Summary
Designer nucleaser såsom zinkfinger nukleaser (ZFNs) og transskription aktivator-lignende effektor nucleaser (TALENS) kan anvendes til at modificere genomet af muse præimplantations embryoner ved at udløse både homolog ende sammenføjning (NHEJ), og homolog rekombination (HR) veje. Disse fremskridt gør det muligt hurtig generering af mus med præcise genetiske modifikationer.
Abstract
Transgene mus, der bærer stedspecifikke genom modifikationer (knockout, knock-i) er af afgørende betydning for at dissekere komplekse biologiske systemer samt til modellering af menneskelige sygdomme og afprøvning terapeutiske strategier. Nylige fremskridt i brugen af designer nucleaser såsom zink finger nucleaser (ZFNs), transskription aktivator-lignende effektor nucleaser (Talens), og de grupperede regelmæssigt ad hinanden korte palindromiske gentagelser (CRISPR) / CRISPR-associeret (Cas) 9. system for site- specifik genom teknik åbner mulighed for at foretage en målrettet genom modifikation i stort set alle laboratorie arter uden at skulle stole på embryonale stamceller (ES)-teknologi. Et genom redigering eksperiment starter typisk med identifikation af designer nukleaseresistente målwebsteder inden for et gen af interesse, efterfulgt af opførelsen af brugerdefinerede DNA-bindende domæner til at dirigere nukleaseaktiviteten til investigator-definerede genomisk locus. Designer nuclease plasmider er in vitro </ Em> transkriberes til at frembringe mRNA for mikroinjektion af befrugtede muse-oocytter. Her giver vi en protokol for at opnå målrettet genom modifikation ved direkte injektion af TALEN mRNA til befrugtede museoocytter.
Introduction
Mus er langt den mest populære platform til at generere transgene dyremodeller. Den alsidige værktøjskasse til gensplejsning af muse embryo 1-3 er for nylig blevet udvidet med genom redigering metoder baseret på designer nucleases såsom zink finger nucleaser (ZFN) 4-6, transskription aktivator-lignende effektor nucleaser (Talen) 7,8, og de grupperede regelmæssigt ad hinanden korte palindromiske gentagelser (CRISPR) / CRISPR-associeret (Cas) 9 9. ZFN og TALEN fungerer som par af to specialdesignede protein-baserede DNA-bindende domæner (arrays på zinkfingerproteiner og gentag-variable di-restprodukter (RVDs), henholdsvis), der hver koblet til FokI endonukleasen 10-12. Omvendt er specificitet Cas9-medieret DNA spaltning fra transaktiverende CRISPR RNA'er (crRNA og tracrRNA, som også kan kombineres i en enkelt kimært RNA-molekyle betegnes guide RNA) 11, der handler i et kompleks medCRISPR protein.
Talens med en defineret sekvens af RVDs hurtigt kan konstrueres ved individuelle eksperimentatorer med et væld af montage strategier til at vælge fra 13-17. CRISPR/Cas9 lover endnu mindre arbejdskrævende generation af designer nucleaser dog specificitet guide RNA-DNA-binding er stadig ikke helt løst 18,19. Generering af brugerdefinerede ZFNs har hidtil været begrænset til specialiserede akademiske laboratorier og kommercielle leverandører såsom Sangamo Biosciences og Sigma CompoZr service.
Generelt genom redigering med designer nucleases sigter mod at indføre dobbelt strengbrud (DSB) på definerede genomisk loci, som efterfølgende tiltrække ikke-homolog ende sammenføjning (NHEJ) eller homolog rekombination (HR) DNA reparation machineries 10,12. NHEJ-medieret reparation af en DSB ofte resulterer i indførelsen af indsætninger og sletninger i tæt nærhed til stedet for reparation. Således NHEJ reparation cen udnyttes til at banke ud af funktionen af et mål gen ved at indføre en rammeskiftsmutation i generne protein-kodende sekvens 4,7,9. Alternativt kan defineres tilføjelse eller udskiftning af genetisk information kan opnås ved at tilvejebringe en DNA-donor sammen med designeren nukleaser. En DNA-donor omfatter investigator-designede DNA-sekvenser flankeret af homologiregioner med mållocuset og således tjene som en skabelon for DSB reparation af HR. Begge plasmider 5,6,20 og enkelt-strengede oligonukleotider 8,9,21 succes er blevet brugt som donorer. Hverken NHEJ-eller HR-medieret genom redigering kræve indførelse af en selekterbar markør i genomet af muse embryo, hvilket gør disse strategier specielt velegnet til at skabe små ændringer i nukleotidsekvensen uden at forstyrre den overordnede genetiske arkitektur.
I denne protokol beskriver vi alle væsentlige procedurer for genom redigering iembryo mus ved hjælp af Talens. Disse omfatter 1) identifikation af et TALEN målsted 22, 2) konstruktion af Talens ved golden gate kloning 13, 3) in vitro syntese af TALEN mRNA, 4) mikroinjektion af TALEN mRNA til befrugtede museoocytter, 5) kirurgiske procedurer for overførsel af embryoner og 6) analyse af TALEN-induceret mutagenese stamdyr. Vi fokuserer på TALEN mRNA mikroinjektion og screening af grundlæggerne for NHEJ-inducerede indrykninger / sletninger. Til dette formål har vi frembragt bifunktionelle Talen konstruktioner, der tillader både ekspression i mammale celler, når det transficeres plasmider og in vitro syntese af TALEN mRNA for mikroinjektion i musefostre. Disse konstruktioner omfatter en trunkeret TALE rygrad 23 fusioneret til heterodimert FokI domæner 24,25 til optimal genom redigering i pattedyrceller. Denne protokol kan også vedtages for mikroinjektion af andre designer nucleaser eller kombineret injektioner af designer nucleaserog donor-konstruktionerne (konstruktion af DNA-donorer er beskrevet fremragende tekniske publikationer Wefers et al. 26,27).
Etisk Statement
Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med de retningslinjer og regler i Cantonal Veterinærkontor Canton Zürich.
Protocol
1.. Identifikation af Talen Skud Sites
- Besøg TAL Effector Nucleotide Targeter 2,0 website (http://tale-nt.cac.cornell.edu) og vælg "TALEN Targeter".
- Indtast den sekvens af målgenet. Hvis pCAG-T7-TALEN ekspressionskonstrukter bliver brugt (figur 1C) skal du vælge "Miller et al. 2011" under "Brug en Preset Architecture" for at forudsige målwebsteder der kan målrettes med den optimale spacer længde (15-20 bp) og antal af Tale RVDs (15-20) for denne TALEN arkitektur.
