Summary
In de afgelopen jaren zijn levende celgebaseerde proeven met succes gebruikt om antilichamen tegen oppervlak en conformationele antigenen. Hier beschrijven we een werkwijze met hoge doorvoer flowcytometrie waardoor de analyse van grote patiëntencohorten. Detectie van nieuwe antilichamen verbetert diagnose en behandeling van immuun-gemedieerde aandoeningen.
Abstract
De afgelopen jaren hebben antilichamen tegen oppervlak en conformationele proteïnen betrokken bij neurotransmissie waargenomen bij auto CNS aandoeningen bij kinderen en volwassenen. Deze antilichamen zijn gebruikt om te leiden diagnose en behandeling. Cel-gebaseerde testen hebben de detectie van antilichamen in het serum patiënt verbeterd. Ze zijn gebaseerd op de oppervlakte expressie van hersenantigenen op eukaryotische cellen, die vervolgens geïncubeerd met verdunde sera gevolgd door fluorochroom-geconjugeerde secundaire antilichamen. Na wassen wordt voortgezet antilichaambinding vervolgens geanalyseerd door flow cytometrie. Onze groep heeft een high-throughput flowcytometrie levende cellen gebaseerde test ontwikkeld om betrouwbaar te detecteren antilichamen tegen specifieke neurotransmitter receptoren. Deze stroom cytometrie methode is eenvoudig, kwantitatief, efficiënt en het gebruik van een high-throughput sampler systeem maakt grote patientencohorten gemakkelijk worden getest in een korte tijd. Bovendien, deze cel-gebaseerde alszegt kan gemakkelijk worden aangepast aan antilichamen vele verschillende antigene doelen, zowel het centrale zenuwstelsel en de periferie. Het ontdekken van extra nieuwe afweerstoffen zal een snelle en nauwkeurige diagnose mogelijk te maken en het verbeteren van de behandeling van immuun-gemedieerde aandoeningen.
Introduction
In de afgelopen jaren hebben auto-vormen van het centrale zenuwstelsel (CNS) ziekten geïdentificeerd. Aangetoond is dat deze ziekten geassocieerd zijn gedefinieerd door de aanwezigheid van autoantilichamen. Deze antilichamen binden aan receptoren neuronale en synaptische proteïnen betrokken bij neurotransmissie 1,2. Verschillende antigenen werden gedetecteerd, zoals N-methyl-D-aspartaat receptor (NMDAR) 3-5, γ-aminoboterzuur B receptor (GABA B) receptor 6, α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4- isoxazolepropionic zuur (AMPA) receptor 7, voltage-gated kalium kanaal (VGKC) geassocieerde eiwitten: leucine-rich-glioom geactiveerd 1 eiwit (LGL-1) en-contactine geassocieerd proteïne 2 (capsr2) 8,9, glutamaat receptor 5,10 en dopamine-2-receptor (D2R) 11. In het verleden zijn deze auto in het centraal zenuwstelsel (vooral genoemd encefalitis) waren vaak niet gediagnosticeerd en onbehandeld. Deze nieuwe afweerstoffen, bijv.NMDAR antilichaam of D2R antilichaam, zijn aanzienlijk verbeterd diagnose en bewustzijn, en hebben behandelingsopties voor patiënten geopend. Inderdaad, is vroege behandeling met immuuntherapie geassocieerd met een verbeterde uitkomst 11,12.
Traditionele methoden om antilichamen, zoals enzym-gebonden immunosorbent assay (ELISA) en Western blot detectie zijn gebruikt voor de detectie van antilichamen in sera. Echter, ze niet gemakkelijk in staat de erkenning van extracellulaire of oppervlakte-epitopen en, in plaats daarvan kan immunoreactiviteit naar een intracellulaire epitoop onthullen. Bovendien antilichamen die binden aan het extracellulaire domein van belangrijke eiwitten die betrokken zijn bij neurotransmissie waarschijnlijk pathogeen 2,3,7,13,14 zijn. Daarom is de ontwikkeling van nauwkeurige en gevoelige assays om relevante celoppervlak of extracellulaire targets voor antilichamen bij patiënten ontdekken staat voorop. De gouden standaard methode het gebied is gebaseerd op het gebruik van levende cellen in de zogenaamde "cel-based assays ". Deze werkwijze omvat de expressie van een antigeen op het oppervlak van zoogdiercellen (meest humane embryonische nier 293 (HEK293) cellen) in zijn natieve vorm door transfectie van vectoren die de volledige cDNA-sequentie van het antigeen van belang. Nonpermeabilized levende cellen worden vervolgens geïncubeerd met verdund patiënt serum en vervolgens fluorochroom-geconjugeerde anti-humaan immunoglobuline (Ig) secundair antilichaam. De intensiteit of het niveau van fluorescentie wordt vervolgens gedetecteerd en is gekoppeld aan het niveau van auto-antilichaam binding. Deze techniek is specifiek, aangezien slechts een antigeen tot overexpressie wordt gebracht in cellen. De meest gebruikte "read-out" heeft confocale microscopie analyse geweest na immunocytochemie 4,5,8-10. Echter, flowcytometrie celgebaseerde proeven zijn met succes gebruikt om antilichamen te detecteren bij patiënten met demyelineringsziekten 15-17. Vooral Waters et al.. 15 vergeleek de opsporing van antilichamen met een panel antilichaam detectietechnieken zoals celgebaseerde proeven gevolgd door microscopie of flowcytometrie geanalyseerd en blijkt flowcytometrie celgebaseerde analyse de meest gevoelige, nauwkeurige en betrouwbare methode. Daarom flowcytometrie celgebaseerde analyse is voordelig omdat het kwantitatief, niet onderzoeker afhankelijk, en het gebruik van radioactieve stoffen geen sprake. Het is ook handig omdat hiermee grote patientencohorten worden getest in een korte tijd.
