Summary
خلال السنوات الأخيرة، وقد استخدمت المقايسات القائم على الخلية الحية بنجاح للكشف عن الأجسام المضادة ضد المستضدات السطحية ومتعلق بتكوين جزئي. هنا، نحن تصف طريقة استخدام تدفق عالية الإنتاجية الخلوي تمكن من تحليل الأفواج الكبيرة من المرضى. وكشف عن الأجسام المضادة رواية تحسين تشخيص وعلاج اضطرابات مناعية.
Abstract
على مدى السنوات الأخيرة، تم الكشف عن الأجسام المضادة ضد سطح والبروتينات بتكوين تشارك في النقل العصبي في الجهاز العصبي المركزي أمراض المناعة الذاتية لدى الأطفال والبالغين. وقد استخدمت هذه الأجسام المضادة لتوجيه التشخيص والعلاج. المقايسات خلية مقرها تحسنت كشف عن الأجسام المضادة في مصل المريض. لأنها تستند إلى التعبير مستضدات سطح الدماغ على خلايا حقيقية النواة، والتي يتم بعد ذلك حضنت مع المريض الأمصال المخفف تليها الأجسام المضادة الثانوية تألقي مترافق. بعد الغسيل، الأجسام المضادة الثانوية ملزمة ثم يتم تحليلها من قبل التدفق الخلوي. وقد وضعت مجموعتنا تدفق عالية الإنتاجية الخلوي الحية فحص خلية مقرها لكشف موثوق أجسام مضادة ضد مستقبلات الناقل العصبي محددة. هذا الأسلوب التدفق الخلوي هو مستقيم إلى الأمام، الكمي وفعالة، واستخدام نظام العينات عالية الإنتاجية يسمح للأفواج كبيرة المريض أن يعاير بسهولة في فترة قصيرة من الزمن. بالإضافة إلى ذلك، استنادا الخلية هذا النحويقول يمكن تكييفها بسهولة للكشف عن الأجسام المضادة لكثير من الأهداف المستضدية مختلفة، سواء من الجهاز العصبي المركزي والمحيط. واكتشاف المؤشرات الحيوية إضافية رواية الضد تمكين تشخيص سريعة ودقيقة وتحسين علاج اضطرابات مناعية.
Introduction
خلال السنوات الأخيرة، تم تحديد أشكال المناعة الذاتية من الجهاز العصبي المركزي (CNS) الأمراض. وقد تبين أن هذه الأمراض ترتبط ويعرف عن وجود الأجسام المضادة. هذه الأجسام المضادة لمستقبلات الخلايا العصبية ربط أو البروتينات متشابك المشاركة في العصبي 1،2. تم الكشف عن مستضدات مختلفة، مثل مستقبلات N-ميثيل مد اسبارتاتي (NMDAR) 3-5، γ-B حمض الغاما مستقبلات (GABA B) مستقبلات 6، α-أمينو 3 هيدروكسي-5-الميثيل-4- حمض isoxazolepropionic (أمبا) مستقبلات 7، الجهد بوابات قنوات البوتاسيوم (VGKC) المرتبطة البروتينات: يسين الغنية تنشيط دبقي 1 البروتين (LGL-1) ويرتبط البروتين contactin 2 (capsr2) 8،9، 5،10 مستقبلات الغلوتامات ، والدوبامين-2 مستقبلات (D2R) 11. في الماضي، كانت هذه الاضطرابات الجهاز العصبي المركزي المناعة الذاتية (التهاب الدماغ تسمى أساسا) في كثير من الأحيان دون تشخيص وعلاج. هذه المؤشرات الحيوية الضد الرواية، على سبيل المثالالأجسام المضادة NMDAR أو D2R الأجسام المضادة، قد تحسنت بشكل كبير التشخيص والوعي، وفتحت خيارات العلاج للمرضى. في الواقع، ويرتبط العلاج المبكر مع المناعية مع تحسن نتائج 11،12.
