेल patterning के लिए परोक्ष रूप से इस्तेमाल किया गया है. यह दृष्टिकोण गरीब संकल्प द्वारा सीमित है और कई चरणों की आवश्यकता है. यहाँ वर्णित प्रक्रिया के बजाय कि parylene सी क्षेत्रों बाध्यकारी hydrophobicity और सीरम प्रोटीन में कमी का एक संयोजन के माध्यम से, सेल चिपकने वाला बन सुनिश्चित करने के लिए, सीरम ऊष्मायन द्वारा पीछा एक एसिड खोदना कदम है, का इस्तेमाल करता.
अंतिम परिणाम जैविक सक्रियण के बाद, संबंधित cyto चिपकने वाला या cyto-प्रतिकारक विशेषताओं को प्रकट करने और इसलिए एक प्रभावी सेल pattering मंच का प्रतिनिधित्व करता है, जो दो अलग substrates से बना एक निर्माण है. महत्वपूर्ण बात है, जैविक एजी शुरू करने की कोई जरूरत नहीं है(वे भ्रूण गोजातीय सीरम या अन्य सक्रियण समाधान का उपयोग कर सक्रिय कर रहे हैं, जिस) पिता cleanroom सुविधा नमूनों में substrates का उपयोग करने के लिए अनिश्चित काल के पूर्व भंडारित किया जा सकता है.
निर्माण प्रक्रिया इतनी बारीकी microelectronic निर्माण के लिए इस्तेमाल किया उन दर्पण के रूप में इस parylene-C/SiO 2 patterning मंच, इसलिए MEMS घटकों के साथ एक गठबंधन के लिए एक अच्छे उम्मीदवार हैं.
Protocol
1. 2 Sio पर Parylene पैटर्न का निर्माण: प्रक्रिया प्रवाह (चित्रा 1 देखें)
- डिजाइन को पढ़ने में सक्षम एक लेआउट संपादक सॉफ्टवेयर पैकेज, / सीआईएफ (कैलटेक मध्यवर्ती फार्म) या जीडीएस द्वितीय (ग्राफिक डाटाबेस सिस्टम द्वितीय) फाइल लिखने का उपयोग parylene सी विन्यास वांछित. सीआईएफ और जीडीएस द्वितीय एकीकृत परिपथ कलाकृति लेआउट के लिए उद्योग मानक फ़ाइल स्वरूप हैं.
- आयोग फोटो मुखौटा एक उपयुक्त माइक्रोइलेक्ट्रॉनिक की सुविधा के लिए निर्माण, या सुविधाओं मौजूद अगर घर में बनाते हैं.
- एक 200 एनएम 2 SIO परत (एक छोटी सी जगह स्पेक्ट्रोस्कोपी reflectometer साथ मोटाई की पुष्टि) के उत्पादन के लिए 40 मिनट के लिए 950 डिग्री सेल्सियस पर एक वायुमंडलीय क्षैतिज भट्ठी (एच 2 1.88 SLM और ओ 2 1.25 SLM) में एक सिलिकॉन वेफर oxidize.
- एक silane आसंजन प्रमोटर के साथ प्रधानमंत्री ऑक्सीकरण वेफर. अब विशेष रूप से parylene जमा करने के लिए बनाया गया एक बयान निर्वात प्रणाली का उपयोग कर डिमर की 1.298 एनएम / मिलीग्राम की दर से 22 डिग्री सेल्सियस पर parylene सी जमा. 100एनएम मोटी parylene सी कोटिंग नीचे दिखाया गया है सभी उदाहरण के लिए इस्तेमाल किया गया था.
- एक उपयुक्त तस्वीर का विरोध कोटिंग प्रणाली का उपयोग कर parylene में लिपटे वेफर पर अगला जमा hexamethyldisilazane (HMDS) आसंजन प्रवर्तक.
- अब आवेदन करने whilst के 30 सेकंड के लिए 4000 rpm पर वेफर स्पिन सकारात्मक रूप से ऊपर एक ही photoresist कोटिंग प्रणाली का उपयोग कर, (1 माइक्रोन का एक सैद्धांतिक मोटाई में जिसके परिणामस्वरूप) तस्वीर का विरोध.
- शीतल 90 डिग्री सेल्सियस पर 60 सेकंड के लिए वेफर सेंकना
- एक मुखौटा aligner में वेफर और premanufactured फोटो मुखौटा दोनों डालें.
