Summary
Designer nukleaser såsom zinkfinger nukleaser (ZFNs) och transkriptionsaktivatorpliknande effektorceller nukleaser (TALENS) kan användas för att modifiera genomet hos mus preimplantatorisk embryon genom att utlösa både icke-homolog ände gå (NHEJ) och homolog rekombination (HR) vägar. Dessa framsteg möjliggöra snabb generering av möss med exakta genetiska modifieringar.
Abstract
Transgena möss som bär platsspecifika genom modifieringar (knockout, knock-in) är av avgörande betydelse för att dissekera komplexa biologiska system samt för modellering av mänskliga sjukdomar och testa terapeutiska strategier. Nya framsteg i användningen av designer nukleaser såsom zink finger nukleaser (ZFNs), transkriptions aktivator liknande effektor nukleaser (Talens), och de klustrade regelbundet mellanrum korta palindromiska upprepningar (CRISPR) / CRISPR-associerad (CAS) 9 system för plats- specifik genomet teknik öppnar möjligheten att utföra snabba riktade genom ändring i praktiskt taget alla laboratorie arter utan att behöva förlita sig på embryonala stamceller (ES) cellteknologi. En genomredigeringsexperiment börjar vanligtvis med identifiering av designer nukleas mål platser inom en gen av intresse, följt av byggandet av egna DNA-bindande domäner till direkt nukleasaktiviteten till utredaren definierade genomisk locus. Designer nukleas plasmider är in vitro </ Em> transkriberas för att generera mRNA för mikroinjektion av befruktade musoocyter. Här ger vi ett protokoll för att uppnå riktade genom modifiering av direktinsprutning av TALEN mRNA i befruktade musoocyter.
Introduction
Möss är det överlägset mest populära plattform för att generera transgena djurmodeller. Den mångsidiga verktygslåda för genteknik av musen embryot 1-3 har nyligen förlängts med genom redigering metoder baserade på designer nukleaser såsom zink finger nukleaser (ZFN) 4-6, transkriptionsaktivator liknande effektor nukleaser (talen) 7,8, och de klustrade regelbundet mellanrum korta palindromiska upprepningar (CRISPR) / CRISPR-associerad (CAS) 9 systemet 9. ZFN och TALEN funktion som par av två specialdesignade proteinbaserade DNA-bindande domäner (arrayer av zinkfingerproteiner och upprepa-variabel di-rester (rvds), respektive) som var och en är kopplade till Fokl endonukleas 10-12. Omvänt är specificitet Cas9-medierad DNA-klyvning från transaktiverande CRISPR RNA (crRNA och tracrRNA, som även kan kombineras till en enda chimär RNA-molekyl kallas styr RNA) 11 som agerar i ett komplex medCRISPR protein.
Talens med en definierad sekvens av rvds snabbt kan konstrueras av enskilda praktiker med en mängd monterings strategier att välja mellan 13-17. CRISPR/Cas9 lovar ännu mindre arbetskrävande generation designer nukleaser, men specificiteten hos styr RNA-DNA-bindande fortfarande inte helt löst 18,19. Generation av anpassade ZFNs har hittills varit begränsad till specialiserade akademiska laboratorier och kommersiella leverantörer såsom Sangamo Biosciences och Sigma CompoZr tjänsten.
I allmänhet, genom att redigera med designer nukleaser syftar till att införa dubbla strängbrott (DSB) vid definierade iska loci, som sedan lockar nonhomologous slut gå (NHEJ) eller homolog rekombination (HR) DNA-reparations maskinerier 10,12. NHEJ medierad reparation av en DSB ofta resulterar i införandet av insertioner och deletioner i omedelbar närhet av platsen för reparation. Sålunda NHEJ reparation cen utnyttjas för att slå ut funktionen av en målgen genom att introducera en frame-shift mutation inom gener proteinkodande sekvensen 4,7,9. Alternativt kan definierade tillägg eller utbyte av genetisk information kan uppnås genom att tillhandahålla en DNA-givare tillsammans med designer nukleaser. En DNA-givare består forskar utformade DNA-sekvenser flankerade av regioner av homologi med den sökta stället, vilket fungerar som en mall för DSB reparation av HR. Båda plasmiderna 5,6,20 och enkelsträngade oligonukleotider 8,9,21 har med framgång använts som givare. Varken NHEJ-nor HR-medierad genomet redigering kräva införande av en selekterbar markör i genomet hos det musembryo, vilket gör dessa strategier speciellt väl lämpad för att skapa små förändringar i nukleotidsekvensen utan att störa den totala genetiska arkitekturen.
I detta protokoll beskriver vi alla viktiga rutiner för genomet redigering imus embryo med hjälp av Talens. Dessa omfattar 1) identifiering av en TALEN målplatsen 22, 2) konstruktion av Talens från golden gate kloning 13, 3) in vitro syntes av TALEN mRNA, 4) mikroinjektion av TALEN mRNA i befruktade musoocyter, 5) kirurgiska ingrepp för embryoöverföring och 6) analys av TALEN-inducerad mutagenes i grundardjur. Vi fokuserar på TALEN mRNA mikroinjektion och screening av grundarna för NHEJ-inducerade infogningar / raderingar. För detta ändamål har vi genererat bifunktionella Talen konstruktioner som gör att både uttryck i däggdjursceller när den transfekteras såsom plasmider och in vitro-syntes av TALEN mRNA för mikroinjektion i musembryon. Dessa konstruktioner innefattar en stympad SAGA ryggrad 23 smält till heterodimert Fokl domäner 24,25 för optimal genomet redigering i däggdjursceller. Detta protokoll kan också antas för mikroinjektion av andra designer nukleaser eller för kombinerade injektioner av designer nukleaseroch givar konstruktioner (utformning av DNA-donatorer har beskrivits i utmärkta tekniska publikationer från Wefers et al. 26,27).
Etiska riktlinjer
Alla djurförsök har utförts i enlighet med de riktlinjer och regler i Cantonal veterinärfrågor i Kanton Zürich.
Protocol
1. Identifiering av Talen Target webbplatser
- Besök 2,0 webbplatsen TAL Effector Nucleotide styrning i (http://tale-nt.cac.cornell.edu) och välj "TALEN styrning i".