- Vælg "NN" under "G Stedfortræder" (guanosin-specifikke NH RVDs er også tilgængelige, men endnu ikke grundigt testet for TALEN samling).
- Valgfrit: til andre indstillinger og valgmuligheder skal du følge vejledningen på hjemmesiden og de links, der.
- En tekstfil med potentielle target-sites er genereret, hvilket kan væreimporteres i et regneark program til mere praktisk visning. Vælg TALEN parret (r) for Golden Gate forsamling.
- Valgfrit: Sequence den genomiske region af interesse i mus stamme, der vil blive anvendt til mikroinjektion at opdage mulige enkelt nukleotid polymorfier (SNP), som måske ikke bogføres i offentlige databaser og kan potentielt forebygge nuklease bindende.
- Valgfrit: Der henvises til Tabel 3 for yderligere designer nukleaser-relaterede online ressourcer.
- De fleste plasmider kræves for ZFN og TALEN konstruktion fås Addgene:
http://www.addgene.org/special-collections/
Addgene id'er for Golden Gate TALEN kit og pattedyr Talen Ekspressionskonstruktioner i Tabel 2.
Alternativt kan bestemte funktionelle moduler såsom zink finger-domæner bestilles fra et gen syntese tjenesteudbyder.
Dette afsnit beskriver samlingen af Talens ved hjælp af en protokol, udgivet af Cermak et al. 13 fuld længde Talens er konstrueret ved hjælp to efterfølgende Golden Gate kloningstrin (Figur 1). Denne tilgang gør det muligt at inkorporering af et vilkårligt antal RVDs mellem 12 og 31 i den endelige ekspressionskonstrukter. Forsamlingen protokol er blevet tilpasset til destination vektorer designet til at generere mRNA'er (figur 1C), der udtrykker meget aktive Talens efter oocyt mikroinjektion. I øvrigt henvises til online-protokol af Golden Gate TALEN kit til at etablere og opretholde plasmid bibliotek ( http://www.addgene.org/TALeffector/goldengateV2/ ).
- Dag 1 - Golden Gate Reaction # 1 - Montering af RVD Arrays i PFUS Vektorer
- Valgfrit: For hver TALEN par designet i Protokol 1, træder DNA-sekvensen af de to målstederne (inklusive den første T, 5 'til 3') i TALEN_Voytas_Pipetting regneark til at generere en pipettering ordning for hver Golden Gate reaktion (også indtaste koncentrationer af alle plasmider, som anvendes til samlinger ). Regnearket giver også den forventede DNA-sekvensen af alle RVDs, der kan anvendes til tilpasning af sekventeringsresultaterne i afsnit 2.5.2.
- For hver unik TALEN designet i protokol nr. 1:
Hvis TALEN længde er 12-21 (standard) ved at vælge gentage variable di-rester (RVDs) 1-10 og destination vektor pFUS_A. Vælg de resterende RVDs og en pFUS_B destination vektor, fx en TALEN med 15 RVDs (herunder den sidste gentagelse, som vil blive tilføjet til den endelige samling i afsnit 2.3.3, skal du vælge RVDs 11-14 og destination vektor pFUS_B4 (figur 1A).
Hvis TALEN længde er 22-31, bruge RVDs 1-10 og destination vector pFUS_A30A. Pick RVDs 11-20 og destination vektor pFUS_A30B. Vælg de resterende RVDs og en pFUS_Bdestination vektor, f. eks. til TALEN med 24 RVDs pick RVDs 21-23 og destination vektor pFUS_B3. - Opsæt Golden Gate reaktion # 1 for hver PFU'er + RVD kombination separat, dvs 1-10 + pFUS_A og de resterende RVDs + respektive pFUS_B vektor eller TALEN længere end 21 RVDs, 1-10 + pFUS_A30A, 11-20 pFUS_A30B, og de resterende RVDs + respektive pFUS_B vektor. Brug 150 ng af hver RVD vektor, 150 ng PFUS vektor, 1 pi BsaI, 1 pi T4 DNA-ligase, 2 pi 10x T4 DNA-ligase-puffer, og H2O til 20 pi total reaktionstid volumen. (Med friske portioner af T4 ligase buffer for hver runde af Golden Gate forsamlinger er anbefales, da gentagen optøning / frysning af T4 ligasepuffer kan reducere effektiviteten af reaktionerne.)
- Placer Golden Gate reaktioner i en thermo cycler.
Program:
37 ° C 5 min
16 ° C 10 min
50 ° C 5 min
80 ° C 5 min - Tilsæt 1 pi 10 mM ATP og 1 pi Plasmid-Safe nuclease til hver blanding og inkuberes ved 37 ° C i 1 time. Denne behandling vil fjerne lineære ufuldstændige ligeringsprodukter, der kan klones ind i destination vektorer ved in vivo homolog rekombination i transformerede bakterier.
- Transformere E. coli med individuelle ligeringsreaktioner (elektrokompetente eller kemisk kompetente E. coli, der letter α-komplementering såsom XL1-Blue eller DH5a kan her og i efterfølgende omdannelser anvendes).
- Plate bakterier på spectinomycin (50 ug / ml) plader med X-Gal og IPTG (40 ug / ml hver) til blå / hvid koloni valg.
- Dag 2 - Bekræftelse af Korrekt PFUS-RVDs Assembly
- Ved hjælp af koloni PCR med primere pCR8_F1 og pCR8_R1 (Se tabel 1 for primersekvenserne) skærm 1-3 hvidkolonier fra hver plade. Korrekt PFUS-RVDs forsamlinger typisk vise et bånd svarende til den samlede længde af alle RVDs klonede (f.eks omkring 1,1 kb i 10 RVDs) og en "stiges" mindre mindre prominente bånd (figur 1b).
PCR-program:
95 ° C 3 min
95 ° C 30 sek
55 ° C 30 sek
72 ° C 1 min 45 sek
30-35 cykler
72 ° C 10 min - Brug bekræftede kloner til at starte natten over kultur (2-5 ml LB med 50 ug / ml spectinomycin).
- Ved hjælp af koloni PCR med primere pCR8_F1 og pCR8_R1 (Se tabel 1 for primersekvenserne) skærm 1-3 hvidkolonier fra hver plade. Korrekt PFUS-RVDs forsamlinger typisk vise et bånd svarende til den samlede længde af alle RVDs klonede (f.eks omkring 1,1 kb i 10 RVDs) og en "stiges" mindre mindre prominente bånd (figur 1b).
