Summary
I de senere år har levende cellebaserede assays med held blevet anvendt til påvisning af antistoffer mod overflade og konformationelle antigener. Her beskriver vi en fremgangsmåde, ved hjælp af høj-throughput flowcytometri muliggør analyse af store grupper af patienter. Påvisning af nye antistoffer vil forbedre diagnosticering og behandling af immun-medierede sygdomme.
Abstract
I de senere år har antistoffer mod overflade og konformationelle proteiner involveret i neurotransmission blevet detekteret i autoimmune CNS-sygdomme hos børn og voksne. Disse antistoffer er blevet benyttet til at lede diagnose og behandling. Cellebaserede assays har forbedret påvisning af antistoffer i patientens serum. De er baseret på overflade-ekspression i hjernen antigener på eukaryote celler, som derefter inkuberes med fortyndet patientsera efterfulgt af fluorochrom-konjugerede sekundære antistoffer. Efter vask sekundært antistof binder derefter analyseret ved flowcytometri. Vores gruppe har udviklet et high-throughput flowcytometri levende celle-baserede assay til pålideligt antistoffer mod specifikke neurotransmitterreceptorer. Denne flowcytometri fremgangsmåde er ligetil, kvantitativ, effektiv og anvendelse af en high-throughput sampler system giver mulighed for store patientkohorter at være let analyseres på kort tid. Derudover denne celle-baseredesiger, kan let tilpasses til påvisning af antistoffer mod mange forskellige antigene mål, både fra centralnervesystemet og periferien. Opdage yderligere roman antistof biomarkører vil muliggøre hurtig og præcis diagnose og forbedre behandlingen af immun-medierede sygdomme.
Introduction
Over de senere år har autoimmune former for sygdomme i centralnervesystemet (CNS) sygdomme blevet identificeret. Det er blevet vist, at disse sygdomme er forbundet og defineret ved tilstedeværelsen af autoantistoffer. Disse antistoffer binder til neuronale receptorer eller synaptiske proteiner involveret i neurotransmission 1,2. Er blevet opdaget forskellige antigener, såsom N-methyl-D-aspartat-receptor (NMDAR) 3-5, γ-aminosmørsyre B receptor (GABAB) receptor 6, α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4- isoxazolpropionsyre (AMPA)-receptor 7 spændingsstyret kaliumkanal (VGKC) associerede proteiner: leucin-rige gliom-aktiverede 1 protein (LGL-1) og contactin-associeret protein 2 (capsr2) 8,9, glutamatreceptor 5,10 og dopamin-2-receptor (D2R) 11. I fortiden, disse autoimmune CNS sygdomme (hovedsagelig kaldet encephalitis) var ofte udiagnosticeret og ubehandlet. Disse nye antistof biomarkører, fxNMDAR antistof eller D2R antistof, væsentligt har forbedret diagnose og bevidsthed, og har åbnet behandlingsmuligheder for patienterne. Faktisk er tidlig behandling med immunterapi er forbundet med forbedret resultat 11,12.
Traditionelle metoder til påvisning af antistoffer, såsom enzymkoblet immunosorbent assay (ELISA) og Western blot er blevet anvendt til påvisning af antistoffer i sera. Men de ikke umiddelbart muliggøre anerkendelse af ekstracellulære eller overfladeepitoper og snarere kan afsløre immunoreaktivitet mod en intracellulær epitop. Antistoffer, som binder til det ekstracellulære domæne af vigtige proteiner involveret i neurotransmission sandsynligvis være patogene 2,3,7,13,14. Derfor er udviklingen af præcise og følsomme assays til at opdage relevante celleoverfladen eller ekstracellulære antistof mål i patienter er altafgørende. Guldstandarden metode i feltet er baseret på brug af levende celler, i såkaldt "celle-baSED assays ". Denne fremgangsmåde involverer ekspressionen af et antigen på overfladen af pattedyrceller (oftest humane embryonale nyre 293 (HEK293) celler) i sin native form ved transfektion af vektorer indeholdende den komplette cDNA-sekvens for antigenet af interesse. Levende nonpermeabilized celler inkuberes derefter med fortyndet patientserum og efterfølges af fluorokrom-konjugeret anti-humant immunglobulin (Ig) sekundært antistof. Intensiteten eller niveauet af fluorescens påvises derefter, og er knyttet til niveauet af autoantistof binding. Denne teknik er specifik, da kun et antigen overudtrykkes i celler. Den mest udbredte "read-out" har været konfokal mikroskopi analyse efter immuncytokemisk 4,5,8-10. Men flowcytometri cellebaserede assays er blevet anvendt med succes til påvisning af antistoffer hos patienter med demyeliniserende 15-17. Især Waters et al. 15. sammenlignet påvisning af antistof ved hjælp af en grydeel af antistof detektionsteknikker, herunder celle-baserede assays efterfulgt af mikroskopi eller flowcytometri analyser og har vist flowcytometri cellebaserede analyse at være den mest følsomme, nøjagtig og pålidelig metode. Derfor flowcytometri cellebaserede analyse er fordelagtig, da det er kvantitativ, ikke investigator-afhængige, og ikke indebærer nogen anvendelse af radioaktivt materiale. Det er også praktisk, da det giver store patientkohorter der skal analyseres i en kort tid.
