Summary
Nel corso degli ultimi anni, saggi cellulari vivi sono stati utilizzati con successo per rilevare gli anticorpi contro gli antigeni di superficie e conformazionale. Qui, descriviamo un metodo con elevate throughput citometria consentire l'analisi di grandi coorti di pazienti. Individuazione di anticorpi romanzo migliorare la diagnosi e il trattamento di disturbi immuno-mediata.
Abstract
Nel corso degli ultimi anni, gli anticorpi contro le proteine di superficie e conformazionali coinvolti nella neurotrasmissione sono state rilevate nelle malattie autoimmuni del sistema nervoso centrale nei bambini e negli adulti. Questi anticorpi sono stati utilizzati per guidare la diagnosi e il trattamento. Saggi cellulari hanno migliorato il rilevamento di anticorpi nel siero del paziente. Essi si basano sulla superficie espressione di antigeni cerebrali sulle cellule eucariotiche, che vengono poi incubate con sieri diluiti paziente seguito da anticorpi secondari coniugati con fluorocromi. Dopo il lavaggio, il legame anticorpo secondario viene quindi analizzata mediante citometria a flusso. Il nostro gruppo ha sviluppato un flusso di high-throughput citometria saggio basato su cellule-live per rilevare in modo affidabile gli anticorpi contro recettori dei neurotrasmettitori specifici. Questo metodo di citometria a flusso è dritto in avanti, quantitativa, efficiente, e l'uso di un sistema di campionamento ad alta velocità permette di grandi coorti di pazienti di essere facilmente analizzati in un breve lasso di tempo. Inoltre, questa cella basata comedire che può essere facilmente adattato per rilevare gli anticorpi a molti diversi target antigenici, sia dal sistema nervoso centrale e la periferia. Alla scoperta di biomarcatori supplementari romanzo di anticorpi consentirà una diagnosi tempestiva e accurata e migliorare il trattamento dei disturbi immuno-mediate.
Introduction
Negli ultimi anni, sono state individuate forme autoimmuni del sistema nervoso centrale (SNC) malattie. E 'stato dimostrato che queste malattie sono associate e definiti dalla presenza di autoanticorpi. Questi anticorpi si legano ai recettori neuronali o proteine sinaptiche coinvolte nella neurotrasmissione 1,2. Sono stati rilevati diversi antigeni, come recettore N-metil-D-aspartato (NMDAR) 3-5, recettore γ-amminobutirrico B (GABA B) recettore 6, α-ammino-3-idrossi-5-metil-4- L'acido isoxazolepropionic (AMPA) recettore 7, canale del potassio voltaggio-dipendenti (anti-VGKC) proteine associate: leucina-ricchi glioma attivato 1 proteina (LGL-1) e contattonel-proteina associata 2 (capsr2) 8,9, glutammato recettore 5,10 , e la dopamina-2 recettore (D2R) 11. In passato, questi disturbi autoimmuni del sistema nervoso centrale (principalmente chiamati encefalite) erano spesso non diagnosticata e non trattata. Questi biomarcatori anticorpi romanzo, ad esempio,NMDAR anticorpo o anticorpi D2R, hanno sostanzialmente migliorato la diagnosi e la consapevolezza, e hanno aperto le opzioni di trattamento per i pazienti. Infatti, il trattamento precoce con immunoterapie è associata con una migliore esito 11,12.