Meer recent hebben wij een high-throughput doorstroomcytometrie celgebaseerde assay NMDAR antilichaam en D2R opsporing van antilichamen bij patiënten met auto centrale zenuwstelsel 11 geoptimaliseerd. Heeft onze groep recent ontdekt NMDAR antilichaam in sera van patiënten met behulp van flowcytometrie-cel-gebaseerde test. Deze NMDAR antilichaam-positieve sera waren eerder geanalyseerd met confocale microscopie en bleken ook positief te zijn 11. Dit protocol beschrijft een doorstroomcytometrie-cellen gebaseerde assay voor de detectie van conformation-gevoelige CNS antilichaam in serum van de patiënt met behulp van een geautomatiseerde high-throughput sampler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Subkloning strategie om Construct pIRES2-EGFP vector Encoding D2R of NMDAR
- Verkrijgen volle lengte cDNA kloon van humaan D2R of NMDAR subunit 1 (NR1).
- Kies een expressievector, zoals pIRES2-EGFP, die geschikt is voor expressie van transmembraan eiwitten met een versterkt groen fluorescent eiwit (GFP) reporter onder controle van een interne ribosoom toegangsplaats (IRES), zodat beide antigenen en GFP te coexpressed in cellen afzonderlijk.
- Subkloon humane cDNA in pIRES2-EGFP vector.
- Om cDNA subkloneren, gebruik dan geschikte restrictie-enzymen (bijvoorbeeld Nhel en Xhol voor menselijke D2R cDNA).
- Ligeer cut cDNA te voegen binnen de beperkte pIRES2-EGFP vector.
- Sequentie geligeerd pIRES2-EGFP D2R of NMDAR vector te controleren of de vector bevat de juiste volgorde.
- Zuiveren en versterken pIRES2-EGFP D2R of NMDAR vector voor later gebruik in transfectie.
- Cultuur HEK293 cellen in weefselkweek kolven met verse Dulbecco's Modified Eagle Medium (1x) (DMEM) compleet met 4,5 g / L D-glucose, L-glutamine en 110 mg / l natriumpyruvaat, aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 2 mM GlutaMAX en 50 ug / ml Gentamicine.
- Los HEK293 cellen met behulp van trypsine en overbrengen in een conische buis.
- Was cellen door centrifugeren bij 250 g gedurende 6 minuten en resuspendeer de celpellet in vers compleet DMEM.
- Tel de cellen en zaden 6 putjes op ongeveer 8 x 10 5 cellen / putje en cultuur overnacht in 2 ml DMEM bij 37 ° C en 5% CO2 in een incubator.
- Zodra ze ongeveer 70% confluentie bereikt, transfecteren de HEK293 cellen met pIRES2-EGFP NR1 (HEK293 NMDAR + cellen), pIRES2-EGFP D2R (HEK293 D2R + cellen) en pIRES2-EGFP (HEK293 CTL cellen; vectorbesturing) als volgt.Houd enkele ongetransfecteerde HEK293 cellen tot schadevergoeding later.
- Bereid het vereiste volume transfectiemengsel omvattende 2,5 ug DNA, 200 gl 0,9% natriumchloride en 4 ug / ml polyethyleenimine / putje (elk 2 ml vers compleet DMEM).
- Onmiddellijk geschud mix voor 10 seconden en geïncubeerd bij kamertemperatuur (KT) gedurende 10 minuten, voor het toevoegen volume transfectiemengsel aan de geschikte putjes.