For nylig har vi optimeret en high-throughput flowcytometri cellebaseret assay til påvisning NMDAR antistof og D2R antistof hos patienter med autoimmune sygdomme i centralnervesystemet 11. Vores gruppe nylig opdaget NMDAR antistof i patientens sera hjælp flowcytometri cellebaserede assay. Disse NMDAR antistof-positive sera tidligere analyseret ved hjælp af konfokal mikroskopi og den fandtes også at være positiv 11. Denne protokol beskrives en flowcytometri cellebaseret assay til påvisning af conformation-sensitive CNS antistof i patientens serum ved anvendelse af en automatiseret høj-throughput sampler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Subkloning strategi til at konstruere pIRES2-EGFP Vector Encoding D2R eller NMDAR
- Opnå fuld længde cDNA klon af menneskelig D2R eller NMDAR subunit 1 (NR1).
- Vælg en ekspressionsvektor, såsom pIRES2-EGFP, som er egnet til ekspression af transmembrane proteiner med en forstærket grønt fluorescerende protein (GFP) reporter under kontrol af en intern ribosombindingssite (IRES), hvor både antigener og GFP skal co-udtrykte i celler separat.
- Subklone humant cDNA under pIRES2-EGFP vektor.
- At subklone cDNA, anvende passende restriktionsenzymer (f.eks Nhel og Xhol for menneskers D2R cDNA).
- Liger cut cDNA-insertet i begrænset pIRES2-EGFP vektor.
- Sekvens ligeret pIRES2-EGFP D2R eller NMDAR vektor at kontrollere, om vektoren indeholder den korrekte rækkefølge.
- Rense og forstærke pIRES2-EGFP D2R eller NMDAR vektor for senere brug i transfektion.
- Kultur HEK293-celler i vævskulturkolber med frisk Dulbeccos Modified Eagle Medium (1x) (DMEM) komplet med 4,5 g / l D-glucose, L-glutamin og 110 mg / L natriumpyruvat suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), 2 mM Glutamax og 50 ug / ml gentamicin.
- Frigør HEK293-celler ved hjælp af trypsin og overførsel til et konisk rør.
- Vask ved centrifugering celler ved 250 xg i 6 min og resuspender cellepelleten i frisk komplet DMEM.
- Tæl celler og frø 6 brøndsplader på omkring 8 x 10 5 celler / brønd og kultur natten over i 2 ml DMEM ved 37 ° C og 5% CO2 i en inkubator.
- Når de har nået omkring 70% konfluens, transfektere HEK293 celler med pIRES2-EGFP NR1 (HEK293 NMDAR + celler), pIRES2-EGFP D2R (HEK293 D2R + celler), og pIRES2-EGFP (HEK293 CTL celler vektor kontrol) som følger.Hold nogle utransficerede HEK293 celler til erstatning senere.
- Forbered den nødvendige mængde transfektion blanding omfattende 2,5 ug DNA, 200 pi 0,9% natriumchlorid og 4 pg / ml polyethylenimin / brønd (der hver indeholder 2 ml frisk komplet DMEM).
- Umiddelbart vortex blandingen i 10 sek, og der inkuberes ved stuetemperatur (RT) i 10 min, før du tilføjer volumen Transfektionsblandingen til de relevante brønde.
- Dæk pladen, wrap siderne med Parafilm, og centrifuger ved 280 xg i 5 min for at hjælpe celletransfektion.
- Fjern Parafilm og derefter placere i inkubatoren til kultur ved 37 ° C.
- Udskift dyrkningsmedier 18 timer senere med frisk komplet DMEM og vedligeholde i kultur i en anden 72 timer.