I metodi tradizionali per rilevare gli anticorpi, come immunoenzimatico assay (ELISA) e Western Blot sono stati utilizzati per la rilevazione di anticorpi nel siero. Tuttavia, essi non consentono facilmente riconoscimento di epitopi extracellulari o di superficie e, invece, possono rivelare immunoreattività verso un epitopo intracellulare. Inoltre, gli anticorpi che si legano al dominio extracellulare di proteine importanti coinvolti nella neurotrasmissione sono suscettibili di essere 2,3,7,13,14 patogeni. Pertanto, lo sviluppo di analisi accurate e sensibili per scoprire superficie cellulare pertinente o bersagli degli anticorpi extracellulare nei pazienti è fondamentale. Il metodo gold standard nel campo si basa sull'utilizzo di cellule vive, nelle cosiddette "cell-basaggi sed ". Questo metodo comporta l'espressione di un antigene sulla superficie di cellule di mammifero (molto spesso renali (293) HEK293 cellule embrionali umane) nella sua forma nativa mediante trasfezione di vettori contenenti la sequenza di cDNA completa l'antigene di interesse. Cellule nonpermeabilized live vengono poi incubate con il siero del paziente diluito e seguiti da fluorocromo coniugato immunoglobulina anti-umana (Ig) anticorpo secondario. Viene quindi rilevata l'intensità o livello di fluorescenza ed è associato al livello di legame autoanticorpi. Questa tecnica è specifico, come un unico antigene è iperespresso nelle cellule. Il ampiamente usato "read-out" più è stata l'analisi di microscopia confocale dopo immunocitochimica 4,5,8-10. Tuttavia, citometria a flusso saggi cellulari sono stati utilizzati con successo per rilevare gli anticorpi nei pazienti con malattie demielinizzanti 15-17. In particolare, Waters et al. 15 rispetto individuazione di anticorpi utilizzando una vaschettael di tecniche di rilevazione degli anticorpi, tra cui saggi cellulari seguite da microscopio o flusso analisi di citometria, e ha mostrato la citometria a flusso saggio basato su cellule ad essere il metodo più sensibile, accurato e affidabile. Pertanto, citofluorimetria saggio basato su cellule è vantaggioso in quanto è quantitativa, non investigatore-dipendente, e non comporta alcun uso di materiale radioattivo. E 'anche conveniente in quanto consente grandi coorti di pazienti da analizzare in un breve lasso di tempo.
Più di recente, abbiamo ottimizzato un flusso di high-throughput citometria saggio basato su cellule di rilevare NMDAR anticorpi e anticorpi D2R nei pazienti con malattie autoimmuni del sistema nervoso centrale 11. Il nostro gruppo ha recentemente rilevato anticorpi NMDAR nel siero del paziente usando la citometria a flusso saggio basato su cellule. Questi sieri anticorpo-positivi NMDAR sono stati precedentemente analizzati usando la microscopia confocale e sono stati anche trovato positivo 11. Questo protocollo delinea una citofluorimetria saggio basato su cellule per la rilevazione di conformation sensibile anticorpi CNS nel siero del paziente utilizzando un campionatore ad alto rendimento automatizzato.
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Protocol
1. Subclonaggio Strategia Per costruire pIRES2-EGFP Vector Encoding D2R o NMDAR
- Ottenere full-length cDNA clone di D2R umana o NMDAR subunità 1 (NR1).
- Scegliere un vettore di espressione, come pIRES2-EGFP, che è adatto per l'espressione di proteine transmembrana con una proteina migliorata verde fluorescente (GFP) reporter sotto il controllo di un sito di entrata del ribosoma interno (IRES), permettendo sia antigeni e GFP essere coespressi in cellule separatamente.
- Subclone cDNA umano all'interno pIRES2-EGFP vettoriale.
- Per subclonare cDNA, utilizzare appropriati enzimi di restrizione (ad esempio NheI e XhoI per l'uomo D2R cDNA).
- Inserire legare taglio cDNA entro ristretto pIRES2-EGFP vettoriale.
- Sequenza ligato pIRES2-EGFP D2R o NMDAR vettore per verificare se il vettore contiene la sequenza corretta.
- Purificare e amplificare pIRES2-EGFP D2R o NMDAR vettore per un uso successivo in trasfezione.
- Cellule Cultura HEK293 in tessuto fiasche di coltura con il fresco di Dulbecco Modified Eagle Medium (1x) (DMEM) completa di 4,5 g / L D-glucosio, L-glutammina e 110 mg / L piruvato di sodio supplementato con 10% di siero fetale bovino (FBS), 2 GlutaMAX mM e 50 pg / ml Gentamicina.
- Staccare cellule HEK293 con tripsina e trasferimento in un tubo conico.
- Lavare le cellule per centrifugazione a 250 xg per 6 min e risospendere il pellet di cellule in DMEM fresco completo.
