Summary
I løpet av de siste årene, har levende celle-baserte analyser blitt brukt med hell for å påvise antistoffer mot overflaten og conformational antigener. Her beskriver vi en metode med høy gjennomstrømming flowcytometri muliggjør analyse av store årskull av pasienter. Detektering av nye antistoffer vil bedre diagnose og behandling av immunmedierte forstyrrelser.
Abstract
I løpet av de siste årene, har antistoffer mot overflaten og conformational proteiner involvert i nevrotransmisjon blitt oppdaget i autoimmune CNS sykdommer hos barn og voksne. Disse antistoffer er blitt benyttet til å lede diagnose og behandling. Celle-baserte analyser har forbedret påvisning av antistoffer i pasientens serum. De er basert på overflaten ekspresjon av hjerne antigener på eukaryotiske celler, som deretter inkubert med fortynnet pasientsera etterfulgt av fluorokromkonjugerte konjugerte sekundære antistoffer. Etter vasking, blir sekundært antistoff bindende deretter analysert ved strømningscytometri. Vår gruppe har utviklet en høy gjennomstrømning flowcytometri levende cellebaserte analysen til pålitelig oppdage antistoffer mot spesifikke nevrotransmitterreseptorer. Denne flowcytometri metoden er rett frem, kvantitativ, effektiv, og bruk av en high-throughput-sampler system muliggjør store pasientgruppene for å være lett analyseres i løpet av kort tid. I tillegg gir denne cellebasert isi lett kan tilpasses for å detektere antistoffer mot mange forskjellige antigene mål, både fra sentralnervesystemet og periferi. Oppdage flere romanen antistoff biomarkører vil muliggjøre rask og nøyaktig diagnose og bedre behandling av immunmedierte lidelser.
Introduction
Over de siste årene, har autoimmune former for sentralnervesystemet (CNS) sykdommer er identifisert. Det har vist seg at disse sykdommene er assosiert, og er definert ved tilstedeværelsen av autoantistoffer. Disse antistoffene binder til neuronale synaptiske reseptorer eller proteiner som er involvert i nevrotransmisjon 1,2. Forskjellige antigener er blitt detektert, for eksempel N-metyl-D-aspartat (NMDAR) 3-5, γ-aminosmørsyre B reseptor (GABA B) reseptor 6, α-amino-3-hydroksy-5-metyl-4- isoksazolpropionsyre (AMPA) reseptoren 7, spenningsstyrte kaliumkanaler (VGKC) forbundet proteiner: leucin-rik glioma-aktivert protein 1 (LGL-1) og contactin-assosiert protein 2 (capsr2) 8,9, 5,10 glutamatreseptor og dopamin-2-reseptor (D2R) 11. I det siste, disse autoimmune forstyrrelser i sentralnervesystemet (hovedsakelig kalt encefalitt) var ofte udiagnostisert og ubehandlet. Disse nye antistoff biomarkører, f.eksNMDAR antistoff eller D2R antistoff, har gitt en kraftig forbedret diagnose og bevissthet, og har åpnet behandlingstilbud for pasientene. Faktisk er tidlig behandling med immunterapi assosiert med bedre utfall 11,12.
Tradisjonelle metoder for å påvise antistoffer, for eksempel enzym-bundet immunosorbent assay (ELISA) og western blot har blitt brukt for påvisning av antistoffer i sera. Men at de ikke lett å regnskaps av ekstracellulære eller overflate epitoper og, heller, kan avsløre immunoreaktivitets mot en intracellulær epitop. Videre antistoffer som binder til det ekstracellulære domenet av viktige proteiner som er involvert i nevrotransmisjon er sannsynlig å være patogene 2,3,7,13,14. Derfor er utvikling av nøyaktige og følsomme analyser for å finne relevant celleoverflaten eller ekstracellulære antistoff mål i pasienter akutt. Gullet standardmetoden i feltet er basert på bruken av levende celler, i såkalt "celle-based analyser ". Denne metoden involverer ekspresjon av et antigen på overflaten av pattedyrceller (oftest humane embryoniske nyre 293 (HEK293) celler) i sin opprinnelige form ved transfeksjon av vektorer inneholdende den fullstendige cDNA-sekvensen av antigenet av interesse. Aktive nonpermeabilized cellene blir deretter inkubert med fortynnet pasientens serum og fulgt av fluorkrom-konjugerte anti-humant immunoglobulin (Ig) sekundært antistoff. Intensiteten eller nivå av fluorescens blir så detektert og er forbundet til nivået av autoantistoffbinding. Denne teknikken er spesifikk, siden bare ett antigen er overuttrykt i celler. Den mest brukte "read-out" har vært konfokalmikroskopi analyse etter immunocytochemistry 4,5,8-10. Imidlertid strømningscytometri celle-baserte analyser har blitt brukt for å påvise antistoffer i pasienter med demyeliniserende sykdommer 15-17. Spesielt Waters et al. 15. lignet påvisning av antistoff ved hjelp av en panel av antistoff påvisningsteknikker, inkludert celle-baserte analyser, etterfulgt av mikroskopi eller strømningscytometri analyser, og har vist flowcytometri cellebasert assay for å være den mest følsom, nøyaktig og pålitelig måte. Derfor er flowcytometri cellebasert assay fordelaktig da det er kvantitativ, og ikke utprøver avhengig, og innebærer ikke noen bruk av radioaktivt materiale. Det er også fordelaktig da det gjør det mulig for store pasientgruppene som skal undersøkes i løpet av kort tid.