- Valgfrit: 72 timer efter transfektion, kan transficerede celler udvælges ved dyrkning i fuldstændig DMEM suppleret med 250 ug / ml Geneticin, for at opnå en polyklonal stabil transfektant.
- Frigør HEK293 NMDAR + HEK293 D2R + og HEK293 CTL-celler ved inkubering med 500 ul / brønd Versene i ca 5 minutter ved 37 ° C.
- Resuspender i 2ml/well PBS (-Ca 2 + /-Mg 2 +) suppleret med 2% FBS (PBS / FBS) og overføres til en 15 ml eller 50 ml konisk rør.
- Vask cellerne ved centrifugering ved 250 xg i 6 min og resuspender cellepelleten i 15-50 ml PBS / FBS. Gentag vask 2x.
- Tæl celler og resuspender i PBS / FBS ved 1 x 10 6 celler / ml.
- Design 96-brønds skabelon for flowcytometri erhvervelse, i betragtning af at HEK293 D2R + eller HEK293 NMDAR +-celler, samt HEK293 CTL-celler skal inkuberes med hver patientprøve eller primære antistof.
- Seed celler i en V-bund 96 brønd plade på 50.000 celler / vill ifølge flowcytometri erhvervelse skabelon.
- Pelletere cellerne ved centrifugering af pladen med 96 brønde ved 450 xg i 5 minutter og forsigtigt supernatanten fjernes ved hjælp af en elektronisk eller manuel multikanalpipette vippe pladen på en vinkel og pas på ikke at aspirere cellepelleten.
- Inkuber HEK293 D2R + HEK293 NMDAR + og HEK293 CTL-celler i 1 time ved stuetemperatur i mørke med:
- Serielle fortyndinger af primært antistof for at vurdere antigen overfladeekspression.
- Patientprøver for at detektere antistoffet.
- Brug passende flowcytometri kontrol kompensation, f.eks. ufarvede transficerede HEK293-celler, GFP + HEK293-celler (AF647 -) og ikke-transficerede AF647 + HEK293 celler (GFP).
- Vask cellerne ved centrifugering ved 450 xg i 5 minutter og resuspender cellepelleten i 170 pi PBS / FBS. Gentag vask trin to gange mere.
- Cellerne inkuberes i 1 timer ved stuetemperatur i mørke med 1:100 fortynding af AF647-konjugeret sekundært antistof (anti-humant IgG i patientens serum og anti-muse-IgG for anti-NR1-eller anti-D2R primære antistoffer).
- Vask cellerne tre gange, som i trin 3.7, og resuspenderes i 35 pi PBS / FBS til flowcytometri celle erhvervelsen.
- Opsætning af high-throughput sampler (HTS) på flowcytometeret (BDLSRII).
- Anskaf 10.000 events / godt ifølge flowcytometri erhvervelse skabelon.
- Eksporter og derefter analysere data til analyse ved hjælp af en flowcytometri softwarepakke, såsom FlowJo v7.5:
- Først gate levende HEK293 celler baseret på forward (størrelse) og side (granularitet) spreder.
- Yderligere gate levende HEK293-celler baseret på stærkt GFP-positivitet at analysere kun de transficerede celler.
- Bestem den gennemsnitlige fluorescensintensitet (MFI) af AF647 kanal inden levende GFP-positive celler.
- Eksporter data til Excel eller Prism til analyse:
- Plot concentrations primære antistof (anti-NMDAR eller anti-D2R antistof) versus MFI opnået fra celler inkuberet med disse antistoffer.
- For hver patient og kontrolprøven, bestemme ΔMFI ved at fratrække MFI for HEK293 CTL celler fra MFI af HEK293 D2R + eller HEK293 NMDAR +-celler, hhv.
- Beregn tærsklen af antistof positivitet ved tilsætning af tre standardafvigelser over middelværdien ΔMFI af kontrollen kohorten.
