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Medicine

मानव सीरम में एन मिथाइल-D-aspartate रिसेप्टर या dopamine का 2 रिसेप्टर के लिए एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए उच्च throughput फ्लो सेल आधारित परख

Published: November 23, 2013 doi: 10.3791/50935
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1, 1
1Institute for Neuroscience and Muscle Research, The Kids Research Institute at the Children's Hospital at Westmead, The University of Sydney, 2Flow Cytometry Centre, Westmead Millennium Institute for Medical Research

Summary

हाल के वर्षों में, लाइव सेल आधारित assays सतह और गठनात्मक एंटीजन के खिलाफ एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है. यहाँ, हम रोगियों की बड़ी साथियों के विश्लेषण सक्षम cytometry उच्च throughput प्रवाह का उपयोग कर एक विधि का वर्णन. उपन्यास एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए प्रतिरक्षा की मध्यस्थता से जुड़ी समस्याओं के निदान और उपचार में सुधार होगा.

Abstract

हाल के वर्षों में, सतह और neurotransmission में शामिल गठनात्मक प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी बच्चों और वयस्कों में autoimmune सीएनएस रोगों में खोजा गया है. ये एंटीबॉडी निदान और उपचार के लिए गाइड करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. सेल आधारित assays रोगी सीरम में एंटीबॉडी का पता लगाने में सुधार हुआ है. वे तो fluorochrome संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी द्वारा पीछा पतला रोगी सीरा के साथ incubated हैं जो कोशिकाओं पर मस्तिष्क एंटीजन, की सतह अभिव्यक्ति पर आधारित हैं. धोने के बाद, बाध्यकारी माध्यमिक एंटीबॉडी तो फ्लो से विश्लेषण किया है. हमारे समूह मज़बूती से विशिष्ट neurotransmitter रिसेप्टर्स के खिलाफ एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए लाइव सेल आधारित परख cytometry एक उच्च throughput प्रवाह विकसित की है. इस फ्लो विधि सीधे आगे, मात्रात्मक, कुशल है, और बड़े रोगी साथियों को आसानी से समय की एक छोटी जगह में assayed हो के लिए एक उच्च throughput नमूना प्रणाली का प्रयोग अनुमति देता है. इसके अतिरिक्त, इस रूप में सेल आधारितकहने आसानी से केंद्रीय तंत्रिका तंत्र और परिधि से दोनों कई अलग अलग प्रतिजनी लक्ष्य के लिए एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. अतिरिक्त उपन्यास एंटीबॉडी बायोमार्कर की खोज शीघ्र और सही निदान सक्षम और प्रतिरक्षा की मध्यस्थता विकारों के उपचार में सुधार होगा.

Introduction

हाल के वर्षों में, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) रोगों के autoimmune रूपों की पहचान की गई है. यह इन बीमारियों जुड़े और autoantibodies की उपस्थिति द्वारा परिभाषित कर रहे हैं कि दिखाया गया है. ये एंटीबॉडी neuronal रिसेप्टर्स या neurotransmission 1,2 में शामिल synaptic प्रोटीन के लिए बाध्य. विभिन्न एंटीजन ऐसी एन मिथाइल-D-aspartate रिसेप्टर (NMDAR) 3-5, γ-aminobutyric एसिड बी रिसेप्टर (GABA बी) रिसेप्टर 6, α-अमीनो-3-hydroxy-5-मिथाइल-4-, के रूप में खोजा गया है isoxazolepropionic एसिड (AMPA) रिसेप्टर 7, वोल्टेज gated पोटेशियम चैनल (VGKC) जुड़े प्रोटीन: leucine संपन्न glioma सक्रिय 1 प्रोटीन (LGL -1) और contactin जुड़े प्रोटीन 2 (capsr2) 8,9, ग्लूटामेट रिसेप्टर 5,10 , और डोपामाइन -2 रिसेप्टर (D2R) 11. अतीत में, (मुख्य रूप से इन्सेफेलाइटिस कहा जाता है) इन autoimmune सीएनएस विकारों अक्सर undiagnosed और अनुपचारित थे. ये उपन्यास एंटीबॉडी बायोमार्कर, उदाNMDAR एंटीबॉडी या D2R एंटीबॉडी, काफी हद तक निदान और जागरूकता में सुधार हुआ है, और रोगियों के लिए उपचार के विकल्प खोल दिया है. दरअसल, immunotherapies के साथ जल्दी इलाज बेहतर परिणाम 11,12 के साथ जुड़ा हुआ है.