- Ange sekvensen för målgenen. Om pCAG-T7-TALEN uttryckskonstruktioner används (Figur 1C) välj "Miller et al., 2011" under "Använd en förinställd Architecture" för att förutsäga målplatser som kan riktas med den optimala distanslängden (15-20 bp) och antalet tale rvds (15-20) för denna TALEN arkitektur.
- Välj "NN" under "G Substitute" (guanosin specifik NH rvds är också tillgängliga men ännu inte testats för TALEN montering).
- Tillval: andra inställningar och alternativ du följa instruktionerna på webbplatsen och länkarna där.
- En textfil med potentiella mål-platser skapas, vilket kan varaimporteras till ett kalkylprogram för bekvämare visning. Välj TALEN par (er) för Golden Gate montering.
- Tillval: Sequence den genomiska regionen av intresse i musen stam som kommer att användas för mikroinjektion för att upptäcka eventuella single nucleotide polymorphisms (SNP) som inte kan redovisas i offentliga databaser och skulle kunna förhindra nukleas bindande.
- Tillval: Se Tabell 3 för ytterligare designer nukleaser relaterade resurser på nätet.
- De flesta plasmider som krävs för ZFN och TALEN konstruktion kan erhållas från Addgene:
http://www.addgene.org/special-collections/
Addgene ID för Golden Gate TALEN kit och däggdjurs talen uttryckskonstruktioner finns i tabell 2.
Alternativt kan särskilda funktionella moduler såsom zinkfingerdomäner beställas från en gen syntes tjänsteleverantör.
Detta avsnitt beskriver montering av Talens använda ett protokoll som publiceras av Cermak et al. 13 Fullängds Talens är konstruerade med hjälp av två efterföljande Golden Gate kloningssteg (Figur 1). Detta tillvägagångssätt tillåter inkorporeringen av valfritt antal rvds mellan 12 och 31 in i de slutliga expressionskonstruktioner. Hopsättningen protokoll har anpassats till destinations vektorer konstruerad för att generera mRNA-sekvenser (Figur 1C) som uttrycker högaktiva TALENS följande oocyt mikroinjektion. Se även online-protokollet av Golden Gate TALEN kit för anläggning och underhåll av plasmiden biblioteket ( http://www.addgene.org/TALeffector/goldengateV2/ ).
- Dag 1 - Golden Gate Reaction # 1 - Montering av RVD matriser i PFU vektorer
- Tillval: För varje TALEN par utformats i Protocol 1 anger DNA-sekvensen för de två målställena (inklusive den initiala T, 5 'till 3') in i TALEN_Voytas_Pipetting kalkylblad för att generera en pipetteringssystem för varje Golden Gate reaktion (även ange halterna av alla plasmider som användes för anordningarna ). Kalkylprogrammet tillhandahåller också den förväntade DNA-sekvensen av alla rvds som kan användas för inriktning av sekvenseringsresultat i avsnitt 2.5.2.
- För varje unik TALEN utformade i protokoll nr 1:
Om TALEN längd är 12-21 (standard) väljer upprepa variabla di-rester (rvds) 1-10 och destinationsvektor pFUS_A. Välj återstående rvds och en pFUS_B destination vektor, t.ex. för en TALEN med 15 rvds (inklusive den sista repetition, som kommer att läggas till slutmontering i avsnitt 2.3.3, välj rvds 11-14 och destination vektor pFUS_B4 (Figur 1A).
Om TALEN längd är 22-31, använd rvds 1-10 och destinations vector pFUS_A30A. Plocka rvds 11-20 och destination vektor pFUS_A30B. Välj återstående rvds och en pFUS_Bdestination vektor, t.ex. för TALEN med 24 rvds plocka rvds 21-23 och destination vektor pFUS_B3. - Ställ in Golden Gate reaktion # 1 för varje PFU + RVD kombination för sig, det vill säga 1-10 + pFUS_A och resterande rvds + respektive pFUS_B vektor-eller TALEN längre än 21 rvds, 1-10 + pFUS_A30A, 11-20 pFUS_A30B och resterande rvds + respektive pFUS_B vektor. Använd 150 ng av varje RVD vektor, 150 ng av PFU vektor, 1 pl Bsal, 1 ^ il T4 DNA-ligas, 2 | il 10 x T4 DNA-ligasbuffert, och H2O till 20 | il total reaktionsvolym. (Med färska alikvoter av T4-ligas-buffert för varje omgång av Golden Gate aggregaten rekommenderas eftersom upprepad tining / frysning av T4-ligas-buffert kan minska effektiviteten av reaktionerna.)
- Placera Golden Gate reaktioner i en termocykelapparat.
Program:
37 ° C, 5 min
16 ° C 10 min
50 ° C, 5 min
80 ° C, 5 min - Lägg 1 pl 10 mM ATP och 1 | il Plasmid-Safe-nukleas till var och en blandning och inkubera vid 37 ° C under 1 timme. Denna behandling kommer att avlägsna linjära ofullständig ligeringsprodukter som kan klonas in i destinationsvektorerna genom homolog rekombination in vivo i transformerade bakterier.
- Transformera E. coli med individuella ligeringsreaktioner (elektrokompetent eller kemiskt kompetent E. coli som underlättar α-komplemente såsom XL1-Blue eller DH5a kan användas här och i efterföljande transformationer).
- Tallrik bakterier på spektinomycin (50 pg / ml)-plattor med X-Gal och IPTG (40 ^ g / ml vardera) för blå / vit koloni urval.
- Dag 2 - Bekräftelse av Korrekt PFU-rvds Assembly
- Genom användning av koloni-PCR med primers pCR8_F1 och pCR8_R1 (Se Tabell 1 för primersekvenser) skärm 1-3 vitkolonier från varje platta. Korrekt PFU-rvds församlingar visar vanligtvis ett band som motsvarar den sammanlagda längden av alla rvds klonade (t.ex. cirka 1,1 kb för 10 rvds) och en "stege" av små, mindre framträdande band (Figur 1B).
PCR-program:
95 ° C 3 min
95 ° C 30 sek
55 ° C 30 sek
72 ° C 1 min 45 sek
30 till 35 cykler
72 ° C 10 min - Använd bekräftade kloner att starta natten kultur (2-5 ml LB med 50 mikrogram / ml spektinomycin).
- Genom användning av koloni-PCR med primers pCR8_F1 och pCR8_R1 (Se Tabell 1 för primersekvenser) skärm 1-3 vitkolonier från varje platta. Korrekt PFU-rvds församlingar visar vanligtvis ett band som motsvarar den sammanlagda längden av alla rvds klonade (t.ex. cirka 1,1 kb för 10 rvds) och en "stege" av små, mindre framträdande band (Figur 1B).
