Summary
Ao longo dos últimos anos, os ensaios baseados em células vivas têm sido utilizados com sucesso para detectar anticorpos contra antigénios de superfície e de conformação. Aqui, descrevemos um método que utiliza o fluxo de alto rendimento citometria permitindo a análise de grandes grupos de pacientes. Detecção de novos anticorpos irá melhorar o diagnóstico e tratamento de distúrbios mediados pela imunes.
Abstract
Ao longo dos últimos anos, os anticorpos contra a superfície de conformação e proteínas envolvidas na neurotransmissão foram detectados em doenças auto-imunes do sistema nervoso central em crianças e adultos. Estes anticorpos têm sido usados para ajudar no diagnóstico e tratamento. Os ensaios baseados em células têm melhorado a detecção de anticorpos no soro do paciente. Eles baseiam-se na expressão de antigénios de superfície do cérebro em células eucarióticas, que são, em seguida, incubadas com soro de paciente diluído seguido de anticorpos secundários conjugados com fluorocromo. Após a lavagem, o anticorpo secundário de ligação é então analisada por citometria de fluxo. O nosso grupo desenvolveu um fluxo de alto rendimento citometria de ensaio baseado em células vivas para detectar com fiabilidade os anticorpos contra receptores de neurotransmissores específicos. Este método de citometria de fluxo é para a frente, quantitativa, eficiente, e a utilização de um sistema de amostragem de alto rendimento permite grandes grupos de pacientes para ser facilmente testada num curto espaço de tempo. Além disso, esta célula baseada em quantodizer pode ser facilmente adaptado para a detecção de anticorpos para vários alvos antigénicos diferentes, tanto do sistema nervoso central e na periferia. Descobrindo biomarcadores romance anticorpos adicionais permitirá o diagnóstico rápido e preciso e melhorar o tratamento de doenças imunomediadas.
Introduction
Nos últimos anos, as formas auto-imunes do sistema nervoso central, doenças (CNS) tem sido identificado. Tem sido demonstrado que estas doenças estão associadas e definida pela presença de auto-anticorpos. Estes anticorpos ligam-se a receptores neuronais ou proteínas sinápticas envolvidas na neurotransmissão 1,2. Antigénios diferentes foram detectados, tal como o receptor de N-metil-D-aspartato (NMDAR) 3-5, receptor γ-aminobutírico, o B (GABA B) do receptor 6, α-amino-3-hidroxi-5-metil-4- ácido isoxazolopropiónico (AMPA) receptor 7, canal de potássio voltagem-dependentes (CPVD) proteínas associadas: leucina-rico uma proteína ativada por glioma (LGL-1) e associada à contactina proteína 2 (capsr2) receptor 8,9, glutamato 5,10 , e a dopamina-2 receptor (D2R) 11. No passado, estas desordens auto-imunes do sistema nervoso central (principalmente chamados encefalite) eram frequentemente não diagnosticada e não tratada. Estes biomarcadores de anticorpos novela, por exemplo,Anticorpo NMDAR ou anticorpo D2R, melhoraram substancialmente o diagnóstico e consciência, e abriram as opções de tratamento para os pacientes. Na verdade, o tratamento precoce com immunotherapies se associa à melhora resultado 11,12.