ऐसे एंजाइम से जुड़ी immunosorbent परख (एलिसा) और पश्चिमी धब्बा के रूप में एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए पारंपरिक तरीकों के सेरा में एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया है. हालांकि, वे आसानी से बाह्य या सतह epitopes की मान्यता सक्षम नहीं है और, बल्कि, एक intracellular मिलान की ओर immunoreactivity प्रकट हो सकता है. इसके अलावा, neurotransmission में शामिल महत्वपूर्ण प्रोटीन की कोशिकी डोमेन के लिए बाध्य एंटीबॉडी कि रोगजनक 2,3,7,13,14 होने की संभावना है. इसलिए, प्रासंगिक कोशिका की सतह या रोगियों में बाह्य एंटीबॉडी लक्ष्य की खोज करने के लिए सही और संवेदनशील assays के विकास सर्वोपरि है. क्षेत्र में सोने के मानक विधि तथाकथित "सेल में बीए, जीवित कोशिकाओं के उपयोग पर आधारित हैSED assays ". इस विधि स्तनधारी कोशिकाओं ब्याज की प्रतिजन की पूरी सीडीएनए अनुक्रम युक्त वैक्टर के अभिकर्मक द्वारा अपने मूल रूप में (सबसे अधिक बार मानव भ्रूण गुर्दे 293 (HEK293) कोशिकाओं) की सतह पर एक प्रतिजन की अभिव्यक्ति शामिल है. लाइव nonpermeabilized कोशिकाओं तो पतला रोगी सीरम के साथ incubated और fluorochrome संयुग्मित विरोधी मानव इम्युनोग्लोबुलिन (आईजी) माध्यमिक एंटीबॉडी द्वारा पीछा कर रहे हैं. प्रतिदीप्ति की तीव्रता या स्तर तो पता चला है और बाध्यकारी स्वप्रतिरक्षी के स्तर पर जुड़ा हुआ है. केवल एक प्रतिजन कोशिकाओं में overexpressed है के रूप में इस तकनीक, विशिष्ट है. सबसे व्यापक रूप से "पढ़ने के लिए बाहर" का इस्तेमाल immunocytochemistry 4,5,8-10 बाद confocal माइक्रोस्कोपी विश्लेषण किया गया है. हालांकि, सेल आधारित assays प्रवाह cytometry सफलतापूर्वक demyelinating रोगों 15-17 के साथ रोगियों में एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया है. विशेष रूप से, जल एट अल. 15 एक पैन का उपयोग एंटीबॉडी का पता लगाने की तुलनासेल आधारित माइक्रोस्कोपी द्वारा पीछा assays या प्रवाह सहित एंटीबॉडी का पता लगाने की तकनीक का El cytometry विश्लेषण करती है, और सबसे संवेदनशील सटीक और विश्वसनीय तरीका हो सेल आधारित परख प्रवाह cytometry दिखाया गया है. यह अन्वेषक निर्भर, मात्रात्मक नहीं है, और रेडियोधर्मी सामग्री के किसी भी इस्तेमाल को शामिल नहीं करता है के रूप में इसलिए, सेल आधारित परख प्रवाह cytometry फायदेमंद है. यह बड़े रोगी साथियों समय की एक छोटी राशि में assayed की अनुमति देता है के रूप में यह भी सुविधाजनक है.

हाल ही में, हम autoimmune सीएनएस बीमारियों 11 के साथ रोगियों में NMDAR एंटीबॉडी और D2R एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए सेल आधारित परख cytometry एक उच्च throughput प्रवाह अनुकूलित है. हमारे समूह ने हाल ही में सेल आधारित परख प्रवाह cytometry का उपयोग रोगी सीरा में NMDAR एंटीबॉडी का पता चला. ये NMDAR एंटीबॉडी पॉजिटिव सीरा पहले confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग विश्लेषण किया गया है और यह भी 11 पॉजिटिव पाए गए. इस प्रोटोकॉल सी का पता लगाने के लिए सेल आधारित परख cytometry एक प्रवाह की रूपरेखाएक स्वचालित उच्च throughput पारखी उपयोग रोगी सीरम में onformation संवेदनशील सीएनएस एंटीबॉडी.

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Protocol

1. रणनीति pIRES2-EGFP वेक्टर तय D2R या NMDAR के निर्माण के लिए subcloning

  1. मानव D2R या NMDAR सबयूनिट 1 (NR1) की पूर्ण लंबाई सीडीएनए क्लोन प्राप्त करते हैं.
  2. ऐसे में coexpressed होने के लिए एंटीजन और GFP दोनों को सक्षम करने के एक बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन एक आंतरिक ribosome प्रविष्टि साइट (IRES) के नियंत्रण में (GFP) के संवाददाता के साथ transmembrane प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए उपयुक्त है जो pIRES2-EGFP, के रूप में एक अभिव्यक्ति वेक्टर, चुनें अलग कोशिकाओं.
  3. PIRES2-EGFP वेक्टर भीतर मानव सीडीएनए Subclone.
    1. , सीडीएनए subclone उचित प्रतिबंध एंजाइमों का उपयोग करने के लिए (मानव D2R सीडीएनए के लिए उदाहरण NheI और XhoI के लिए).
    2. Ligate कटौती सीडीएनए प्रतिबंधित pIRES2-EGFP वेक्टर भीतर डालें.
    3. अनुक्रम वेक्टर सही क्रम होता है कि क्या जांच करने के लिए pIRES2-EGFP D2R या NMDAR वेक्टर ligated.
    4. शुद्ध और अभिकर्मक में बाद में उपयोग के लिए pIRES2-EGFP D2R या NMDAR वेक्टर बढ़ाना.
itle "> 2. Neuronal एंटीजन की अभिव्यक्ति के लिए HEK293 सेल अभिकर्मक