Mer nylig har vi optimalisert en high-throughput flowcytometri cellebasert assay for å påvise antistoff og NMDAR D2R antistoff hos pasienter med autoimmune sykdommer i sentralnervesystemet 11. Vår gruppe nylig oppdaget NMDAR-antistoff i pasientens sera ved hjelp av strømningscytometri cellebasert assay. Disse NMDAR-antistoff-positive sera, er tidligere analysert ved hjelp av konfokal mikroskopi og ble også funnet å være positive 11. Denne protokollen beskriver en flowcytometri cellebasert assay for påvisning av conformation-sensitive CNS antistoff i pasientens serum utnytte en automatisert høy gjennomstrømming sampler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Subkloning Strategi Konstruer pIRES2-EGFP Vector Encoding D2R eller NMDAR
- Oppnå full-lengde cDNA klon av menneskelig D2R eller NMDAR subenhet 1 (NR1).
- Velg en ekspresjonsvektor, slik som pIRES2-EGFP, som er egnet for ekspresjon av transmembranproteiner med en forbedret grønt fluorescerende protein (GFP) reporter under styring av et internt ribosom inngangsside (IRES), slik at både antigener og GFP som skal coexpressed i celler separat.
- Subclone menneskelig cDNA innen pIRES2-EGFP vektor.
- Å subclone cDNA, bruke egnet restriksjonsenzymer (for eksempel NheI og XhoI for human D2R cDNA).
- Ligate kutt cDNA sett innenfor begrenset pIRES2-EGFP vektor.
- Sequence ligatisert pIRES2-EGFP D2R eller NMDAR vektor for å sjekke om vektoren inneholder riktig rekkefølge.
- Rens og forsterke pIRES2-EGFP D2R eller NMDAR vektor for senere bruk i transfeksjon.
- Kultur HEK293-celler i vevskultur-kolber med frisk Dulbeccos Modified Eagle Medium (1x) (DMEM) komplett med 4,5 g / L D-glukose, L-glutamin, og 110 mg / l natrium-pyruvat supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), 2 mM Glutamax, og 50 pg / ml gentamicin.
- Løsne HEK293 celler ved hjelp av trypsin og overføring til en konisk tube.
- Vask cellene ved sentrifugering ved 250 x g i 6 minutter og cellepelleten suspenderes i friskt komplett DMEM.
- Tell cellene og frø 6 brønners plater på omtrent 8 x 10 5 celler / brønn, og kulturen over natten i 2 ml DMEM ved 37 ° C og 5% CO2 i en inkubator.
- Når de har nådd rundt 70% confluency, transfektere de HEK293 celler med pIRES2-EGFP NR1 (HEK293 NMDAR + celler), pIRES2-EGFP D2R (HEK293 D2R + celler), og pIRES2-EGFP (HEK293 CTL celler, vektorkontroll) som følger.Hold noen untransfected HEK293 celler for kompensasjon senere.
- Klargjør det nødvendige volum av transfeksjon blanding bestående av 2,5 ug DNA, 200 mL 0,9% natrium-klorid og 4 ug / ml polyetylenimin / brønn (hver inneholdende 2 ml friskt komplett DMEM).
- Umiddelbart vortex blanding i 10 sekunder og inkuberes ved romtemperatur (RT) i 10 min, før tilsetning volum av transfeksjon blanding til de passende brønner.
- Dekk platen, pakk sidene med Parafilm, og sentrifuger ved 280 xg i 5 min for å hjelpe celle transfeksjon.