- Bedek de plaat, wikkel de zijkanten met Parafilm, en centrifugeer bij 280 xg gedurende 5 minuten tot celtransfectie helpen.
- Verwijder de Parafilm en plaats in de incubator om de cultuur bij 37 ° C.
- Vervang voedingsbodems 18 uur later met verse volledige DMEM, en in cultuur te behouden voor een ander 72 uur.
- Optioneel: 72 uur na transfectie, kan getransfecteerde cellen door kweek worden geselecteerd compleet DMEM gesupplementeerd met 250 ug / ml Geneticine, teneinde een polyklonaal stabiele transfectant verkrijgen.
- Maak HEK293 NMDAR +, HEK293 D2R + en HEK293 CTL-cellen door incubatie met 500 ul / putje Versene gedurende ongeveer 5 minuten bij 37 ° C.
- Resuspendeer in 2ml/well PBS (-Ca 2 + /-Mg 2 +) aangevuld met 2% FBS (PBS / FBS) en overbrengen in een 15 ml of 50 ml conische buis.
- Was de cellen door centrifugeren bij 250 g gedurende 6 minuten en resuspendeer de celpellet in 15-50 ml PBS / FBS. Herhaal wassen 2x.
- Tel de cellen en resuspendeer in PBS / FBS 1 x 10 6 cellen / ml.
- Ontwerp van de 96-well template voor flowcytometrie verkrijgen, aangezien HEK293 D2R + en HEK293 NMDAR + cellen, evenals CTL HEK293 cellen moeten worden geïncubeerd met elke patiënt monster of primaire antilichaam.
- Zaadcellen in een V-bodem 96-well plaat bij 50.000 cellen / weII volgens de flowcytometrie acquisitie sjabloon.
- Pellet de cellen door centrifugeren van het 96-well plaat bij 450 xg gedurende 5 minuten en verwijder voorzichtig de supernatant met behulp van elektronische of handmatige multichannel pipet, kantelen van de plaat op een hoek en verzorgen de celpellet niet te zuigen.
- Incubeer HEK293 D2R +, HEK293 NMDAR + en HEK293 CTL cellen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker met:
- Seriële verdunningen van het primaire antilichaam om antigeen oppervlakte-expressie beoordelen.
- Patiëntmonsters om antilichamen te detecteren.
- Gebruik de juiste flowcytometrie compensatie controles, bijvoorbeeld. ongekleurde getransfecteerde HEK293 cellen, GFP + HEK293 cellen (AF647 -) en getransfecteerde AF647 + HEK293 cellen (GFP).
- Was de cellen door centrifugeren bij 450 g gedurende 5 minuten en resuspendeer de celpellet in 170 ul PBS / FBS. Herhaal wasstap twee keer.
- Incubeer cellen gedurende 1 uurr bij kamertemperatuur in het donker met 1:100 verdunning van AF647-geconjugeerd secundair antilichaam (anti-humaan IgG patiënt serum en anti-muis IgG voor anti-NR1 of anti-D2R primaire antilichamen).
- Was de cellen drie keer, zoals in stap 3.7 en resuspendeer in 35 ul PBS / FBS voor flowcytometrie cel acquisitie.
- Stel de high-throughput sampler (HTS) op de flowcytometer (BDLSRII).
- Verwerven 10.000 evenementen / goed volgens de flowcytometrie overname sjabloon.
- Export en vervolgens analyseren van gegevens voor analyse met behulp van een flowcytometrie softwarepakket, zoals FlowJo v7.5:
- Ten eerste, de poort van de live-HEK293 cellen op basis van forward (grootte) en zijkant (granulariteit) verstrooit.
- Verder poort levende HEK293 cellen op basis van hoge GFP-positiviteit alleen de getransfecteerde cellen te analyseren.
- Bepaal de gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) van de AF647 kanaal binnen de live GFP-positieve cellen.
- Gegevens exporteren naar Excel of Prism voor analyse:
- Perceel concentrations primaire antilichaam (anti-NMDAR of anti-D2R antilichaam) ten opzichte van de MFI verkregen uit de cellen geïncubeerd met deze antilichamen.
- Voor elke patiënt en controle monster bepalen ΔMFI door van de MFI van de CTL HEK293 cellen van de MFI van de HEK293 D2R + en HEK293 NMDAR + cellen.
- Bereken de drempel van antilichaam positiviteit door toevoeging van drie standaardafwijkingen boven de gemiddelde ΔMFI van de controle cohort.