Os métodos tradicionais para a detecção de anticorpos, tais como o ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA) e Western blot foram utilizados para a detecção de anticorpos no soro. No entanto, eles não são facilmente permitir o reconhecimento de epitopos extracelulares ou de superfície e, em vez disso, pode revelar imunorreactividade contra o epitopo intracelular. Além disso, os anticorpos que se ligam ao domínio extracelular de proteínas importantes envolvidas na neurotransmissão são susceptíveis de ser 2,3,7,13,14 patogénico. Portanto, o desenvolvimento de ensaios precisos e sensíveis para descobrir superfície celular relevante ou alvos de anticorpos extracelulares em pacientes é fundamental. O método padrão de ouro no domínio baseia-se na utilização de células vivas, em chamada "célula-baensaios sed ". Este método envolve a expressão de um antigénio na superfície de células de mamíferos (mais frequentemente nos rins (293) células embrionárias humanas HEK293) na sua forma nativa por transfecção de vectores contendo a sequência de cDNA completa do antigénio de interesse. Nonpermeabilized células vivas são então incubadas com o soro diluído do paciente e seguido por fluorocromo-conjugados com anti-imunoglobulina humana (Ig), o anticorpo secundário. A intensidade ou o nível de fluorescência é detectada e é associado ao nível de ligação de auto-anticorpos. Esta técnica é específica, uma vez que apenas um antígeno é sobre-expresso em células. O mais usado "read-out" tem sido a análise de microscopia confocal após imunocitoquímica 4,5,8-10. No entanto, a citometria de fluxo ensaios baseados em células têm sido usados com sucesso para detectar anticorpos em pacientes com doenças desmielinizantes 15-17. Em particular, 15 Waters et al. Comparado a detecção do anticorpo usando uma panelael das técnicas de detecção de anticorpos, incluindo ensaios com células seguidas por microscopia ou citometria de fluxo analisa e mostrou citometria de fluxo ensaio baseado em célula a ser o método mais sensível, preciso e confiável. Portanto, citometria de fluxo ensaio baseado em células é vantajoso, pois é quantitativa, não dependente de investigador, e não envolve qualquer uso de material radioativo. Também é conveniente, uma vez que permite que grandes grupos de pacientes a serem ensaiadas em um curto espaço de tempo.
Mais recentemente, temos um fluxo otimizado de alto rendimento citometria de ensaio baseado em células para detectar anticorpos NMDAR e D2R anticorpo em pacientes com doenças auto-imunes do SNC 11. O nosso grupo detectados recentemente nos soros de anticorpos NMDAR paciente utilizando citometria de fluxo de ensaio de base celular. Estes soros de anticorpos positivos NMDAR foram previamente analisados por meio de microscopia confocal e também foram encontrados para ser positivo 11. Este protocolo descreve uma citometria de fluxo de ensaio à base de células para a detecção de canticorpo CNS onformation sensível no soro do paciente, utilizando um amostrador automático de alto rendimento.
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Protocol
1. Subclonagem Estratégia Construir pIRES2-EGFP Vector Codificação D2R ou NMDAR
- Obter full-length cDNA clone de D2R humano ou NMDAR subunidade 1 (NR1).
- Escolher um vector de expressão, tal como pIRES2-EGFP, o que é adequado para a expressão de proteínas de transmembrana com uma proteína verde fluorescente melhorada (GFP) repórter sob o controlo de um local de entrada de ribossoma interno (IRES), permitindo que ambos os antigénios e GFP para ser co-expressas em células separadamente.
- Subclone cDNA humano dentro pIRES2-EGFP vetor.
- Para subclonar cDNA, utilizar enzimas de restrição adequadas (por exemplo NheI e XhoI para humano D2R cDNA).
- CDNA corte ligadura inserir dentro restrito vetor pIRES2-EGFP.
- Seqüência ligado pIRES2-EGFP D2R ou NMDAR vetor para verificar se o vetor contém a seqüência correta.
- Purificar e amplificar pIRES2-EGFP D2R ou NMDAR vetor para uso posterior na transfecção.
- Células de cultura HEK293 em tecidos frascos de cultura com Meio Eagle Modificado fresco por Dulbecco (1x) (DMEM) completo com 4,5 g / L de D-glucose, L-glutamina e 110 mg / piruvato de sódio L suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), GlutaMAX 2 mM, e 50 ug / ml de gentamicina.
- Retire células HEK293 usando tripsina e transferir para um tubo cônico.
- Lave as células por centrifugação a 250 xg durante 6 minutos e ressuspender o sedimento de células em meio DMEM completo fresco.
- Contar as células e as sementes em placas de 6 poços a cerca de 8 x 10 5 células / poço e cultura durante a noite em DMEM 2 ml a 37 ° C e 5% de CO 2 num incubador.
- Uma vez que eles tenham atingido cerca de 70% de confluência, transfecção as células HEK293 com pIRES2-EGFP NR1 (células HEK293 NMDAR +), pIRES2-EGFP D2R (células HEK293 D2R +) e (células HEK293 CTL, controle vetorial) pIRES2-EGFP como segue.Mantenha algumas células HEK293 untransfected de indemnização mais tarde.