وقد استخدمت الأساليب التقليدية للكشف عن الأجسام المضادة، مثل انزيم مرتبط المناعي فحص (ELISA) وصمة عار الغربية للكشف عن الأجسام المضادة في الأمصال. ومع ذلك، فإنها لا تمكن بسهولة الاعتراف الحواتم خارج الخلية أو السطحية، وبدلا من ذلك، قد تكشف عن مناعية نحو حاتمة داخل الخلايا. وعلاوة على ذلك، والأجسام المضادة التي تربط إلى المجال خارج الخلية من البروتينات الهامة التي ينطوي عليها العصبي من المرجح أن تكون 2،3،7،13،14 المسببة للأمراض. وبالتالي، فإن تطوير فحوصات دقيقة وحساسة لاكتشاف سطح الخلية ذات الصلة أو أهداف الضد خارج الخلية في المرضى هو الهدف الأسمى. ويستند أسلوب المعيار الذهبي في هذا المجال على استخدام الخلايا الحية، في ما يسمى ب "خلية باالمقايسات ااا ". ينطوي هذا الأسلوب في التعبير عن مستضد على سطح خلايا الثدييات (في معظم الأحيان الكلى 293 (HEK293) الخلايا الجنينية البشرية) في شكلها الأصلي قبل ترنسفكأيشن ناقلات تحتوي على تسلسل [كدنا] كامل للمستضد من الفائدة. ثم يتم تحضين الخلايا الحية nonpermeabilized مع مصل المريض المخفف وتليها تألقي مترافق المضادة للالمناعي البشري (IG) الضد الثانوية. ثم يتم الكشف عن كثافة أو مستوى مضان ويرتبط إلى مستوى الأجسام المضادة ملزمة. هذا الأسلوب غير محددة، كما هى overexpressed مستضد واحد فقط في الخلايا. وكان الأكثر استخداما على نطاق واسع "تلا" التحليل المجهري متحد البؤر بعد مناعية 4،5،8-10. ومع ذلك، التدفق الخلوي المقايسات خلية مقرها استخدمت بنجاح للكشف عن الأجسام المضادة في المرضى الذين يعانون من أمراض المزيل 15-17. على وجه الخصوص، ووترز 15 آخرون. مقارنة الكشف عن الأجسام المضادة باستخدام مقلاةش من الأجسام المضادة تقنيات الاستكشاف بما في ذلك المقايسات خلية مقرها تليها المجهري أو تدفق يحلل الخلوي، وأظهرت فحص التدفق الخلوي خلية القاعدة أن يكون الأسلوب الأكثر حساسية، ودقيقة، ويمكن الاعتماد عليها. لذلك، فحص التدفق الخلوي خلية القاعدة هو مفيد كما هو كمي، لا تعتمد على المحقق، وليس فيها أي استخدام للمواد المشعة. كما أنها مريحة لأنها تسمح الأفواج الكبيرة المريض أن يعاير في فترة قصيرة من الزمن.
في الآونة الأخيرة، قمنا الأمثل تدفق عالية الإنتاجية الخلوي فحص خلية مقرها للكشف عن الأجسام المضادة NMDAR وD2R الأجسام المضادة في المرضى الذين يعانون من أمراض المناعة الذاتية الجهاز العصبي المركزي 11. الكشف عن مجموعتنا مؤخرا NMDAR الأجسام المضادة في مصل المريض باستخدام التدفق الخلوي فحص خلية مقرها. هذه NMDAR الضد إيجابية الأمصال تم تحليلها سابقا باستخدام متحد البؤر المجهري وعثر أيضا أن تكون إيجابية 11. يحدد هذا البروتوكول لفحص التدفق الخلوي خلية القاعدة للكشف عن جonformation الحساسة الأجسام المضادة في مصل المريض CNS استفاد من العينات الآلي عالية الإنتاجية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Subcloning استراتيجية لبناء pIRES2-EGFP ناقلات ترميز D2R أو NMDAR
- الحصول على كامل طول استنساخ [كدنا] من D2R الإنسان أو NMDAR الوحيدات 1 (NR1).
- اختيار ناقلات التعبير، مثل pIRES2-EGFP، الذي هو مناسبة للتعبير عن البروتينات عبر الغشاء مع تعزيز البروتين الفلوري الأخضر (GFP) تحت سيطرة مراسل موقع الريبوسوم دخول الداخلي (IRES)، مما يمكن كلا المستضدات وGFP أن coexpressed في الخلايا بشكل منفصل.
- Subclone كدنا] الإنسان داخل pIRES2-EGFP ناقلات.
- لsubclone [كدنا]، واستخدام إنزيمات التقييد المناسب (على سبيل المثال NheI وXhoI عن الإنسان D2R [كدنا]).
- Ligate قطع كدنا] إدراج ضمن محدود pIRES2-EGFP ناقلات.
- تسلسل ligated pIRES2-EGFP D2R أو NMDAR ناقلات للتحقق ما إذا كان متجه يحتوي على التسلسل الصحيح.
- تنقية وتضخيم pIRES2-EGFP D2R أو NMDAR ناقلات لاستخدامها لاحقا في ترنسفكأيشن.
- خلايا الثقافة HEK293 في قوارير زراعة الأنسجة مع الطازجة Dulbecco لتعديل النسر متوسطة (1X) (DMEM) كاملة مع 4.5 غرام / لتر D-الجلوكوز، L-الجلوتامين و 110 ملغم / لتر البيروفات الصوديوم تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS)، 2 مم GlutaMAX، و 50 ميكروغرام / مل جنتاميسين.
- فصل الخلايا باستخدام التربسين HEK293 ونقل إلى أنبوب مخروطي.
- غسل الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 250 x ج لمدة 6 دقائق و resuspend بيليه خلية في DMEM كاملة جديدة.
- عد الخلايا والبذور 6 لوحات جيدا في حوالي 8 × 5 10 خلايا / جيد والثقافة بين عشية وضحاها في DMEM 2ML عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 في حاضنة.
- بمجرد أن وصلت إلى حوالي 70٪ confluency، بالنقل الخلايا HEK293 مع pIRES2-EGFP NR1 (HEK293 NMDAR + الخلايا)، pIRES2-EGFP D2R (HEK293 D2R + الخلايا)، و (خلايا HEK293 CTL؛ مكافحة ناقلات) pIRES2-EGFP على النحو التالي. الحفاظ على بعض الخلايا HEK293 untransfected للتعويض في وقت لاحق.
- إعداد حجم المطلوب من مزيج ترنسفكأيشن تضم 2.5 ميكروغرام الحمض النووي، 200 ميكرولتر 0.9٪ كلوريد الصوديوم و 4 ميكروغرام / مل polyethylenimine / جيد (كل منها يحتوي على 2 مل DMEM كاملة الطازجة).