- Dag 3 - Golden Gate Reaction # 2 - RVD matriser i talen expressionsvektorer
- Utför "minipreps" att isolera PFU-RVD församlingar (beroende på antal rvds antingen pFUS_A och pFUS_B eller pFUS_A30A, pFUS_A30B och pFUS_B).
- Tillval: Sequence enskilda PFU vektorer med hjälp av primers pCR8_F1, pCR8_R1 (se tabell 1 för primer sekvenser). Mönsterkombinationer kan också utföras på fInal TALEN konstruktioner (avsnitt 2.5.2); Men för längre Talens fullständig läser av alla rvds kanske inte är möjligt att använda Sanger-sekvensering.
- Ställ in Golden Gate reaktion # 2 för varje enskild TALEN. 150 ng av varje PFU vektor, 150 ng av PLR-HD, PLR-NG, PLR-NI, PLR-NN (sista "halv-repeat") i enlighet med utformningen av RVD-sekvensen och för l änster TALEN använda 75 ng av pCAG-T7-TALEN-ELD-destination och för rätt TALEN använda 75 ng pCAG-T7-TALEN-KKR-destination (eller vice versa). Lägg ett pl Esp3I, 1 ^ il T4 DNA-ligas, 2 | il 10 x T4 DNA-ligasbuffert, H2O till 20 | il total reaktionsvolym.
- Placera Golden Gate reaktioner i en termocykelapparat.
Program:
37 ° C, 5 min
16 ° C 10 min
10 cykler
37 ° C 15 min
80 ° C, 5 min - Använd reaktioner från avsnitt 2.3.4 att omvandla E. coli.
- <strong> Dag 4 - Bekräftelse av Korrekt TALEN Assembly
- Display 1-3 vita kolonier från varje platta genom koloni-PCR med primers TAL_F1 och TAL_R2 (se tabell 1 för primersekvenser). Korrekt monterad TALENS visar en PCR-produkt med en längd som motsvarar det totala antalet rvds inkorporerade (figur 1D, detta band är ibland svårt att upptäcka medan "stege effekt" representerar en stabil indikator på framgångsrik montering).
PCR-program:
95 ° C 3 min
95 ° C 30 sek
55 ° C 30 sek
72 ° C 3 min
30 till 35 cykler
72 ° C 10 min - Använd bekräftade korrekta kloner för att starta över natten bakteriekultur (2-5 ml LB med 100 ng / ml ampicillin).
- Display 1-3 vita kolonier från varje platta genom koloni-PCR med primers TAL_F1 och TAL_R2 (se tabell 1 för primersekvenser). Korrekt monterad TALENS visar en PCR-produkt med en längd som motsvarar det totala antalet rvds inkorporerade (figur 1D, detta band är ibland svårt att upptäcka medan "stege effekt" representerar en stabil indikator på framgångsrik montering).
- Dag 5 - Bekräftelse av Korrekt TALEN Assembly
- Utför "minipreps" att isolera pCAG-T7-talen plasmider.
- Om sekvense inte utfördes i sigInsatser 2.3.2, använder primers TAL_Seq_5-1 och TAL_R2 (se tabell 1 för primersekvenser) för att bestämma rätt RVD montering i full längd TALEN.
3. Nuclease mRNA-syntes
- Generering av DNA-mall
- Förbered högkvalitativa midi eller maxipreps av pCAG-T7-talen plasmider för mRNA-syntes.
- Linjärisera 10 ug av TALEN eller ZFN mRNA-syntes-plasmid med användning av ett restriktionsenzym som företrädesvis klyver nedströms och i omedelbar närhet av nukleas stoppkodon (för pCAG-T7-talen vektorer använda SacI). mRNA-syntes plasmider innefattar typiskt en T7-eller SP6-fag-promotorn uppströms om den nukleas-kodande sekvensen.
- Springa 200-500 ng klippta plasmid på en 0,7-1% agarosgel för att kontrollera för fullständig nedbrytning.
- Avlägsna salter från plasmid smälta genom utfällning av DNA: t med 0,1 volym natriumacetat och tre volymer etanol under 1 timme vid rums-temperature. Pelle DNA genom centrifugering vid 14000 x g eller mer under 10 min, tvätta pelleten med 200 pl 70% etanol, centrifugering för en annan 5 min, avlägsnande av etanol, lufttorka pelletten och återsuspendera i en lämplig volym av RNAs-fritt vatten. Rening av den lineariserade plasmiden är även möjligt med användning av en kolonn-baserade system, t.ex. QIAquick PCR Purification Kit.
- Bestäm koncentrationen av den linjära mall och använda en xg att upprätta in vitro transkription.
- mRNA-syntes och polyadenylering
- För in vitro transkription av pCAG-T7-TALEN plasmider använder mMESSAGEmMACHINE T7 Ultra Kit. Ställ upp transkriptionsreaktion för varje TALEN på is: till 20 ul med nukleasfritt vatten, 10 pl T7 2x NTP / ARCA, 2 pl 10x T7-reaktionsbuffert, 1 | j, g av DNA-mallen, 2 pl T7 enzymblandning. Blanda reaktion och inkubera under 1-2 h vid 37 ° C.
- Använd den fullständiga 20 jil transkription reaktionsblandning för att ställa in polyadenylation reaktion på is: 36 pl nukleasfritt vatten, 20 ^ 5x EPAP buffert, 10 pl 25 mM MnCl2, 10 pl 10 mM ATP. Blanda och avlägsna 2,5 ul av reaktionsblandningen som kontrollprover L1 och R1 (för vänster och höger nukleas, respektive). Lägg 4 pl E-PAP-enzym och inkubera reaktionen under 45-60 minuter vid 37 ° C. Ta bort ytterligare 2,5 l av reaktionsblandningen som kontrollprover L2 och R2.
- mRNA Purification
- Använd NucAway Spin Columns för mRNA-rening (buffert utbyte och borttagning av oregistrerade nukleotider). Tryck kolumner att bosätta torr gel i kolumnens botten. Hydrate kolonnen med 650 ul av RNas-fritt mikroinjektion buffert (1 mM Tris-Cl, 0,1 EDTA, pH 7,5). Cap, virvel, peka ut luftbubblor, och hydrat under 5-15 minuter i rumstemperatur.