- वांछित parylene सी विन्यास का एक यूवी नकारात्मक प्रतिनिधित्व के साथ photoresist में लिपटे वेफर बेनकाब.
- 110 डिग्री सेल्सियस पर 60 सेकंड के लिए खुल वेफर सेंकना
- सभी एक उपयुक्त डेवलपर समाधान में विकसित करके वेफर से फोटो विरोध उजागर निकालें.
- असुरक्षित parylene बंद खोदना. एक ऑक्सीजन प्लाज्मा नक़्क़ाशी एक 50 mTorr कक्ष दबाव में सिस्टम (49 sccm 2 हे, 13.56 मेगाहर्ट्ज पर 100 डब्ल्यू आरएफ शक्ति, और प्रयोगअंतर्निहित 2 Sio प्रकट करने के लिए 100 एनएम / मिनट) के एक खोदना दर.
- एक उपयुक्त dicing देखा (तकला गति 30,000 आरपीएम, चारा गति 7 मिमी / सेक) का उपयोग कर वेफर पासा.
- विआयनीकृत एच 2 ओ में चिप्स कुल्ला और नाइट्रोजन के साथ सूखी झटका.
- स्टोर चिप्स (अनिश्चित काल के लिए) धूल मुक्त बॉक्स में जब तक आवश्यक है.
2. चिप सफाई और एक्टिवेशन: प्रोटोकॉल
- 10 सेकंड के लिए एसीटोन में धोने से चिप्स से अवशिष्ट photoresist निकालें.
- विआयनीकृत आसुत एच 2 ओ 3x में कुल्ला.
- ताजा पिरान्हा एसिड (एक 5:03 30% हाइड्रोजन पेरोक्साइड का अनुपात और 98% सल्फ्यूरिक एसिड) को बनाओ.
चेतावनी: महान देखभाल के साथ पिरान्हा एसिड तैयार करते हैं. यह एक अत्यंत शक्तिशाली आक्सीकारक है दृढ़ता से अम्लीय है, और सल्फ्यूरिक एसिड के साथ हाइड्रोजन पेरोक्साइड मिश्रण एक एक्ज़ोथिर्मिक प्रतिक्रिया है. एक एसिड धूआं हुड में इस चरण को पूरा करें. 2 मिनट पिरान्हा एसिड मिश्रण के बाद पारित लेकिन 20 मिनट के भीतर का उपयोग करने की अनुमति दें. - गड़बड़ी में विसर्जन से स्वच्छ और खोदना चिप्स10 मिनट के लिए ranha एसिड.
- कुल्ला चिप्स विआयनीकृत एच 2 ओ में 3x और एक बाँझ संस्कृति डिश के लिए स्थानांतरण.
- अब सेल patterning के लिए चिप्स को सक्रिय करें. उदाहरण के लिए, 6 अच्छी तरह से थाली करने के लिए अच्छी तरह से प्रति दो चिप्स जोड़ने के लिए और पूरी तरह से सभी चिप्स को विसर्जित करने के लिए इतनी के रूप में तो भ्रूण गोजातीय सीरम के 2 मिलीलीटर जोड़ें. एक लामिना का प्रवाह टिशू कल्चर हुड में बाँझ शर्तों के तहत इस, और बाद के सभी सेल संस्कृति चरणों, प्रदर्शन करते हैं.
- 37 डिग्री सेल्सियस पर 3-12 घंटे के लिए सीरम में चिप्स सेते
नोट: कदम 2.4-2.7 क्रमिक रूप से और कदम के बीच देरी के बिना किया जाना चाहिए. पिरान्हा उपचार, सेल patterning के कारण 2 Sio क्षेत्रों से कम सेल प्रतिकर्षण को बिगड़ा हुआ है के बाद सीरम सक्रियण ≥ 24 घंटा से देरी हो रही है.
विशेष सेल आसंजन प्रोटीन युक्त वैकल्पिक सक्रियण समाधान भ्रूण गोजातीय सीरम के स्थान पर प्रयोग किया जा सकता है. इस तरह के समाधान दो परस्पर विरोधी substrates (उदाहरण के लिए प्रतिनिधि परिणाम देखें) के सेल आसंजन विशेषताओं को बदल.3. पर चिप चढ़ाना सेल लाइन्स: प्रोटोकॉल
- उनके सक्रियण समाधान से चिप्स निकालें और हांक संतुलित नमक के घोल में 10 सेकंड के लिए एक बार धोने.