- دوامة فورا المزيج لمدة 10 ثانية ويحضن في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 10 دقيقة، قبل أن يضيف حجم مزيج ترنسفكأيشن إلى الآبار المناسبة.
- تغطية لوحة، والتفاف الجانبين مع parafilm، وأجهزة الطرد المركزي في 280 x ج لمدة 5 دقائق لمساعدة ترنسفكأيشن الخلية.
- إزالة Parafilm ثم وضع في الحاضنة للثقافة في 37 درجة مئوية.
- استبدال سائل الإعلام والثقافة بعد 18 ساعة مع DMEM كاملة جديدة، والحفاظ في الثقافة لمدة 72 ساعة أخرى.
- اختياري: 72 ساعة بعد ترنسفكأيشن، يمكن تحديد الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل الثقافة في DMEM كاملة تستكمل مع 250 ميكروغرام / مل Geneticin، من أجل الحصول على بولكلونل transfectant مستقرة.
الطبقة = "jove_title"> 3. التدفق الخلوي قائم على خلية الفحص للكشف عن الأجسام المضادة لمستضدات سطح الخلايا العصبية
- فصل HEK293 NMDAR +، + HEK293 D2R، والخلايا HEK293 CTL قبل الحضانة مع 500 ميكرولتر / جيد Versene لحوالي 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
- resuspend في 2ml/well من برنامج تلفزيوني (كا 2 + /-2 ملغ +) تستكمل مع FBS 2٪ (PBS / FBS) ونقل إلى 15 مل أو 50 مل أنبوب مخروطي.
- غسل الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 250 x ج لمدة 6 دقائق و resuspend بيليه خلية في 15-50 مل PBS / FBS. تكرار غسل 2X.
- عد الخلايا ثم resuspend في برنامج تلفزيوني / FBS في 1 × 10 6 خلية / مل.
- تصميم القالب 96 جيدا لاكتساب التدفق الخلوي، معتبرا أن HEK293 D2R + أو HEK293 NMDAR + الخلايا، وكذلك الخلايا HEK293 CTL سيتعين حضنت مع كل عينة مريض أو الأجسام المضادة الأولية.
- خلايا البذور في لوحة 96-V-جيدا أسفل في 50،000 خلية / نحنليرة لبنانية وفقا لالتدفق الخلوي قالب الاستحواذ.
- بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي لوحة 96 جيدا في 450 x ج لمدة 5 دقائق وإزالة طاف بلطف باستخدام ماصة الأقنية الإلكترونية أو دليل، إمالة لوحة على زاوية ومع الحرص على عدم نضح بيليه الخلية.
- احتضان HEK293 D2R +، + HEK293 NMDAR، والخلايا HEK293 CTL لمدة 1 ساعة على RT في الظلام مع:
- التخفيفات المسلسل من الأجسام المضادة الأولية من أجل تقييم التعبير مستضد السطح.
- عينات من المرضى من أجل الكشف عن الأجسام المضادة.
- استخدام التدفق الخلوي الضوابط المناسبة التعويض، على سبيل المثال. خلايا HEK293 untransfected غير ملوثين، GFP + HEK293 الخلايا (AF647 -)، وuntransfected AF647 + HEK293 الخلايا (GFP).
- غسل الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 450 x ج لمدة 5 دقائق و resuspend الخلية بيليه في 170 ميكرولتر PBS / FBS. تكرار غسل الخطوة مرتين أخريين.
- احتضان الخلايا لمدة 1 ساعةص في RT في الظلام مع 1:100 التخفيف من الأجسام المضادة الثانوية AF647 مترافق (مفتش مكافحة الإنسان لمصل المريض ومكافحة فأر مفتش لمكافحة NR1 أو المضادة للD2R الأجسام المضادة الأولية).
- غسل الخلايا ثلاث مرات، كما في الخطوة 3.7، و resuspend في 35 ميكرولتر PBS / FBS لاكتساب التدفق الخلوي الخلية.
- إعداد عينات عالية الإنتاجية (HTS) على تدفق عداد الكريات (BDLSRII).
- اكتساب 10،000 الأحداث / جيد وفقا للالتدفق الخلوي قالب الاستحواذ.
- التصدير ومن ثم تحليل البيانات لتحليل التدفق الخلوي باستخدام حزمة البرامج، مثل FlowJo V7.5:
- الأولى، البوابة الخلايا الحية HEK293 استنادا إلى الأمام (حجم) والجانب (تحبب) ينثر.
- مزيد من البوابة الخلايا الحية HEK293 استنادا عالية GFP-الإيجابية لتحليل فقط الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل.
- تحديد كثافة يعني مضان (MFI) من قناة AF647 داخل خلايا GFP إيجابية الحية.
- تصدير البيانات إلى Excel أو بريزم للتحليل:
- مؤامرة جoncentrations من الأجسام المضادة الأولية (المضادة للNMDAR أو المضادة للD2R الضد) مقابل الحصول عليها من مؤسسات التمويل الأصغر الخلايا المحتضنة مع هذه الأجسام المضادة.
- لكل عينة المريض والسيطرة، وتحديد ΔMFI بطرح مؤسسات التمويل الأصغر من الخلايا HEK293 CTL من مؤسسات التمويل الأصغر من HEK293 D2R + أو HEK293 NMDAR + الخلايا، على التوالي.