- Placera kolonnen i en samling rör och snurrvid 750 x g, 4 ° C under 2 min för att avlägsna överskott av interstitiell vätska. Kassera provröret och plats kolumn i en 1,5 ml eluering tub.
- Applicera fullständig reaktionsblandning från avsnitt 3.2.2 till kolonnen och centrifugera vid 750 xg, 4 ° C i 2 min. Nuclease mRNA kommer nu lösas i mikroinjektion buffert. Ta 2,5 l av renade prover L3 och R3.
- Affär mRNA vid -80 ° C tills mikroinjektion portioner tillagas.
- mRNA Gelelektrofores
- Ren en gel kammaren för att avlägsna RNAs föroreningar med användning av 10% SDS-lösning eller RNaseZAP.
- Bered en 1% agarosgel i 1xTBE löpbufferten.
- Blanda varje RNA-prov L1/R1, L2/R2, L3/R3 med 3 volymer av NorthernMax Formaldehyde Load Dye och inkubera i 15 min vid 65 ° C.
- Last prover och en RNA-storlek stege (t.ex. RNA Millennium storleksmarkör) på gelenoch kör gelén vid 10 V / cm i 1 x TBE, tills loading dye når slutet av gelén.
- Färga gelén med användning av SYBR grön lösning (Invitrogen) för 30 till 60 minuter med omröring vid rumstemperatur.
- Bild gelen och jämföra storlekar L1/R1 med L2/R2 och L3/R3. Prover L2/R2 och L3/R3 ska visa band av ökad storlek i förhållande till L1/R1 indikerar framgångsrik polyadenylering i (Figur 2).
- Bestäm mRNA koncentration med användning av en spektrofotometer.
- Förbered mRNA alikvoter för microinjections genom att blanda vänster nukleas och höger nukleas mRNA i förhållandet 1:1. Vi rekommenderar att framställa alikvoter med en total koncentration av 200 ng / | il (100 ng / ul av varje nukleas) genom utspädning med mikroinjektion buffert. Butiks mRNA-alikvoter vid -80 ° C.
4. Embryo Isolering och mikroinjektion
- Embryo Isolering. Detta protokoll har använts framgångsrikt med C57BL/6J och BDF1 stams och kan sannolikt anpassas till andra stammar som vanligen används i mikroinjektionsexperiment såsom FVB eller CBF1. Mössen förvarade under en 12 h-12 h ljus-mörker-cykel i en temperatur-och fuktighetskontrollerad anläggning med föda och vatten ad libitum.
- Superovulate donatorhondjuren att öka utbytet av embryon. 16 honor (4 veckor gamla) är superovulated genom intraperitoneal (ip) injektion av 5 IE gravid sto serum gonadotropin (PMSG), följt av ip injektion av 5 IE humant koriongonadotropin (hCG) 48 timmar senare.
- Mate de 16 superovulated honorna till 16 fertil ålder (2-8 månader) hanar omedelbart efter hCG-injektionen.
- Offra honorna med hjälp av en godkänd dödshjälp protokoll såsom CO2 inandning.
- Åter befruktade ägg. Oocyter uppsamlas från äggledarna nästa morgon och därefter befrias från eventuellt kvarvarande cumulus-celler genom en 3-5 min behandling i 0,1% bovint hyaluronidas upplöst i M2-medium. Beroende på den hoppassande prestanda och den använda stammen embryot täckning kan variera. 16 C57BL/6J honor brukar producera 150-250, medan BDF1 ge 300-400 befruktade ägg, respektive.
- Embryo Mikroinjektion
- Injicera nukleas mRNA. Pronukleära scen oocyter vanligtvis injiceras i början av eftermiddagen. Cytoplasmisk mRNA mikroinjektion utförs i M2-medium under mineralolja med användning av ett inverterat mikroskop utrustat med Nomarski DIC använder 20X objektiv och med embryo mikromanipulatorer samt en insprutningsenhet. Vi rekommenderar påbörjas injektionerna av TALEN mRNA vid en koncentration av 10 ng / | il (20 ng / | il totalt).
- Aspirera oocyt med en anläggning kapillär och injicera nukleas mRNA i cytoplasman av embryot att undvika kontakt med den pronuclei. Injektionen bör vara ytlig, nära plasmamembranet. Injektionsvolymen bör hållas låg och mikroinjektion nålen ska vara withdrawn vid första tecken på cytoplasma buk. En mikroinjektion serien skall normalt bestå av 100-300 ägg. Typiskt bör åtminstone 80 till 90% av embryona överleva injektionen utan omedelbar lys.
- Efter mikroinjektion, placera embryona i 1 h i M16 (Sigma)-medium vid 37 ° C och 5% CO2 och överföra de överlevande embryon till pseudodräktiga fostermödrar.
5. Kirurgisk Embryo Transfer
- Förbered pseudo embryo mottagare (fostermödrar) en dag före mRNA mikroinjektion. Mogna kvinnor (3-6 månader gamla) i en robust utavlade stam, såsom CD-1, är väl lämpade för rollen. Framkalla pseudodräktighet genom parning honorna på en tidigare dag med antingen kirurgiskt eller genetiskt vasektomiserade män 28. Endast 0,5 DPC honor med en tydlig copulatory plugg används som embryon mottagare. I oanvända honor den pseudodräktighet försvinner efter ca 3 weeks medger deras upprepad användning.
- Bedöva de 0,5 DPC fostermor honor genom ip-injektion av ketamin, xylazin (120 mg / kg och 16 mg / kg, respektive). Denna formulering garanterar ~ 30 min kirurgisk toleranstiden är mer än tillräckligt för den planerade drifttid på 5-10 min.
- Placera bedövade djuret på sin mage på en varm yta och desinfektera området för snittet med lämpligt desinfektionsmedel, såsom 70% etanol eller klorhexidin och alkoholblandning.
- Incise huden på ryggen av djuret och öppna den peritoneala kaviteten med steril sax.
- Visualisera och externalize livmoderhornet genom att dra i fettkudden fastsatt på äggstocken. Håll organen fuktiga med hjälp av varm 0,9% NaCl-lösning. Tänk på att operationsområdet kan behöva draperad med sterilt förband eller rakat, för att anpassa sig till lokala veterinär riktlinjer.