- Plot individuele monsters gegroepeerd volgens hun serum tekst op een grafiek en vertegenwoordigen de drempel als een lijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Wonen HEK293 D2R + en HEK293 CTL-cellen werden verkregen bij de flowcytometer behulp van een high-throughput sampler. Tijdens de analyse werden de cellen gated gebaseerd op voorwaartse verstrooiing (grootte) en zijwaartse verstrooiing (granulariteit) parameters (figuren 1A en 1D). Getransfecteerde HEK293 cellen brachten het reportermolecuul, GFP in het cytoplasma en niet-getransfecteerde cellen werden uitgesloten van de analyse (figuren 1B en 1E). Binnen de GFP + poort, de MFI verbonden AF647-geconjugeerd anti-humaan IgG secundair antilichaam binding werd gemeten (figuren 1C en 1F). Om de achtergrond fluorescentie elimineren bij het analyseren humane sera werd de ΔMFI berekend door de MFI van de CTL HEK293 cellen van de MFI van de HEK293 D2R +-cellen (figuur 1G). De getoonde gegevens zijn representatief voor D2R antilichaam analyse, endezelfde gating strategie en gegevensanalyse kunnen worden gebruikt voor NMDAR antilichamen (gegevens niet getoond).
Antilichaam detectie door flow cytometrie celgebaseerde analyse is gebaseerd op het celoppervlak expressie van het antigeen van belang. Zoals getoond in figuur 2, HEK293 NMDAR + cellen sterk tot expressie oppervlak NMDAR (figuur 2A) en HEK293 D2R + cellen sterk tot expressie oppervlak D2R (figuur 2B), terwijl CTL HEK293 cellen brachten geen van deze antigenen (Figuren 2A en 2B).
De patiëntengroepen gebruikt in dit werk bestond uit een patiëntenpopulatie met NMDAR encefalitis (NMDAR Enc, n = 4, een encefalitis bepaald door het detecteren van oppervlakte NMDAR-subunit 1 NR1-antilichaam 3), D2R-antilichaam geassocieerde encefalitis (D2R Enc, n = 6, een encefalitis bepaald door de opsporing van antilichaam oppervlak D2R 11) en een controlecohort wie noninflammatory andere neurologische aandoeningen (OND, n = 26), zoals epilepsie, beroerte, en ontwikkelingsstoornissen of neurodegeneratieve aandoeningen. Patiënten monsters zijn eerder gevalideerd voor NMDAR 5 en D2R 11 IgG positiviteit. De vier patiënten positief voor NMDAR antistoffen typisch klinisch syndroom van NMDAR encefalitis beschreven 3 en serummonsters bleken positief met celgebaseerde proeven voor NMDAR antilichamen zoals beschreven en in commercieel gebruik 3,4. De zes patiënten positief voor D2R antilichamen hadden een typisch klinisch syndroom van basale ganglia encefalitis zoals beschreven 11, en serum monsters werden positief voor D2R antilichamen met behulp van D2R knock-out hersenen secties, getransfecteerde cellen en neuronen 11 bewezen.
Om antilichaam positiviteit patiënten de drempel of cutoff antilichaam positiviteit werd berekend in elk experiment door toevoeging van drie standaardafwijkingen boven debedoel ΔMFI van de NDD controles. De 4/4 patiënten met NMDAR Enc werden positief voor menselijke oppervlak NMDAR IgG antilichaam (figuur 3A) bevestigd, terwijl de 6/6 patiënten met D2R Enc waren positief voor menselijke oppervlak D2R IgG antilichaam (Figuur 3B). Geen van de positieve patiënten waren dubbel positief voor antilichamen gericht NMDAR en D2R. NMDAR en D2R antilichamen werden in geen van de OND controles geanalyseerd gedetecteerd (Figuren 3A en 3B). Patiëntenmonsters werden positief beschouwd indien zij boven de drempelwaarde in ten minste twee van de drie herhaalde experimenten.