- Dag 3 - Golden Gate Reaction # 2 - RVD Arrays i Talen ekspressionsvektorer
- Udfør "minipreps" at isolere PFUS-RVD forsamlinger (afhængigt af antallet af RVDs enten pFUS_A og pFUS_B eller pFUS_A30A, pFUS_A30B og pFUS_B).
- Valgfrit: Sequence individuelle PFUS vektorer ved hjælp af primere pCR8_F1, pCR8_R1 (se tabel 1 for primersekvenserne). Sekventering kan også udføres på fINAL TALEN konstruktioner (afsnit 2.5.2); dog længere Talens komplet læser alle RVDs måske ikke være muligt ved hjælp af Sanger-sekventering.
- Opsæt Golden Gate reaktion # 2 for hver enkelt TALEN. 150 ng af hver PFUS vektor, 150 ng PLR-HD, PLR-NG, PLR-NI, PLR-NN (sidste "halv-repeat") i henhold til udformningen af RVD sekvensen og for l eft TALEN bruge 75 ng af pCAG-T7-TALEN-ELD-destination og for retten TALEN bruge 75 ng pCAG-T7-TALEN-KKR-Destination (eller omvendt). Tilsæt 1 gl Esp3I, 1 pi T4 DNA-ligase, 2 pi 10x T4 DNA-ligase buffer, H 2 O til 20 ul samlede reaktion volumen.
- Placer Golden Gate reaktioner i en thermo cycler.
Program:
37 ° C 5 min
16 ° C 10 min
10 cykler
37 ° C 15 min
80 ° C 5 min - Brug reaktioner fra afsnit 2.3.4 til at transformere E. coli.
- <strong> Dag 4 - Bekræftelse af Korrekt TALEN Assembly
- Screen 1-3 hvide kolonier fra hver plade ved koloni-PCR med primere TAL_F1 og TAL_R2 (se tabel 1 for primersekvenser). Korrekt samles Talens viser et PCR-produkt med en længde svarende til det samlede antal RVDs indarbejdet (figur 1D, dette band er nogle gange svært at opdage mens "stigen effekt" repræsenterer en robust indikator for vellykket samling).
PCR-program:
95 ° C 3 min
95 ° C 30 sek
55 ° C 30 sek
72 ° C 3 min
30-35 cykler
72 ° C 10 min - Brug bekræftede korrekte kloner til at starte natten bakteriekulturer (2-5 ml LB med 100 ug / ml ampicillin).
- Screen 1-3 hvide kolonier fra hver plade ved koloni-PCR med primere TAL_F1 og TAL_R2 (se tabel 1 for primersekvenser). Korrekt samles Talens viser et PCR-produkt med en længde svarende til det samlede antal RVDs indarbejdet (figur 1D, dette band er nogle gange svært at opdage mens "stigen effekt" repræsenterer en robust indikator for vellykket samling).
- Dag 5 - Bekræftelse af Korrekt TALEN Assembly
- Udfør "minipreps" at isolere pCAG-T7-Talen plasmider.
- Hvis sekventering ikke blev udført i SEKTION 2.3.2, bruger primere TAL_Seq_5-1 og TAL_R2 (se tabel 1 for primersekvenser) til at bestemme korrekte RVD forsamling i fuld længde TALEN.
3. Nuclease mRNA Synthesis
- Dannelse af DNA-skabelon
- Forbered midi eller maxipreps af pCAG-T7-Talen plasmider til mRNA syntese af høj kvalitet.
- Linearisere 10 ug af TALEN eller ZFN mRNA-syntese plasmid ved hjælp af et restriktionsenzym, som fortrinsvis spalter nedstrøms og i tæt nærhed til nuklease STOP codon (for pCAG-T7-talen vektorer anvender Sacl). mRNA syntese plasmider indbefatter typisk en T7-eller SP6-fag-promotor opstrøms for nuklease sekvens.
- Kør 200-500 ng fordøjet plasmid på 0,7-1% agarosegel for at kontrollere fuldstændig fordøjelse.
- Fjerne salte fra plasmid fordøje ved at udfælde DNA'et med 0,1 volumen natriumacetat og 3 volumener ethanol i 1 time ved rumtemperature. Pelletere DNA'et ved centrifugering ved 14.000 x g eller mere i 10 minutter, vaskes pelleten med 200 pi 70% ethanol, spin for yderligere 5 minutter, fjernes ethanolen, lufttørre pellet og resuspenderes i et passende volumen af RNAse-frit vand. Oprensning af det lineariserede plasmid er også muligt ved hjælp af en søjle-baseret system, f.eks QIAquick PCR Purification Kit.
- Bestem koncentrationen af den lineære skabelon og anvende 1 ug til nedsat in vitro-transkription.
- mRNA-syntese og polyadenylering
- Til in vitro transskription af pCAG-T7-TALEN plasmider bruger mMESSAGEmMACHINE T7 Ultra Kit. Opsæt transskription reaktion på hver TALEN på is: til 20 pi med nuklease-frit vand, 10 pi T7 2x NTP / ARCA, 2 pi 10x T7 Reaction Buffer, 1 ug DNA-skabelon, 2 pi T7 enzym mix. Bland reaktionsblandingen og inkuberes i 1-2 timer ved 37 ° C.
- Brug komplet 20 pi transcription reaktion mix at opsætte polyadenyle reaktion på is: 36 ul nuklease-frit vand, 20 pi 5x EPAP buffer, 10 pi 25 mM MnCl2, 10 pi 10 mM ATP. Mix og fjerne 2,5 pi af reaktionsblandingen som kontrolprøver L1 og R1 (til venstre og højre nuklease, henholdsvis). Tilsæt 4 pi af E-PAP enzym og inkuber reaktion i 45-60 minutter ved 37 ° C. Fjern yderligere 2,5 pi reaktion mix som kontrolprøver L2 og R2.
- mRNA Oprensning
- Brug NucAway spinkolonner for mRNA oprensning (buffer udveksling og fjernelse af ikke-inkorporerede nukleotider). Tryk kolonner at bosætte tørre gel i kolonnen bund. Hydrate kolonne med 650 pi RNAse-fri mikroinjektion buffer (1 mM Tris-CI, 0,1 EDTA, pH 7,5). Cap, vortex, trykke ud luftbobler og hydrat i 5-15 min ved stuetemperatur.