- Immobilisera reproduktionsorganen genom att klippa äggstocken fettkudden med en bulldog klämma.
- Ta försiktigt tag äggledaren strax uppströms om ampulla med Urmakarverktyg pincett och använda en 30 G injektionsnål för att skapa ett litet hål i äggledaren vägg.
- Dra ut nålen och sätt en tunn glas kapillär innehållande embryona in i hålet som tillåter placeringen av embryona i ampulla genom att försiktigt blåsa i munstycket av kapillären hållaren. Uttag kapillären gång embryona deponeras i ampulla och ersätta de reproduktiva organen tillbaka i kroppshåligheten.
- Stäng den peritoneala håligheten med en serie av sterila suturer (Prolene 6-0).
- Stäng huden med 1-2 sårklämmor (AutoClip 9 mm) beroende på storleken på öppningen.
- Efter transaktionen tillbaka djuren till sitt hem bur och övervaka dem till dess att effekten av anestesi avklinga.
- För att minimera stress, hus mössen i stabila sociala grupper (2-4 djur / typ III bur) när det är möjligt.
- Applicera postoperativ analgetisks i form av Dafalgan sattes till dricksvattnet (paracetamol 200 mg / kg kroppsvikt) för tre dagar efter operationen.
6. Analys av grundarna av PCR-och T7 Endonuclease eller restriktionsenzymspjälkning
- Design primrar för att amplifiera en region mellan 200-700 bp runt nukleas bindningsstället. De avstånd som framåtriktad primer-nukleas-spacerområdet och nukleas-spacerområdet-omvänd primer bör vara tillräckligt olika för att tillåta detektering av två separata band för spjälkade produkter på en agarosgel (se figurerna 3 och 4 till exempel).
- Kör PCR med optimerade betingelser. Kontrollera PCR amplicon storlek på en agarosgel.
- Tillval: Rena PCR-produkter, t.ex. med QIAquick PCR Purification Kit för att avlägsna salter och nukleotider från PCR-mix. Behövs ej Många restriktionsenzymer är aktiva i PCR-prover kompletterade med det lämpliga restriktionsenzymbuffert och rening. Vi har också successfully används T7-endonukleas i QiagenTaq PCR-buffert kompletterad med NEBuffer 2.
- T7 endonukleas analys. Blanda 17 l av PCR-produkt med 2 l av NEBuffer 2 och kör heteroduplexbildning (figur 3b) program i en termocykler:
95 ° C 2 min
95 ° C till 85 ° C (-2 ° C / sek)
85 ° C till 25 ° C (-0,1 ° C / sek)
4 ° C håll.
Lägg ett pl av T7 endonukleas till varje prov och inkubera vid 37 ° C under 20 min. (Den besiktningsman analys (Transgenomic), som bygger på CEL 1 nukleas, kan du också använda här. Se tillverkarens instruktioner.) - Restriktionsdigerering av PCR-produkt. Blanda 17 l av PCR-produkt med 2 pl av 10x restriktionsenzymbuffert och 1 pl av restriktionsenzym. Digerera vid lämplig temperatur under en timme eller mer.
- T7 endonukleas analys. Blanda 17 l av PCR-produkt med 2 l av NEBuffer 2 och kör heteroduplexbildning (figur 3b) program i en termocykler:
- Lägg DNA laddningsfärg till proverna och kördes på en 2% agarosgel för att detektera distinkta matsmältningmönster för vildtyp djur och grundare bär muterade alleler. Se figurerna 3 och 4 för de förväntade resultaten.
- Klon PCR-produkter av grundarna positiva för muterade alleler för Sanger-sekvensering (t.ex. genom TA-kloning i pGEM-T Easyor direkt sekvens blandningar av PCR-produkter med hjälp av nästa generations sekvensering.
Representative Results
Vi konstruerade destinations plasmider är kompatibla med guld-GateTALEN aggregatet publicerad av Cermak et al. 13 att tillåta expression av TALENS i däggdjursceller såväl som in vitro-mRNA-syntes från T7-fag-promotorn (Figur 1C). Dessa plasmider bär heterodimera Foki domäner (ELD eller KKR mutationer) som har visat sig minska off-target effekter i förhållande till Foki homodimerer och öka klyvning aktivitet jämfört med första generationen Fokl heterodimerema 25,29. Golden Gate monterings reaktioner # 1 och # 2 är vanligtvis mycket effektiva och varje vit koloni, när den analyseras genom koloni-PCR, visar det förväntade mönstret för det speciella antalet rvds klonade (figurerna 1B och 1D).
Gel-analys av in vitro syntetiserade mRNA (figur 2) bör visa en enda urskiljbara band med liten eller ingen utsmetning för varje prov analyserades. Det bör finnas en tydlig storleksförskjutning mellan prover L1/R1 och L2/R2, L3/R3, vilket indikerar lyckad polyadenylering.
Grundare djuren kan screenas för NHEJ-inducerade muterade alleler med användning genotypning PCR följt av antingen T7 endonukleas matsmältning (figur 3) eller en restriktionsdigerering med användning av ett enzym, som klyver vildtyp-sekvensen inom spacerområdet av nukleas par (figur 4). T7-endonukleas-analys är tillämpbar på varje typ av mutation oberoende av den specifika genomiska sekvensen i den mellanliggande regionen av nukleas par injiceras; Men upptäcker det bara obalanser mellan DNA-strängar i heteroduplex PCR-produkter. Således, i de sällsynta fall då en av grundarna bär två identiskt muterade alleler, PCR-produkter inte skulle visa någon T7 matsmältningen mönster. En sådan skillnad är dock alltid möjligt när en specifik restriktionsställe är beläget inom nukleaset distans region som kommer att elimineras genom NHEJ-Inducerad infogningar / raderingar (Figur 5). Här, osmält band indikera förekomsten av mutationer, och avsaknad av nedbrutna produkter tyder starkt på en grundare som bär mutationer i båda allelerna i den riktade genen (markerade med asterisker i figur 4b).