- Prepare o volume requerido da mistura de transfecção compreende de 2,5 ug de ADN, 200 ul de cloreto de sódio a 0,9% e 4 ug / ml de polietilenimina / poço (contendo cada um 2 ml de DMEM completo fresco).
- Vortex imediatamente a mistura para 10 seg e incubar à temperatura ambiente (RT) durante 10 minutos, antes da adição do volume da mistura de transfecção para os poços apropriados.
- Cubra o prato, embrulhe os lados com Parafilm e centrifugar a 280 xg por 5 min para ajudar transfecção celular.
- Remover o Parafilm e depois colocar na incubadora a cultura a 37 ° C.
- Substitua os meios de cultura de 18 horas depois, com DMEM completo fresco e manter em cultura por outra 72 horas.
- Opcional: 72 horas pós-transfecção, as células transfectadas podem ser seleccionadas por cultura em meio DMEM completo suplementado com 250 ug / ml de geneticina, de modo a obter um policlonal transfectante estável.
- Separar HEK293 NMDAR +, HEK293 D2R +, e células HEK293 CTL por incubação com 500 ul / poço Versene durante aproximadamente 5 min a 37 ° C.
- Ressuspender em 2ml/well de PBS (-Ca 2 + /-Mg 2 +) suplementado com 2% de FBS (PBS / FBS) e transferência para a 15 ml ou 50 ml de tubo cónica.
- Lavar as células por centrifugação a 250 xg durante 6 minutos e ressuspender o sedimento de células em 15-50 ml de PBS / FBS. Repita lavagem 2x.
- Contar as células e em seguida ressuspender em PBS / FBS a 1 x 10 6 células / ml.
- Conceber o molde de 96 cavidades para a aquisição de citometria de fluxo, uma vez que as células HEK293 D2R + ou HEK293 NMDAR +, bem como células HEK293 CTL terá de ser incubada com cada amostra de doente ou anticorpo primário.
- Células de sementes em uma placa de 96 poços de fundo em V a 50.000 células / nósll acordo com a citometria de fluxo modelo de aquisição.
- Agregar as células por centrifugação a placa de 96 poços a 450 g durante 5 min e suavemente remover o sobrenadante utilizando uma pipeta multi-canal electrónico ou manual, inclinando a placa sobre um ângulo e tendo cuidado para não aspirar o sedimento celular.
- Incubar HEK293 D2R +, HEK293 NMDAR +, e células HEK293 CTL durante 1 h à TA no escuro, com:
- Diluições em série de anticorpo primário, a fim de avaliar a expressão do antigénio de superfície.
- As amostras dos pacientes, a fim de detectar anticorpos.
- Use fluxo apropriado citometria controles de compensação, por exemplo. células HEK293 não transf ectadas não coradas, GFP + células HEK293 (AF647 -), e AF647 + células HEK293 não transf ectadas (GFP).
- Lavar as células por centrifugação a 450 xg durante 5 min e ressuspender o sedimento de células em 170 ul de PBS / FBS. Repita o passo de lavagem mais duas vezes.
- Incubar as células durante 1 hr à TA no escuro, com uma diluição de 1:100 de anticorpo secundário conjugado com AF647 (IgG anti-humano para o soro do paciente e anti-IgG de ratinho a anticorpos primários anti-NR1 ou anti-D2R).
- Lave as células três vezes, tal como no passo 3.7, e voltar a suspender em 35 ul de PBS / FBS por citometria de fluxo de células de aquisição.
- Configure o amostrador de alto rendimento (HTS) no citômetro de fluxo (BDLSRII).
- Adquirir 10.000 eventos / poço de acordo com o modelo de aquisição de citometria de fluxo.
- Export e, em seguida, analisar os dados para a análise usando uma citometria de fluxo de pacotes de software, como FlowJo v7.5:
- Primeiro, porta as células HEK293 vivos, com base para a frente (tamanho) e lateral (granularidade), espalha.
- Além disso portão células HEK293 ao vivo com base na alta GFP-positividade para analisar apenas as células transfectadas.
- Determinar a intensidade média de fluorescência (MFI) do canal AF647 nas células GFP positivas vivas.