  1. ताजा Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (1x) (DMEM) 4.5 छ / एल डी ग्लूकोज, एल glutamine और 110 मिलीग्राम 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक / एल सोडियम पाइरूवेट के साथ पूरा साथ टिशू कल्चर बोतल में संस्कृति HEK293 कोशिकाओं, 2 मिमी GlutaMAX, और 50 माइक्रोग्राम / एमएल gentamicin.
  2. Trypsin और हस्तांतरण एक शंक्वाकार ट्यूब का उपयोग HEK293 कोशिकाओं को अलग करें.
    1. 6 मिनट के लिए 250 XG पर कोशिकाओं centrifuging द्वारा धो लें और ताजा पूरा DMEM में सेल गोली resuspend.
  3. लगभग 8 x 10 5 कोशिकाओं / अच्छी तरह से और संस्कृति रातोंरात 2ml DMEM में 37 डिग्री सेल्सियस और 5% एक इनक्यूबेटर में सीओ 2 में कोशिकाओं और बीज 6 अच्छी तरह प्लेटें गणना.
  4. वे लगभग 70% confluency पर पहुंच जाने के बाद, pIRES2-EGFP NR1 (HEK293 NMDAR + कोशिकाओं), pIRES2-EGFP D2R (HEK293 D2R + कोशिकाओं) के साथ HEK293 कोशिकाओं transfect, और pIRES2-EGFP (HEK293 सीटीएल कोशिकाओं, वेक्टर नियंत्रण) के रूप में.बाद में मुआवजे के लिए कुछ untransfected HEK293 कोशिकाओं रखें.
    1. 2.5 माइक्रोग्राम डीएनए, 200 μl 0.9% सोडियम क्लोराइड और 4 ग्राम / एमएल polyethylenimine / अच्छी तरह से (प्रत्येक 2 मिलीलीटर ताजा पूरा DMEM युक्त) शामिल अभिकर्मक मिश्रण की मात्रा को तैयार है.
    2. इसके तत्काल बाद 10 सेकंड के लिए मिश्रण भंवर और उचित वेल्स को अभिकर्मक मिश्रण की मात्रा जोड़ने से पहले, 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आर टी) पर सेते हैं.
    3. , प्लेट कवर Parafilm के साथ पक्षों लपेट, और सेल अभिकर्मक सहायता करने के लिए 5 मिनट के लिए 280 XG पर अपकेंद्रित्र.
    4. Parafilm निकालें और फिर 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति को इनक्यूबेटर में जगह
    5. ताजा पूरा DMEM के साथ 18 घंटे बाद संस्कृति मीडिया बदलें, और एक और 72 घंटे के लिए संस्कृति में बनाए रखें.
    6. वैकल्पिक: 72 घंटे बाद अभिकर्मक, कोशिकाओं एक पॉलीक्लोनल स्थिर transfectant प्राप्त करने के लिए, 250 ग्राम / एमएल Geneticin के साथ पूरक पूरा DMEM में संस्कृति से चुना जा सकता है.
  1. 37 डिग्री सेल्सियस पर लगभग 5 मिनट के लिए 500 μl / अच्छी तरह Versene साथ ऊष्मायन द्वारा HEK293 NMDAR +, HEK293 D2R +, और HEK293 सीटीएल कोशिकाओं को अलग करें
    1. पीबीएस के 2ml/well में Resuspend (सीए 2 + /-2 मिलीग्राम +) 2% FBS (पीबीएस / FBS) और एक 15 मिलीलीटर या 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब को हस्तांतरण के साथ पूरक.
    2. 6 मिनट के लिए 250 XG पर centrifuging द्वारा कोशिकाओं को धो लें और 15-50 मिलीलीटर पीबीएस / FBS में सेल गोली resuspend. धोने 2x दोहराएँ.
    3. कक्षों की गणना और फिर 1 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल पीबीएस / FBS में resuspend.
  2. HEK293 D2R + या HEK293 NMDAR + कोशिकाओं, साथ ही HEK293 सीटीएल कोशिकाओं प्रत्येक रोगी नमूना या प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ incubated करना होगा, विचार है कि फ्लो अधिग्रहण के लिए 96 अच्छी तरह से डिजाइन टेम्पलेट.
  3. 50,000 कोशिकाओं / हम पर एक वी के नीचे 96 अच्छी तरह से थाली में बीज कोशिकाओंडालूँगा अधिग्रहण टेम्पलेट प्रवाह cytometry के अनुसार.
  4. 5 मिनट के लिए 450 XG पर 96 अच्छी तरह से थाली centrifuging और धीरे एक इलेक्ट्रॉनिक या मैनुअल मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग कर सतह पर तैरनेवाला हटाने, एक कोण पर थाली झुकने और सेल गोली महाप्राण को नहीं ख्याल रख रही द्वारा गोली कोशिकाओं.
  5. HEK293 D2R +, HEK293 NMDAR +, और साथ अंधेरे में आरटी पर 1 घंटे के लिए HEK293 सीटीएल कोशिकाओं को सेते हैं:
    1. प्रतिजन सतह अभिव्यक्ति का आकलन करने के क्रम में प्राथमिक एंटीबॉडी के धारावाहिक dilutions.
    2. एंटीबॉडी का पता लगाने के क्रम में मरीज के नमूनों.
  6. जैसे, मुआवजा नियंत्रण cytometry उचित प्रवाह का उपयोग करें. बेदाग untransfected HEK293 कोशिकाओं, + GFP HEK293 कोशिकाओं (AF647 -), और untransfected AF647 + HEK293 कोशिकाओं (GFP).
  7. 5 मिनट के लिए 450 XG पर centrifuging द्वारा कोशिकाओं को धो लें और 170 μl पीबीएस / FBS में सेल गोली resuspend. धोने कदम दो बार दोहराएँ.
  8. 1 घंटे के लिए कोशिकाओं को सेते(एंटी NR1 या विरोधी D2R प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए रोगी सीरम और विरोधी माउस आईजीजी के लिए विरोधी मानव आईजीजी) AF647 संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के 1:100 कमजोर पड़ने के साथ अंधेरे में आरटी पर आर.
  9. कदम 3.7 में के रूप में, कोशिकाओं तीन बार धोएं, और सेल अधिग्रहण प्रवाह cytometry के लिए 35 μl पीबीएस / FBS में resuspend.
  10. (BDLSRII) प्रवाह cytometer पर उच्च throughput पारखी (एचटीएस) की स्थापना की.
  11. अधिग्रहण टेम्पलेट प्रवाह cytometry के अनुसार 10,000 घटनाओं / अच्छी तरह से मोल.
  12. निर्यात और फिर ऐसे FlowJo v7.5 के रूप में सॉफ्टवेयर पैकेज cytometry एक प्रवाह है, का उपयोग विश्लेषण के लिए डेटा का विश्लेषण:
    1. सबसे पहले, आगे (आकार) और पक्ष (विघटन) पर आधारित गेट लाइव HEK293 कोशिकाओं scatters.
    2. केवल ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए उच्च GFP-सकारात्मकता के आधार पर आगे के गेट लाइव HEK293 कोशिकाओं.
    3. लाइव GFP पॉजिटिव कोशिकाओं के भीतर AF647 चैनल का मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता (एमएफआई) निर्धारित करते हैं.
    4. विश्लेषण के लिए एक्सेल या चश्मे में निर्यात डेटा:
      1. प्लॉट गएमएफआई बनाम प्राथमिक एंटीबॉडी (विरोधी NMDAR या विरोधी D2R एंटीबॉडी) की oncentrations इन एंटीबॉडी के साथ incubated कोशिकाओं से प्राप्त की.
      2. प्रत्येक रोगी और नियंत्रण नमूना के लिए क्रमशः HEK293 D2R + या HEK293 NMDAR + कोशिकाओं के एमएफआई से HEK293 सीटीएल कोशिकाओं के एमएफआई घटाकर ΔMFI निर्धारित करते हैं.
      3. नियंत्रण पलटन का मतलब ΔMFI ऊपर तीन मानक विचलन जोड़कर एंटीबॉडी सकारात्मकता की सीमा की गणना.
      4. प्लॉट व्यक्तिगत नमूने एक ग्राफ पर उनके सीरम प्रकार के अनुसार वर्गीकृत और एक पंक्ति के रूप में सीमा का प्रतिनिधित्व करते हैं.