- حساب عتبة الأجسام المضادة الإيجابية عن طريق إضافة ثلاثة انحرافات معيارية فوق ΔMFI متوسط الفوج السيطرة.
- عينات فردية مؤامرة مجمعة وفقا لنوع المصل على الرسم البياني وتمثل عتبة كخط.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم الحصول على الخلايا الحية HEK293 D2R + وHEK293 CTL في تدفق عداد الكريات باستخدام عينات عالية الإنتاجية. خلال التحليل، وبوابات الخلايا استنادا مبعثر إلى الأمام (حجم) ومبعثر الجانب (تحبب) المعلمات (أرقام 1A و1D). أعرب خلايا HEK293 Transfected جزيء مراسل GFP، في السيتوبلازم، واستبعدت من التحليل خلايا untransfected (أرقام 1B و1E). داخل GFP + البوابة، تم قياس مؤسسات التمويل الأصغر المرتبطة AF647 مترافق المضادة للمفتش الإنسان الضد الثانوية ملزمة (أرقام 1C و1F). من أجل القضاء على مضان الخلفية عند تحليل الأمصال البشرية، تم احتساب ΔMFI بطرح مؤسسات التمويل الأصغر من الخلايا HEK293 CTL من مؤسسات التمويل الأصغر من HEK293 D2R + الخلايا (الشكل 1G). البيانات المعروضة ممثل تحليل D2R الأجسام المضادة، وويمكن استخدام استراتيجية المحاصرة وتحليل البيانات لنفس NMDAR كشف الأجسام المضادة (لا تظهر البيانات).
ويستند الكشف عن الأجسام المضادة بواسطة التدفق الخلوي فحص خلية مقرها على سطح الخلية التعبير للمستضد من الفائدة. كما هو مبين في الشكل 2، HEK293 NMDAR + الخلايا أعرب NMDAR غاية السطحية (الشكل 2A) وHEK293 D2R + الخلايا أعرب D2R غاية السطحية (الشكل 2B)، في حين أعرب خلايا HEK293 CTL أيا من هذه المستضدات (أرقام 2A و 2B).
ومجموعات المرضى المستخدمة في هذا العمل يتألف من الفوج المريض مع NMDAR التهاب الدماغ (جرب NMDAR، ن = 4، والتهاب الدماغ التي يحددها الكشف عن سطح NMDAR-الوحيدات 1 NR1 الضد 3)، D2R الأجسام المضادة المرتبطة التهاب الدماغ (D2R جرب، ن = 6، والتهاب الدماغ التي يحددها الكشف عن الأجسام المضادة السطحية D2R 11)، والتحكم الفوج وايالأمراض الأخرى ال اللاالتهابي العصبية (OND، ن = 26)، مثل الصرع، السكتة الدماغية، واضطرابات النمو أو الاعصاب. وقد تم التحقق من صحة عينات المريض سابقا لNMDAR 5 و 11 مفتش D2R الإيجابية. وكان أربعة مرضى إيجابية عن الأجسام المضادة NMDAR متلازمة السريرية النمطية لNMDAR التهاب الدماغ كما هو موضح 3 وثبت عينات المصل الإيجابي باستخدام المقايسات خلية مقرها لNMDAR الأجسام المضادة كما هو موضح والمتاحة في الاستخدام التجاري 3،4. وكان ستة مرضى إيجابية عن الأجسام المضادة D2R متلازمة سريرية نموذجية من التهاب الدماغ القاعدية العقد كما هو موضح 11، وثبت عينات مصل إيجابية عن الأجسام المضادة باستخدام D2R D2R خروج المغلوب أقسام الدماغ، الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل، والخلايا العصبية 11.
من أجل تحديد الأجسام المضادة إيجابية في المرضى، تم حساب العتبة، أو قطع، من الأجسام المضادة الإيجابية في كل تجربة من خلال إضافة ثلاثة انحرافات معيارية فوقيعني ΔMFI من الضوابط أندو. وأكد 4/4 المرضى الذين يعانون من NMDAR جرب إيجابية للسطح الإنسان NMDAR مفتش الأضداد (الشكل 3A)، في حين كانت 6/6: المرضى الذين يعانون من D2R جرب إيجابية للسطح الإنسان D2R مفتش الأضداد (الشكل 3B). لم تكن أي من المرضى إيجابية إيجابية مزدوجة لأجسام مضادة تستهدف NMDAR وD2R. لم يتم الكشف عن NMDAR وD2R الأجسام المضادة في أي من الضوابط OND تحليل (أرقام 3A 3B و). واعتبرت عينات المرضى إيجابية إذا كانوا فوق عتبة في اثنين على الأقل من أصل ثلاث تجارب متكررة.