Figur 1. Golden Gate kloning av talen rvds i heterodimera pCAG-T7-Destination vektorer. A) Montering av RVD arrayer i PFU vektorer. Här visas ett exempel för en TALEN par med individuella tale matriser innefattande 15 rvds och 17 rvds, respektive (för saga arrayer längre än 21 rvds är tre PFU-rvds aggregaten erfordras, ej visad). Pilar indikerar primers för PFU-särskilda kolonin PCR-reaktioner. B) PCR-produkterförstärks från korrekta PFU församlingar vanligtvis visar ett band som motsvarar den sammanlagda längden av alla rvds klonade (t.ex. cirka 1,1 kb för 10 rvds) och en "stege" av små, mindre framträdande band på grund av den repetitiva karaktären av RVD matriser. C) Slutmontering av PFU-RVD arrayer och en plasmid innehållande den sista upprepningen (PLR) i heterodimera Talen expressionsvektorer med FokIELD och FokIKKR varianter, respektive. Den TALEN ryggrad (kommenterad som N och C) liknar arkitekturen publicerad av Miller et al. 23 CAG (CMV tidig förstärkarelement / kyckling-beta-aktin)-promotorn ger höga expressionsnivåer i transfekterade däggdjursceller, medan T7-fag-promotorn medger i vitro mRNA-syntes (använd SacI för linearisering av vektorn nedströms nukleas stoppkodonet). D) Koloni-PCR med användning av primrar som anges med pilar i C) medger identifiering av rätt monterad TALENS. Full length PCR-produkter är ofta mindre framträdande medan "stege effekten" representerar en robust indikator på framgångsrik montering. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 2. . Kvalitetskontroll av nukleas mRNA-syntes in vitro med användning av agarosgelelektrofores ZFN mRNA visas som ett exempel (L, vänster ZFN, R, höger ZFN). Prover L1/R1 visar mRNA före polyadenylering, prover L2/R2 show polyadenylerat mRNA och L3/R3 visar renat polyadenylerad mRNA. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 3. Exempel på en T7-endonukleas-analys används för identifiering av grundar djur som bär nukleas-inducerade mutationer av målstället. A) Ett TALEN par utformades för att klyva inom den kodande regionen av musen prionproteingenen (PRNP kan TALEN målsekvens lämnas på begäran). En PCR-produkt genereras genom användning av en framåtriktad primer (F) som är placerad 110 bp uppströms och en omvänd primer (R) 250 bp nedströms om TALEN klyvningsstället. B) PCR-produkten utsätts därefter för heteroduplexbildning och T7 endonukleas matsmältning. C) TALEN-inducerad mutagenes inom den riktade genomregion av enkels grundare avslöjas genom närvaron av en fullängds-PCR-produkten med nedbrytningsprodukter av 250 och 110 bps.50930/50930fig3highres.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att visa en större bild.
Figur 4. Exempel på en restriktionsdigerering av PCR-produkter som används för identifiering av grundar djur som bär nukleas-inducerade mutationer av målstället. ZFN specifika för mus ROSA26 locus 29 målet på ett Xbal-restriktionsställe inom intron 1. A) Founders screenades genom genotypning av PCR med användning av en framåtriktad primer (F) som är placerad 500 bp uppströms och en omvänd primer (R) 250 bp nedströms om klyvningsstället. B) Digerering av PCR-produkter med Xbal avslöjar uppslutningsmönster indikerar möss med bi-alleliska mutationer (markerade med asterisker), mono -alleliska mutationer (smälta och osmälta band, t.ex. djur 2)och wt-möss (fullständig nedbrytning, t.ex. djur 21). C) sekvensering av möss med potentiella bi-allel modifieringar visar upp till 3 (djur 24) distinkta infogningar / raderingar. Klicka här för att visa en större bild .
| Namn på Primer | Sekvens 5 'till 3' |
| pCR8_F1 | ttgatgcctggcagttccct |
| pCR8_R1 | cgaaccgaacaggcttatgt |
| TAL_F1 | ttggcgtcggcaaacagtgg |
| TAL_R2 | ggcgacgaggtggtcgttgg |
| TAL_Seq_5-1 | catcgcgcaatgcactgac |
Tabell 1. Sekvenser av primers som används för koloni PCR och sekvensering inom Golden Gate TALEN församlingprotokoll.
| Plasmid / Collection | Inläggs | Addgene ID | Kommentarer |
| Golden Gate TALEN och TAL Effector Kit 2.0 | Voytas lab | 1000000024 | Innehåller alla plasmider som krävs för Golden Gate TALEN församling |
| pCAG-T7-TALEN -KKR/ELD destination vektorer | Pelczar lab | 40131, 40132 | Add-on plasmider för TALEN uttryck i däggdjursceller och för in vitro-mRNA-syntes |
Tabell 2. Plasmider och plasmid-samlingar som krävs för Golden Gate TALEN aggregatet kan erhållas från Addgene ( www.addgene.org ).
| OnlineResource | Kommentarer |
| http://tale-nt.cac.cornell.edu | Design av TALEN; TALEN off-target förutsägelse |
| http://zifit.partners.org/ZiFiT/ | Design of TALEN, OPEN ZFN, coda ZFN, CRISPR/Cas9 |
| http://www.genome-engineering.org | Design av TALEN, CRISPR/Cas9; CRISPR/Cas9 off-target förutsägelse |
| http://baolab.bme.gatech.edu/Research/BioinformaticTools/assembleTALSequences.html | Montering av TALEN sekvenser för bekräftelse av sekvenseringsresultat |
| http://pgfe.umassmed.edu/ZFPmo dularsearchV2.html | Konstruktion av modulanordning ZFN |
| www.genomecenter.ucdavis.edu/s egallab / segallabsoftware | Konstruktion av modulanordning ZFN |
Tabell 3. Online resurser för att utforma ZFN, TALEN och CRISPR/Cas9.
Discussion
Designer nukleas driven genomet redigering metoder har kraftigt utökat utbud av arter kan bli föremål för riktade ändringar av sina respektive genomen 10,12. Hos möss har gen-inriktning i ES-celler varit en standardteknik i över två decennier; Emellertid har det visat sig svårt att anpassa sig till ES-celler från andra källor än mus arter, även om det har funnits viss ny framgång i rått ES-celler. Även med tillgång till "off-the-shelf" gen-riktade mus ES-cellkloner som tillhandahålls av konsortier såsom EUCOMM, KOMP, eller NorCOMM 3 genomet redigering av ZFN och TALEN ger högre precision och flexibilitet när det gäller spektrum av ändringar som kan infördes i mus-genomet. Grundare djur som bär nukleas-medierad mutations verkar vara starkt germ-line behöriga 4-6,20,21, vilket inte alltid är fallet för chimärer som härrör från blastocyst injektioner av ES-celler. Således, i vissa fall mikroinjektion av designer nukleaser kan resultera i betydligt snabbare generering av nya mus linjer med riktade genom modifieringar.