- अच्छी तरह से एक संस्कृति में चिप रखें और अपनी सामान्य विकास मीडिया में एक निलंबन के रूप में चुना सेल प्रकार थाली. इष्टतम सेल चढ़ाना घनत्व सेल प्रकार और पर चिप parylene सी के ज्यामितीय पैटर्न पर दोनों निर्भर करता है. 5 एक्स 10 4 कोशिकाओं / एमएल के एक घनत्व एक समझदार शुरुआती बिंदु है.
- इमेजिंग सेल patterning लेकिन जीवित कोशिका व्यवहार को आसानी से एक उपयुक्त रिले लेंस के साथ एक विदारक माइक्रोस्कोप और एक डिजिटल कैमरे का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है के लिए अंतर्निहित प्रेरणा के अनुरूप है.
Representative Results
parylene सी के साथ 2 Sio patterning के photolithographic प्रक्रिया चित्रा 1 में सचित्र है. एक बार तैयार, भ्रूण गोजातीय सीरम में चिप्स की सक्रियता संस्कृति में नमूनों किया जाना सेल प्रकार की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए सक्षम बनाता है. हमारे समूह सफलतापूर्वक प्राथमिक murine हिप्पोकैम्पस कोशिकाओं 14-16, HEK 293 सेल लाइन 17, मानव न्यूरॉन की तरह teratocarcinoma (HNT) सेल लाइन 18, प्राथमिक murine अनुमस्तिष्क ग्रेन्युल कोशिकाओं, और प्राथमिक मानव glioma व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं की तरह नमूनों गया है.
चित्रा 3 'पार' बाल एक्सटेंशन के साथ परिपत्र नोड्स से मिलकर parylene तर्ज पर HEK 293 कोशिकाओं की मजबूत patterning दिखाता है. इस उदाहरण में चिप सक्रियण भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ था. इसके विपरीत, चित्रा 4 वैकल्पिक सक्रियण समाधान का उपयोग करके patterning मंच बढ़ाने के लिए क्षमता दिखाता है. गोजातीय सीरम albumin (3 मिलीग्राम / एमएल) की एक समाधान का उपयोग करना और HBSS में फ़ाइब्रोनेक्टिन (1 ग्राम / एमएल), पिछले patterning नियम उलटा कर दिया गया है.
चित्रा 5 एक अलग सेल प्रकार (एक उच्च ग्रेड glioma से व्युत्पन्न एक प्राथमिक मानव व्युत्पन्न स्टेम जैसे सेल लाइन) को दिखाता है. आंकड़े 4B और 4C में दिखाया गया है यहाँ, चित्रा -4 ए में दिखाए गए पैटर्न पतली parylene सी के साथ सेल प्रक्रिया विकास को बढ़ावा देने के साथ अंतर्निहित पैटर्न प्रभावों सेल व्यवहार की ज्यामिति, पटरियों.
स्थापित भ्रूण गोजातीय सीरम सक्रियण प्रोटोकॉल का उपयोग करते समय कुछ प्रकार की कोशिकाओं पैटर्न नहीं करते. 6 parylene सी और Sio 2 क्षेत्रों के बीच कोई discernable cyto-प्रतिकारक या cyto चिपकने वाला अंतर के साथ संगम से बढ़ 3T3 एल 1 कोशिकाओं को दिखाता है चित्रा.
pload/50929/50929fig1.jpg "/>
चित्रा 1. 2 Sio पर parylene सी पैटर्न के निर्माण के लिए प्रक्रिया illustrating आरेख प्रवाह.
चित्रा 2. चिप सक्रियण चरणों के दौरान नमूनों parylene सी और 2 Sio डोमेन के लिए संपर्क कोण में परिवर्तन को दर्शाता हुआ प्रवाह आरेख.