- Plot individuelle prøver grupperet efter deres serum type på en graf og repræsentere tærsklen som en linje.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lev HEK293 D2R + og HEK293 CTL celler blev erhvervet på flowcytometeret bruge en high-throughput sampler. Under analysen blev cellerne gated baseret på forward scatter (størrelse) og sidespredning (granularitetskravene) parametre (figur 1A og 1D). Transficerede HEK293 celler udtrykte reportermolekylet GFP, i cytoplasmaet, og transficerede celler blev udelukket fra analysen (figur 1B og 1E). Inden GFP + gate blev MFI forbundet med AF647-konjugeret anti-humant IgG-sekundært antistof binding målt (figur 1C og 1F). For at fjerne den baggrundsfluorescens, når man analyserer humane sera, blev ΔMFI beregnet ved at fratrække MFI af HEK293 CTL celler fra MFI af HEK293 D2R +-celler (figur 1G). De viste data er repræsentativ for D2R antistof analyse ogsamme gating strategi og data-analyse kan anvendes til NMDAR antistofpåvisning (data ikke vist).
Antistofpåvisning ved flowcytometri cellebaseret assay er baseret på celleoverfladeekspression af antigenet af interesse. Som vist i figur 2, HEK293 NMDAR +-celler overudtrykt overflade NMDAR (figur 2A), og HEK293 D2R +-celler overudtrykt overflade D2R (figur 2B), hvorimod HEK293 CTL-celler udtrykte ingen af disse antigener (figur 2A og 2B).
De patientgrupper, der anvendes i dette arbejde bestod af en patient kohorte med NMDAR encephalitis (NMDAR Enc, n = 4, en hjernebetændelse defineret ved påvisning af overfladen NMDAR-subunit 1 NR1-antistof 3), D2R antistof-associeret encephalitis (D2R Enc, n = 6, hjernebetændelse defineret ved påvisning af overfladen D2R antistof 11), og en kontrolgruppe kohorte with andre inflammatoriske neurologiske sygdomme (OND, n = 26), såsom epilepsi, slagtilfælde og udviklingsmæssige eller neurodegenerative sygdomme. Patientprøver er tidligere blevet valideret til NMDAR 5. og D2R 11 IgG positivitet. De fire patienter var positive for NMDAR antistoffer havde en typisk kliniske syndrom NMDAR encephalitis som beskrevet 3 og serumprøver blev påvist positive ved cellebaserede assays til NMDAR antistoffer som beskrevet og tilgængelige i kommerciel brug 3,4. De seks patienter var positive for D2R antistoffer havde en typisk klinisk syndrom af basalganglierne encephalitis som beskrevet 11 og serumprøver blev påvist positive for D2R antistoffer ved anvendelse D2R knock-out hjernesnit, transficerede celler og neuroner 11.
For at bestemme antistof positivitet i patienter, er den tærskel, eller cutoff af antistof positivitet beregnes i hvert forsøg ved at tilføje tre standardafvigelser over denbetyde ΔMFI af OND kontrol. De 4/4 patienter med NMDAR Enc blev bekræftet positive for menneskelig overflade NMDAR IgG-antistof (figur 3A), mens 6/6 patienter med D2R Enc var positive for menneskelig overflade D2R IgG-antistof (figur 3B). Ingen af de positive patienter var dobbelt positive for antistoffer rettet NMDAR og D2R. NMDAR og D2R antistoffer blev ikke påvist i nogen af OND kontroller analyserede (3A og 3B). Patientprøver blev betragtet som positive, hvis de i mindst to var over den tærskel af tre gentagne forsøg.
Figur 1. Påvisning af antistof ved high-throughput flowcytometri cellebaserede analyse:. Gating strategi og dataanalyse Liv e HEK293 CTL-celler og HEK293 D2R + stabile transfektanter blev gated baseret på forward scatter (FSC) og sidespredning (SSC) (74,7% og 68,5%, henholdsvis A, D). GFP-positive celler i HEK293 CTL og HEK293 D2R +-celler (32,8% og 95,4%, henholdsvis B, E) blev yderligere gated at udelukke utransficerede GFP - celler (67,2% og 4,6%, henholdsvis B, E). Inden for GFP +-celler, var den gennemsnitlige fluorescensintensitet (MFI) er forbundet med AF647-konjugeret anti-humant IgG-sekundært antistof (HEK293 CTL = 3.657; HEK293 D2R + = 9128) blev målt (C, F). For humane prøver blev ΔMFI beregnet ved at fratrække MFI for HEK293 CTL-celler fra de HEK293 D2R +-celler (G). Repræsentative data fra D2R antistofpåvisning vises. ank "> Klik her for at se større billede.