Figuur 1. Detectie van antilichaam door high-throughput flowcytometrie-cel-gebaseerde test:. Gating strategie en data-analyse Liv e HEK293 CTL-cellen en HEK293 D2R + stabiele transfectanten werden afgesloten op basis van voorwaartse verstrooiing (FSC) en zijwaartse verstrooiing (SSC) (74,7% en 68,5%, respectievelijk A, D). GFP-positieve cellen in HEK293 CTL en HEK293 D2R + cellen (32,8% en 95,4%, respectievelijk, B, E) werden verder gated om ongetransfecteerde GFP sluiten - cellen (67,2% en 4,6%, respectievelijk, B, E). Binnen de GFP + cellen, de gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) verbonden AF647-geconjugeerd anti-humaan IgG secundair antilichaam (HEK293 CTL = 3657; HEK293 D2R + = 9128) werd gemeten (C, F). Voor menselijke monsters werd de ΔMFI berekend door de MFI van de HEK293 cellen van CTL die van de HEK293 D2R + cellen (G). Representatieve gegevens van D2R antilichaamdetectie wordt getoond. ank "> Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 2. Expressie oppervlakte NMDAR en D2R bepaald met high-throughput doorstroomcytometrie celgebaseerde analyse. HEK293 NMDAR + (A), HEK293 D2R + (B) en HEK293 CTL-cellen werden gekleurd met seriële verdunningen van het primaire antilichaam, gevolgd door een geschikt secundair antilichaam. Hoge oppervlakte-expressie van NMDAR en D2R waargenomen. MFI waarden gecorreleerd met antilichaam titer zij gestaag met toenemende concentraties van primair antilichaam. Zoals verwacht, was er geen detectie oppervlakte NMDAR of D2R in HEK293 cellen CTL. Representatieve gegevens weergegeven.blank "> Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 3. Bevestigd detectie oppervlakte NMDAR en D2R antilichamen in een cohort van patiënten. Sera van NMDAR encefalitis (NMDAR Enc, n = 4), D2R-antilichaam geassocieerde encefalitis (D2R Enc, n = 6) patiënten of controles met andere neurologische aandoeningen (OND , n = 26 of 24) werden geïncubeerd met levende HEK293 NMDAR +, HEK293 D2R + en HEK293 cellen CTL, gevolgd door AF647-geconjugeerd anti-humaan IgG secundair antilichaam. Oppervlak NMDAR en D2R antilichamen werden gedetecteerd in het serum van 4/4 NMDAR Enc patiënten (A) en 6/6 D2R Enc patiënten (B), respectievelijk, terwijl geen van de NDD controles (0/26 of 0/24) had ofwel antilichaam (A, B). Dotted lijnen op grafieken geven de positiviteit drempel berekend door drie standaarddeviaties van het gemiddelde ΔMFI van NDD controles. Vertegenwoordiger puntdiagrammen van de drie experimenten worden getoond. Klik hier voor grotere afbeelding .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit document beschrijft een nieuwe toepassing van flowcytometrie levende cellen gebaseerde test om antilichamen gericht op specifieke celoppervlak neuronale eiwitten met behulp van een high-throughput sampler detecteren. Met behulp van deze techniek, we melden dat een subgroep van patiënten die lijden met auto CNS ziekten hebben serum antilichamen tegen NMDAR oppervlak of aan de oppervlakte D2R.
Essentiële stappen voor optimale detectie-antilichaam met deze high-throughput doorstroomcytometrie levende cellen gebaseerde assay omvat 1) het verkrijgen van een hoge opbrengst aan gezonde getransfecteerde cellen, 2) het verifiëren hoge celoppervlak expressie van het antigeen van belang, 3), waarin een drempel antilichaam positiviteit met een cohort van controles, 4) en bevestiging van de reproduceerbaarheid van de gegevens.
De cultuur van gezonde cellen is essentieel voor het succes van deze techniek. HEK293 cellen zijn bekend om hun gemak van cultuur, hoge transfectie-efficiëntie, en het gebrek aan expressie van neuronaleeiwitten, dat is waarom ze vaak gebruikt in celgebaseerde proeven opsporing van antilichamen tegen specifieke neuronale antigenen 4,5,8-10. Een optimale transfectie een hoog percentage levende GFP + cellen te verkrijgen is kritiek voor deze test nauwkeurig te berekenen MFI. Om deze reden, het produceren van een polyklonaal stabiele cellijn van GFP + HEK293 NMDAR +, HEK293 D2R +, of HEK293 CTL cellen is voordelig omdat het een consistent hoog niveau van GFP + cellen, met het gemak van het niet hebben herhaaldelijk transfecteren cellen voorafgaand aan elk experiment. Een snelle weergave van de getransfecteerde cellen door een omgekeerde microscoop wordt aangeraden om gezonde cellen (GFP + cellen fluoresceren als kwiklamp beschikbaar). Als levensvatbaarheid blijkt niet zo hoog, kan het nuttig zijn om een kleurstof levensvatbaarheid, zoals 7-amino-actinomycine D, alvorens cel verwerving cytometer gebruik van de stroming en een extra stap in de gating analys toevoegenis levensvatbaar cellen uitsluiten.