- Kolonnen anbringes i en samling rør og centrifugeringved 750 x g, 4 ° C i 2 min for at fjerne overskydende interstitiel væske. Kassér samling rør og sted kolonne i et 1,5 ml elueringsrør.
- Påfør fuldstændig reaktion mix fra afsnit 3.2.2 til kolonne og centrifugering ved 750 xg, 4 ° C i 2 minutter. Nuclease mRNA vil nu blive opløst i mikroinjektion buffer. Fjern 2,5 pi oprensede prøver L3 og R3.
- Store mRNA ved -80 ° C indtil mikroinjektion portioner fremstilles.
- mRNA gelelektroforese
- Rengør en gel kammeret for at fjerne RNAse forureninger ved hjælp af 10% SDS-opløsning eller RNaseZAP.
- Forbered en 1% agarose gel i 1xTBE kører buffer.
- Bland hver RNA prøve L1/R1, L2/R2, L3/R3 med 3 rumfang NorthernMax Formaldehyd Load Dye og inkuberes i 15 min ved 65 ° C.
- Load prøver og en RNA størrelse stige (fx RNA Millennium størrelse markør) på gelenog køre gelen ved 10 V / cm i 1x TBE indtil påføringsfarvestof når enden af gelen.
- Farv gelen med brug af SYBR grønne opløsning (Invitrogen) i 30-60 minutter under omrøring ved stuetemperatur.
- Billede gelen og sammenligne størrelser af L1/R1 med L2/R2 og L3/R3. Prøver L2/R2 og L3/R3 skal vise bands af en forøget størrelse i forhold til L1/R1 indikerer succesfuld polyadenylering i (figur 2).
- Bestem mRNA koncentrationen ved hjælp af et spektrofotometer.
- Forbered mRNA alikvoter for microinjections ved blanding venstre nuklease og højre nuclease-mRNA i forholdet 1:1. Vi anbefaler fremstilling portioner med en total koncentration på 200 ng / ul (100 ng / pl af hver nuklease) ved fortynding med mikroinjektion buffer. Store mRNA alikvoter ved -80 ° C.
4.. Embryo Isolering og Mikroinjektion
- Embryo Isolation. Denne protokol held har været anvendt med C57BL/6J og BDF1 stammes og kan sandsynligvis tilpasses til andre stammer, der almindeligvis anvendes i mikroinjektion eksperimenter såsom FVB eller CBF1. Musene huses under en 12 h-12 h lys-mørke-cyklus på en temperatur og fugtighed kontrolleret anlæg med foder og vand ad libitum.
- Superovulere Donorkøerne til at øge udbyttet af embryoner. 16 kvinder (4 uger) er superovulated ved intraperitoneal (ip) injektion af 5 IU drægtig hoppe serum gonadotropin (PMSG), efterfulgt af ip injektion af 5 IE humant choriongonadotropin (hCG) 48 timer senere.
- Parre 16 superovulated hunner til 16 avl alder (2-8 måneder) hanner umiddelbart efter hCG-injektion.
- Sacrifice hunnerne hjælp af en godkendt eutanasi protokol som CO 2 indånding.
- Inddrive de befrugtede oocytter. Oocytter opsamlet fra æggelederne næste morgen og derefter frigjort fra resterende cumulusceller af en 3-5 minutters behandling i 0,1% bovint hyaluronidase opløst i M2-medium. Afhængigt af parring og anvendte stamme udbyttet embryo kan variere. 16 C57BL/6J hunner normalt producerer 150-250, mens BDF1 give 300-400 befrugtede oocytter, hhv.
- Embryo Mikroinjektion
- Sprøjt nukleasen mRNA. Pronukleær fase oocyter typisk injiceres i den tidlige eftermiddag. Cytoplasmisk mRNA mikroinjektion udføres i M2 medium under mineralsk olie under anvendelse af et inverteret mikroskop udstyret med Nomarski DIC hjælp 20X objektiv og med embryo mikromanipulatorer samt en indsprøjtningsenhed. Vi anbefaler, begynder de injektioner af TALEN mRNA ved en koncentration på 10 ng / ul (20 ng / pi i alt).
- Aspirer ægget med en bedrift kapillarrør og injicere nukleasen mRNA i cytoplasma af embryo undgå kontakt med pronuclei. Injektionen skal være overfladisk, tæt på plasmamembranen. Injektionsvolumen skal holdes lavt, og mikroinjektion nålen skal være withdrawn ved det første tegn på cytoplasmatisk udspiling. En mikroinjektion serie vil normalt bestå af 100-300 oocytter. Typisk skal mindst 80-90% af embryonerne overleve indsprøjtning uden øjeblikkelig lysis.
- Efter mikroinjektion placere embryoner i 1 time i M16 (Sigma) medium ved 37 ° C og 5% CO 2 og overføre de overlevende embryoner i pseudogravide fostermødre.
5.. Kirurgisk Embryo Transfer
- Forbered pseudogravide embryo modtagere (plejebørn mødre) en dag før mRNA mikroinjektion. Modne kvinder (3-6 måneder gammel) af et robust outbred belastes meget, f.eks CD-1, er velegnede til rollen. Fremkald pseudodrægtighed ved at parre hunnerne på en tidligere dag med enten kirurgisk eller genetisk vasectomized hanner 28. Kun 0,5 DPC hunner med en klar copulatory stik anvendes som embryoner modtagere. I ubrugte hunner forsvinder pseudodrægtighed efter omkring 3 weeks tillader deres gentagen brug.
- Bedøv 0,5 dpc plejemor hunner ved ip injektion af ketamin, xylazin (120 mg / kg og 16 mg / kg). Denne formulering garantier ~ 30 min kirurgisk tolerance er mere end tilstrækkelig til den forventede driftstid på 5-10 min.
- Placer bedøvede dyr på sin mave på en varm overflade og desinficere området for snittet med et egnet desinfektionsmiddel, såsom 70% ethanol eller klorhexidin og alkohol blanding.
- Incise huden på bagsiden af dyret og åbne bughulen med sterile sakse.
- Visualisere og externalize uterushornet ved at trække fedtpuden knyttet til æggestokkene. Hold organer fugtig med varmt 0,9% NaCl-opløsning. Husk, at operationsstedet skal måske draperet med steril forbinding eller barberet for at overholde lokale veterinære retningslinjer.
- Immobilisere de reproduktive organer ved klipning æggestokken fedt pad med en bulldog klemme.