Figur 2. Ekspression af overfladen NMDAR og D2R bestemt ved high-throughput flowcytometri cellebaseret assay. Blev HEK293 NMDAR + (A), HEK293 D2R + (B) og HEK293 CTL celler farvet med serielle fortyndinger af primært antistof efterfulgt af passende sekundært antistof. Høj overflade udtryk for NMDAR og D2R blev observeret. MFI-værdier korreleret med antistoftiter, som de steg støt med stigende koncentrationer af primært antistof. Som forventet var der ingen påvisning af overfladevand NMDAR eller D2R i HEK293 CTL-celler. Repræsentative data vises.blank "> Klik her for at se større billede.
Figur 3. Bekræftet påvisning af overfladevand NMDAR og D2R antistoffer i en kohorte af patienter. Sera fra NMDAR hjernebetændelse (NMDAR Enc, n = 4), D2R antistof-associeret encephalitis (D2R Enc, n = 6) patienter, eller kontroller med andre neurologiske sygdomme (OND , n = 26 eller 24) blev inkuberet med levende HEK293 NMDAR + HEK293 D2R + og HEK293 CTL-celler, efterfulgt af AF647-konjugeret anti-humant IgG-sekundært antistof. Overflade NMDAR og D2R antistoffer blev påvist i serum af 4/4 NMDAR Enc patienter (A) og 6/6 D2R Enc patienter (B), mens der ingen af OND kontrol (0/26 eller 0/24), havde enten antistof (A, B). Dotted linje på grafer repræsenterer positivitet tærskel, som beregnes ved at lægge tre standardafvigelser til middelværdien ΔMFI af OND kontroller. Repræsentative dot plots ud af tre eksperimenter er vist. Klik her for at se større billede .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette papir beskriver en hidtil ukendt anvendelse af flowcytometri levende cellebaseret assay til påvisning af antistoffer rettet mod specifikke celleoverflade neuronale proteiner ved anvendelse af en high-throughput sampler. Ved at bruge denne teknik, rapporterer vi, at en undergruppe af patienter, der lider med autoimmune CNS-sygdomme har serumantistoffer til overflade NMDAR eller til overfladen D2R.
Væsentlige skridt til optimal antistofpåvisning ved hjælp af denne high-throughput flowcytometri levende celle-baserede assay omfatter 1) opnåelse af et højt udbytte af sunde transficerede celler, 2) at kontrollere højt celleoverfladeekspression af antigenet af interesse, 3) oprettelse af en tærskel på antistof positivitet ved hjælp af en kohorte af kontrol, 4) og bekræfter reproducerbarhed af data.
Den kultur af raske celler er afgørende for succes i denne teknik. HEK293-celler er kendt for deres lette kultur, høj transfektionseffektivitet og deres manglende ekspression af neuronalproteiner, hvilket er hvorfor de er blevet almindeligt anvendt i cellebaserede assays til påvisning af antistoffer til specifikke neuronale antigener 4,5,8-10. En optimal transfektion sats at erhverve en høj procentdel af levende GFP +-celler er afgørende for denne analyse til præcist at beregne MFI. Af denne grund, der producerer en polyklonale stabil cellelinje af GFP + HEK293 NMDAR +, HEK293 D2R + eller HEK293 CTL-celler er en fordel, da det giver et konsekvent højt niveau af GFP + celler, med den ekstra bekvemmelighed for ikke at skulle gentagne gange transficere celler før hvert eksperiment. Der anbefales en hurtig visning af de transficerede celler gennem et inverteret mikroskop for at kontrollere for sunde celler (GFP +-celler fluorescerer, hvis kviksølvlampe er tilgængelig). Hvis levedygtighed virker ikke så høj, kan det være en fordel at bruge en levedygtighed farvestof, såsom 7-amino-actinomycin D, før celle erhvervelse på flowcytometeret og at tilføje en ekstra gating skridt i Analyser at udelukke ikke-levedygtige celler.
I autoimmune CNS-sygdomme, er antistoffer, der binder til ekstracellulære domæner af hjerne-antigener menes at være patogene 2,3,7,13,14, derfor lægges der vægt på påvisning af antistoffer ved hjælp af levende og nonpermeabilized celler. Denne protokol opnår dette mål ved hjælp af transficerede celler, der udtrykker overfladeantigener. Derfor korrekt eksport af disse antigener til overfladen skal bestemmes ved farvning af transficerede celler med seriefortyndinger af en kommerciel primært antistof mod antigenet af interesse. Ved vurderingen af niveauet af ekspression af overflade-antigen på nonpermeabilized celler, er det vigtigt at anvende et antistof rettet mod en extracellulær epitop af proteinet. Hvis et specifikt antistof ikke er tilgængelig, kan det være nødvendigt at tilføje et tag på et ekstracellulært domæne af antigenet, og derefter anvende et kommercielt antistof mod tag at bestemme overflade-ekspression. Vi har med succesanvendt denne metode ved hjælp af en hemagglutinin-mærket D2R og udelukket immunoreaktivitet patient sera til tag selv 11. Det er også kritisk, at hele cDNA-sekvensen for antigenet af interesse subklones i en egnet vektor, således at ekspression og strukturel integritet i cellemembranen ikke er kompromitteret. Faktisk er det tidligere vist, at bestemte domæner af en receptor protein er afgørende for korrekt foldning, eksport og integration i cellemembranen 18.