Bij auto-CNS ziekten worden antilichamen die binden aan extracellulaire domeinen van hersenantigenen gedacht pathogene 2,3,7,13,14 zijn derhalve nadruk gelegd op de detectie van antilichamen met levende en nonpermeabilized cellen. Dit protocol bereikt dit doel door getransfecteerde cellen die oppervlakteantigenen. Daarom is de correcte uitvoer van deze antigenen op het oppervlak moet worden bepaald door kleuring van getransfecteerde cellen met seriële verdunningen van commerciële primair antilichaam tegen het antigeen van belang. Bij de beoordeling van het niveau van expressie van oppervlakte-antigeen op nonpermeabilized cellen is het essentieel om een antilichaam gericht op een extracellulaire epitoop van het eiwit te gebruiken. Wanneer een specifiek antilichaam beschikbaar is, kan het nodig zijn om een tag toevoegen een extracellulair domein van het antigeen en vervolgens gebruiken commerciële antilichaam tegen het tag op oppervlakte-expressie te bepalen. We hebben met succesgebruikte deze benadering met behulp van een-hemagglutinine gelabeld D2R en uitgesloten immunoreactiviteit van patiëntensera de tag zelf 11. Het is ook essentieel dat de gehele cDNA-sequentie van het antigeen van interesse wordt gesubkloneerd in een geschikte vector zodat expressie en structurele integriteit van het celmembraan niet wordt aangetast. Inderdaad, het is eerder aangetoond dat bepaalde domeinen van een receptor eiwit essentieel voor de correcte vouwing, export en integratie in de celmembraan 18.
In flowcytometrie-cel-gebaseerde testen, beoordelen antilichaam positiviteit van patiëntensera in elk experiment is gebaseerd op de vaststelling van een drempel of cutoff, afgeleid van een cohort van de controles. Zhou et al.. 19 berekende een drempel van antilichaam positiviteit door het toevoegen van twee standaarddeviaties boven het gemiddelde Δmedian fluorescentie-intensiteit, en dit ongeveer overeen met de 95 ste percentiel van de gezonde controle bereik. Inonze vorige studies, hebben we gekozen voor een hogere cutoff (toevoeging van drie standaarddeviaties van het gemiddelde Δ MFI van de controle cohort), wat overeenkwam met de 99 e percentiel van de gezonde controle bereik 11,20. Bovendien McLaughlin et al.. 16 gekozen om de bepaling van specifieke antilichaam reactiviteit drukken als de verhouding van MFI tussen de antigeen tot expressie brengende cellen en de antigeen-negatieve cellen. Een verhouding groter dan 5 werd positief beschouwd en overeen met drie standaardafwijkingen boven de gemiddelde verhouding van de controles, die vergelijkbaar is met ons werk. Met behulp van een hogere drempel verhoogt de striktheid van het protocol en verbetert de discriminatie tussen controles en patiënten positief voor antilichamen. Belangrijk is, in onze ervaring, het antilichaam reactiviteit van de gezonde controle bereik was niet significant verschillend van de NDD bereik, waardoor het gebruik van een van beide bevolking berekend wordene de drempel van antilichaam positiviteit 11,20.
Zoals in al het onderzoek experimenten, data reproduceerbaarheid van het grootste belang. Patiënt sera positief voor antilichamen tegen een specifiek antigeen neuronale beschouwd wanneer boven de drempel van positiviteit in ten minste twee van drie onafhankelijke experimenten. Individuele patiënten variërende concentraties IgG in hun serum. Deze variaties kunnen van invloed zijn op het niveau van antilichaambinding opzichte van andere patiënten. Alle patiënten sera uit onze vorige studie werden gemeten door nefelometrie en gevonden binnen het normale bereik (6,2-14,4 g / L) 11, en we altijd verdunde sera met dezelfde verdunningsfactor. De oprichting van een titer curve van de individuele serum kunnen worden opgesteld om te vergelijken concentraties van antilichamen tussen patiënten. Daarnaast wordt aanvankelijke blindering van de onderzoeker aanbevolen tijdens celgebaseerde analyse, maar controles moeten worden gedeblindeerd om de poneren berekenenivity drempel.
Wanneer een plausibele doelantilichaam wordt gevonden, wordt geschikte validatie vereist om valse positiviteit voorkomen. Antilichaam-positieve of-negatieve monsters gedetecteerd met de flowcytometrie-cellen gebaseerde bepaling worden getest met behulp van een alternatieve methode die zou bij voorkeur niet gedenatureerd of gelineariseerde antigenen gebruiken. Zo verminderde immunoreactiviteit op hersensecties van antigeen-knock-out dieren is succesvol gebleken bij verschillende pas gerapporteerd CNS autoantigenen 9-11,21. Immunoabsorptie van patiëntensera on-antigeen tot expressie brengende cellen ook werden gebruikt om de resultaten 9,11 valideren.