- Fjern Parafilm og deretter plassere i inkubatoren til kultur ved 37 ° C.
- Bytt kultur media 18 timer senere med fersk komplett DMEM, og vedlikeholde i kultur for en annen 72 timer.
- Valgfritt: 72 timer post-transfeksjon, kan transfekterte celler bli valgt ved dyrking i fullstendig DMEM supplert med 250 ug / ml Geneticin, for å oppnå et polyklonalt stabil transfectant.
- Ta HEK293 NMDAR +, HEK293 D2R +, og HEK293 CTL-celler ved inkubasjon med 500 ul / brønn Versene i omtrent 5 min ved 37 ° C.
- Suspender i 2ml/well av PBS (-Ca 2 + /-Mg 2 +) supplert med 2% FBS (PBS / FBS) og overføring til en 15 ml eller 50 ml konisk tube.
- Vask cellene ved sentrifugering ved 250 x g i 6 minutter og cellepelleten suspenderes i 15 til 50 ml PBS / FBS. Gjenta vask 2x.
- Tell cellene og resuspender i PBS / FBS i en 6 x 10 celler / ml.
- Design 96-brønnrammen for flowcytometri oppkjøpet, med tanke på at HEK293 D2R + eller HEK293 NMDAR + celler, samt HEK293 CTL celler må inkuberes med hver pasientprøve eller primær antistoff.
- Seed celler i en V-bunn 96-brønns plate ved 50 000 celler / Vill i henhold til flowcytometri anskaffelses mal.
- Pellet cellene ved sentrifugering i 96-brønns plate ved 450 xg i 5 minutter og fjern forsiktig supernatanten ved hjelp av en elektronisk eller manuelt multikanal pipette, vipping av platen om en vinkel, og tar seg ikke å aspirere cellepelleten.
- Inkuber HEK293 D2R +, HEK293 NMDAR +, og HEK293 CTL-celler i 1 time ved RT i mørket med:
- Serielle fortynninger av primært antistoff, for å bedømme antigenet overflate uttrykk.
- Pasientprøver for å påvise antistoff.
- Bruk egnet flowcytometri kompensasjon kontroller, f.eks. ufargede untransfected HEK293 celler, GFP + HEK293 celler (AF647 -), og untransfected AF647 + HEK293 celler (GFP).
- Vask cellene ved sentrifugering ved 450 xg i 5 minutter og cellepelleten suspenderes i 170 pl PBS / FBS. Gjenta vasketrinn to ganger til.
- Inkuber cellene i 1 timer ved romtemperatur i mørke med 1:100 fortynning av AF647-konjugert sekundært antistoff (anti-human IgG for pasientserum og anti-mus IgG anti-NR1-eller anti-D2R primære antistoffer).
- Vask cellene tre ganger, som i trinn 3.7, og resuspender i 35 mL PBS / FBS for flowcytometri celle oppkjøpet.
- Sett opp high-throughput sampler (HTS) på flowcytometer (BDLSRII).
- Erverve 10 000 hendelser / godt i henhold til flowcytometri oppkjøpet mal.
- Eksport og deretter analysere data for analyse med flowcytometri programvarepakke, som FlowJo v7.5:
- Først gate live HEK293 celler basert på forward (størrelse) og side (finjustering) sprer.
- Videre gate levende HEK293 celler basert på høy GFP-positivitet å analysere bare de transfekterte cellene.
- Bestem gjennomsnittlig fluorescensintensitet (MFI) av AF647 kanal innenfor de levende GFP-positive celler.
- Eksportere data til Excel eller Prism for analyse:
- Tomte concentrations av primære antistoff (anti-NMDAR-eller anti-D2R antistoff) mot MFI erholdt fra cellene inkubert med disse antistoffer.
- For hver pasient og kontrollprøven, bestemme ΔMFI ved å subtrahere MFI av HEK293 CTL-celler fra MFI i HEK293 D2R + eller HEK293 NMDAR +-celler, respektivt.
- Beregn terskelen av antistoff positivitet ved å legge tre standardavvik over gjennomsnittet ΔMFI av med kontrollgruppen.