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Representative Results

लाइव HEK293 D2R + और ​​HEK293 सीटीएल कोशिकाओं को एक उच्च throughput पारखी का उपयोग कर प्रवाह cytometer पर हासिल किया गया. विश्लेषण के दौरान, कोशिकाओं आगे तितर बितर (आकार) और पक्ष तितर बितर (विघटन) मापदंडों (आंकड़े 1 ए और 1 डी) पर आधारित gated थे. ट्रांसफ़ेक्ट HEK293 कोशिकाओं कोशिका द्रव्य में संवाददाता अणु, GFP व्यक्त, और untransfected कोशिकाओं विश्लेषण (आंकड़े 1 बी और 1E) से बाहर रखा गया. + GFP फाटक के भीतर, AF647 संयुग्मित विरोधी मानव आईजीजी माध्यमिक एंटीबॉडी बंधन के साथ जुड़े एमएफआई (आंकड़े 1 सी और 1F) मापा गया था. मानव सीरा विश्लेषण करते समय पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति को खत्म करने के लिए, ΔMFI HEK293 D2R + कोशिकाओं के एमएफआई (चित्रा 1G) से HEK293 सीटीएल कोशिकाओं के एमएफआई घटाकर द्वारा गणना की गई. दिखाया गया डेटा D2R प्रतिरक्षी विश्लेषण के प्रतिनिधि है, औरएक ही gating रणनीति और डेटा विश्लेषण NMDAR एंटीबॉडी का पता लगाने (नहीं दिखाया डेटा) के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

सेल आधारित परख प्रवाह cytometry द्वारा एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए ब्याज की प्रतिजन की कोशिका की सतह अभिव्यक्ति पर आधारित है. चित्रा 2 में दिखाया गया है HEK293 सीटीएल कोशिकाओं इन एंटीजन की न तो (आंकड़े 2A और 2 बी) व्यक्त जबकि, HEK293 NMDAR + कोशिकाओं अत्यधिक सतह NMDAR (2A चित्रा) व्यक्त की और HEK293 D2R + कोशिकाओं अत्यधिक सतह D2R (चित्रा 2B) व्यक्त किया.

इस काम में इस्तेमाल रोगी समूहों NMDAR इन्सेफेलाइटिस के साथ एक रोगी पलटन के शामिल (NMDAR पूर्वी नौसेना कमान, N = 4, सतह NMDAR सबयूनिट 1 का पता लगाने NR1 एंटीबॉडी 3 से परिभाषित एक इन्सेफेलाइटिस), D2R एंटीबॉडी जुड़े इन्सेफेलाइटिस (D2R पूर्वी नौसेना कमान, एन = 6, सतह D2R एंटीबॉडी 11 का पता लगाने के द्वारा परिभाषित एक इन्सेफेलाइटिस), और एक नियंत्रण पलटन वाईमिर्गी, स्ट्रोक, और विकास या neurodegenerative विकारों के रूप में वें अन्य noninflammatory मस्तिष्क संबंधी बीमारियों (दूसरी, एन = 26),. रोगी के नमूने पहले NMDAR 5 और D2R 11 आईजीजी सकारात्मकता के लिए मान्य किया गया है. NMDAR एंटीबॉडी के लिए सकारात्मक चार रोगियों 3 में वर्णित है और सीरम नमूनों वर्णित और वाणिज्यिक उपयोग के 3,4 में उपलब्ध के रूप में NMDAR एंटीबॉडी के लिए सेल आधारित assays का उपयोग सकारात्मक साबित हो रहे थे के रूप में NMDAR इन्सेफेलाइटिस का एक विशिष्ट नैदानिक ​​सिंड्रोम था. D2R एंटीबॉडी के लिए सकारात्मक छह रोगियों 11 के रूप में वर्णित बेसल ganglia इन्सेफेलाइटिस का एक विशिष्ट नैदानिक ​​सिंड्रोम था, और सीरम नमूनों D2R नाक आउट मस्तिष्क वर्गों, कोशिकाओं, और न्यूरॉन्स 11 का उपयोग D2R एंटीबॉडी के लिए सकारात्मक साबित हो रहे थे.