- Contare le celle e sementi 6 pozzetti a circa 8 x 10 5 cellule / pozzetto e cultura pernottamento in DMEM 2 ml a 37 ° C e 5% di CO 2 in un incubatore.
- Una volta che hanno raggiunto circa il 70% di confluenza, trasfezione le cellule HEK293 con pIRES2-EGFP NR1 (+ cellule HEK293 NMDAR), pIRES2-EGFP D2R (HEK293 D2R + cellule), e (cellule HEK293 CTL; controllo vettoriale) pIRES2-EGFP come segue.Mantenere alcune cellule HEK293 untransfected di risarcimento in seguito.
- Preparare il volume richiesto di miscela di trasfezione comprendente 2,5 ug di DNA, 200 microlitri 0,9% cloruro di sodio e 4 mg / ml polyethylenimine / pozzetto (ciascuna contenente 2 ml di DMEM fresco completo).
- Vortice immediatamente la miscela per 10 sec e incubare a temperatura ambiente (RT) per 10 minuti, prima di aggiungere volume di miscela di trasfezione ai pozzetti appropriati.
- Coprire la piastra, avvolgere i lati con Parafilm e centrifugare a 280 xg per 5 minuti per aiutare trasfezione cellulare.
- Rimuovere il Parafilm e poi posto in incubatrice alla cultura a 37 ° C.
- Sostituire la cultura dei media 18 ore più tardi con DMEM fresco completo, e mantenere in coltura per un altro 72 hr.
- Facoltativo: 72 ore dopo la trasfezione, le cellule transfettate possono essere selezionati mediante coltura in DMEM completo supplementato con 250 ug / ml Geneticin, al fine di ottenere un policlonale trasfettante stabile.
- Staccare HEK293 NMDAR +, HEK293 D2R +, e cellule HEK293 CTL mediante incubazione con 500 microlitri / pozzetto Versene per circa 5 min a 37 ° C.
- Risospendere in 2ml/well di PBS (-Ca 2 + /-Mg 2 +) integrato con il 2% FBS (PBS / FBS) e trasferimento a 15 ml o 50 ml tubo conico.
- Lavare le cellule per centrifugazione a 250 xg per 6 min e risospendere il pellet di cellule in 15-50 ml di PBS / FBS. Ripetere il lavaggio 2x.
- Contare le cellule e poi risospendere in PBS / FBS a 1 x 10 6 cellule / ml.
- Progettare il modello a 96 pozzetti per l'acquisizione citometria a flusso, visto che + cellule HEK293 D2R + o HEK293 NMDAR, così come le cellule HEK293 CTL dovranno essere incubate con ciascun campione clinico o anticorpo primario.
- Cellule seme in una piastra a 96 pozzetti V-bottom a 50.000 cellule / noill secondo la citometria a flusso template di acquisizione.
- Agglomerare le cellule per centrifugazione della piastra a 96 pozzetti a 450 xg per 5 min e rimuovere delicatamente il supernatante utilizzando una pipetta multicanale elettronica o manuale, inclinando la piastra su un angolo e facendo attenzione a non aspirare il pellet di cellule.
- Incubare HEK293 D2R +, HEK293 NMDAR +, e le cellule HEK293 CTL per 1 ora a temperatura ambiente al buio con:
- Diluizioni seriali di anticorpo primario al fine di valutare l'espressione dell'antigene di superficie.
- I campioni dei pazienti al fine di rilevare gli anticorpi.
- Usare adeguato flusso citometria a controlli di compensazione, ad esempio. cellule HEK293 untransfected non colorate, GFP + cellule HEK293 (AF647 -), e untransfected AF647 + HEK293 cellule (GFP).
- Lavare le cellule per centrifugazione a 450 xg per 5 minuti e risospendere il pellet cellulare in 170 microlitri di PBS / FBS. Ripetere la fase di lavaggio altre due volte.
- Incubare le cellule per 1 hr alla RT al buio con diluizione 1:100 di AF647 coniugato anticorpo secondario (anti-IgG umane per il siero del paziente e anti-topo IgG per anticorpi primari anti-NR1 o anti-D2R).