- Plot individuelle prøver gruppert etter deres serum typen på en graf og representerer terskelen som en linje.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lev HEK293 D2R + og HEK293 CTL celler ble kjøpt på flowcytometer bruke en høy gjennomstrømming sampler. Under analyse ble cellene gated basert på forward scatter (størrelse) og side scatter (finjustering) parametre (Tall 1A og 1D). Transfekterte HEK293 celler uttrykt reporteren molekyl, GFP, i cytoplasma, og untransfected celler ble ekskludert fra analysen (figur 1B og 1E). Innenfor GFP + porten, ble MFI-forbundet med AF647-konjugert anti-human IgG sekundært antistoff binding måles (figurene 1C og 1F). For å eliminere bakgrunnsfluorescens ved analyse av humant sera ble ΔMFI beregnet ved å trekke MFI av HEK293 CTL-celler fra MFI av HEK293 D2R + celler (fig. 1G). Dataene som vises er representative for D2R antistoff analyse, ogsamme gating strategi og dataanalyse kan anvendes for NMDAR antistoffdeteksjon (data ikke vist).
Antistoff detektering ved strømningscytometri cellebaserte analysen er basert på celleoverflate-ekspresjon av antigenet av interesse. Som vist i figur 2, HEK293 NMDAR + celler sterkt uttrykt overflate NMDAR (figur 2A) og HEK293 D2R + celler sterkt uttrykt overflate D2R (figur 2B), mens CTL HEK293-celler uttrykte ingen av disse antigenene (figurene 2A og 2B).
De pasientgrupper som brukes i dette arbeidet besto av en pasient kohort med NMDAR encefalitt (NMDAR Enc, n = 4, en encefalitt definert ved påvisning av overflate NMDAR-subenhet en NR1-antistoff 3), D2R antistoffassosiert encefalitt (D2R Enc, n = 6, en encefalitt definert ved påvisning av overflate D2R antistoff 11), og et kontroll kohort with andre noninflammatory nevrologiske sykdommer (OND, n = 26), som for eksempel epilepsi, hjerneslag, og utviklings-eller nevrodegenerative lidelser. Pasientprøver har tidligere blitt validert for NMDAR 5 og D2R 11 IgG positivitet. De fire pasienter som var positive for NMDAR antistoffer hadde en typisk klinisk syndrom på NMDAR encefalitt som beskrevet 3, og serumprøver ble påvist ved hjelp av positive celle-baserte analyser for NMDAR-antistoffer som beskrevet og tilgjengelig i kommersiell bruk 3,4. De seks pasienter positive for D2R antistoffer hadde en typisk klinisk syndrom av basalgangliene encefalitt som beskrevet 11, og serumprøver ble påvist positiv for D2R antistoffer ved hjelp D2R knock-out hjerne seksjoner, transfekterte celler og nevroner 11.
For å bestemme antistoff positivitet hos pasienter, ble terskelen, eller cutoff, av antistoff positivitet beregnes i hvert eksperiment ved å legge tre standardavvik overmener ΔMFI av OND kontroller. De 4/4 pasienter med NMDAR ENC ble bekreftet positiv for menneskelig overflaten NMDAR IgG antistoff (figur 3A), mens 6/6 pasienter med D2R ENC var positive for menneskelig overflaten D2R IgG antistoff (Figur 3B). Ingen av de positive pasienter var dobbelt positiv for antistoffer rettet NMDAR og D2R. NMDAR og D2R antistoffer ble ikke påvist i noen av de OND kontroller ble analysert (figurene 3A og 3B). Pasientprøver ble betraktet som positive hvis de var over terskelverdien i minst to av tre gjentatte forsøk.
Figur 1. Påvisning av antistoffet ved high-throughput flowcytometri cellebasert assay:. Gating strategi og dataanalyse Liv e HEK293 CTL celler og HEK293 D2R + stabile transfektanter ble gated basert på forward scatter (FSC) og side scatter (SSC) (74,7% og 68,5%, henholdsvis, A, D). GFP positive celler i HEK293 CTL og HEK293 D2R +-celler (32,8% og 95,4%, henholdsvis B, E) ble ytterligere avgrenset for å utelukke untransfected GFP - celler (67.2% og 4,6%, henholdsvis, B, E). Innenfor de GFP + celler, var gjennomsnittlig fluorescensintensitet (MFI) forbundet med AF647-konjugert anti-human IgG sekundært antistoff (HEK293 CTL = 3,657; HEK293 D2R + = 9128) ble målt (C, F). For humane prøver ble ΔMFI beregnet ved å trekke MFI av HEK293 CTL-celler fra den i HEK293 D2R +-celler (G). Representative data for D2R antistoffpåvisning vises. ank "> Klikk her for å se større bilde.