रोगियों में एंटीबॉडी सकारात्मकता का निर्धारण करने के लिए, एंटीबॉडी सकारात्मकता की दहलीज, या कटऑफ, ऊपर तीन मानक विचलन जोड़कर प्रत्येक प्रयोग में गणना की गईदूसरी नियंत्रण के ΔMFI मतलब है. D2R पूर्वी नौसेना कमान के साथ 6/6 रोगियों मानव सतह D2R आईजीजी एंटीबॉडी (3B चित्रा) के लिए सकारात्मक थे जबकि NMDAR पूर्वी नौसेना कमान के साथ 4/4 रोगियों, मानव सतह NMDAR आईजीजी एंटीबॉडी (चित्रा 3) के लिए सकारात्मक की पुष्टि की थी. पॉजिटिव रोगियों में से कोई भी NMDAR और D2R को लक्षित एंटीबॉडी के लिए डबल सकारात्मक थे. NMDAR और D2R एंटीबॉडी का विश्लेषण दूसरी नियंत्रणों में से किसी में नहीं पाया गया (आंकड़े 3 ए और 3 बी). वे तीन दोहराया प्रयोगों के बाहर कम से कम दो में सीमा से ऊपर थे, तो रोगी के नमूने सकारात्मक विचार किया गया.

चित्रा 1
चित्रा 1. सेल आधारित परख cytometry उच्च throughput प्रवाह द्वारा एंटीबॉडी की जांच:. रणनीति और डेटा विश्लेषण gating लिव ई HEK293 सीटीएल कोशिकाओं और HEK293 D2R + स्थिर transfectants आगे तितर बितर (एफएससी) और पक्ष तितर बितर (एसएससी) (; ए, डी क्रमशः 74.7% और 68.5%,) पर आधारित gated थे. HEK293 सीटीएल और HEK293 D2R + कोशिकाओं (क्रमशः 32.8% और 95.4%,, बी, ई) के भीतर GFP सकारात्मक कोशिकाओं - कोशिकाओं (; बी, ई क्रमशः 67.2% और 4.6%,) आगे untransfected GFP बाहर करने के लिए gated थे. GFP + कोशिकाओं के भीतर, AF647 संयुग्मित विरोधी मानव आईजीजी माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ जुड़े मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता (एमएफआई) (= 3,657 HEK293 सीटीएल, HEK293 D2R + = 9128) (सी, एफ) मापा गया था. मानव नमूने लिए, ΔMFI HEK293 D2R + कोशिकाओं (जी) के उस से HEK293 सीटीएल कोशिकाओं के एमएफआई घटाकर द्वारा गणना की गई. D2R एंटीबॉडी का पता लगाने के प्रतिनिधि डेटा दिखाया गया है. ANK "> बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
चित्रा 2. सेल आधारित परख cytometry उच्च throughput प्रवाह द्वारा निर्धारित सतह NMDAR और D2R की अभिव्यक्ति. HEK293 NMDAR + (ए), HEK293 D2R + (बी), और HEK293 सीटीएल कोशिकाओं उचित माध्यमिक एंटीबॉडी द्वारा पीछा प्राथमिक एंटीबॉडी के धारावाहिक dilutions, साथ दाग रहे थे. NMDAR और D2R की उच्च सतह अभिव्यक्ति मनाया गया. वे प्राथमिक एंटीबॉडी की बढ़ती सांद्रता के साथ तेजी से वृद्धि हुई के रूप में एमएफआई मूल्यों एंटीबॉडी titre साथ सहसंबद्ध. जैसी कि उम्मीद थी, HEK293 सीटीएल कोशिकाओं में सतह NMDAR या D2R का कोई पता लगाने वहाँ था. प्रतिनिधि डेटा दिखाया गया है.रिक्त "> बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
चित्रा 3. रोगियों. NMDAR इन्सेफेलाइटिस से सीरा (NMDAR पूर्वी नौसेना कमान, N = 4) अन्य स्नायविक रोगों के साथ, D2R एंटीबॉडी जुड़े इन्सेफेलाइटिस (D2R पूर्वी नौसेना कमान, एन = 6) रोगियों, या नियंत्रण (दूसरी की एक पलटन में सतह NMDAR और D2R एंटीबॉडी की पुष्टि का पता लगाने , एन = 26 या 24), जी HEK293 NMDAR +, HEK293 D2R +, और HEK293 सीटीएल कोशिकाओं के साथ incubated AF647 संयुग्मित विरोधी मानव आईजीजी माध्यमिक एंटीबॉडी द्वारा पीछा किया गया था. दूसरी नियंत्रण (0/26 या 0/24) में से कोई भी या तो था, जबकि भूतल NMDAR और D2R एंटीबॉडी, 4/4 NMDAR पूर्वी नौसेना कमान रोगियों (ए) और 6/6 D2R पूर्वी नौसेना कमान रोगियों (बी) के सीरम में पाया गया एंटीबॉडी (ए, बी). Dotteरेखांकन पर डी लाइनों दूसरी नियंत्रण का मतलब ΔMFI के लिए तीन मानक विचलन जोड़कर गणना की सकारात्मकता सीमा का प्रतिनिधित्व करते हैं. तीन प्रयोगों के बाहर प्रतिनिधि डॉट भूखंडों दिखाए जाते हैं. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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Discussion

यह पत्र एक उच्च throughput पारखी का उपयोग विशेष सेल सतह neuronal प्रोटीन का लक्ष्य एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए लाइव सेल आधारित परख प्रवाह cytometry का एक उपन्यास आवेदन का वर्णन करता है. इस तकनीक का उपयोग करना, हम autoimmune सीएनएस रोगों से प्रभावित रोगियों के एक उपसमूह NMDAR सतह के लिए या D2R सतह के लिए सीरम एंटीबॉडी है कि रिपोर्ट.