चित्रा 3. इन विट्रो में तीन दिनों के बाद parylene-C/SiO 2 पर सुसंस्कृत HEK 293 कोशिकाओं का जीना सेल इमेजिंग. चिप्स भ्रूण गोजातीय सीरम में 3 घंटे के लिए incubated कोशिकाओं थे जिसके बाद5 एक्स 10 4 कोशिकाओं / एमएल के एक एकाग्रता में निलंबन में चढ़ाया. Parylene सी whilst के सेल आसंजन को बढ़ावा देता नंगे 2 Sio कोशिकाओं repels. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 4. Parylene-C/SiO 2 पर 293 कोशिकाओं सुसंस्कृत HEK का लाइव सेल इमेजिंग इन विट्रो में तीन दिनों के बाद अलग युक्तिसंगत सक्रियण समाधान में 3 घंटे के लिए सक्रिय चिप्स:. एक: भ्रूण गोजातीय सीरम, बी: vitronectin HBSS में (1 ग्राम / एमएल), सी: गोजातीय सीरम albumin HBSS, डी (3 मिलीग्राम / एमएल) + vitronectin (1 ग्राम / एमएल): गोजातीय सीरम albumin (3 मिलीग्राम / एमएल) + फ़ाइब्रोनेक्टिन (156; जी / एमएल) HBSS में. मढ़वाया कोशिकाओं 5 एक्स 10 4 कोशिकाओं / एमएल के घनत्व पर निलंबन में थे. चिप के विभिन्न उपचार Sio 2 के साथ पिछले patterning हठधर्मिता, अब चिपकने वाला और parylene सी प्रतिकारक के उत्क्रमण में हुई है ध्यान दें कि कैसे. ह्यूजेस एट अल. 17 से अनुकूलित Parylene सी नोड व्यास 250 माइक्रोन, इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 5. . प्राथमिक मानव glioma व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं की तरह की Immunofluorescence छवियों 2 Sio पर parylene सी के विभिन्न पैटर्न एक पर हो: योजनाबद्ध बी और सी में दिखाया जालीदार parylene डिजाइन illustrating बी:.. Glial fibrillary अम्लीय प्रोटीन (GFAP) के लिए दाग (इन विट्रो में 4 दिनों के बाद) तय की कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति माइक्रोग्राफ सी:. एक ही चिप पर जीवित कोशिकाओं की लाइट माइक्रोग्राफ डी: एक अलग parylene पर GFAP-दाग कोशिकाओं illustrating प्रतिदीप्ति छवि . डिजाइन ई:. Reflectance नोड की छवि और विकास में imaged parylene डिजाइन बात की थी इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 6. इन विट्रो में चार दिनों के बाद parylene-C/SiO 2 पर सुसंस्कृत 3T3 एल 1 कोशिकाओं का जीना सेल इमेजिंग. डब्ल्यू के बाद भ्रूण गोजातीय सीरम में 3 घंटे के लिए सक्रिय चिप्सhich कोशिकाओं निलंबन (3 x 10 4 कोशिकाओं / एमएल) में चढ़ाया गया. इस उदाहरण में, मंच कोशिकाओं parylene सी और 2 Sio क्षेत्रों पर समान रूप से मिला हुआ बनने के साथ, patterning सक्षम नहीं है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
Discussion
पिरान्हा एसिड में चिप्स का विसर्जन न केवल कार्य करता है किसी भी अवशिष्ट कार्बनिक पदार्थ को निकालने के लिए, लेकिन यह भी सब्सट्रेट सतहों etches. इस भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ प्रभावी सक्रियण सक्षम करने के लिए महत्वपूर्ण है. ऐसा करने में विफलता सेल patterning रोकता है और गहराई पर चिप सेल व्यवहार बदल. पिरान्हा एसिड के साथ सफाई के बाद चिप्स बाँझ कोई आवश्यकता नहीं है. दरअसल यूवी जोखिम से नसबंदी एक खुराक पर निर्भर फैशन 13 में सेल patterning को कमजोर करने के लिए दिखाया गया है. केयर photolithographic प्रक्रिया के बाद सभी अवशिष्ट photoresist से धो लिया जाना चाहिए. बने photoresist parylene-C/SiO 2 ज्यामिति से तय patterning ओवरराइड करने वाली एक अवांछित cyto चिपकने वाला परत के रूप में कार्य कर सकते हैं. निर्दिष्ट अभिकर्मकों ऊपर और साथ वर्णित photolithographic प्रक्रिया का उपयोग करते समय एसीटोन प्रभावी है. हालांकि, photoresist अन्य प्रकार एक अलग विलायक आवश्यकता हो सकती है.
विभिन्न का प्रभाव और सफलता का आकलन करने के लिएNT निर्माण कदम, दो परस्पर विरोधी substrates के संपर्क कोण मापा जा सकता है. चित्रा 2 चिप सक्रियण प्रक्रिया के दौरान होने वाले परिवर्तन दिखाता है. यह सीरम में विशिष्ट चिपकने वाला और प्रतिकारक प्रोटीन घटक अंततः अपने संबंधित cyto चिपकने वाला या cyto-प्रतिकारक विशेषताओं डालती parylene नमूनों चिप है कि सक्षम, हालांकि, संभावना है.