Figur 2. Ekspresjon av overflate NMDAR og D2R bestemt ved high-throughput flowcytometri cellebasert assay. Ble HEK293 NMDAR + (A), HEK293 D2R + (B), og HEK293 CTL-celler farget med serielle fortynninger av primært antistoff, etterfulgt av passende sekundært antistoff. Høy overflate uttrykk for NMDAR og D2R ble observert. MFI verdier korrelert med antistofftiter som de økte jevnt med økende konsentrasjoner av primær antistoff. Som forventet, var det ingen påvisning av overflate NMDAR eller D2R i HEK293 CTL-celler. Representative data er vist.blank "> Klikk her for å se større bilde.
Figur 3. Bekreftet deteksjon av overflate NMDAR og D2R antistoffer i en kohort av pasientene. Sera fra NMDAR encefalitt (NMDAR Enc, n = 4), D2R antistoffassosiert encefalitt (D2R Enc, n = 6) pasienter, eller kontroller med andre neurologiske sykdommer (OND , n = 26 eller 24) ble inkubert med levende HEK293 NMDAR +, HEK293 D2R +, og HEK293 CTL-celler, etterfulgt av AF647-konjugert anti-human IgG sekundært antistoff. Overflate NMDAR og D2R antistoffer ble detektert i serumet til 4/4 NMDAR ENC pasienter (A) og 6/6 D2R ENC pasienter (B), henholdsvis, mens ingen av de OND kontroller (0/26 eller 0/24) hadde enten antistoff (A, B). Dotted linjer på grafene representerer positivitet terskelen beregnes ved å legge tre standardavvik til gjennomsnittet ΔMFI av OND kontroller. Representative prikkplotter av tre forsøk er vist. Klikk her for å se større bilde .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette notatet beskriver en roman anvendelse av flowcytometri levende cellebasert analyse for å påvise antistoffer rettet mot bestemte celleoverflaten nevrale proteiner ved hjelp av en høy gjennomstrømming sampler. Ved hjelp av denne teknikken, rapporterer vi at en undergruppe av pasienter som lider av autoimmune CNS sykdommer har antistoffer til overflaten NMDAR eller til overflaten D2R.
Viktige trinn for optimal antistoffpåvisning ved hjelp av denne high-throughput flowcytometri levende cellebasert assay inkluderer 1) å oppnå et høyt utbytte av sunne transfekterte celler, 2) verifisering av høy celleoverflate-ekspresjon av antigenet av interesse, 3) å etablere en terskelantistoff positivitet ved hjelp av en kohort av kontrollene, 4), og bekrefter reproduserbarheten av dataene.
Kulturen i friske celler er grunnleggende for å lykkes med denne teknikken. HEK293 celler er godt kjent for sin enkle kultur, høy transfeksjon effektivitet, og deres mangel på uttrykk for nevronaleproteiner, noe som er grunnen til at de er vanlig brukt i celle-baserte analyser for å påvise antistoff mot spesifikke nevronale antigener 4,5,8-10. En optimal transfeksjon sats å få en høy prosentandel av levende GFP + celler er avgjørende for denne analysen til å beregne nøyaktig MFI. Av denne grunn, produsere en polyklonal stabil cellelinje av GFP + HEK293 NMDAR +, HEK293 D2R +, eller HEK293 CTL celler er en fordel da det gir et konsistent høyt nivå av GFP + celler, med den ekstra bekvemmeligheten av ikke å måtte gjentatte ganger transfektere celler før hvert forsøk. En rask visning av de transfekterte cellene gjennom en invertert mikroskop anbefales å sjekke for friske celler (GFP + celler vil fluorescere om kvikksølvlampe er tilgjengelig). Hvis levedyktigheten synes ikke er så høy, kan det være fordelaktig å bruke en levedyktighet fargestoff, slik som 7-amino-actinomycin D, før cellen anskaffelse ved strømningscytometer og for å legge til en ekstra gating trinn i analyser å ekskludere ikke-levedyktige celler.