De flowcytometrie celgebaseerde assay protocol beschreven in dit document kunnen eenvoudig worden gewijzigd antilichaam specificiteit beoordelen in een veelheid van verschillende antigene, inclusief die zich buiten het CZS. Het is waarschijnlijk dat antilichamen van andere onbekende specificiteiten bestaan en nog wordengeïdentificeerd. Bovendien is deze methode geschikt voor het detecteren van verschillende klassen en subklassen van Ig, zoals IgM, zoals in onze eerdere studies 11,20. De bepaling van IgG subklasse kan ook potentieel te onthullen bij te dragen aan de ziekte pathogenese. Bijvoorbeeld IgG1 en IgG3 kunnen antilichaam-afhankelijke cel-gemedieerde cytotoxiciteit mediëren of complement-afhankelijke cytotoxiciteit die worden gerapporteerd autoantilichaam geïnduceerde pathogene mechanismen 14,20,22. Dan AF647 (far rood) fluorescente kleurstoffen kunnen ook zolang ze emissiepieken ver genoeg van die van het reportermolecuul, GFP worden gebruikt. Elke overlappende emissiespectra moet de juiste schadevergoeding eisen. Het bepalen van de specificiteit van een antilichaam aan een intracellulair eiwit zou ook mogelijk zijn met flowcytometrie, hoewel cellen moeten eerst worden vastgesteld en permeabel het antigeen beschikbare antilichaambinding maken. Deze alternatieve techniek kan tot hoge background als gevolg van de blootstelling van antilichamen tegen intracellulaire domeinen evenals tal van cellulaire antigenen, die anders verborgen waren in levende nonpermeabilized cellen. Deze verstorende factoren kunnen de sterkte van de stroom cytometrie celgebaseerde analyse en geschikte controles dienovereenkomstig worden uitgevoerd te verminderen.
Het gebruik van high-throughput doorstroomcytometrie celgebaseerde analyse een betrouwbare en nauwkeurige werkwijze voor de detectie van antilichamen in menselijk serum van grote patiëntencohorten. Het ontdekken van extra nieuwe antilichamen door middel van deze techniek zal helpen bij de diagnose en toekomstige behandelingen van patiënten met auto-CNS ziekten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Belangenconflict: Een octrooi is ingediend door FB en RCD (Universiteit van Sydney) claimen D2R als doelwit voor auto-antilichamen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Australische National Health en Medical Research Council, Star Scientific Foundation (Australië), Gilles de la Tourette syndroom Association (USA), De Trish Multiple Sclerose Research Foundation en Multiple Sclerose Research Australië, Petre Foundation (Australië), de Rebecca L. Cooper Medical Research Foundation (Australië). Wij danken alle patiënten en familieleden die monsters voor onze studie verstrekt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pIRES2-EGFP vector | Clontech | 6029-1 | |
| Human HA-Dopamine-2 receptor (D2R) cDNA | Missouri S&T cDNA Resource Centre | DRD020TN00 | |
| Human subunit 1 of NMDAR (NR1) cDNA | Gift from Prof A. Vincent (Oxford, UK) | ||
| Monoclonal purified mouse anti-human NR1 antibody (clone: 54.1) | BD Pharmingen | 556308 | |
| Mouse purified monoclonal anti-DRD2 IgG (clone: 1B11) | Sigma-Aldrich | WH0001813M1-50UG | |
| Alexa Fluor 647 donkey anti-mouse IgG (H + L) | Invitrogen | A31571 | |
| Alexa Fluor 647 goat anti-human IgG (H + L) | Invitrogen | A21445 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (1x) 4.5 g/L D-glucose, L-Glutamine and 110 mg/L sodium pyruvate | Invitrogen | 11995-065 | |
| Foetal bovine serum | Invitrogen | 10099-141 | |
| Gentamicin | Invitrogen | 15710-072 | |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050-061 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Geneticin | Invitrogen | 10131-035 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x) (-Ca2+/-Mg2+) | Invitrogen | 14190-144 | |
| TrypLE Express (1x) with Phenol Red | Invitrogen | 12605-028 | |
| 0.9% Sodium chloride | Baxter | AHF7975 | |
| Polyethylenimine | Polysciences Inc | 9002-98-6 | |
| Versene | Invitrogen | 15040-066 | |
| XhoI | Roche | 10899194001 | |
| NheI | Roche | 10885843001 | |
| PureLink PCR Purification Kit | Invitrogen | K3100-01 | |
| JetQuick Gel Extraction Spin Kit | Genomed | 420050 | |
| T4 DNA Ligase | Roche | 10481220001 | |
| Plasmid Plus Maxi Kit | Qiagen | 12963 | |
| Name of Equipment/Software | Company | Catalog Number | Model/Version |
| Flow cytometer with high-throughput sampler system | BD Biosciences | BDLSRII with HTS | |
| Inverted microscope | Olympus | CKX41 (with mercury lamp and U-RFLT50 power supply) | |
| Electronic multichannel pipette (15-300 μl) | Eppendorf | 613-2240P | 12-channel Xplorer Plus |
| Excel | Microsoft | 2010 | |
| Prism | GraphPad Software, Inc. | v4 | |
| FlowJo | Treestar | v7.5 | |
| 50 ml polypropylene conical tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| 6-well plate | BD Biosciences | 353046 | |
| Tissue culture flask (T75) | BD Biosciences | 353136 | |
| Parafilm | Pechiney Plastic Packaging | PM-992 | |
| V-bottom 96-well plate | Corning | 651180 | |
References
- Lancaster, E., Martinez-Hernandez, E., Dalmau, J. Encephalitis and antibodies to synaptic and neuronal cell surface proteins. Neurol. 77, 179-189 (2011).