- Lavare le cellule tre volte, come al punto 3.7, e risospendere in 35 microlitri di PBS / FBS per citometria a flusso acquisizione cellulare.
- Impostare il campionatore ad alto rendimento (HTS) sul citofluorimetro (BDLSRII).
- Acquisire 10.000 eventi / bene secondo la citometria a flusso template di acquisizione.
- Export e poi analizzare i dati per l'analisi utilizzando un citometria a flusso pacchetto software, come ad esempio FlowJo v7.5:
- In primo luogo, porta le cellule HEK293 viventi basata su avanti (dimensione) e laterale (granularità) disperde.
- Ulteriori cancello cellule vive HEK293 basato su alta GFP-positività per analizzare solo le cellule trasfettate.
- Determinare l'intensità di fluorescenza media (MFI) del canale AF647 all'interno delle cellule GFP-positive vivi.
- Esportare dati in Excel o Prism per l'analisi:
- Plot cconcentrazioni del di anticorpo primario (anti-NMDAR o anticorpo anti-D2R) contro l'MFI ottenuti dalle cellule incubate con questi anticorpi.
- Per ciascun campione e controllo, determinare il ΔMFI sottraendo il MFI delle cellule HEK293 CTL dal MFI del HEK293 D2R + o + NMDAR cellule HEK293, rispettivamente.
- Calcolare la soglia di positività anticorpale con l'aggiunta di tre deviazioni standard sopra la ΔMFI media della coorte di controllo.
- Singoli campioni Plot raggruppati in base al loro tipo di siero su un grafico e rappresentano la soglia come una linea.
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Representative Results
Cellule vive HEK293 D2R + e HEK293 CTL sono stati acquisiti al citofluorimetro utilizzando un campionatore high-throughput. Durante l'analisi, le cellule sono state gated basato su forward scatter (dimensione) e parametri (granularità) (Figure 1A e 1D) side scatter. Cellule HEK293 trasfettate espressi molecola reporter, GFP, nel citoplasma, e le cellule non trasfettate sono stati esclusi dall'analisi (Figure 1B e 1E). All'interno della GFP + cancello, la MFI associata con il legame AF647-coniugato anti-IgG umane anticorpo secondario è stato misurato (figure 1C e 1F). Al fine di eliminare la fluorescenza di fondo analizzando sieri umani, la ΔMFI stato calcolato sottraendo il MFI delle cellule HEK293 CTL dal MFI delle D2R + cellule HEK293 (Figura 1G). I dati indicati sono rappresentativi di analisi degli anticorpi D2R, ela stessa analisi strategia di gating e dati possono essere utilizzati per la rilevazione di anticorpi NMDAR (dati non mostrati).
Rilevazione degli anticorpi mediante citometria di flusso saggio basato su cellule si basa sulla superficie cellulare espressione dell'antigene di interesse. Come mostrato in Figura 2, + cellule HEK293 NMDAR altamente espressi NMDAR superficie (Figura 2A) e + cellule HEK293 D2R altamente espressi superficie D2R (Figura 2B), mentre le cellule HEK293 CTL espressi nessuno di questi antigeni (Figure 2A e 2B).
I gruppi di pazienti utilizzati in questo lavoro consisteva di una coorte di pazienti con NMDAR encefalite (NMDAR Enc, n = 4, l'encefalite definito dal rilevamento di superficie NMDAR-1 subunità NR1-anticorpo 3), D2R anticorpo-associata encefalite (D2R Enc, n = 6, l'encefalite definito dalla rilevazione di D2R superficie anticorpo 11), e un controllo coorte with altre malattie infiammatorie neurologiche (OND, n = 26), come l'epilessia, ictus e disturbi dello sviluppo o neurodegenerative. I campioni dei pazienti sono stati precedentemente convalidati per NMDAR 5 e D2R 11 IgG positività. I quattro pazienti positivi per gli anticorpi NMDAR avevano una tipica sindrome clinica di NMDAR encefalite come descritto 3 e campioni di siero sono stati dimostrato positivo utilizzando saggi cellulari per gli anticorpi NMDAR come descritto e sono disponibili in uso commerciale 3,4. I sei pazienti positivi per gli anticorpi D2R avevano una tipica sindrome clinica dei gangli basali encefalite come descritto 11, e campioni di siero sono stati dimostrati positivi per gli anticorpi D2R utilizzando D2R knock-out sezioni di cervello, le cellule trasfettate, e neuroni 11.