I autoimmune sykdommer i sentralnervesystemet, har antistoffer som binder til ekstracellulære domener av hjerne antigener antas å være patogene 2,3,7,13,14, derfor legges vekt på påvisningen av antistoffer ved hjelp av spenningsførende og nonpermeabilized celler. Denne protokollen oppnår dette målet ved hjelp av transfekterte celler uttrykker overflateantigener. Derfor må den riktige eksport av disse antigener til overflaten for å bli bestemt ved farging av transfekterte celler med seriefortynninger av en kommersiell primære antistoff mot antigenet av interesse. Ved vurdering av nivået av ekspresjon av overflate-antigen på nonpermeabilized celler, er det viktig å bruke et antistoff rettet mot en ekstracellulær epitope av proteinet. Hvis en spesifikt antistoff ikke er tilgjengelig, kan det være nødvendig å legge til en kode på et ekstracellulært domene av antigenet, og deretter bruke en kommersiell antistoff mot merkelappen for å bestemme overflate uttrykk. Vi har lykkesbrukt denne tilnærmingen ved hjelp av en hemagglutinin-merket D2R og utelukkes immunoreaktivitet av pasientsera til koden selv 11. Det er også viktig at hele cDNA-sekvensen av antigenet av interesse blir subklonet i en egnet vektor, slik at uttrykk og strukturell integritet i cellemembranen ikke blir redusert. Faktisk har det tidligere blitt vist at visse domener av et reseptorprotein er avgjørende for korrekt folding, eksport, og integrering inn i cellemembranen 18..
I flowcytometri celle-baserte analyser, vurdere antistoff positivitet av pasientsera i hvert forsøk er avhengig av etablering av en terskel, eller cutoff, avledet fra en kohort av kontrollene. Zhou et al. 19 beregnet en terskel på antistoff positivitet ved å legge to standardavvik over gjennomsnittet Δmedian fluorescens intensitet, og dette omtrent tilsvarte 95 persentilen av den friske kontrollgruppen rekkevidde. Ivåre tidligere studier, valgte vi en høyere cutoff (tillegg av tre standardavvik til gjennomsnittet Δ MFI i kontrollgruppen), noe som tilsvarte 99 persentilen av den friske kontrollgruppen utvalg 11,20. Videre McLaughlin et al. 16. valgt å uttrykke måling av spesifikk antistoffreaksjon som forholdet MFI mellom antigen-uttrykkende celler og antigen-negative celler. Et forhold som er større enn 5 ble ansett positiv og tilsvarte tre standard avvik over gjennomsnittsforholdet av kontrollene, som er lik arbeidet. Ved hjelp av en høyere terskel øker stringens av protokollen, og forbedrer diskriminering mellom kontroller og pasienter positive for antistoffer. Viktigere, i vår erfaring, antistoffreaksjon av det sunne reguleringsområdet var ikke vesentlig annerledes enn den OND rekkevidde, slik at bruk av enten befolkningen til å beregnese terskelen av antistoff positivitet 11,20.
Som i alle forskningseksperimenter, er data reproduserbarhet viktig. Pasientsera regnes som positive for antistoff mot et spesifikt antigen neuronal hvis de er over terskelverdien for positivitet i minst to av tre uavhengige eksperimenter. Individuelle pasienter har varierende konsentrasjoner av IgG i deres serum. Disse variasjoner kan ha en innflytelse på nivået av antistoff-binding i forhold til andre pasienter. Alle pasientsera brukt i vår tidligere studie ble målt ved nefelometri, og funnet å være innenfor det normale området (6,2 til 14,4 g / L) 11 og vi alltid fortynnet sera med samme fortynningsfaktor. Kan være gunstig for å sammenligne konsentrasjoner av antistoffer mellom pasienter etablere en titer kurve av individuelle serum. I tillegg er utgangs blinding av undersøkeren anbefalt i cellebaserte analysen, men løsningene må være avblindet for å beregne positivity terskel.
Når en plausibel antistoff målet er funnet, er hensiktsmessig validering nødvendig for å hindre falsk positivitet. Antistoff-positive eller-negative prøver detektert ved hjelp av strømningscytometri cellebaserte analysen skal analyseres ved hjelp av en alternativ metode som ville fortrinnsvis ikke benytte denaturert eller lineariserte antigener. For eksempel, nedsatt immunreaktivitet i hjernesnitt fra antigenspesifikke knock-out dyr har blitt vist i tilfellet med flere nylig rapportert CNS autoantigener 9-11,21. Immunoabsorption av pasientsera på antigen-uttrykke celler har også blitt brukt til å validere resultatene 9,11.