الشكل 1. الكشف عن الأجسام المضادة عن طريق تدفق عالية الإنتاجية الخلوي فحص خلية مقرها: تبوب استراتيجية وتحليل البيانات ليف تم بوابات الخلايا ه HEK293 CTL وHEK293 D2R + transfectants مستقرة على أساس مبعثر إلى الأمام (FSC) والجانب مبعثر (SSC) (74.7٪ و 68.5٪، على التوالي؛ A، D). تم بوابات أخرى لاستبعاد GFP untransfected - الخلايا (67.2٪ و 4.6٪، على التوالي، B، E)؛ خلايا GFP إيجابية داخل HEK293 CTL وHEK293 D2R + خلايا (B، E 32.8٪ و 95.4٪ على التوالي). داخل GFP + الخلايا، وشدة يعني مضان (MFI) المرتبطة AF647 مترافق المضادة للمفتش الإنسان الضد الثانوية؛ تم قياس (C، F) (HEK293 CTL = 3،657 HEK293 D2R + = 9،128). للعينات البشرية، تم احتساب ΔMFI بطرح مؤسسات التمويل الأصغر من الخلايا HEK293 CTL عن ذلك من HEK293 D2R + الخلايا (G). وأظهرت بيانات ممثل D2R الكشف عن الأجسام المضادة. عنخ "> اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
الشكل 2. التعبير عن NMDAR السطحية وD2R يحددها تدفق عالية الإنتاجية الخلوي مقايسة القائم على الخلية. كانت ملطخة HEK293 NMDAR + (A)، HEK293 D2R + (B)، وHEK293 خلايا CTL مع التخفيفات المسلسل من الأجسام المضادة الأولية، تليها الضد الثانوية المناسبة. وقد لوحظت التعبير ارتفاع سطح NMDAR وD2R. قيم مؤسسة التمويل الأصغر المترابطة مع الضد عيار كما زادت باطراد مع زيادة تركيزات الأجسام المضادة الأولية. كما هو متوقع، لم يكن هناك كشف NMDAR السطح أو D2R في الخلايا HEK293 CTL. وأظهرت بيانات تمثيلية.بياض "> اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
الرقم 3. كشف مؤكدة NMDAR السطحية وD2R الأجسام المضادة في لفيف من المرضى. سيرا من NMDAR التهاب الدماغ (جرب NMDAR، ن = 4)، D2R الأجسام المضادة المرتبطة التهاب الدماغ (جرب D2R، ن = 6) من المرضى، أو الضوابط مع الأمراض العصبية الأخرى (OND ، ن = حضنت 26 أو 24) مع العيش HEK293 NMDAR +، + HEK293 D2R، والخلايا HEK293 CTL، تليها AF647 مترافق المضادة للمفتش الإنسان الضد الثانوية. تم الكشف عن NMDAR السطحية وD2R الأجسام المضادة في مصل 4/4 المرضى NMDAR جرب (A) و6/6 مرضى D2R جرب (B)، على التوالي، في حين أن أيا من الضوابط أندو (0/0 أو 26/24) كان إما الأجسام المضادة (A، B). Dotteخطوط د على رسوم بيانية تمثل عتبة إيجابية تحسب عن طريق إضافة ثلاثة انحرافات معيارية إلى الوسط ΔMFI الضوابط أندو. وتظهر المؤامرات دوت ممثل من ثلاث تجارب. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وتصف هذه الورقة تطبيق الرواية من التدفق الخلوي الحية فحص خلية مقرها لكشف الأجسام المضادة التي تستهدف بروتينات معينة سطح الخلية العصبية باستخدام عينات عالية الإنتاجية. باستخدام هذه التقنية، ونحن التقرير أن مجموعة فرعية من المرضى المصابين يعانون من أمراض المناعة الذاتية الجهاز العصبي المركزي لديهم الأجسام المضادة في الدم إلى السطح NMDAR أو تطفو على السطح D2R.
خطوات أساسية للكشف عن الأجسام المضادة الأمثل باستخدام هذا التدفق الإنتاجية العالية الخلوي الحية فحص خلية مقرها وتشمل 1) الحصول على عائد مرتفع من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل صحية، 2) التحقق من التعبير سطح الخلية عالية للمستضد من الفائدة، 3) وضع عتبة من الأجسام المضادة الإيجابية باستخدام لفيف من الضوابط، 4)، والتأكيد على استنساخ البيانات.
ثقافة الخلايا السليمة أمر أساسي لنجاح هذه التقنية. خلايا HEK293 معروفة لسهولة الثقافة، وارتفاع كفاءة ترنسفكأيشن، وافتقارها للتعبير عن العصبيةالبروتينات، ولهذا السبب كانت قد استخدمت عادة في المقايسات خلية مقرها للكشف عن الأجسام المضادة لمستضدات الخلايا العصبية المحددة 4،5،8-10. معدل ترنسفكأيشن الأمثل للحصول على نسبة عالية من الخلايا + GFP الحية هو أمر حاسم لهذا الاختبار لحساب بدقة مؤسسات التمويل الأصغر. لهذا السبب، وإنتاج بولكلونل خط الخلية مستقرة من GFP + HEK293 NMDAR +، HEK293 D2R +، أو HEK293 CTL الخلايا هو مفيد، حيث أنه يوفر مستوى عال ثابت من GFP + الخلايا، مع الراحة لعدم الاضطرار إلى مرارا وتكرارا الخلايا بالنقل قبل كل تجربة. ينصح عرض السريع من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل من خلال مجهر مقلوب للتحقق من الخلايا السليمة (GFP + الخلايا سوف يتألق إذا مصباح الزئبق غير متوفرة). إذا الجدوى يبدو ليست عالية جدا، فإنه قد يكون من المفيد استخدام صبغة حيوية، مثل 7-الأمينية أكتينوميسين D، قبل اكتساب الخلية في تدفق عداد الكريات وإضافة خطوة إضافية النابضة في analysهو استبعاد الخلايا غير قابل للحياة.