Per determinare positività anticorpale in pazienti, la soglia, o di taglio, di una positività anticorpale è stata calcolata in ciascun esperimento aggiungendo tre deviazioni standard sopra lasignifica ΔMFI dei controlli OND. I quattro quarti pazienti con NMDAR Enc sono stati confermati positivi per superficie umana NMDAR anticorpi IgG (Figura 3A), mentre i 6/6 pazienti con D2R Enc sono stati positivi per superficie umana IgG D2R anticorpo (Figura 3B). Nessuno dei pazienti positivi erano doppia positivi per gli anticorpi rivolti NMDAR e D2R. Anticorpi NMDAR e D2R non sono stati rilevati in nessuno dei controlli OND analizzati (Figure 3A e 3B). I campioni dei pazienti sono stati considerati positivi se fossero sopra la soglia in almeno due dei tre esperimenti ripetuti.
Figura 1. Individuazione di anticorpi dal flusso high-throughput citometria saggio basato su cellule. Gating strategia e analisi dei dati Liv cellule HEK293 e CTL e transfettanti stabili HEK293 D2R + sono stati gated basato su forward scatter (FSC) e side scatter (SSC) (74,7% e 68,5%, rispettivamente, A, D). GFP cellule positive all'interno HEK293 CTL e HEK293 D2R + cellule (32,8% e 95,4%, rispettivamente; B, E) sono stati ulteriormente gated per escludere GFP untransfected - cellule (67,2% e 4,6%, rispettivamente; B, E). All'interno delle cellule GFP +, l'intensità media di fluorescenza (MFI) associata a AF647-coniugato anti-IgG umane anticorpo secondario (HEK293 CTL = 3.657; HEK293 D2R + = 9128) è stato misurato (C, F). Per campioni umani, la ΔMFI stato calcolato sottraendo il MFI delle cellule HEK293 CTL da quello delle D2R + cellule HEK293 (G). Di seguito riportiamo i dati rappresentativi della rilevazione di anticorpi D2R. ank "> Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
Figura 2. Espressione di NMDAR di superficie e D2R determinato dal flusso di high-throughput citometria saggio basato su cellule. HEK293 NMDAR + (A), HEK293 D2R + (B), e le cellule CTL HEK293 sono state colorate con diluizioni seriali di anticorpo primario, seguiti da anticorpo secondario appropriato. Espressione superficiale di NMDAR e D2R sono stati osservati. Valori MFI correlati con titolo anticorpale in quanto sono aumentate costantemente con concentrazioni crescenti di anticorpo primario. Come previsto, non c'era rilevamento di NMDAR superficie o D2R in cellule HEK293 CTL. È mostrato dati rappresentativi.blank "> Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
Figura 3. Confermato il rilevamento di anticorpi NMDAR di superficie e D2R in una coorte di pazienti. Sieri di NMDAR encefalite (NMDAR Enc, n = 4), D2R anticorpi associata encefalite (D2R Enc, n = 6) dei pazienti, o dei controlli con altre malattie neurologiche (OND , n = 26 o 24) sono state incubate con live HEK293 NMDAR +, HEK293 D2R +, e le cellule HEK293 CTL, seguita da anticorpo secondario AF647-coniugato anti-IgG umane. Anticorpi NMDAR superficie e D2R sono stati rilevati nel siero di 4/4 pazienti NMDAR Enc (A) e 6/6 pazienti D2R Enc (B), rispettivamente, mentre nessuno dei controlli OND (0/26 o 0/24) ha avuto uno anticorpo (A, B). Dottelinee d sulla grafici rappresentano la soglia di positività calcolato sommando tre deviazioni standard al ΔMFI media dei controlli OND. Sono mostrati dot plots rappresentativi su tre esperimenti. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
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Discussion
Questo articolo descrive una nuova applicazione di citometria a flusso saggio basato su cellule in tempo reale per individuare gli anticorpi specifici mirati proteine neuronali superficie cellulare utilizzando un campionatore high-throughput. Utilizzando questa tecnica, si segnala che un sottogruppo di pazienti affetti da malattie autoimmuni del sistema nervoso centrale hanno anticorpi sierici di superficie NMDAR o alla superficie D2R.