Den flowcytometri cellebasert assay-forskrift som er beskrevet i dette dokumentet, kan lett endres for å evaluere antistoff-spesifisitet til et mangfold av forskjellige antigene mål, inkludert de som finnes utenfor CNS. Det er sannsynlig at antistoffer av andre ukjente særegen eksisterer og er ennå å væreidentifisert. Videre er denne teknikken er egnet for detektering av forskjellige klasser og underklasser av Ig, inkludert IgM, som vist i våre tidligere studier 11,20. Fastsettelsen av IgG subklasse kan også avsløre potensial for å bidra til sykdom patogenesen. For eksempel IgG1 eller IgG3 er i stand til å formidle antistoffavhengig cellemediert cytotoksisitet eller komplementavhengig cytotoksisitet, som rapporteres autoantistoff-indusert patogenitet mekanismer 14,20,22. Andre enn AF647 (helt til rødt) Fluorescerende fargestoffer kan også anvendes så lenge som de har emisjonstoppene langt nok fra den i reporter molekyl, GFP. Noen overlappende utslipp spektra må ha de riktige erstatningskrav. Å bestemme spesifisiteten til et antistoff til et intracellulært protein ville også være mulig ved hjelp av flyt-cytometri, selv om cellene først må være fast og permeabilized å lage antigenet er tilgjengelig for antistoffbinding. Denne alternative teknikk som kan resultere i høy background på grunn av eksponering av antistoffer mot intracellulære domener samt en rekke cellulære antigener, som ellers var gjemt i levende nonpermeabilized celler. Disse kompliserende faktorer kan redusere styrken av flowcytometri cellebaserte analysen og passende kontroller må utføres tilsvarende.
Bruken av high-throughput flowcytometri cellebaserte analysen gir en pålitelig og nøyaktig fremgangsmåte for påvisning av antistoffer i humant serum fra store kullene av pasienter. Oppdage flere nye antistoffer gjennom denne teknikken vil hjelpe diagnose og fremtidig behandling av pasienter med autoimmune CNS sykdommer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Interessekonflikt: Et patent er inngitt av FB og RCD (University of Sydney) hevder D2R som mål for autoantistoffer.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av den australske National Health and Medical Research Council, Star Scientific Foundation (Australia), Tourettes syndrom Association (USA), The Trish Multippel sklerose Research Foundation og Multippel Sklerose Forskning Australia, Petre Foundation (Australia), Rebecca L. Cooper Medical Research Foundation (Australia). Vi takker alle pasienter og familiemedlemmer som følger prøver for vår studie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pIRES2-EGFP vector | Clontech | 6029-1 | |
| Human HA-Dopamine-2 receptor (D2R) cDNA | Missouri S&T cDNA Resource Centre | DRD020TN00 | |
| Human subunit 1 of NMDAR (NR1) cDNA | Gift from Prof A. Vincent (Oxford, UK) | ||
| Monoclonal purified mouse anti-human NR1 antibody (clone: 54.1) | BD Pharmingen | 556308 | |
| Mouse purified monoclonal anti-DRD2 IgG (clone: 1B11) | Sigma-Aldrich | WH0001813M1-50UG | |
| Alexa Fluor 647 donkey anti-mouse IgG (H + L) | Invitrogen | A31571 | |
| Alexa Fluor 647 goat anti-human IgG (H + L) | Invitrogen | A21445 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (1x) 4.5 g/L D-glucose, L-Glutamine and 110 mg/L sodium pyruvate | Invitrogen | 11995-065 | |
| Foetal bovine serum | Invitrogen | 10099-141 | |
| Gentamicin | Invitrogen | 15710-072 | |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050-061 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Geneticin | Invitrogen | 10131-035 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x) (-Ca2+/-Mg2+) | Invitrogen | 14190-144 | |
| TrypLE Express (1x) with Phenol Red | Invitrogen | 12605-028 | |
| 0.9% Sodium chloride | Baxter | AHF7975 | |
| Polyethylenimine | Polysciences Inc | 9002-98-6 | |
| Versene | Invitrogen | 15040-066 | |
| XhoI | Roche | 10899194001 | |
| NheI | Roche | 10885843001 | |
| PureLink PCR Purification Kit | Invitrogen | K3100-01 | |
| JetQuick Gel Extraction Spin Kit | Genomed | 420050 | |
| T4 DNA Ligase | Roche | 10481220001 | |
| Plasmid Plus Maxi Kit | Qiagen | 12963 | |
| Name of Equipment/Software | Company | Catalog Number | Model/Version |
| Flow cytometer with high-throughput sampler system | BD Biosciences | BDLSRII with HTS | |
| Inverted microscope | Olympus | CKX41 (with mercury lamp and U-RFLT50 power supply) | |
| Electronic multichannel pipette (15-300 μl) | Eppendorf | 613-2240P | 12-channel Xplorer Plus |
| Excel | Microsoft | 2010 | |
| Prism | GraphPad Software, Inc. | v4 | |
| FlowJo | Treestar | v7.5 | |
| 50 ml polypropylene conical tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| 6-well plate | BD Biosciences | 353046 | |
| Tissue culture flask (T75) | BD Biosciences | 353136 | |
| Parafilm | Pechiney Plastic Packaging | PM-992 | |
| V-bottom 96-well plate | Corning | 651180 | |
References
- Lancaster, E., Martinez-Hernandez, E., Dalmau, J. Encephalitis and antibodies to synaptic and neuronal cell surface proteins. Neurol. 77, 179-189 (2011).