I flowcytometri cellebaserede assays, vurdere antistof positivitet patient sera i hvert forsøg bygger på etablering af en tærskel, eller cutoff, der stammer fra en kohorte af kontrol. Zhou et al. 19. beregnes en tærskel af antistof positivitet ved at tilføje to standardafvigelser over middelværdien Δmedian fluorescensintensitet, og det omtrent svarede til de 95 percentil af sund reguleringsområdet. Ivores tidligere undersøgelser, vi har valgt en højere cutoff (tilføjelse af tre standardafvigelser til middelværdien Δ MFI af kontrol kohorte), hvilket svarede til de 99 percentil af de sunde reguleringsområdet 11,20. Desuden McLaughlin et al. 16. valgte at udtrykke måling af specifik antistofreaktivitet som forholdet MFI mellem de antigen-udtrykkende celler og antigen-negative celler. Et forhold på større end 5, blev betragtet som positive og svarede til tre standardafvigelser over middelværdien forholdet kontrol, hvilket svarer til vores arbejde. Ved hjælp af en højere tærskel øger stringensen af protokollen og forbedrer diskrimination mellem kontrol og patienter positive for antistoffer. Vigtigere er det, i vores erfaring, antistofreaktivitet af den sunde reguleringsområdet var ikke signifikant anderledes end OND rækkevidde, der muliggør anvendelse af enten befolkning til at berege tærsklen af antistof positivitet 11,20.
Som i alle forsknings-eksperimenter, data reproducerbarhed er altafgørende. Patient sera betragtes som positive for antistof mod et specifikt neuronal antigen, hvis de er over den tærskel på positivitet i mindst to ud af tre uafhængige forsøg. Individuelle patienter har varierende koncentrationer af IgG i deres serum. Disse variationer kan have indflydelse på niveauet af antistofbinding i forhold til andre patienter. Alle patient sera bruges i vores tidligere undersøgelse blev målt ved nephelometri og fundet at være inden for normalområdet (6,2-14,4 g / L) 11, og vi altid fortyndet sera med samme fortyndingsfaktor. Etablering af en titer kurve individuelle serum kunne være gavnligt med henblik på at sammenligne koncentrationer af antistoffer mellem patienter. Derudover er indledende blinding af investigator anbefales under celle-baserede assay, men kontrollen skal afblindes for at beregne postulereivity tærskel.
Når en plausibel antistof mål er fundet, passende validering påkrævet for at undgå falsk positivitet. Antistof-positive eller-negative prøver påvist ved hjælp af flowcytometri cellebaserede analyse skal analyseres ved hjælp af en alternativ metode, der vil fortrinsvis ikke bruge denaturerede eller lineariserede antigener. For eksempel faldt immunoreaktivitet på hjernen sektioner fra antigen-specifikke knock-out dyr er blevet succesfuldt vist i tilfælde af flere nyligt rapporteret CNS autoantigenerne 9-11,21. Immunabsorption af patientsera på antigen-udtrykkende celler også er blevet anvendt til at validere resultaterne 9,11.