- Klem forsigtigt æggelederen lige opstrøms ampulla med urmager pincet og bruge en 30 G kanyle til at skabe et lille hul i æggelederen væg.
- Træk kanylen og sæt en tynd glaskapillar indeholder embryoner i hullet tillader placering af embryoner i ampulla ved forsigtigt at blæse ind i mundstykket på kapillære holderen. Træk kapillarrøret, når embryonerne deponeret i ampulla og erstatte de reproduktive organer tilbage i kropskaviteten.
- Luk bughulen med en serie af sterile suturer (prolene 6-0).
- Luk huden ved hjælp af 1-2 sårklemmer (Autoclip 9 mm) afhængigt af størrelsen af åbningen.
- Efter transaktionen tilbagesende dyrene til deres hjem bur og tilsyn med dem indtil effekten af bedøvelsen fortager sig.
- For at minimere stress, huse musene i stabile sociale grupper (2-4 dyr / type III bur) når det er muligt.
- Påfør postoperative smertestillendes i form af Dafalgan tilsat til drikkevand (Paracetamol 200 mg / kg legemsvægt) i 3 dage efter operationen.
6.. Analyse af Founders ved PCR og T7 endonuklease eller restriktionsenzymspaltning
- Design primere for at amplificere et område mellem 200-700 bp omkring nuklease bindingssted. Afstandene fremadrettet primer-nuklease spacerregionen og nuklease spacer region revers primer skal være tilstrækkeligt forskellige til at muliggøre detektion af to separate bånd for fordøjede produkter på en agarose-gel (se figur 3 og 4 for eksempler).
- Kør PCR med optimerede betingelser. Check PCR-amplikon størrelse på en agarosegel.
- Valgfrit: Purify PCR-produkter, f.eks med QIAquick PCR Purification Kit til at fjerne salte og nukleotider fra PCR-mix. Mange restriktionsenzymer er aktive i PCR prøver suppleret med det passende restriktionsenzym buffer og rensning er ikke nødvendig. Vi har også successfully brugt T7 endonuclease i QiagenTaq PCR-buffer suppleret med NEBuffer 2.
- T7 endonuclease assay. Bland 17 pi PCR-produkt med 2 pi NEBuffer 2 og køre heteroduplex dannelse (figur 3b) program i en thermocycler:
95 ° C 2 min
95 ° C til 85 ° C (2 ° C / sek)
85 ° C til 25 ° C (-0,1 ° C / sek)
4 ° C hold.
Tilsæt 1 pi T7 endonuclease til hver prøve og inkuberes ved 37 ° C i 20 min. (Inspektørens assay (Transgenomic), der bygger på CEL 1 nuklease, kan også bruges her. Henvises til producentens anvisninger.) - Restriktionsfordøjelse PCR-produkt. Bland 17 ul PCR-produkt med 2 pi 10x restriktionsenzym-buffer og 1 ul restriktionsenzym. Fordøje ved passende temperatur i 1 time eller mere.
- T7 endonuclease assay. Bland 17 pi PCR-produkt med 2 pi NEBuffer 2 og køre heteroduplex dannelse (figur 3b) program i en thermocycler:
- Tilføj DNA loading farvestof til prøver og kørt på en 2% agarosegel for at detektere særskilte fordøjelsemønstre for vildtype dyr og stiftere bærer muterede alleler. Se figur 3 og 4 for forventede resultater.
- Klon PCR-produkter af grundlæggerne positive for muterede alleler for Sanger sekventering (fx ved TA-kloning i pGEM-T Easyor direkte sekvens blandinger af PCR-produkter ved hjælp af næste generation sekventering.
Representative Results
Vi konstruerede destination plasmider kompatible med det gyldne GateTALEN samling udgivet af Cermak et al. 13, som tillader ekspression af TALENS i mammale celler såvel som in vitro mRNA-syntese fra T7-fag-promotoren (figur 1C). Disse plasmider bære heterodimeriske Foki domæner (ELD eller KKR mutationer), der har vist sig at reducere ikke-tilsigtede effekter i forhold til Foki homodimererne og øge kavalergang aktivitet i forhold til første generation FokI heterodimererne 25,29. Golden Gate samling reaktioner # 1 og # 2 er normalt meget effektive og hver hvid koloni, når det analyseres ved hjælp af koloni-PCR, viser det forventede mønster for det pågældende antal RVDs klonede (figur 1B og 1D).
Gel analyse af in vitro syntetiseret mRNA (figur 2) skal afsløre en enkelt adskiller bånd med lidt eller ingen udtværing for hver prøve analyseret. Der bør være en klar størrelse skift mellem prøverne L1/R1 og L2/R2, L3/R3, hvilket indikerer en succesfuld polyadenylering.
Stamdyr kan screenes for NHEJ inducerede muterede alleler ved hjælp af genotypebestemmelse PCR efterfulgt af enten T7 endonukleasefordøjelse (figur 3) eller en restriktionsspaltning ved hjælp af et enzym, der spalter vildtype-sekvens i spacerregionen af nuklease par (figur 4). T7 endonuclease assay kan anvendes til enhver form for mutation uanset den specifikke genomiske sekvens i spacerregionen af nuklease par injiceret; Men det opdager kun mismatch mellem DNA-strenge i heteroduplex PCR-produkter. Således i det sjældne tilfælde, at en grundlægger bærer to identisk muterede alleler, PCR-produkter ikke ville vise noget T7 fordøjelse mønster. En sådan sondring er dog altid muligt, når en specifik begrænsning stedet ligger inden nukleasegenet spacer regionen, der vil blive elimineret ved NHEJ-Induceret insertioner / deletioner (fig. 5). Her ufordøjet bands indikerer tilstedeværelsen af mutationer, og de ikke har nogen fordøjede produkter tyder stærkt på en grundlægger bærer mutationer i begge alleler af målrettede gen (markeret med stjerner i figur 4b).