- Vincent, A., Bien, C. G., Irani, S. R., Waters, P. Autoantibodies associated with diseases of the CNS: new developments and future challenges. Lancet Neurol. 10, 759-772 (2011).
- Dalmau, J., et al. Anti-NMDA-receptor encephalitis: case series and analysis of the effects of antibodies. Lancet Neurol. 7, 1091-1098 (2008).
- Dalmau, J., et al. Paraneoplastic anti-N-methyl-D-aspartate receptor encephalitis associated with ovarian teratoma. Ann Neurol. 61, 25-36 (2007).
- Dale, R. C., et al. N-methyl-D-aspartate receptor antibodies in pediatric dyskinetic encephalitis lethargica. Ann Neurol. 66, 704-709 (2009).
- Lancaster, E., et al. Antibodies to the GABA(B) receptor in limbic encephalitis with seizures: Case series and characterisation of the antigen. Lancet Neurol. 9, 67-76 (2010).
- Lai, M., et al. AMPA receptor antibodies in limbic encephalitis alter synaptic receptor location. Ann Neurol. 65, 424-434 (2009).
- Irani, S. R., et al. Antibodies to Kv1 potassium channel-complex proteins leucine-rich, glioma inactivated 1 protein and contactin-associated protein-2 in limbic encephalitis, Morvan’s syndrome and acquired neuromyotonia. Brain. 133, 2734-2748 (2010).
- Lai, M., et al. Investigation of LGI1 as the antigen in limbic encephalitis previously attributed to potassium channels: a case series. Lancet Neurol. 9, 776-785 (2010).
- Lancaster, E., et al. Antibodies to metabotropic glutamate receptor 5 in the Ophelia syndrome. Neurol. 77, 1698-1701 (2011).
- Dale, R. C., et al. Antibodies to surface dopamine-2 receptor in autoimmune movement and psychiatric disorders. Brain. , (2012).
- Titulaer, M. J., et al. Treatment and prognostic factors for long-term outcome in patients with anti-NMDA receptor encephalitis: an observational cohort study. Lancet Neurol. 12, 157-165 (2013).
- Hughes, E. G., et al. Cellular and synaptic mechanisms of anti-NMDA receptor encephalitis. J Neurosci. 30, 5866-5875 (2010).
- Bien, C. G., et al. Immunopathology of autoantibody-associated encephalitides: clues for pathogenesis. Brain. 135, 1622-1638 (2012).
- Waters, P. J., et al. Serologic diagnosis of NMO: a multicenter comparison of aquaporin-4-IgG assays. Neurol. 78, 665-671 (2012).
- McLaughlin, K. A., et al. Age-Dependent B Cell Autoimmunity to a Myelin Surface Antigen in Pediatric Multiple Sclerosis. J Immunol. 183, 4067-4076 (2009).
- Probstel, A. K., et al. Antibodies to MOG are transient in childhood acute disseminated encephalomyelitis. Neurol. 77, 580-588 (2011).
- Cho, D., et al. N-terminal Region of Dopamine D2 Receptor, a Rhodopsin Family GPCR, Regulates Proper Integration into Plasma Membrane and Endocytic Routes. British journal of pharmacology. , (2011).
- Zhou, D., et al. Identification of a pathogenic antibody response to native myelin oligodendrocyte glycoprotein in multiple sclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 19057-19062 (2006).
- Brilot, F., et al. Antibodies to native myelin oligodendrocyte glycoprotein in children with inflammatory demyelinating central nervous system disease. Ann Neurol. 66, 833-842 (2009).
- Boronat, A., et al. Encephalitis and Antibodies to Dipeptidyl-Peptidase-Like Protein-6, a Subunit of Kv4.2. Potassium Channels. Ann Neurol. 73, 120-128 (2013).
- Hinson, S. R., et al. Aquaporin-4-binding autoantibodies in patients with neuromyelitis optica impair glutamate transport by down-regulating EAAT2. J. Exp. Med. 205, 2473-2481 (2008).