Flowcytometri cellebaseret assay-protokol, der er beskrevet i dette dokument, kan let ændres til at vurdere antistof specificitet for en mangfoldighed af forskellige antigene mål, herunder dem, der findes uden for centralnervesystemet. Det er sandsynligt, at antistoffer af andre ukendte specificiteter eksisterer og er endnu ikkeidentificeret. Desuden er denne teknik er egnet til påvisning af forskellige klasser og underklasser af Ig, herunder IgM, som vist i vores tidligere undersøgelser 11,20. Bestemmelsen af IgG subklasse kan også afsløre potentiale for at bidrage til sygdom patogenese. For eksempel IgG1 eller IgG3 er i stand til at mediere antistofafhængig cellemedieret cytotoksicitet eller komplement-afhængig cytotoksicitet, som rapporteres autoantistof-induceret patogenicitet mekanismer 14,20,22. Bortset AF647 (langt rød) fluorescerende farvestoffer kan også anvendes, så længe de har emissionstoppe langt nok fra det reportermolekylet, GFP. Enhver overlappende emissionsspektre skal have de korrekte krav kompensation. Bestemmelse af specificiteten af et antistof til et intracellulært protein vil også være muligt ved anvendelse af flowcytometri, selv først nødt til at være faste og permeabiliseres at gøre antigenet til rådighed for antistofbinding celler. Denne alternative teknik kan resultere i høj background pga. eksponeringen af antistoffer mod intracellulære domæner samt talrige cellulære antigener, der ellers var skjult i levende nonpermeabilized celler. Disse forstyrrende faktorer kan reducere styrken af flowcytometri cellebaserede analyse, og egnede kontroller skal udføres i overensstemmelse hermed.
Brugen af high-throughput flowcytometri cellebaserede analyse giver en pålidelig og nøjagtig metode til påvisning af antistoffer i humant serum fra store grupper af patienter. Opdage yderligere hidtil ukendte antistoffer ved denne teknik vil hjælpe diagnose og fremtidige behandling af patienter med autoimmune sygdomme i centralnervesystemet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Interessekonflikter: Et patent er indgivet af FB og RCD (University of Sydney), der hævder D2R som mål for autoantistoffer.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af den australske National Sundhed og Medical Research Council, Star Scientific Foundation (Australien), Tourettes syndrom Association (USA), The Trish multipel sklerose Research Foundation og multipel sklerose Research Australien, Petre Foundation (Australien), Rebecca L. Cooper Medical Research Foundation (Australien). Vi takker alle de patienter og familiemedlemmer, der leveres prøver for vores undersøgelse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pIRES2-EGFP vector | Clontech | 6029-1 | |
| Human HA-Dopamine-2 receptor (D2R) cDNA | Missouri S&T cDNA Resource Centre | DRD020TN00 | |
| Human subunit 1 of NMDAR (NR1) cDNA | Gift from Prof A. Vincent (Oxford, UK) | ||
| Monoclonal purified mouse anti-human NR1 antibody (clone: 54.1) | BD Pharmingen | 556308 | |
| Mouse purified monoclonal anti-DRD2 IgG (clone: 1B11) | Sigma-Aldrich | WH0001813M1-50UG | |
| Alexa Fluor 647 donkey anti-mouse IgG (H + L) | Invitrogen | A31571 | |
| Alexa Fluor 647 goat anti-human IgG (H + L) | Invitrogen | A21445 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (1x) 4.5 g/L D-glucose, L-Glutamine and 110 mg/L sodium pyruvate | Invitrogen | 11995-065 | |
| Foetal bovine serum | Invitrogen | 10099-141 | |
| Gentamicin | Invitrogen | 15710-072 | |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050-061 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Geneticin | Invitrogen | 10131-035 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x) (-Ca2+/-Mg2+) | Invitrogen | 14190-144 | |
| TrypLE Express (1x) with Phenol Red | Invitrogen | 12605-028 | |
| 0.9% Sodium chloride | Baxter | AHF7975 | |
| Polyethylenimine | Polysciences Inc | 9002-98-6 | |
| Versene | Invitrogen | 15040-066 | |
| XhoI | Roche | 10899194001 | |
| NheI | Roche | 10885843001 | |
| PureLink PCR Purification Kit | Invitrogen | K3100-01 | |
| JetQuick Gel Extraction Spin Kit | Genomed | 420050 | |
| T4 DNA Ligase | Roche | 10481220001 | |
| Plasmid Plus Maxi Kit | Qiagen | 12963 | |
| Name of Equipment/Software | Company | Catalog Number | Model/Version |
| Flow cytometer with high-throughput sampler system | BD Biosciences | BDLSRII with HTS | |
| Inverted microscope | Olympus | CKX41 (with mercury lamp and U-RFLT50 power supply) | |
| Electronic multichannel pipette (15-300 μl) | Eppendorf | 613-2240P | 12-channel Xplorer Plus |
| Excel | Microsoft | 2010 | |
| Prism | GraphPad Software, Inc. | v4 | |
| FlowJo | Treestar | v7.5 | |
| 50 ml polypropylene conical tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| 6-well plate | BD Biosciences | 353046 | |
| Tissue culture flask (T75) | BD Biosciences | 353136 | |
| Parafilm | Pechiney Plastic Packaging | PM-992 | |
| V-bottom 96-well plate | Corning | 651180 | |
References
- Lancaster, E., Martinez-Hernandez, E., Dalmau, J. Encephalitis and antibodies to synaptic and neuronal cell surface proteins. Neurol. 77, 179-189 (2011).