Figur 1. Golden Gate kloning af Talen RVDs i heterodimere pCAG-T7-Destination vektorer. A) Montering af RVD arrays i PFUS vektorer. Her er vist et eksempel på en TALEN par med individuelle fortælling arrays bestående af 15 RVDs og 17 RVDs henholdsvis (for fortælling arrays længere end 21 RVDs der tre PFUS-RVDs forsamlinger kræves ikke vist). Pile viser primere for PFUS-specifikke koloni PCR reaktioner. B) PCR-produkteramplificeret fra korrekte PFUS forsamlinger typisk viser et band, der svarer til den samlede længde af alle RVDs klonede (f.eks omkring 1,1 kb i 10 RVDs) og en "stiges" mindre mindre prominente bands på grund af den repetitive karakter af RVD arrays. C) Slutmontage af PFUS-RVD arrays og et plasmid indeholdende den sidste gentagelse (PLR) ind heterodimere Talen ekspressionsvektorer med FokIELD og FokIKKR varianter, hhv. Den TALEN rygrad (kommenteret som N og C) ligner arkitekturen udgivet af Miller et al. 23. KAG (CMV tidlig enhancerelement / kylling beta-actin) promotor sikrer høj ekspressionsniveauer i transficerede pattedyrceller, mens T7 fag promotor tillader i vitro mRNA-syntese (brug SacI linearisering af vektoren nedstrøms for nuklease stopkodon). D) Colony PCR under anvendelse af primere, der er angivet med pile i C) tillader identifikation af samlet korrekt TALENS. Full-length PCR-produkter er ofte mindre fremtrædende mens "stigen effekt" repræsenterer en robust indikator for en vellykket montering. Klik her for at se større billede .
Figur 2. . Kvalitetskontrol nuklease mRNA in vitro-syntese ved hjælp af agarosegelelektroforese er ZFN mRNA'er vist som et eksempel (L, venstre ZFN, R, højre ZFN). Prøver L1/R1 vise mRNA før polyadenylering prøver L2/R2 show polyadenyleret mRNA og L3/R3 viser renset polyadenyleret mRNA. Klik her for at se større billede .
Figur 3. Eksempel på en T7-endonuclease-assay anvendes til identificering af stamdyr bærer nuclease-inducerede mutationer af mål-locus. A) Et TALEN par var designet til at spalte i den kodende region af muse prionprotein genet (Prnp kan TALEN målsekvens gives efter anmodning). Et PCR-produkt genereret under anvendelse af en fremadrettet primer (F) ligger 110 bp opstrøms og en revers primer (R) 250 bp nedstrøms for TALEN spaltningssted. B) PCR-produktet efterfølgende udsættes for heteroduplex dannelse og T7 nucleasefordøjelse. C) TALEN-induceret mutagenese inden målrettet genomisk område af enkelt grundlæggere afsløres ved tilstedeværelsen af et PCR-produkt i fuld længde med fordøjelsesprodukter fra 250 og 110 bps.50930/50930fig3highres.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se større billede.
Figur 4.. Eksempel på en restriktionsfordøjelse af PCR-produkter, der anvendes til identifikation af stamdyr bærer nuclease-inducerede mutationer af mål-locus. ZFN specifikke for muse Rosa26 locus 29 mål et Xbal restriktionssted inden for intron 1. A) stifterne blev screenet ved PCR under anvendelse af genotypebestemmelse en fremadrettet primer (F), der ligger 500 bp opstrøms og en revers primer (R) 250 bp nedstrøms for spaltningsstedet. B) Spaltning af PCR-produkter med Xbal afslører fordøjelsesmønstre angiver mus med bi-allele mutationer (markeret med stjerner), mono -allelliske mutationer (fordøjet og ufordøjet bands, fx dyr 2)og wt mus (komplet fordøjelse, fx dyr 21). C) Sekventering af mus med potentielle bi-allel modifikationer viser op til 3 (dyr 24) distinkte indrykninger / sletninger. Klik her for at se større billede .
| Navn på Primer | Sekvensen 5 'til 3' |
| pCR8_F1 | ttgatgcctggcagttccct |
| pCR8_R1 | cgaaccgaacaggcttatgt |
| TAL_F1 | ttggcgtcggcaaacagtgg |
| TAL_R2 | ggcgacgaggtggtcgttgg |
| TAL_Seq_5-1 | catcgcgcaatgcactgac |
Tabel 1. Sekvenser af primere, der anvendes til koloni PCR og sekventering i Golden Gate TALEN samlingprotokol.
| Plasmid / Collection | Bidragyder | Addgene ID | Kommentarer |
| Golden Gate TALEN og TAL Effector Kit 2.0 | Voytas lab | 1000000024 | Indeholder alle plasmider er nødvendige for Golden Gate TALEN samling |
| pCAG-T7-TALEN -KKR/ELD destination vektorer | Pelczar lab | 40131, 40132 | Add-on plasmider for TALEN udtryk i pattedyrsceller og in vitro mRNA-syntese |
Tabel 2. Plasmider og plasmid kollektioner kræves for Golden Gate TALEN samling kan fås fra Addgene ( www.addgene.org ).
| OnlineResource | Kommentarer |
| http://tale-nt.cac.cornell.edu | Design af TALEN; TALEN off-target forudsigelse |
| http://zifit.partners.org/ZiFiT/ | Design af TALEN, OPEN ZFN, CODA ZFN, CRISPR/Cas9 |
| http://www.genome-engineering.org | Design af TALEN, CRISPR/Cas9; CRISPR/Cas9 off-target forudsigelse |
| http://baolab.bme.gatech.edu/Research/BioinformaticTools/assembleTALSequences.html | Montering af TALEN sekvenser til bekræftelse af sekventering resultater |
| http://pgfe.umassmed.edu/ZFPmo dularsearchV2.html | Design af modulær samling ZFN |
| www.genomecenter.ucdavis.edu/s egallab / segallabsoftware | Design af modulær samling ZFN |
Tabel 3. Online ressourcer til at designe ZFN, TALEN og CRISPR/Cas9.
Discussion
Designer nukleaseresistente drevet genom redigering tilgange har betydeligt udvidet række arter gøres til genstand for målrettede ændringer af deres respektive genomer 10,12. I mus, har gen-targeting i ES-celler været en standard teknik til mere end to årtier; Det har imidlertid vist sig vanskeligt at tilpasse sig til ES-celler fra andre end musen arter, selv om der har været nogle nylige succes i rotte ES-celler. Selv med tilgængeligheden af "off-the-shelf" gen-målrettede mus ES celle kloner fra konsortier såsom EUCOMM, KOMP, eller NorCOMM 3 genom redigering ved ZFN og TALEN giver højere præcision og fleksibilitet med hensyn til spektret af ændringer, der kan være indføres i muse-genomet. Stamdyr bærer nuclease-medieret mutationer synes at være meget kimlinie kompetente 4-6,20,21, hvilket ikke altid er tilfældet for kimærer stammer fra blastocyst injektioner af ES-celler. Således i visse tilfælde mikroinjektion af designer nucleases kan resultere i betydeligt hurtigere generation af nye muselinjer med målrettede genom ændringer.