लाइव सेल आधारित परख cytometry इस उच्च throughput प्रवाह का उपयोग इष्टतम एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए आवश्यक कदम स्वस्थ कोशिकाओं की एक उच्च उपज प्राप्त करने के) शामिल हैं 1, ब्याज की प्रतिजन का 2) की पुष्टि उच्च कोशिका की सतह अभिव्यक्ति, 3) एंटीबॉडी की एक सीमा की स्थापना सकारात्मकता नियंत्रण की एक पलटन का उपयोग कर, 4) और डेटा के reproducibility की पुष्टि.

स्वस्थ कोशिकाओं की संस्कृति इस तकनीक की सफलता के लिए मौलिक है. HEK293 कोशिकाओं संस्कृति, उच्च अभिकर्मक दक्षता, और neuronal की अभिव्यक्ति की कमी के अपने आसानी के लिए प्रसिद्ध हैंप्रोटीन, जो वे आमतौर पर विशिष्ट neuronal एंटीजन 4,5,8-10 के लिए एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए सेल आधारित assays में इस्तेमाल किया गया है क्यों है. इस परख सही एमएफआई की गणना करने के लिए लाइव GFP + कोशिकाओं के एक उच्च प्रतिशत अर्जित करने का इष्टतम अभिकर्मक दर महत्वपूर्ण है. यह पिछले करने के लिए बार बार transfect कोशिकाओं को नहीं होने का जोड़ा सुविधा के साथ, GFP + कोशिकाओं के एक लगातार उच्च स्तर प्रदान करता है के रूप में इस कारण से, एक GFP की पॉलीक्लोनल स्थिर सेल लाइन + HEK293 NMDAR +, HEK293 D2R +, या HEK293 सीटीएल कोशिकाओं के निर्माण लाभप्रद है प्रत्येक प्रयोग. एक औंधा माइक्रोस्कोप के माध्यम से कोशिकाओं की एक त्वरित देखने स्वस्थ कोशिकाओं (पारा दीपक उपलब्ध है अगर GFP + कोशिकाओं प्रतिदीप्ति) के लिए जांच की सिफारिश की है. व्यवहार्यता इतनी अधिक नहीं लगता है, यह प्रवाह cytometer पर सेल अधिग्रहण से पहले इस तरह के 7 अमीनो actinomycin डी के रूप में एक व्यवहार्यता डाई, उपयोग करने के लिए फायदेमंद हो सकता है और analys में एक अतिरिक्त gating कदम जोड़ने के लिएnonviable कोशिकाओं को बाहर करने के लिए है.

Autoimmune सीएनएस रोगों में, मस्तिष्क एंटीजन की कोशिकी डोमेन के लिए बाध्य है कि एंटीबॉडी इसलिए जोर लाइव और nonpermeabilized कोशिकाओं का उपयोग एंटीबॉडी का पता लगाने पर रखा गया है, रोगजनक 2,3,7,13,14 माना जाता है. इस प्रोटोकॉल सतह एंटीजन व्यक्त कोशिकाओं का उपयोग कर इस उद्देश्य को प्राप्त होता है. इसलिए, सतह के लिए इन एंटीजन का सही निर्यात हित के प्रतिजन के खिलाफ एक वाणिज्यिक प्राथमिक एंटीबॉडी के धारावाहिक dilutions के साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं का धुंधला द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिए. Nonpermeabilized कोशिकाओं पर सतह प्रतिजन की अभिव्यक्ति के स्तर का आकलन करते हैं, यह प्रोटीन का एक बाह्य मिलान को लक्षित एक एंटीबॉडी का उपयोग करने के लिए आवश्यक है. एक विशिष्ट एंटीबॉडी उपलब्ध नहीं है, तो यह प्रतिजन की एक बाह्य डोमेन पर एक टैग जोड़ना आवश्यक हो, और उसके बाद सतह अभिव्यक्ति का निर्धारण करने के टैग के खिलाफ एक वाणिज्यिक एंटीबॉडी का उपयोग कर सकते हैं. हम सफलतापूर्वक हैएक hemagglutinin टैग D2R का उपयोग इस दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया और टैग ही 11 से रोगी सीरा के immunoreactivity खारिज कर दिया. यह कोशिका झिल्ली पर अभिव्यक्ति और संरचनात्मक अखंडता समझौता नहीं है कि इतनी रुचि के प्रतिजन की पूरी सीडीएनए अनुक्रम एक उपयुक्त वेक्टर में subcloned है कि यह भी महत्वपूर्ण है. दरअसल, यह पहले से एक रिसेप्टर प्रोटीन की विशेष डोमेन कोशिका झिल्ली 18 में सही तह, निर्यात, और एकीकरण के लिए आवश्यक हैं कि दिखाया गया है.