في أمراض المناعة الذاتية الجهاز العصبي المركزي، ويعتقد أن الأجسام المضادة التي تربط إلى مجالات خارج الخلية المستضدات الدماغ لتكون 2،3،7،13،14 المسببة للأمراض، وبالتالي يتم التركيز على كشف الأجسام المضادة باستخدام الخلايا الحية وnonpermeabilized. هذا البروتوكول يحقق هذا الهدف عن طريق استخدام الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل معربا عن المستضدات السطحية. وبالتالي، فإن تصدير الصحيح من هذه المستضدات على السطح يحتاج إلى يحدده تلطيخ الخلايا transfected مع التخفيفات المسلسل من الأجسام المضادة الأولية التجارية ضد مستضد من الفائدة. عند تقييم مستوى تعبير عن المستضد السطحي على الخلايا nonpermeabilized، فمن الضروري لاستخدام الأجسام المضادة استهدفت حاتمة خارج الخلية من البروتين. إذا كان الضد محددة غير متوفرة، فإنه قد يكون من الضروري إضافة علامة على نطاق خارج الخلية للمستضد، وبعد ذلك استخدام الأجسام المضادة ضد علامة تجارية لتحديد التعبير السطح. لدينا بنجاحيستخدم هذا النهج باستخدام D2R الموسومة راصة دموية واستبعد مناعية الأمصال المريض إلى العلامة نفسها 11. ومن الأهمية بمكان أيضا أن تسلسل [كدنا] كامل للمستضد من الفائدة subcloned الى ناقلات مناسبة بحيث لا يتم المساس التعبير والسلامة الهيكلية في غشاء الخلية. في الواقع، فقد ثبت سابقا أن مجالات معينة من مستقبلات البروتين ضرورية للطي الصحيح، والتصدير، والاندماج في غشاء الخلية 18.
في التدفق الخلوي المقايسات خلية مقرها، وتقييم الأجسام المضادة الإيجابية الأمصال المريض في كل تجربة تعتمد على إنشاء عتبة، أو قطع، والمستمدة من لفيف من الضوابط. تشو وآخرون 19 احتساب عتبة من الأجسام المضادة الإيجابية عن طريق إضافة اثنين من الانحرافات المعيارية فوق متوسط كثافة مضان Δmedian، وهذا يتفق مع ما يقرب من المئين ال 95 لمجموعة مراقبة صحية. فيدراساتنا السابقة، اخترنا لقطع أعلى (إضافة ثلاثة انحرافات معيارية إلى الوسط Δ مؤسسات التمويل الأصغر للأتراب السيطرة)، والذي يتفق مع المئين ال 99 لمجموعة مراقبة صحية 11،20. بالإضافة إلى ذلك، اختار ماكلولين وآخرون 16 للتعبير عن قياس تفاعل الأجسام المضادة المحددة كنسبة من مؤسسات التمويل الأصغر بين الخلايا، معربا عن مستضد والخلايا مستضد السلبية. واعتبر أن نسبة أكبر من 5 الإيجابية ويتفق مع ثلاثة انحرافات معيارية فوق المتوسط نسبة من الضوابط، التي هي مماثلة لعملنا. باستخدام عتبة أعلى يزيد من صرامة البروتوكول ويحسن التمييز بين الضوابط والمرضى إيجابية عن الأجسام المضادة. الأهم من ذلك، في تجربتنا، وكان تفاعل الأجسام المضادة من مجموعة مراقبة صحية لا تختلف كثيرا من النطاق OND، مما يساعد على استخدام إما السكان إلى calculatه عتبة الأجسام المضادة الإيجابية 11،20.
كما هو الحال في جميع التجارب والبحوث، استنساخ البيانات أمر بالغ الأهمية. تعتبر المريض الأمصال إيجابية للأجسام المضادة ضد المستضد محددة الخلايا العصبية إذا كانت فوق عتبة من الإيجابية في اثنين على الأقل من أصل ثلاث تجارب مستقلة. قد المرضى الفردية تركيزات متفاوتة مفتش في المصل لديهم. وقد يكون لهذه التغيرات تأثير على مستوى من الأجسام المضادة ملزمة، بالنسبة إلى المرضى الآخرين. تم قياس كل مريض الأمصال المستخدمة في الدراسة السابقة لدينا من قبل nephelometry وجدت لتكون ضمن المعدل الطبيعي (6،2 حتي 14،4 ز / L) 11، ونحن دائما الأمصال المخفف مع عامل التخفيف نفسه. إنشاء منحنى عيار المصل الفردية قد تكون مفيدة من أجل مقارنة تركيزات الأجسام المضادة بين المرضى. بالإضافة إلى ذلك، فمن المستحسن تعمية الأولي المحقق خلال فحص خلية مقرها، ولكنها تحتاج إلى أن الضوابط معماة من أجل حساب يفترضعتبة ivity.
عندما يتم العثور على الهدف الضد المعقول، مطلوب التحقق من صحة المناسبة لمنع إيجابية كاذبة. عينات الأجسام المضادة إيجابية أو سلبية الكشف باستخدام التدفق الخلوي فحص خلية مقرها يجب أن يعاير باستخدام منهجية بديلة من شأنها أن تفضيلي لا تستخدم مستضدات التشويه والتحريف أو خطي. على سبيل المثال، انخفضت مناعية على أقسام الدماغ من الحيوانات المغلوب من المستضد محددة وقد تبين بنجاح في حالة وجود عدة المبلغ عنها حديثا CNS autoantigens 9-11،21. Immunoabsorption الأمصال المريض على الخلايا، معربا عن مستضد أيضا وقد استخدمت للتحقق من صحة النتائج 9،11.