Den vellykkede generation af knockout mus ved injektion af ZFN og TALEN afhænger i vid udstrækning af aktiviteten af den injicerede nuklease par. TALENS har vist sig at have en høj succesrate i at målrette en bred vifte af gener i en række organismer; men nyere undersøgelser tyder på, at TALEN binding er følsom over for cytosin methylering 30,31. Således nyligt genererede nuclease par, for eksempel TALENS klonet ind pCAG-T7-vektorer, kan transficeres forbigående ind i en musecellelinie såsom NIH 3T3 eller Neuro -2a, som efterligner kromatin tilstand museembryo til en vis grad. Her kan nukleaseaktiviteten beregnes ved hjælp af T7 endonukleasen assay eller en begrænsning fordøjelse af PCR-produkt som beskrevet i afsnit 5 før mRNA syntese og mikroinjektion. Vi anbefaler sekventering af genomisk område af interesse i forbindelseive cellelinie og musestamme anvendes til mikroinjektion eksperimenter.
I mus zygoter vil forskellige Talen eller ZFN par fungere optimalt på forskellige mRNA-koncentrationer og derfor optimale arbejdsforhold koncentration af mikroinjiceret nukleaseresistens mRNA kan skal bestemmes eksperimentelt. Afhængigt af nuklease par, vil en for lav koncentration resultere i nogen spaltning henviser for højt kan resultere i fosterletalitet. Afhængigt af nuklease par, vi har haft succes ved hjælp af total mRNA koncentrationer så lave som 2 ng / pi og så højt som 200 ug / ul. Disse virkninger er vanskelige at forudsige fra forsøg i cellekultur og nukleasegenet koncentrationen optimal for både embryo overlevelse og modifikation på mållocuset skal bestemmes empirisk.
Meget aktiv ZFN eller TALEN kan spalte deres målsekvens over mere end et celle etape af mikroinjiceret embryoner og dermed forårsage komplekse mønstre af mutagenese end mosaicisme i stifterne. Vi og andre 4 har observeret tre eller flere distinkte muterede alleler i en enkelt grundlægger (figur 5C). Således, når oprettelse af en ny mus linje fra disse grundlæggere, afkom bør omhyggeligt screenes ved sekventering for tilstedeværelsen af den gunstige mutation siden fordøjelse analyser beviser kun, at en udefineret mutation er til stede.
Et af de kritikpunkter ofte udtryk mod ZFN og Talen systemer er muligheden for, at disse nukleaser er også i stand til at spalte sekvenser til stede et andet sted i genomet, som svarer til målområderne. Sådanne ikke-target effekter er blevet observeret med tidlig generation reagenser ved hjælp af homodimert FokI domæne, og heterodimere konstruktioner blev designet til at afhjælpe ikke-tilsigtede virkninger 25. Potentielle off-målsteder kan forudsiges i en vis udstrækning i silico 32,33 og screenet ved PCR og sekventering. En indlysende fordel of hjælp ZFNs og TALENS til generering af mus i stedet for cellelinjer er muligheden for at fjerne off målmutationer tilkoblede til den ønskede genom modifikation ved at udføre flere tilbagekrydsning til en vildtypestamme af valg. Til analyse af et stort antal stiftende mus næste generation dyb sekventering af PCR-produkter der genereres fra nuklease målrettede locus og in silico forudsagt off-målloci kunne tilbyde et alternativ kvalitativ og kvantitativ udlæsning til fordøjelse analyser af PCR-produkter.
De kunstig befrugtning, der er beskrevet i denne protokol er optimeret til standard mus stammer, der anvendes til mikroinjektion eksperimenter såsom C57BL/6J eller B6D2F1. Mus af forskellig oprindelse, såsom udavlede stammer, kan i princippet anvendes til genom redigering tilgange og vil måske give en mere passende genetisk baggrund til specifikke forskningsmæssige spørgsmål. Udførelsen af assisteret reproduktion teknikker såsom superovulation kan være Predicted for en række stammer 34-36, men kan kræve yderligere optimering for nonstandard stammer for at opnå et tilstrækkeligt antal embryoner til nuklease mikroinjektion.
Udover ZFN og TALEN, nu er blevet indført nye designer nucleases såsom RNA-styrede CRISPR/Cas9 systemet 9,37,38 for genom redigeringsprogrammer. Alle metoder til mikroinjektion og analyse af stiftere dyr er beskrevet her gælder også for CRISPR/Cas9 og fremtidige former for genom redigering.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Monika Tarnowska, Cornelia Albrecht, og Ewa Skoczylas for fremragende teknisk bistand. Denne undersøgelse blev finansieret af SNF Sinergia tilskud CRSI33-125.073 til PP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BsaI | NEB | R0535S or L | |
| Esp3I | Thermo Scientific | ER0451 | |
| T4 Ligase | NEB | M0202S or L | |
| Spectinomycin | Sigma | S0692-1ML | |
| Ampicillin | Sigma | A0166 | |
| X-Gal | Sigma | B4252 | |
| IPTG | Sigma | I6758 | |
| Plasmid-Safe nuclease | Epicentre | E3101K | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| QIAGEN Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12143 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit | Invitrogen | AM1345 | |
| NucAway Spin Columns | Invitrogen | AM10070 | |
| RNaseZAP | Sigma | R2020-250ML | |
| NorthernMax Formaldyde Load Dye | Invitrogen | AM8552 | |
| RNA Millennium Markers | Invitrogen | AM7150 | |
| 10x TBE buffer | Thermo Scientific | B52 | |
| T7 endonuclease | NEB | M0302S or L | |
| pGEM-T EasyVector System I | Promega | A3600 | |
| SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain | Invitrogen | S-7563 | |
| pregnant mare's serum gonadotrophin (PMSG) | Sigma | G4877 | |
| human chorionic gonadotropin (hCG) | Sigma | CG5 | |
| M2 embryo culture medium | Sigma | M7167 | |
| M16 embryo culture medium | Sigma | M7292 | |
| Mineral oil, embryo tested | Sigma | M8410 | |
| Ketamine | CentraVet | Ket 201 | |
| Xylazine | Sigma Aldrich | 46995 | |
| Equipment/Tools | |||
| Inverted microscope with Nomarski DIC optics (for example Nikon Eclipse TE200) | Nikon | ||
| Micromanipulator units (for example Narishige, NT88NF) | Narishige | ||
| Embryo holding capillaries | Sutter Instruments | B100-75-10 | |
| Embryo injection capillaries | Narishige | GD-1 | |
| Capillary puller (for example Sutter P97) | Sutter Instruments | ||
| Microforge (for example Narishige MF-900) | Narishige | ||
| Walton skin scissors | FST | 14077-10 | |
| Surgical scissors | FST | 14041-10 | |
| Surgical probe | FST | 10140-03 | |
| Reflex wound clip system (9 mm) | FST | 12031-09 | |
| Reflex wound clips (9 mm) | FST | 12032-09 | |
| Dumont fine forceps 5 | FST | 11254-20 | |
| Moria curved forceps | FST | 11370-31 | |
| Moria fine forceps | FST | 11399-80 | |
| Dietrich bulldog clamp | FST | 18038-45 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Labs | strain code 000664 | |
| CD-1 mice | Charles River | strain code 000664 | |
References
- Capecchi, M. R. Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century. Nat. Rev. Genetics. 6, 507-512 (2005).