सेल आधारित assays प्रवाह cytometry में, प्रत्येक प्रयोग में रोगी सीरा के एंटीबॉडी सकारात्मकता का आकलन नियंत्रण की एक पलटन से व्युत्पन्न, एक सीमा, या कटऑफ की स्थापना पर निर्भर करता है. झोउ एट अल. 19 मतलब Δmedian प्रतिदीप्ति तीव्रता से ऊपर दो मानक विचलन जोड़कर एंटीबॉडी सकारात्मकता की एक सीमा की गणना, और यह लगभग स्वस्थ नियंत्रण श्रृंखला की 95 वीं प्रतिशतक के लिए corresponded. मेंहमारे पिछले अध्ययनों, हम एक उच्च कटऑफ स्वस्थ नियंत्रण सीमा 11,20 के 99 वें प्रतिशतक के लिए corresponded, जो (नियंत्रण पलटन का मतलब Δ एमएफआई के लिए तीन मानक विचलन के अलावा) के लिए चुना. इसके अलावा, McLaughlin एट अल. 16 प्रतिजन व्यक्त कोशिकाओं और प्रतिजन नकारात्मक कोशिकाओं के बीच एमएफआई के अनुपात के रूप में विशिष्ट एंटीबॉडी जेट की माप व्यक्त करने के लिए चुना है. 5 से अधिक का अनुपात सकारात्मक माना जाता है और हमारे काम करने के समान है जो नियंत्रण का मतलब अनुपात, ऊपर तीन मानक विचलन के लिए corresponded गया था. एक उच्च सीमा का उपयोग करना प्रोटोकॉल की तंगी बढ़ जाती है और नियंत्रण और एंटीबॉडी के लिए सकारात्मक रोगियों के बीच भेदभाव को बेहतर बनाता है. महत्वपूर्ण बात है, हमारे अनुभव में, स्वस्थ नियंत्रण सीमा के एंटीबॉडी जेट calculat को आबादी या तो का उपयोग को सक्षम करने, दूसरी श्रृंखला की तुलना में काफी अलग नहीं थाएंटीबॉडी सकारात्मकता 11,20 के ई सीमा.

सभी अनुसंधान प्रयोगों के रूप में, डेटा reproducibility सर्वोपरि है. वे तीन स्वतंत्र प्रयोगों के बाहर कम से कम दो में सकारात्मकता की सीमा से ऊपर हैं अगर रोगी सीरा एक विशिष्ट neuronal प्रतिजन के खिलाफ एंटीबॉडी के लिए सकारात्मक माना जाता है. व्यक्ति के रोगियों को उनके सीरम में आईजीजी की सांद्रता अलग है. इन बदलावों अन्य रोगियों के सापेक्ष बाध्यकारी एंटीबॉडी के स्तर पर प्रभाव पड़ सकता है. हमारे पिछले अध्ययन में इस्तेमाल सभी रोगी सीरा nephelometry से मापा और सामान्य श्रेणी (6.2-14.4 जी / एल) 11 के भीतर हो पाया, और हम हमेशा एक ही कमजोर पड़ने कारक के साथ सीरा पतला थे. व्यक्तिगत सीरम की एक अनुमापांक वक्र की स्थापना रोगियों के बीच एंटीबॉडी की सांद्रता की तुलना करने के क्रम में फायदेमंद हो सकता है. इसके अतिरिक्त, अन्वेषक की प्रारंभिक चकाचौंध सेल आधारित परख के दौरान की सिफारिश की, लेकिन नियंत्रण मंज़ूर की गणना करने के क्रम में unblinded करने की आवश्यकता हैivity सीमा.

एक प्रशंसनीय एंटीबॉडी लक्ष्य पाया जाता है, तो उचित सत्यापन झूठी सकारात्मकता को रोकने के लिए आवश्यक है. सेल आधारित परख प्रवाह cytometry का उपयोग कर पाया एंटीबॉडी पॉजिटिव या नेगेटिव नमूनों preferentially विकृत या linearized एंटीजन का उपयोग नहीं होगा कि एक वैकल्पिक पद्धति का उपयोग assayed किया जाना चाहिए. उदाहरण के लिए, प्रतिजन विशेष तोड़े बाहर जानवरों से मस्तिष्क वर्गों पर immunoreactivity कमी आई सफलतापूर्वक 9-11,21 autoantigens कई नव सूचना दी सीएनएस के मामले में दिखाया गया है. प्रतिजन व्यक्त कोशिकाओं पर रोगी सीरा के Immunoabsorption भी परिणाम 9,11 मान्य करने के लिए इस्तेमाल किया गया है.

इस पत्र में वर्णित सेल आधारित परख प्रोटोकॉल प्रवाह cytometry आसानी सीएनएस के बाहर पाए जाने वाले सहित विभिन्न प्रतिजनी लक्ष्य, के एक भीड़ के लिए एंटीबॉडी विशिष्टता का आकलन करने के लिए बदला जा सकता है. यह अन्य अज्ञात specificities के एंटीबॉडी होने के लिए अभी तक अस्तित्व में रहे हैं और संभावना है किपहचान की. हमारे पिछले अध्ययनों 11,20 में दिखाया गया है इसके अलावा, इस तकनीक, आईजीएम सहित पुलिस महानिरीक्षक के विभिन्न वर्गों और उपवर्गों, का पता लगाने के लिए उपयुक्त है. आईजीजी उपवर्ग का दृढ़ संकल्प भी रोग रोगजनन में योगदान करने के लिए क्षमता प्रकट हो सकता है. उदाहरण के लिए IgG1 या IgG3 एंटीबॉडी पर निर्भर सेल की मध्यस्थता cytotoxicity मध्यस्थता या पूरक पर निर्भर स्वप्रतिरक्षी प्रेरित pathogenicity तंत्र 14,20,22 रिपोर्ट कर रहे हैं जो cytotoxicity, करने में सक्षम हैं. AF647 (सुदूर लाल) के अलावा अन्य फ्लोरोसेंट रंजक भी जब तक वे काफी दूर तक संवाददाता अणु, GFP के उस से उत्सर्जन चोटियों के रूप में उपयोग किया जा सकता है. किसी भी अतिव्यापी उत्सर्जन स्पेक्ट्रा सही मुआवजा आवश्यकताओं के लिए होना चाहिए. कोशिकाओं पहले तय की और एंटीबॉडी बंधन को प्रतिजन उपलब्ध बनाने के लिए permeabilized करने की आवश्यकता है, हालांकि एक intracellular प्रोटीन के लिए एक एंटीबॉडी की विशिष्टता का निर्धारण भी, प्रवाह cytometry का उपयोग संभव होगा. इस वैकल्पिक तकनीक उच्च backgrou में परिणाम कर सकते हैंएन डी कारण अन्यथा लाइव nonpermeabilized कोशिकाओं में छिपे हुए थे, जो intracellular डोमेन साथ ही कई सेलुलर एंटीजन, के लिए एंटीबॉडी का प्रदर्शन करने के लिए. इन कारकों सेल आधारित परख और उपयुक्त नियंत्रण तदनुसार प्रदर्शन किया जाना चाहिए प्रवाह cytometry की ताकत को कम कर सकते हैं.