تدفق الخلوي خلية مقرها بروتوكول مقايسة وصفها في هذه الورقة يمكن تغييرها بسهولة لتقييم الأجسام المضادة النوعية لعدد وافر من الأهداف المستضدية مختلفة، بما في ذلك تلك الموجودة خارج الجهاز العصبي المركزي. فمن المرجح أن الأجسام المضادة من خصوصيات أخرى غير معروفة موجودة وبعد أن تكونالتي تم تحديدها. وعلاوة على ذلك، وهذا الأسلوب هو مناسبة للكشف عن الطبقات والفئات الفرعية المختلفة من الإيج، بما في ذلك الغلوبولين المناعي، كما هو مبين في دراساتنا السابقة 11،20. قد عزم مفتش فرعية تكشف أيضا عن إمكانية المساهمة في التسبب بالمرض. على سبيل المثال IgG1 أو IgG3 قادرون على التوسط الخلية بوساطة السمسة تعتمد على الأجسام المضادة أو تكمل تعتمد السمسة، والتي ذكرت الآليات الإمراضية التي يسببها الأجسام المضادة 14،20،22. الأصباغ الفلورية الأخرى من AF647 (الحمراء بعيدة) كما يمكن أن تستخدم طالما لديهم قمم الانبعاثات بعيدا بما فيه الكفاية من أن للجزيء مراسل GFP. يجب أن يكون أي تداخل الأطياف الانبعاثات متطلبات التعويض الصحيح. أن تحديد خصوصية أجسام مضادة لبروتين داخل الخلايا يكون من الممكن أيضا استخدام التدفق الخلوي، على الرغم من حاجة الخلايا الأولى إلى أن تكون ثابتة وpermeabilized لجعل مستضد الضد المتاحة لملزم. هذه التقنية البديلة يمكن أن يؤدي إلى ارتفاع backgrouالثانية بسبب تعرض الأجسام المضادة إلى مجالات الخلايا فضلا عن العديد من المستضدات الخلوية، والتي كانت مخبأة على خلاف ذلك في الخلايا الحية nonpermeabilized. هذه العوامل التباس قد يقلل من قوة التدفق الخلوي فحص خلية مقرها ويجب تنفيذ ضوابط مناسبة وفقا لذلك.
استخدام تدفق عالية الإنتاجية الخلوي فحص خلية مقرها يوفر طريقة موثوقة ودقيقة للكشف عن الأجسام المضادة في مصل الدم البشري من الأفواج الكبيرة من المرضى. واكتشاف الأجسام المضادة رواية إضافية من خلال هذه التقنية تساعد التشخيص والعلاج المستقبلي للمرضى الذين يعانون من أمراض المناعة الذاتية الجهاز العصبي المركزي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
تضارب المصالح: قد قدم براءة الاختراع عن طريق الفيس بوك والتجمع الدستوري الديمقراطي (جامعة سيدني) مدعيا D2R كهدف للالأجسام المضادة.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل المجلس الأسترالي الوطني للصحة والبحوث الطبية، ومؤسسة ستار العلمية (أستراليا)، جمعية متلازمة توريت (الولايات المتحدة الأمريكية)، والتصلب المتعدد تريش مؤسسة البحوث والتصلب المتعدد البحوث أستراليا، ومؤسسة بيتري (أستراليا)، وريبيكا L. مؤسسة كوبر البحوث الطبية (استراليا). نشكر جميع المرضى وأفراد الأسرة الذين قدموا عينات لدراستنا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pIRES2-EGFP vector | Clontech | 6029-1 | |
| Human HA-Dopamine-2 receptor (D2R) cDNA | Missouri S&T cDNA Resource Centre | DRD020TN00 | |
| Human subunit 1 of NMDAR (NR1) cDNA | Gift from Prof A. Vincent (Oxford, UK) | ||
| Monoclonal purified mouse anti-human NR1 antibody (clone: 54.1) | BD Pharmingen | 556308 | |
| Mouse purified monoclonal anti-DRD2 IgG (clone: 1B11) | Sigma-Aldrich | WH0001813M1-50UG | |
| Alexa Fluor 647 donkey anti-mouse IgG (H + L) | Invitrogen | A31571 | |
| Alexa Fluor 647 goat anti-human IgG (H + L) | Invitrogen | A21445 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (1x) 4.5 g/L D-glucose, L-Glutamine and 110 mg/L sodium pyruvate | Invitrogen | 11995-065 | |
| Foetal bovine serum | Invitrogen | 10099-141 | |
| Gentamicin | Invitrogen | 15710-072 | |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050-061 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Geneticin | Invitrogen | 10131-035 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x) (-Ca2+/-Mg2+) | Invitrogen | 14190-144 | |
| TrypLE Express (1x) with Phenol Red | Invitrogen | 12605-028 | |
| 0.9% Sodium chloride | Baxter | AHF7975 | |
| Polyethylenimine | Polysciences Inc | 9002-98-6 | |
| Versene | Invitrogen | 15040-066 | |
| XhoI | Roche | 10899194001 | |
| NheI | Roche | 10885843001 | |
| PureLink PCR Purification Kit | Invitrogen | K3100-01 | |
| JetQuick Gel Extraction Spin Kit | Genomed | 420050 | |
| T4 DNA Ligase | Roche | 10481220001 | |
| Plasmid Plus Maxi Kit | Qiagen | 12963 | |
| Name of Equipment/Software | Company | Catalog Number | Model/Version |
| Flow cytometer with high-throughput sampler system | BD Biosciences | BDLSRII with HTS | |
| Inverted microscope | Olympus | CKX41 (with mercury lamp and U-RFLT50 power supply) | |
| Electronic multichannel pipette (15-300 μl) | Eppendorf | 613-2240P | 12-channel Xplorer Plus |
| Excel | Microsoft | 2010 | |
| Prism | GraphPad Software, Inc. | v4 | |
| FlowJo | Treestar | v7.5 | |
| 50 ml polypropylene conical tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| 6-well plate | BD Biosciences | 353046 | |
| Tissue culture flask (T75) | BD Biosciences | 353136 | |
| Parafilm | Pechiney Plastic Packaging | PM-992 | |
| V-bottom 96-well plate | Corning | 651180 | |
References
- Lancaster, E., Martinez-Hernandez, E., Dalmau, J. Encephalitis and antibodies to synaptic and neuronal cell surface proteins. Neurol. 77, 179-189 (2011).