- Exportar dados para o Excel ou prisma de análise:
- Lote concentrations de anticorpo primário (anti-NMDAR ou anticorpo anti-D2R) versus o MFI obtido a partir das células incubadas com estes anticorpos.
- Para cada amostra de doente e de controlo, determinar o ΔMFI subtraindo o MFI das células HEK293 CTL do MFI do células HEK293 NMDAR + HEK293 D2R + ou, respectivamente.
- Calcular o limiar de positividade por adição de três desvios padrão acima da média ΔMFI do grupo de controlo.
- Amostras individuais de plotagem agrupados de acordo com seu tipo de soro em um gráfico e representam o limite como uma linha.
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Representative Results
Células vivas HEK293 D2R + e HEK293 CTL foram adquiridas no citômetro de fluxo utilizando um amostrador de alto rendimento. Durante a análise, as células foram fechado com base na dispersão para a frente (tamanho) e (granularidade) parâmetros (Figuras 1A e 1D) dispersão lateral. Células HEK293 transfectadas expressa a molécula repórter, a GFP, no citoplasma, e as células não transfectadas foram excluídos da análise (Figuras 1B e 1E). Dentro da GFP + portão, o IMF associada com o anticorpo anti-IgG humana conjugado secundário AF647 ligação foi medida (Figuras 1C e 1F). De modo a eliminar a fluorescência de fundo, quando a análise de soros humanos, o ΔMFI foi calculado subtraindo o MFI das células HEK293 CTL do MFI das células HEK293 D2R + (Figura 1G). Os dados apresentados são representativos de análise de anticorpos D2R, ea mesma estratégia de propagação e os dados de análise pode ser utilizado para a detecção de anticorpos NMDAR (dados não mostrados).
A detecção de anticorpos por citometria de fluxo de ensaio de base celular é baseado na expressão à superfície celular do antigénio de interesse. Como mostrado na Figura 2, células HEK293 NMDAR + altamente expresso NMDAR superfície (Figura 2A) e células HEK293 D2R + altamente expresso D2R superfície (Figura 2B), enquanto que as células HEK293 CTL expressos nenhum destes antigénios (Figuras 2A e 2B).
Os grupos de pacientes utilizados neste trabalho consistiu de um grupo de pacientes com NMDAR encefalite (NMDAR Enc, n = 4, uma encefalite definidas pela detecção de superfície NMDAR-1 subunidade NR1-anticorpo 3), associada ao anticorpo D2R encefalite (D2R Enc, n = 6, uma encefalite definidas pela detecção de anticorpos D2R superfície 11), e um grupo de controlo wioutras doenças neurológicas (th noninflammatory OND, n = 26), tais como epilepsia, acidente vascular cerebral, e perturbações do desenvolvimento ou neurodegenerativas. As amostras dos pacientes foram previamente validado para NMDAR 5 e D2R 11 positividade IgG. Os quatro pacientes positivos para anticorpos NMDAR tinha uma síndrome clínica típica de NMDAR encefalite como descrito 3 e as amostras de soro foram comprovadas positivo utilizando os ensaios baseados em células para anticorpos NMDAR como descrito e disponíveis em uso comercial, 3,4. Os seis pacientes positivos para anticorpos D2R tinha uma síndrome clínica típica da basal encefalite gânglios como descrito 11, e amostras de soro foram provado positivo para anticorpos D2R D2R usando seções knock-out cérebro, células transfectadas, e neurônios 11.
A fim de determinar a positividade em pacientes, o limiar, ou corte, da positividade do anticorpo foi calculado em cada experiência pela adição de três desvios padrão acima daΔMFI dos controles OND dizer. A 4/4 pacientes com NMDAR Enc foram confirmadas como sendo positivas para o anticorpo humano superfície NMDAR IgG (Figura 3A), enquanto que os 6/6 pacientes com D2R Enc foram positivos para o anticorpo humano superfície D2R IgG (Figura 3B). Nenhum dos pacientes positivos foram o dobro positivo para anticorpos que visam NMDAR e D2R. Anticorpos NMDAR e D2R não foram detectados em nenhum dos controlos OND analisados (Figuras 3A e 3B). As amostras dos pacientes foram considerados positivos se estivessem acima do limite em pelo menos dois dos três experimentos repetidos.