हम सफलतापूर्वक मोटा और पतले दोनों parylene परतों का उपयोग नमूनों है, हालांकि सभी प्रतिनिधि परिणाम, 100 एनएम के एक parylene मोटाई के साथ चिप्स का इस्तेमाल किया. महत्वपूर्ण बात, इस photolithographic नक़्क़ाशी तकनीक है कि यहाँ सचित्र से parylene विन्यास की बहुत अधिक तीन आयामी नियंत्रण की अनुमति देता है. उदाहरण के लिए, photomasks का एक संयोजन का उपयोग कर, यह मिश्रित मोटाई की parylene क्षेत्रों बनाने के लिए संभव है. यह सेल आसंजन / repul की बस हुक्म क्षेत्रों से परे जाकर, परिभाषित तीन आयामी स्थलाकृति के साथ सेल संस्कृतियों बनाने के लिए रास्ते खोलता हैसायन, संभवतः निर्माण में microfluidic चैनलों को एकीकृत करने का एक साधन की पेशकश की.
दिखाया गया है, हालांकि, इस patterning मंच सार्वभौमिक सेल प्रकार भर में प्रभावी नहीं है. जब इस मंच पर सुसंस्कृत विभिन्न सेल लाइनों, उनके विभिन्न सेल आसंजन अणु प्रोफाइल के साथ, हैरानगी अलग तरह से व्यवहार करते हैं. हम अभी तक इस सेल patterning मंच पिन से जो सीरम में प्रमुख घटक है, न ही मानार्थ सेल झिल्ली रिसेप्टर्स, पहचान नहीं है. भविष्य में ऐसा करने से इसकी उपयोगिता और विशिष्टता को व्यापक बनाने का वादा किया. उदाहरण के लिए, एक 'गैर patterning' सेल लाइन आनुवंशिक रूप से अपेक्षित आसंजन अणु व्यक्त करने के लिए संशोधित और इसलिए patterning को बढ़ावा देने किया जा सकता है.
Disclosures
लेखक कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की घोषणा.
Acknowledgments
यह काम एक वेलकम ट्रस्ट क्लीनिकल पीएचडी फैलोशिप (ECAT) द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Layout editor software package | CleWin 5.0 from WieWeb | Capable of reading/writing CIF or GDS-II files. Used to create parylene design for photo mask manufacture. http://www.wieweb.com/ns6/index.html | |
| Bespoke photo mask | Compugraphics International Ltd, Glenrothes, Scotland | Either fabricate in-house of facilities exist or commission. www.compugraphics-photomasks.com | |
| 3 in Silicon wafers | Siltronix, Archamps, France | http://www.siltronix.com | |
| Atmospheric horizontal furnace | Sandvik | For oxidizing silicon wafer. http://www.mrlind.com | |
| Small spot spectroscopic reflectometer | Nanometrics | To measure depth of silicon dioxide layer. www.nanometrics.com/ | |
| Silane adhesion promoter | Merck Chemicals | 1076730050 | Preapplied to wafer to encourage parylene deposition. www.merck-chemicals.de/ |
| Parylene-C | Ultra Electronics | www.ultra-cems.com | |
| SCS Labcoter 2 deposition Unit, Model PDS2010 | SCS Equipment, Surrye, UK | Model PDS2010 | www.scscoatings.com/ |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) adhesion promoter | SpiChem | www.2spi.com | |
| Automated track system for dispensing photoresist on wafers; 3 in photo-resist track | SVG (silicon Valley Group) | Automated track system for dispensing photoresist on wafers. A prime oven bakes the wafer and dispenses the adhesion promoter, HMDS. A combination spinner dispenses photoresist. Prebake oven cures the resist. | |
| Photo-resist | Rohm & Haas | SPR350-1.2 positive photo-resist | www.rohmhaas.com/ |
| MA/BA8 photo-mask aligner | Suss Microtech | www.suss.com | |
| Microchem MF-26A developer | Microchem | Removes exposed regions of photoresist. www.microchem.com | |
| JLS RIE80 plasma etch system | JLS Designs | Removes exposed regions of parylene. www.jlsdesigns.co.uk |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DISCO DAD 680 Wafer dicing saw | DISCO Corporation, Japan | www.disco.co.jp | |
| Acetone | Fisher Scientific | A929-4 | To wash off residual photoresist. |
| 30% Hydrogen Peroxide | Sigma-Aldrich | H1009 | www.sigmaaldrich.com |
| 98% Sulfuric Acid | Sigma-Aldrich | 435589 | www.sigmaaldrich.com |
| Fetal Bovine Serum | Gibco-Invitrogen | 10437 | Standard chip activation. www.invitrogen.com |
| Hank's Balanced Salt Solution | Gibco-Invitrogen | 14170 | www.invitrogen.com |
References
- Zhi, Z. L., et al. A Versatile Gold Surface Approach for Fabrication and Interrogation of Glycoarrays. ChemBioChem. 9, 1568-1575 (2009).