Passi essenziali per la rilevazione ottimale degli anticorpi utilizzando questo flusso high-throughput citometria saggio basato su cellule-live includono 1) ottenere un alto rendimento di cellule trasfettate sane, 2) verificare l'espressione di superficie elevata cellulare dell'antigene di interesse, 3) che stabilisce una soglia di anticorpi positività utilizzando una coorte di controlli, 4) e confermando la riproducibilità dei dati.
La coltura di cellule sane è fondamentale per il successo di questa tecnica. Cellule HEK293 sono ben noti per la loro facilità di cultura, alta efficienza di trasfezione, e la loro mancanza di espressione di neuronaleproteine, che è il motivo per cui sono stati comunemente utilizzati in saggi cellulari per individuare anticorpi specifici antigeni neuronali 4,5,8-10. Un tasso di trasfezione ottimale per acquisire una elevata percentuale di cellule GFP + vivi è critico per questo dosaggio per calcolare con precisione MFI. Per questo motivo, la produzione di una linea cellulare stabile policlonale di GFP + HEK293 NMDAR +, HEK293 D2R +, o HEK293 CTL cellule è vantaggiosa in quanto fornisce un elevato livello costante di + cellule GFP, con la comodità di non dover ripetutamente cellule trasfezione prima ogni esperimento. Una rapida visualizzazione delle cellule trasfettate attraverso un microscopio invertito si consiglia di verificare la presenza di cellule sane (+ cellule GFP saranno fluorescenza se lampada a mercurio è disponibile). Se la vitalità non sembra così alta, può essere vantaggioso utilizzare un colorante vitalità, come 7-amino-actinomicina D, prima acquisizione cella al citofluorimetro e aggiungere un passo gating supplementare nelle analysè di escludere le cellule non vitali.
Nelle malattie autoimmuni del sistema nervoso centrale, anticorpi che si legano ai domini extracellulari di antigeni cerebrali si pensa di essere 2,3,7,13,14 patogeni, quindi l'accento è posto sulla rilevazione di anticorpi utilizzando cellule vive e nonpermeabilized. Questo protocollo raggiunge questo scopo utilizzando cellule trasfettate che esprimono antigeni di superficie. Pertanto, la corretta esportazione di questi antigeni sulla superficie deve essere determinato dalla colorazione di cellule trasfettate con diluizioni seriali di un anticorpo primario commerciale contro l'antigene di interesse. Nel valutare il livello di espressione di antigene di superficie sulle cellule nonpermeabilized, è indispensabile utilizzare un anticorpo mira un epitopo extracellulare della proteina. Se un anticorpo specifico non è disponibile, può essere necessario aggiungere un tag su un dominio extracellulare dell'antigene, e successivamente utilizzare un anticorpo commerciale contro il tag per determinare l'espressione di superficie. Abbiamo successousato questo approccio con un D2R emoagglutinina-tag ed escluso immunoreattività di siero del paziente al tag stesso 11. È anche importante sottolineare che l'intera sequenza di cDNA dell'antigene di interesse viene subclonato in un vettore adatto in modo che l'espressione e l'integrità strutturale della membrana cellulare non è compromessa. Infatti, è stato precedentemente dimostrato che particolari domini di una proteina recettore sono essenziali per il corretto ripiegamento, esportazione, e l'integrazione nella membrana cellulare 18.