Figura 1. A detecção do anticorpo através de fluxo de alto rendimento citometria de ensaio à base de células:. Gating estratégia e análise de dados Liv células HEK293 e CTL e HEK293 D2R + transfectantes estáveis foram fechado com base na dispersão frontal (FSC) e dispersão lateral (SSC) (74,7% e 68,5%, respectivamente; A, D). As células positivas para GFP dentro HEK293 CTL e as células HEK293 D2R + (32,8% e 95,4%, respectivamente, B, E) foram ainda fechado para excluir GFP não transfectada - células (67,2% e 4,6%, respectivamente, B, E). Dentro das células GFP +, a intensidade média de fluorescência (IMF) está relacionado com o anticorpo anti-IgG humana conjugado secundário AF647 (HEK293 CTL = 3,657; HEK293 D2R + = 9128) foi medida (C, F). Para amostras humanas, os ΔMFI foi calculado subtraindo o MFI das células HEK293 CTL da das células HEK293 D2R + (G). Dados representativos da detecção de anticorpos D2R é mostrado. ank "> Clique aqui para ver imagem ampliada.
Figura 2. Expressão de NMDAR superfície e D2R determinado pelo fluxo de alto rendimento citometria de ensaio de base celular. HEK293 NMDAR + (A), HEK293 D2R + (B), e células CTL HEK293 foram coradas com diluições em série do anticorpo primário, seguido de um anticorpo secundário adequado. Foram observadas expressão alta superfície de NMDAR e D2R. Os valores de MFI correlacionada com títulos de anticorpos, uma vez que aumentou progressivamente com concentrações crescentes de anticorpo primário. Como esperado, não houve nenhuma detecção de NMDAR superfície ou D2R em células HEK293 CTL. Representante dados é mostrado.blank "> Clique aqui para ver imagem ampliada.
Figura 3. Confirmado detecção de anticorpos NMDAR superfície e D2R em uma coorte de pacientes. Soros de NMDAR encefalite (NMDAR Enc, n = 4), associado D2R-anticorpo pacientes encefalite (6 D2R Enc, n =), ou controles com outras doenças neurológicas (OND , n = 26 ou 24) foram incubadas com vivo HEK293 NMDAR +, HEK293 D2R +, e células HEK293 CTL, seguido por anticorpo secundário anti-IgG humano conjugado com AF647. Anticorpos NMDAR superfície e D2R foram detectados no soro de 4/4 pacientes NMDAR Enc (A) e 6/6 pacientes D2R Enc (B), respectivamente, ao passo que nenhum dos controles OND (0/26 ou 0/24) teve tanto anticorpo (A, B). Dotted linhas em gráficos representam o limiar de positividade calculado somando três desvios-padrão à média ΔMFI de controles OND. Gráficos de pontos representativos dos três experimentos são mostrados. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
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Discussion
Este artigo descreve uma nova aplicação da citometria de fluxo ensaio baseado em células vivas para detectar anticorpos que visam as proteínas neuronais específicos na superfície celular utilizando um amostrador de alto rendimento. Usando esta técnica, informamos que um subgrupo de pacientes afetados com doenças auto-imunes do sistema nervoso central têm anticorpos séricos para a superfície ou à superfície NMDAR D2R.
Passos essenciais para a detecção de anticorpo óptima utilizando este fluxo de alto rendimento citometria de ensaio baseado em células vivas incluem 1) a obtenção de um elevado rendimento de células transfectadas saudáveis, 2) verificar a expressão de superfície celular elevada do antigénio de interesse, 3), que estabelece um limite de anticorpos positividade usando um grupo de controlo, 4) e confirmando a reprodutibilidade dos dados.