- Vincent, A., Bien, C. G., Irani, S. R., Waters, P. Autoantibodies associated with diseases of the CNS: new developments and future challenges. Lancet Neurol. 10, 759-772 (2011).
- Dalmau, J., et al. Anti-NMDA-receptor encephalitis: case series and analysis of the effects of antibodies. Lancet Neurol. 7, 1091-1098 (2008).
- Dalmau, J., et al. Paraneoplastic anti-N-methyl-D-aspartate receptor encephalitis associated with ovarian teratoma. Ann Neurol. 61, 25-36 (2007).
- Dale, R. C., et al. N-methyl-D-aspartate receptor antibodies in pediatric dyskinetic encephalitis lethargica. Ann Neurol. 66, 704-709 (2009).
- Lancaster, E., et al. Antibodies to the GABA(B) receptor in limbic encephalitis with seizures: Case series and characterisation of the antigen. Lancet Neurol. 9, 67-76 (2010).
- Lai, M., et al. AMPA receptor antibodies in limbic encephalitis alter synaptic receptor location. Ann Neurol. 65, 424-434 (2009).
- Irani, S. R., et al. Antibodies to Kv1 potassium channel-complex proteins leucine-rich, glioma inactivated 1 protein and contactin-associated protein-2 in limbic encephalitis, Morvan’s syndrome and acquired neuromyotonia. Brain. 133, 2734-2748 (2010).
- Lai, M., et al. Investigation of LGI1 as the antigen in limbic encephalitis previously attributed to potassium channels: a case series. Lancet Neurol. 9, 776-785 (2010).
- Lancaster, E., et al. Antibodies to metabotropic glutamate receptor 5 in the Ophelia syndrome. Neurol. 77, 1698-1701 (2011).
- Dale, R. C., et al. Antibodies to surface dopamine-2 receptor in autoimmune movement and psychiatric disorders. Brain. , (2012).
- Titulaer, M. J., et al. Treatment and prognostic factors for long-term outcome in patients with anti-NMDA receptor encephalitis: an observational cohort study. Lancet Neurol. 12, 157-165 (2013).
- Hughes, E. G., et al. Cellular and synaptic mechanisms of anti-NMDA receptor encephalitis. J Neurosci. 30, 5866-5875 (2010).
- Bien, C. G., et al. Immunopathology of autoantibody-associated encephalitides: clues for pathogenesis. Brain. 135, 1622-1638 (2012).
- Waters, P. J., et al. Serologic diagnosis of NMO: a multicenter comparison of aquaporin-4-IgG assays. Neurol. 78, 665-671 (2012).
- McLaughlin, K. A., et al. Age-Dependent B Cell Autoimmunity to a Myelin Surface Antigen in Pediatric Multiple Sclerosis. J Immunol. 183, 4067-4076 (2009).
- Probstel, A. K., et al. Antibodies to MOG are transient in childhood acute disseminated encephalomyelitis. Neurol. 77, 580-588 (2011).
- Cho, D., et al. N-terminal Region of Dopamine D2 Receptor, a Rhodopsin Family GPCR, Regulates Proper Integration into Plasma Membrane and Endocytic Routes. British journal of pharmacology. , (2011).
- Zhou, D., et al. Identification of a pathogenic antibody response to native myelin oligodendrocyte glycoprotein in multiple sclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 19057-19062 (2006).
- Brilot, F., et al. Antibodies to native myelin oligodendrocyte glycoprotein in children with inflammatory demyelinating central nervous system disease. Ann Neurol. 66, 833-842 (2009).
- Boronat, A., et al. Encephalitis and Antibodies to Dipeptidyl-Peptidase-Like Protein-6, a Subunit of Kv4.2. Potassium Channels. Ann Neurol. 73, 120-128 (2013).
- Hinson, S. R., et al. Aquaporin-4-binding autoantibodies in patients with neuromyelitis optica impair glutamate transport by down-regulating EAAT2. J. Exp. Med. 205, 2473-2481 (2008).