- Michelini, E., Roda, A. Staying alive: new perspectives on cell immobilization for biosensing purposes. Anal. Bioanal. Chem. 402 (5), 1785-1797 (2012).
- Franks, W., Tosatti, S., Heer, F., Seif, P., Textor, M., Hierlemann, A. Patterned cell adhesion by self-assembled structures for use with a CMOS cell-based biosensor. Biosens. Bioelectron. 22 (7), 1426-1433 (2007).
- Bacakova, L., Filova, E., Parizek, M., Ruml, T., Svorcik, V. Modulation of cell adhesion, proliferation and differentiation on materials designed for body implants. Biotechnol. Adv. 29 (6), 739-767 (2011).
- Bacakova, L., Svorcik, V. Cell colonization control by physical and chemical modification of materials. In: Cell growth process: new research. Kimura, D. , Nova Science Publishers Inc. New York. 5-56 (2008).
- Sanjana, N. A fast flexible ink-jet printing method for patterning dissociated neurons in culture. J. Neurosci. Methods. 136, 151-163 (2004).
- Brittain, S., Paul, K., Zhao, X. -M., Whitesides, G. Soft lithography and micro- fabrication. Phys. World. 11, 31-36 (1998).
- Maher, M., Pine, J., Wright, J., Tai, Y. C. The neurochip: a new multielectrode device for stimulating and recording from cultured neurons. J. Neurosci. Methods. 87 (1), 45-56 (1999).
- Martinoia, S., Bove, M., Tedesco, M., Margesin, B., Grattarola, M. A simple micro- fluidic system for patterning populations of neurons on silicon micro- machined substrates. J. Neurosci. Methods. 87 (1), 35-44 (1999).
- Zeck, G., Fromherz, P. Noninvasive neuroelectronic interfacing with synaptically connected snail neurons immobilized on a semiconductor chip. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (18), 10457-10462 (2001).
- Michel, R., et al. Selective molecular assembly patterning: a new approach to micro- and nanochemical patterning of surfaces for biological applications. Langmuir. 18 (8), 3281-3287 (2002).
- Rajalingam, B., Selvarasah, S., Dokmeci, M., Khademhosseini, A. Generation of static and dynamic patterned cocultures using microfabricated parylene-C stencils. Lab Chip. 7, 1272-1279 (2007).
- Reusable, reversibly sealable parylene membranes for cell and protein patterning. J. Biomed. Mater. Res. A. Wright, D., Rajalingam, B., Karp, J., Selvarah, S., Ling, Y., Yeh, J., Langer, R., Dokmeci, M., Khademhosseini, A. 85 (2), 530-538 (2008).
- Delivopoulos, E., Murray, A. F., MacLeod, N. K., Curtis, J. C. Guided growth of neurons and glia using microfabricated patterns of parylene-C on a SiO2 background. Biomaterials. 30, 2048-2058 (2009).
- Delivopoulos, E., Murray, A. F., Curtis, J. C. Effects of parylene-C photooxidation on serum-assisted glial and neuronal patterning. J. Biomed. Mater. Res. A. 94, 47-58 (2010).
- Delivopoulos, E., Murray, A. F. Controlled adhesion and growth of long term glial and neuronal cultures on parylene-C. PLoS One. 6 (9), (2011).
- Hughes, M. A., Bunting, A., Cameron, K., Murray, A. F., Shipston, M. J. Modulating patterned adhesion and repulsion of HEK 293 cells on micro-engineered parylene-C/SiO2 substrates. J. Biomed. Mat. Res. Mater. A. 101 (2), 349-357 (2013).
- Unsworth, C. P., Graham, E. S., Delivopoulos, E., Dragunow, M., Murray, A. F. First human hNT neurons patterned on parylene-C/silicon dioxide substrates: Combining an accessible cell line and robust patterning technology for the study of the pathological adult human brain. J. Neurosci. Methods. 194, 154-157 (2010).