- Vincent, A., Bien, C. G., Irani, S. R., Waters, P. Autoantibodies associated with diseases of the CNS: new developments and future challenges. Lancet Neurol. 10, 759-772 (2011).
- Dalmau, J., et al. Anti-NMDA-receptor encephalitis: case series and analysis of the effects of antibodies. Lancet Neurol. 7, 1091-1098 (2008).
- Dalmau, J., et al. Paraneoplastic anti-N-methyl-D-aspartate receptor encephalitis associated with ovarian teratoma. Ann Neurol. 61, 25-36 (2007).
- Dale, R. C., et al. N-methyl-D-aspartate receptor antibodies in pediatric dyskinetic encephalitis lethargica. Ann Neurol. 66, 704-709 (2009).
- Lancaster, E., et al. Antibodies to the GABA(B) receptor in limbic encephalitis with seizures: Case series and characterisation of the antigen. Lancet Neurol. 9, 67-76 (2010).
- Lai, M., et al. AMPA receptor antibodies in limbic encephalitis alter synaptic receptor location. Ann Neurol. 65, 424-434 (2009).
- Irani, S. R., et al. Antibodies to Kv1 potassium channel-complex proteins leucine-rich, glioma inactivated 1 protein and contactin-associated protein-2 in limbic encephalitis, Morvan’s syndrome and acquired neuromyotonia. Brain. 133, 2734-2748 (2010).
- Lai, M., et al. Investigation of LGI1 as the antigen in limbic encephalitis previously attributed to potassium channels: a case series. Lancet Neurol. 9, 776-785 (2010).
- Lancaster, E., et al. Antibodies to metabotropic glutamate receptor 5 in the Ophelia syndrome. Neurol. 77, 1698-1701 (2011).
- Dale, R. C., et al. Antibodies to surface dopamine-2 receptor in autoimmune movement and psychiatric disorders. Brain. , (2012).
- Titulaer, M. J., et al. Treatment and prognostic factors for long-term outcome in patients with anti-NMDA receptor encephalitis: an observational cohort study. Lancet Neurol. 12, 157-165 (2013).
- Hughes, E. G., et al. Cellular and synaptic mechanisms of anti-NMDA receptor encephalitis. J Neurosci. 30, 5866-5875 (2010).
- Bien, C. G., et al. Immunopathology of autoantibody-associated encephalitides: clues for pathogenesis. Brain. 135, 1622-1638 (2012).
- Waters, P. J., et al. Serologic diagnosis of NMO: a multicenter comparison of aquaporin-4-IgG assays. Neurol. 78, 665-671 (2012).
- McLaughlin, K. A., et al. Age-Dependent B Cell Autoimmunity to a Myelin Surface Antigen in Pediatric Multiple Sclerosis. J Immunol. 183, 4067-4076 (2009).
- Probstel, A. K., et al. Antibodies to MOG are transient in childhood acute disseminated encephalomyelitis. Neurol. 77, 580-588 (2011).
- Cho, D., et al. N-terminal Region of Dopamine D2 Receptor, a Rhodopsin Family GPCR, Regulates Proper Integration into Plasma Membrane and Endocytic Routes. British journal of pharmacology. , (2011).
- Zhou, D., et al. Identification of a pathogenic antibody response to native myelin oligodendrocyte glycoprotein in multiple sclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 19057-19062 (2006).
- Brilot, F., et al. Antibodies to native myelin oligodendrocyte glycoprotein in children with inflammatory demyelinating central nervous system disease. Ann Neurol. 66, 833-842 (2009).
- Boronat, A., et al. Encephalitis and Antibodies to Dipeptidyl-Peptidase-Like Protein-6, a Subunit of Kv4.2. Potassium Channels. Ann Neurol. 73, 120-128 (2013).
- Hinson, S. R., et al. Aquaporin-4-binding autoantibodies in patients with neuromyelitis optica impair glutamate transport by down-regulating EAAT2. J. Exp. Med. 205, 2473-2481 (2008).