Den framgångsrika generationen av knockout-möss genom injektion av ZFN och TALEN beror till stor del på aktiviteten av det injicerade nukleas paret. Talens har visat sig ha ett bra resultat i att rikta ett stort antal gener i flera organismer; dock senare studier tyder på att TALEN bindning är känslig för cytosin metylering 30,31. Sålunda nygenererade nukleas parvis, exempelvis TALENS klonas in pCAG-T7-vektorer, kan transfekteras transient in i en mus-cellinje, såsom NIH-3T3-eller Neuro -2a, som efterliknar kromatinet tillståndet i musembryo i viss utsträckning. Här kan nukleasaktivitet uppskattas med hjälp av T7 endonukleas analysen eller en begränsning sammandrag av PCR-produkt som beskrivs i avsnitt 5 före mRNA-syntes och mikroinjektion. Vi rekommenderar att sekvensering av den genomiska regionen av intresse i förhållandeive cellinjen och mus-stam som används för mikroinjektionsexperiment.
I mus-zygoter kommer olika talen eller ZFN paren fungerar optimalt vid olika mRNA-koncentrationer och därför den optimala arbetskoncentration i mikroinjiceras nukleas mRNA kan behöva bestämmas experimentellt. Beroende på nukleaset paret, kommer en för låg koncentration orsaka någon klyvning medan för högt kan leda till embryoletalitet. Beroende på nukleaset paret har vi haft framgång med hjälp av den totala mRNA så låga koncentrationer som 2 ng / l och så högt som 200 mikrogram / ul. Effekterna svåra bedömd från experiment cellodling och nukleas koncentrationen optimal både embryo överlevnad och modifiering takt mållokuset behöver empiriskt.
Mycket aktiv ZFN eller TALEN kan klyva sitt mål sekvens bortom en-cell skede av idag injiceras embryot och därmed orsaka komplexa mönster av mutagenes end mosaicism i grundare. Vi och övriga 4 har observerat tre eller flera distinkta muterade alleler i en enda grundare (figur 5C). Alltså, när du upprättar en ny mus linje från dessa grundare, avkomma bör noggrant kontrolleras genom sekvensering med avseende på förekomst av den gynnsamma mutationen eftersom matsmältningen analyser bevisa endast att en odefinierad mutation är närvarande.
En av den kritik som ofta framförts mot ZFN och talen system är möjligheten att dessa nukleaser också kan klyva sekvenser närvarande någon annanstans i genomet som liknar målet webbplatser. Sådana ej åsyftade effekter har observerats med tidig generation reagenser använder homodimera Fokl domän och heterodimerkomplex konstruktioner var utformade för att lindra ej åsyftade effekter 25. Potentiella off-mål-platser kan förutsägas i viss utsträckning i silico 32,33 och screenas med PCR och sekvensering. En uppenbar fördel of med användning ZFNs och TALENS för alstring möss snarare än cellinjer är möjligheten att ta bort från målet mutationer olänkade till önskad genomet modifiering genom att utföra flera backcrosses till en vildtyp stam av val. För analys av ett stort antal donatormöss, nästa generations djup sekvensering av PCR-produkter genererade från nukleas inriktade lokus och in silico förutspådda off-target loci kan erbjuda en alternativ kvalitativ och kvantitativ utläsning till nedbrytningsanalyser av PCR-produkter.
De assisterad befruktning som beskrivs i detta protokoll är optimerade för vanliga mus stammar som används för mikroinjektion experiment som C57BL/6J eller B6D2F1. Möss av olika ursprung, som avlade stammar, kan i princip användas för genomet redigering metoder och kan ge en mer lämplig genetisk bakgrund för specifika forskningsfrågor. Utförandet av assisterad reproduktionstekniker som superovulation kan vara PrediCTED för ett antal stammar 34-36 men kan kräva ytterligare optimering för icke-standard stammar för att få ett tillräckligt antal embryon för nukleas mikroinjektion.
Förutom ZFN och TALEN har nya designer nukleaser såsom RNA-styrda CRISPR/Cas9 systemet 9,37,38 nu införts för genomet redigeringsprogram. Alla metoder för mikroinjektion och analys av grundar djur som beskrivs här gäller också för CRISPR/Cas9 och framtida former av genomet redigering.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Vi vill tacka Monika Tarnowska, Cornelia Albrecht, och Ewa Skoczylas för utmärkt tekniskt stöd. Denna studie har finansierats av SNF Sinergia bidrag CRSI33-125.073 till PP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BsaI | NEB | R0535S or L | |
| Esp3I | Thermo Scientific | ER0451 | |
| T4 Ligase | NEB | M0202S or L | |
| Spectinomycin | Sigma | S0692-1ML | |
| Ampicillin | Sigma | A0166 | |
| X-Gal | Sigma | B4252 | |
| IPTG | Sigma | I6758 | |
| Plasmid-Safe nuclease | Epicentre | E3101K | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| QIAGEN Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12143 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit | Invitrogen | AM1345 | |
| NucAway Spin Columns | Invitrogen | AM10070 | |
| RNaseZAP | Sigma | R2020-250ML | |
| NorthernMax Formaldyde Load Dye | Invitrogen | AM8552 | |
| RNA Millennium Markers | Invitrogen | AM7150 | |
| 10x TBE buffer | Thermo Scientific | B52 | |
| T7 endonuclease | NEB | M0302S or L | |
| pGEM-T EasyVector System I | Promega | A3600 | |
| SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain | Invitrogen | S-7563 | |
| pregnant mare's serum gonadotrophin (PMSG) | Sigma | G4877 | |
| human chorionic gonadotropin (hCG) | Sigma | CG5 | |
| M2 embryo culture medium | Sigma | M7167 | |
| M16 embryo culture medium | Sigma | M7292 | |
| Mineral oil, embryo tested | Sigma | M8410 | |
| Ketamine | CentraVet | Ket 201 | |
| Xylazine | Sigma Aldrich | 46995 | |
| Equipment/Tools | |||
| Inverted microscope with Nomarski DIC optics (for example Nikon Eclipse TE200) | Nikon | ||
| Micromanipulator units (for example Narishige, NT88NF) | Narishige | ||
| Embryo holding capillaries | Sutter Instruments | B100-75-10 | |
| Embryo injection capillaries | Narishige | GD-1 | |
| Capillary puller (for example Sutter P97) | Sutter Instruments | ||
| Microforge (for example Narishige MF-900) | Narishige | ||
| Walton skin scissors | FST | 14077-10 | |
| Surgical scissors | FST | 14041-10 | |
| Surgical probe | FST | 10140-03 | |
| Reflex wound clip system (9 mm) | FST | 12031-09 | |
| Reflex wound clips (9 mm) | FST | 12032-09 | |
| Dumont fine forceps 5 | FST | 11254-20 | |
| Moria curved forceps | FST | 11370-31 | |
| Moria fine forceps | FST | 11399-80 | |
| Dietrich bulldog clamp | FST | 18038-45 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Labs | strain code 000664 | |
| CD-1 mice | Charles River | strain code 000664 | |
References
- Capecchi, M. R. Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century. Nat. Rev. Genetics. 6, 507-512 (2005).