सेल आधारित परख cytometry उच्च throughput प्रवाह का उपयोग रोगियों की बड़ी साथियों से मानव सीरम में एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए एक विश्वसनीय और सटीक तरीका प्रदान करता है. इस तकनीक के माध्यम से अतिरिक्त उपन्यास एंटीबॉडी की खोज निदान और autoimmune सीएनएस रोगों के रोगियों के भविष्य के उपचार में मदद मिलेगी.

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Disclosures

ब्याज का संघर्ष: एक पेटेंट autoantibodies के लिए लक्ष्य के रूप में D2R का दावा अमेरिकन प्लान और RCD (सिडनी विश्वविद्यालय) द्वारा दायर की गई है.

Acknowledgments

यह काम ऑस्ट्रेलियाई राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद, स्टार वैज्ञानिक फाउंडेशन (ऑस्ट्रेलिया), Tourette सिंड्रोम एसोसिएशन (यूएसए) द्वारा समर्थित किया गया था, ट्रिश मल्टीपल स्केलेरोसिस अनुसंधान फाउंडेशन और मल्टीपल स्केलेरोसिस रिसर्च ऑस्ट्रेलिया, Petre फाउंडेशन (ऑस्ट्रेलिया), रेबेका एल कूपर मेडिकल रिसर्च फाउंडेशन (ऑस्ट्रेलिया). हम सभी रोगियों और हमारे अध्ययन के लिए नमूने उपलब्ध कराए गए हैं, जो परिवार के सदस्यों को धन्यवाद.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pIRES2-EGFP vector Clontech 6029-1
Human HA-Dopamine-2 receptor (D2R) cDNA Missouri S&T cDNA Resource Centre DRD020TN00
Human subunit 1 of NMDAR (NR1) cDNA Gift from Prof A. Vincent  (Oxford, UK)
Monoclonal purified mouse anti-human NR1 antibody (clone: 54.1) BD Pharmingen 556308
Mouse purified monoclonal anti-DRD2 IgG (clone: 1B11) Sigma-Aldrich WH0001813M1-50UG
Alexa Fluor 647 donkey anti-mouse IgG (H + L) Invitrogen A31571
Alexa Fluor 647 goat anti-human IgG (H + L) Invitrogen A21445
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (1x) 4.5 g/L D-glucose, L-Glutamine and 110 mg/L sodium pyruvate Invitrogen 11995-065
Foetal bovine serum Invitrogen 10099-141
Gentamicin Invitrogen 15710-072
GlutaMAX Invitrogen 35050-061
Penicillin-streptomycin Invitrogen 15140-122
Geneticin Invitrogen 10131-035
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x) (-Ca2+/-Mg2+) Invitrogen 14190-144
TrypLE Express (1x) with Phenol Red Invitrogen 12605-028
0.9% Sodium chloride Baxter AHF7975
Polyethylenimine Polysciences Inc 9002-98-6
Versene Invitrogen 15040-066
XhoI Roche 10899194001
NheI Roche 10885843001
PureLink PCR Purification Kit Invitrogen K3100-01
JetQuick Gel Extraction Spin Kit Genomed 420050
T4 DNA Ligase Roche 10481220001
Plasmid Plus Maxi Kit Qiagen 12963
Name of Equipment/Software Company Catalog Number Model/Version
Flow cytometer with high-throughput sampler system BD Biosciences BDLSRII with HTS
Inverted microscope Olympus CKX41 (with mercury lamp and U-RFLT50 power supply)
Electronic multichannel pipette (15-300 μl) Eppendorf 613-2240P 12-channel Xplorer Plus
Excel Microsoft 2010
Prism GraphPad Software, Inc. v4
FlowJo Treestar v7.5
50 ml polypropylene conical tubes BD Biosciences 352070
6-well plate BD Biosciences 353046
Tissue culture flask (T75) BD Biosciences 353136
Parafilm Pechiney Plastic Packaging PM-992
V-bottom 96-well plate Corning 651180

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References

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चिकित्सा अंक 81 प्रवाह cytometry सेल आधारित परख स्वप्रतिरक्षी उच्च throughput पारखी autoimmune सीएनएस रोग
मानव सीरम में एन मिथाइल-D-aspartate रिसेप्टर या dopamine का 2 रिसेप्टर के लिए एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए उच्च throughput फ्लो सेल आधारित परख
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Amatoury, M., Merheb, V., Langer, J., Wang, X. M., Dale, R. C., Brilot, F. High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum. J. Vis. Exp. (81), e50935, doi:10.3791/50935 (2013).

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