In citometria a flusso saggi cellulari, valutando l'anticorpo positività del siero del paziente in ogni esperimento si basa sulla creazione di una soglia, o taglio, derivato da una coorte di controlli. Zhou et al. 19 calcolato una soglia di positività anticorpale con l'aggiunta di due deviazioni standard sopra l'intensità di fluorescenza Δmedian media, e questo corrispondeva approssimativamente al 95 ° percentile della gamma di controllo sano. Innostri studi precedenti, abbiamo optato per un taglio maggiore (aggiunta di tre deviazioni standard dalla media Δ MFI della coorte di controllo), che corrispondeva al 99 ° percentile della gamma di controllo sano 11,20. Inoltre, McLaughlin et al. 16 ha scelto di esprimere la misura della reattività anticorpale specifica come rapporto tra MFI tra le cellule esprimenti l'antigene e le cellule antigene-negativi. Un rapporto superiore a 5 è stato considerato positivo e corrispondeva a tre deviazioni standard sopra percentuale media dei controlli, che è simile al nostro lavoro. Utilizzando una soglia più elevata aumenta il rigore del protocollo e migliora la discriminazione tra controlli e pazienti positivi per gli anticorpi. È importante sottolineare che, nella nostra esperienza, la reattività degli anticorpi della gamma di controllo sano non era significativamente differente rispetto alla gamma OND, consentendo l'uso di una popolazione Calculate la soglia di positività anticorpale 11,20.
Come in tutti gli esperimenti di ricerca, la riproducibilità dei dati è fondamentale. I sieri dei pazienti vengono considerati positivi per gli anticorpi contro un antigene neuronale specifica se sono al di sopra della soglia di positività in almeno due dei tre esperimenti indipendenti. I singoli pazienti hanno diverse concentrazioni di IgG nel loro siero. Queste variazioni possono influenzare il livello di legame anticorpale, rispetto ad altri pazienti. Tutti i sieri dei pazienti utilizzato nel nostro precedente studio sono stati misurati mediante nefelometria e trovato ad essere nel range di normalità (6,2-14,4 g / L) 11, e abbiamo sempre diluito sieri con lo stesso fattore di diluizione. Stabilire una curva titolo di siero individuo potrebbe essere utile al fine di confrontare le concentrazioni di anticorpi tra i pazienti. Inoltre, accecamento iniziale del ricercatore è raccomandato durante saggio basato su cellule, ma i controlli devono essere unblinded per calcolare il positSoglia ivity.
Quando viene trovato un bersaglio anticorpo plausibile, la convalida del caso è necessaria per evitare falsa positività. Campioni anticorpo-positivi o negativi rilevati utilizzando la citometria a flusso saggio basato su cellule dovrebbero essere analizzati utilizzando una metodologia alternativa che non avrebbe preferenzialmente utilizzano antigeni denaturato o linearizzate. Ad esempio, diminuzione immunoreattività su sezioni cerebrali da knock-out animali antigene-specifici è stato dimostrato con successo nel caso di più recente riportato CNS autoantigeni 9-11,21. Immunoassorbimento di sieri dei pazienti sulle cellule esprimenti l'antigene inoltre sono stati utilizzati per convalidare i risultati 9,11.
La citofluorimetria protocollo saggio basato su cellule descritta in questo documento può essere facilmente modificato per valutare anticorpo specificità per una moltitudine di differenti bersagli antigenici, compresi quelli che si trovano all'esterno del SNC. E 'probabile che esistano anticorpi di altre specificità sconosciute e sono ancora di essereidentificato. Inoltre, questa tecnica è adatto per rivelare diverse classi e sottoclassi di Ig, incluse IgM, come mostrato in nostri studi precedenti 11,20. La determinazione di IgG sottoclasse può anche rivelare il potenziale di contribuire alla patogenesi della malattia. Ad esempio IgG1 o IgG3 sono in grado di mediare la citotossicità cellulo-mediata anticorpo-dipendente o complemento-dipendente citotossicità, rilevati autoanticorpi indotta meccanismi di patogenicità 14,20,22. Coloranti fluorescenti diversi AF647 (rosso lontano) possono anche essere utilizzati purché hanno picchi di emissione abbastanza lontano da quello della molecola reporter, GFP. Qualsiasi spettri di emissione sovrapposizione deve avere i requisiti di compensazione corretti. Determinare la specificità di un anticorpo ad una proteina intracellulare sarebbe anche possibile citometria a flusso, anche se, le cellule devono prima essere fisso e permeabilizzate per rendere l'antigene disposizione di legame anticorpale. Questa tecnica alternativa può provocare alta background a causa della esposizione di anticorpi ai domini intracellulari, nonché numerosi antigeni cellulari, che sono stati altrimenti nascoste in cellule nonpermeabilized dal vivo. Questi fattori confondenti possono ridurre la resistenza della citometria a flusso saggio basato su cellule e adeguato controllo devono essere eseguite conseguenza.