- Johansson, T., et al. Building a zoo of mice for genetic analyses: a comprehensive protocol for the rapid generation of BAC transgenic mice. Genesis. 48, 264-280 (2010).
- Skarnes, W. C., et al. A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function. Nature. 474, 337-342 (2011).
- Carbery, I. D., et al. Targeted genome modification in mice using zinc-finger nucleases. Genetics. 186, 451-459 (2010).
- Meyer, M., de Angelis, M. H., Wurst, W., Kuhn, R. Gene targeting by homologous recombination in mouse zygotes mediated by zinc-finger nucleases. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 15022-15026 (2010).
- Cui, X., et al. Targeted integration in rat and mouse embryos with zinc-finger nucleases. Nat. Biotechnol. 29, 64-67 (2011).
- Sung, Y. H., et al. Knockout mice created by TALEN-mediated gene targeting. Nat. Biotechnol. 31, 23-24 (2013).
- Wefers, B., et al. Direct production of mouse disease models by embryo microinjection of TALENs and oligodeoxynucleotides. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 3782-3787 (2013).
- Wang, H., et al. One-Step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153, 910-918 (2013).
- Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nat. Rev. Genetics. 11, 636-646 (2010).
- ZFN, T. A. L. E. N. CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends Biotechnol. 31, 397-405 (2013).
- Joung, J. K., Sander, J. D. TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 14, 49-55 (2013).
- Cermak, T., et al. Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting. Nucleic Acids Res. 39, (2011).
- Reyon, D., et al. FLASH assembly of TALENs for high-throughput genome editing. Nat. Biotechnol. 30, 460-465 (2012).
- Sanjana, N. E., et al. A transcription activator-like effector toolbox for genome engineering. Nat. Protoc. 7, 171-192 (2012).
- Kim, Y., et al. A library of TAL effector nucleases spanning the human genome. Nat. Biotechnol. 31, 251-258 (2013).
- Schmid-Burgk, J. L., Schmidt, T., Kaiser, V., Honing, K., Hornung, V. A ligation-independent cloning technique for high-throughput assembly of transcription activator-like effector genes. Nat. Biotechnol. 31, 76-81 (2013).
- Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat. Biotechnol. 31, 827-832 (2013).
- Fu, Y., et al. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nat. Biotechnol. 31, 822-826 (2013).
- Hermann, M., et al. Evaluation of OPEN zinc finger nucleases for direct gene targeting of the ROSA26 locus in mouse embryos. PLoS ONE. 7, (2012).
- Meyer, M., Ortiz, O., Hrabe de Angelis, M., Wurst, W., Kuhn, R. Modeling disease mutations by gene targeting in one-cell mouse embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 9354-9359 (2012).
- Doyle, E. L., et al. TAL Effector-Nucleotide Targeter (TALE-NT) 2.0: tools for TAL effector design and target prediction. Nucleic Acids Res. 40, 117-122 (2012).
- Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat. Biotechnol. 29, 143-148 (2011).
- Guo, J., Gaj, T., Barbas, C. F. 3rd Directed evolution of an enhanced and highly efficient FokI cleavage domain for zinc finger nucleases. J. Mol. Biol. 400, 96-107 (2010).
- Doyon, Y., et al. Enhancing zinc-finger-nuclease activity with improved obligate heterodimeric architectures. Nat. Methods. 8, 74-79 (2011).
- Wefers, B., et al. Current Protocols in Mouse Biology. , John Wiley & Sons, Inc. (2011).
- Wefers, B., Wurst, W., Kühn, R. Current Protocols in Mouse Biology. , John Wiley & Sons, Inc. (2011).
- Haueter, S., et al. Genetic vasectomy-overexpression of Prm1-EGFP fusion protein in elongating spermatids causes dominant male sterility in mice. Genesis. 48, 151-160 (2010).
- Perez-Pinera, P., Ousterout, D. G., Brown, M. T., Gersbach, C. A. Gene targeting to the ROSA26 locus directed by engineered zinc finger nucleases. Nucleic Acids Res. 40, 3741-3752 (2012).
- Bultmann, S., et al. Targeted transcriptional activation of silent oct4 pluripotency gene by combining designer TALEs and inhibition of epigenetic modifiers. Nucleic Acids Res. 40, 5368-5377 (2012).
- Valton, J., et al. Overcoming TALE DNA binding domain sensitivity to cytosine methylation. J. Biol. Chem. 287, 38427-38432 (2012).
- Cradick, T. J., Ambrosini, G., Iseli, C., Bucher, P., McCaffrey, A. P. ZFN-Site searches genomes for zinc finger nuclease target sites and off-target sites. BMC Bioinform. 12, (2011).
- Doyle, E. L., et al. TAL Effector-Nucleotide Targeter (TALE-NT) 2.0: tools for TAL effector design and target prediction. Nucleic Acids Res. 40, 117-122 (2012).
- Byers, S. L., Payson, S. J., Taft, R. A. Performance of ten inbred mouse strains following assisted reproductive technologies (ARTs). Theriogenology. 65, 1716-1726 (2006).
- Luo, C., et al. Superovulation strategies for 6 commonly used mouse strains. J. Am. Assoc. Lab. Animal Sci. 50, 471-478 (2011).
- Pease, S., Saunders, T. L. International Society for Transgenic Technologies. Advanced protocols for animal transgenesis : an ISTT manual. , Springer. (2011).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339, 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-Guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