- Vincent, A., Bien, C. G., Irani, S. R., Waters, P. Autoantibodies associated with diseases of the CNS: new developments and future challenges. Lancet Neurol. 10, 759-772 (2011).
- Dalmau, J., et al. Anti-NMDA-receptor encephalitis: case series and analysis of the effects of antibodies. Lancet Neurol. 7, 1091-1098 (2008).
- Dalmau, J., et al. Paraneoplastic anti-N-methyl-D-aspartate receptor encephalitis associated with ovarian teratoma. Ann Neurol. 61, 25-36 (2007).
- Dale, R. C., et al. N-methyl-D-aspartate receptor antibodies in pediatric dyskinetic encephalitis lethargica. Ann Neurol. 66, 704-709 (2009).
- Lancaster, E., et al. Antibodies to the GABA(B) receptor in limbic encephalitis with seizures: Case series and characterisation of the antigen. Lancet Neurol. 9, 67-76 (2010).
- Lai, M., et al. AMPA receptor antibodies in limbic encephalitis alter synaptic receptor location. Ann Neurol. 65, 424-434 (2009).
- Irani, S. R., et al. Antibodies to Kv1 potassium channel-complex proteins leucine-rich, glioma inactivated 1 protein and contactin-associated protein-2 in limbic encephalitis, Morvan’s syndrome and acquired neuromyotonia. Brain. 133, 2734-2748 (2010).
- Lai, M., et al. Investigation of LGI1 as the antigen in limbic encephalitis previously attributed to potassium channels: a case series. Lancet Neurol. 9, 776-785 (2010).
- Lancaster, E., et al. Antibodies to metabotropic glutamate receptor 5 in the Ophelia syndrome. Neurol. 77, 1698-1701 (2011).
- Dale, R. C., et al. Antibodies to surface dopamine-2 receptor in autoimmune movement and psychiatric disorders. Brain. , (2012).
- Titulaer, M. J., et al. Treatment and prognostic factors for long-term outcome in patients with anti-NMDA receptor encephalitis: an observational cohort study. Lancet Neurol. 12, 157-165 (2013).
- Hughes, E. G., et al. Cellular and synaptic mechanisms of anti-NMDA receptor encephalitis. J Neurosci. 30, 5866-5875 (2010).
- Bien, C. G., et al. Immunopathology of autoantibody-associated encephalitides: clues for pathogenesis. Brain. 135, 1622-1638 (2012).
- Waters, P. J., et al. Serologic diagnosis of NMO: a multicenter comparison of aquaporin-4-IgG assays. Neurol. 78, 665-671 (2012).
- McLaughlin, K. A., et al. Age-Dependent B Cell Autoimmunity to a Myelin Surface Antigen in Pediatric Multiple Sclerosis. J Immunol. 183, 4067-4076 (2009).
- Probstel, A. K., et al. Antibodies to MOG are transient in childhood acute disseminated encephalomyelitis. Neurol. 77, 580-588 (2011).
- Cho, D., et al. N-terminal Region of Dopamine D2 Receptor, a Rhodopsin Family GPCR, Regulates Proper Integration into Plasma Membrane and Endocytic Routes. British journal of pharmacology. , (2011).
- Zhou, D., et al. Identification of a pathogenic antibody response to native myelin oligodendrocyte glycoprotein in multiple sclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 19057-19062 (2006).
- Brilot, F., et al. Antibodies to native myelin oligodendrocyte glycoprotein in children with inflammatory demyelinating central nervous system disease. Ann Neurol. 66, 833-842 (2009).
- Boronat, A., et al. Encephalitis and Antibodies to Dipeptidyl-Peptidase-Like Protein-6, a Subunit of Kv4.2. Potassium Channels. Ann Neurol. 73, 120-128 (2013).
- Hinson, S. R., et al. Aquaporin-4-binding autoantibodies in patients with neuromyelitis optica impair glutamate transport by down-regulating EAAT2. J. Exp. Med. 205, 2473-2481 (2008).