L'uso di flusso ad alta produttività citometria saggio basato su cellule fornisce un metodo affidabile e preciso per la rivelazione di anticorpi nel siero umano da ampie coorti di pazienti. Alla scoperta di ulteriori anticorpi novelli attraverso questa tecnica aiuterà diagnosi e trattamenti futuri di pazienti con malattie autoimmuni del sistema nervoso centrale.
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Disclosures
Conflitto di interessi: Un brevetto è stato depositato da FB e RCD (Università di Sydney), sostenendo D2R come obiettivo per autoanticorpi.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal Australian Health and Medical Research Council Nazionale, Star Scientific Foundation (Australia), sindrome di Tourette Association (USA), la sclerosi multipla Trish Fondazione per la Ricerca e la sclerosi multipla Research Australia, Petre Foundation (Australia), la Rebecca L. Cooper Medical Research Foundation (Australia). Ringraziamo tutti i pazienti ei familiari che hanno fornito i campioni per il nostro studio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pIRES2-EGFP vector | Clontech | 6029-1 | |
| Human HA-Dopamine-2 receptor (D2R) cDNA | Missouri S&T cDNA Resource Centre | DRD020TN00 | |
| Human subunit 1 of NMDAR (NR1) cDNA | Gift from Prof A. Vincent (Oxford, UK) | ||
| Monoclonal purified mouse anti-human NR1 antibody (clone: 54.1) | BD Pharmingen | 556308 | |
| Mouse purified monoclonal anti-DRD2 IgG (clone: 1B11) | Sigma-Aldrich | WH0001813M1-50UG | |
| Alexa Fluor 647 donkey anti-mouse IgG (H + L) | Invitrogen | A31571 | |
| Alexa Fluor 647 goat anti-human IgG (H + L) | Invitrogen | A21445 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (1x) 4.5 g/L D-glucose, L-Glutamine and 110 mg/L sodium pyruvate | Invitrogen | 11995-065 | |
| Foetal bovine serum | Invitrogen | 10099-141 | |
| Gentamicin | Invitrogen | 15710-072 | |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050-061 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Geneticin | Invitrogen | 10131-035 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x) (-Ca2+/-Mg2+) | Invitrogen | 14190-144 | |
| TrypLE Express (1x) with Phenol Red | Invitrogen | 12605-028 | |
| 0.9% Sodium chloride | Baxter | AHF7975 | |
| Polyethylenimine | Polysciences Inc | 9002-98-6 | |
| Versene | Invitrogen | 15040-066 | |
| XhoI | Roche | 10899194001 | |
| NheI | Roche | 10885843001 | |
| PureLink PCR Purification Kit | Invitrogen | K3100-01 | |
| JetQuick Gel Extraction Spin Kit | Genomed | 420050 | |
| T4 DNA Ligase | Roche | 10481220001 | |
| Plasmid Plus Maxi Kit | Qiagen | 12963 | |
| Name of Equipment/Software | Company | Catalog Number | Model/Version |
| Flow cytometer with high-throughput sampler system | BD Biosciences | BDLSRII with HTS | |
| Inverted microscope | Olympus | CKX41 (with mercury lamp and U-RFLT50 power supply) | |
| Electronic multichannel pipette (15-300 μl) | Eppendorf | 613-2240P | 12-channel Xplorer Plus |
| Excel | Microsoft | 2010 | |
| Prism | GraphPad Software, Inc. | v4 | |
| FlowJo | Treestar | v7.5 | |
| 50 ml polypropylene conical tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| 6-well plate | BD Biosciences | 353046 | |
| Tissue culture flask (T75) | BD Biosciences | 353136 | |
| Parafilm | Pechiney Plastic Packaging | PM-992 | |
| V-bottom 96-well plate | Corning | 651180 | |
References
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