- Johansson, T., et al. Building a zoo of mice for genetic analyses: a comprehensive protocol for the rapid generation of BAC transgenic mice. Genesis. 48, 264-280 (2010).
- Skarnes, W. C., et al. A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function. Nature. 474, 337-342 (2011).
- Carbery, I. D., et al. Targeted genome modification in mice using zinc-finger nucleases. Genetics. 186, 451-459 (2010).
- Meyer, M., de Angelis, M. H., Wurst, W., Kuhn, R. Gene targeting by homologous recombination in mouse zygotes mediated by zinc-finger nucleases. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 15022-15026 (2010).
- Cui, X., et al. Targeted integration in rat and mouse embryos with zinc-finger nucleases. Nat. Biotechnol. 29, 64-67 (2011).
- Sung, Y. H., et al. Knockout mice created by TALEN-mediated gene targeting. Nat. Biotechnol. 31, 23-24 (2013).
- Wefers, B., et al. Direct production of mouse disease models by embryo microinjection of TALENs and oligodeoxynucleotides. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 3782-3787 (2013).
- Wang, H., et al. One-Step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153, 910-918 (2013).
- Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nat. Rev. Genetics. 11, 636-646 (2010).
- ZFN, T. A. L. E. N. CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends Biotechnol. 31, 397-405 (2013).
- Joung, J. K., Sander, J. D. TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 14, 49-55 (2013).
- Cermak, T., et al. Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting. Nucleic Acids Res. 39, (2011).
- Reyon, D., et al. FLASH assembly of TALENs for high-throughput genome editing. Nat. Biotechnol. 30, 460-465 (2012).
- Sanjana, N. E., et al. A transcription activator-like effector toolbox for genome engineering. Nat. Protoc. 7, 171-192 (2012).
- Kim, Y., et al. A library of TAL effector nucleases spanning the human genome. Nat. Biotechnol. 31, 251-258 (2013).
- Schmid-Burgk, J. L., Schmidt, T., Kaiser, V., Honing, K., Hornung, V. A ligation-independent cloning technique for high-throughput assembly of transcription activator-like effector genes. Nat. Biotechnol. 31, 76-81 (2013).
- Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat. Biotechnol. 31, 827-832 (2013).
- Fu, Y., et al. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nat. Biotechnol. 31, 822-826 (2013).
- Hermann, M., et al. Evaluation of OPEN zinc finger nucleases for direct gene targeting of the ROSA26 locus in mouse embryos. PLoS ONE. 7, (2012).
- Meyer, M., Ortiz, O., Hrabe de Angelis, M., Wurst, W., Kuhn, R. Modeling disease mutations by gene targeting in one-cell mouse embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 9354-9359 (2012).
- Doyle, E. L., et al. TAL Effector-Nucleotide Targeter (TALE-NT) 2.0: tools for TAL effector design and target prediction. Nucleic Acids Res. 40, 117-122 (2012).
- Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat. Biotechnol. 29, 143-148 (2011).
- Guo, J., Gaj, T., Barbas, C. F. 3rd Directed evolution of an enhanced and highly efficient FokI cleavage domain for zinc finger nucleases. J. Mol. Biol. 400, 96-107 (2010).
- Doyon, Y., et al. Enhancing zinc-finger-nuclease activity with improved obligate heterodimeric architectures. Nat. Methods. 8, 74-79 (2011).
- Wefers, B., et al. Current Protocols in Mouse Biology. , John Wiley & Sons, Inc. (2011).
- Wefers, B., Wurst, W., Kühn, R. Current Protocols in Mouse Biology. , John Wiley & Sons, Inc. (2011).
- Haueter, S., et al. Genetic vasectomy-overexpression of Prm1-EGFP fusion protein in elongating spermatids causes dominant male sterility in mice. Genesis. 48, 151-160 (2010).
- Perez-Pinera, P., Ousterout, D. G., Brown, M. T., Gersbach, C. A. Gene targeting to the ROSA26 locus directed by engineered zinc finger nucleases. Nucleic Acids Res. 40, 3741-3752 (2012).
- Bultmann, S., et al. Targeted transcriptional activation of silent oct4 pluripotency gene by combining designer TALEs and inhibition of epigenetic modifiers. Nucleic Acids Res. 40, 5368-5377 (2012).
- Valton, J., et al. Overcoming TALE DNA binding domain sensitivity to cytosine methylation. J. Biol. Chem. 287, 38427-38432 (2012).
- Cradick, T. J., Ambrosini, G., Iseli, C., Bucher, P., McCaffrey, A. P. ZFN-Site searches genomes for zinc finger nuclease target sites and off-target sites. BMC Bioinform. 12, (2011).
- Doyle, E. L., et al. TAL Effector-Nucleotide Targeter (TALE-NT) 2.0: tools for TAL effector design and target prediction. Nucleic Acids Res. 40, 117-122 (2012).
- Byers, S. L., Payson, S. J., Taft, R. A. Performance of ten inbred mouse strains following assisted reproductive technologies (ARTs). Theriogenology. 65, 1716-1726 (2006).
- Luo, C., et al. Superovulation strategies for 6 commonly used mouse strains. J. Am. Assoc. Lab. Animal Sci. 50, 471-478 (2011).
- Pease, S., Saunders, T. L. International Society for Transgenic Technologies. Advanced protocols for animal transgenesis : an ISTT manual. , Springer. (2011).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339, 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-Guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