A cultura de células saudáveis é fundamental para o sucesso desta técnica. Células HEK293 são bem conhecidos pela sua facilidade de cultura, de alta eficiência de transfecção, e a sua falta de expressão do neuronalproteínas, que é por isso que eles têm sido comumente utilizado em ensaios baseados em células para detectar anticorpos contra antígenos neuronais específicos 4,5,8-10. Uma taxa de transfecção óptima para adquirir uma alta percentagem de células vivas + GFP é crítico para este ensaio para calcular com precisão IMF. Por esta razão, a produção de uma linha celular policlonal estável da GFP + HEK293 NMDAR +, HEK293 D2R + ou HEK293 CTL células é vantajoso, pois proporciona um alto nível consistente de células GFP +, com a comodidade de não ter que repetidamente células transfectar antes cada experimento. A visualização rápida das células transfectadas através de um microscópio invertido é recomendado para verificar se as células saudáveis (células GFP + fica fluorescente se lâmpada de mercúrio estiver disponível). Se a viabilidade não parece ser tão alta, pode ser vantajoso usar um corante de viabilidade, tal como a 7-amino-actinomicina D, antes da obtenção das células no citómetro de fluxo, e para adicionar uma etapa extra de propagação nos Analysé excluir as células não viáveis.
Em doenças auto-imunes do sistema nervoso central, os anticorpos que se ligam aos domínios extracelulares dos antigénios do cérebro são pensados para ser 2,3,7,13,14 patogénico, por conseguinte, a ênfase é colocada sobre a detecção de anticorpos utilizando células vivas e nonpermeabilized. Este protocolo permite alcançar este objectivo mediante a utilização de células transfectadas que expressam os antigénios de superfície. Assim, a exportação correcta destes antígenos à superfície precisa de ser determinada pela coloração de células transfectadas com uma série de diluições de um anticorpo primário comercial contra o antigénio de interesse. Ao avaliar o nível de expressão do antigénio de superfície em células nonpermeabilized, é essencial a utilização de um anticorpo alvo um epitopo extracelular da proteína. Se um anticorpo específico não está disponível, pode ser necessário adicionar uma marca de um domínio extracelular do antigénio, e, posteriormente, utilizar um anticorpo comercial contra a tag para determinar a expressão de superfície. Temos com sucessousado essa abordagem usando um D2R marcado-hemaglutinina e descartou imunorreatividade de soros de pacientes com a tag em si 11. É também essencial que toda a sequência de cDNA do antigénio de interesse é sub-clonado num vector adequado, de modo que a expressão e a integridade estrutural na membrana celular não é comprometida. Na verdade, tem-se mostrado previamente que domínios específicos da proteína receptora são essenciais para a correcta dobragem, exportação e integração na membrana da célula 18.
Na citometria de fluxo ensaios baseados em células, avaliando positividade do soro do paciente em cada experimento baseia-se no estabelecimento de um limite, ou de corte, derivado de uma coorte de controles. Zhou et al. 19 calculado um limiar de positividade, adicionando dois desvios-padrão acima da intensidade de fluorescência média Δmedian, e este corresponderam aproximadamente do percentil 95 da faixa de controle saudável. Emnossos estudos anteriores, optou-se por um corte maior (além de três desvios-padrão para a média Δ MFI do grupo de controlo), o que correspondeu a 99 º percentil da faixa de controle saudáveis 11,20. Além disso, McLaughlin et ai. 16 escolheu para expressar a medição da reactividade de anticorpos específicos como a razão de MFI entre as células que expressam o antigénio e células de antigénio-negativas. Uma razão superior a 5 foi considerada positiva e correspondiam aos três desvios padrão acima da média da razão de controlo, que é semelhante ao nosso trabalho. Usando um limiar mais elevado aumenta o rigor do protocolo e melhora a discriminação entre controles e pacientes positivos para anticorpos. É importante ressaltar que, em nossa experiência, a reatividade de anticorpos da faixa de controle saudável não foi significativamente diferente do que a faixa OND, permitindo o uso de qualquer população de Calculate do limiar de positividade 11,20.
Como em todos os experimentos de pesquisa, reprodutibilidade dos dados é fundamental. Soros de pacientes são considerados positivos para anticorpos contra um antígeno específico neuronal se eles estão acima do limite de positividade em pelo menos dois dos três experimentos independentes. Pacientes individuais têm diferentes concentrações de IgG no soro. Estas variações podem ter uma influência sobre o nível de ligação de anticorpo, em relação a outros pacientes. Todos os soros de pacientes utilizado em nosso estudo anterior, por nefelometria e considerados dentro da faixa normal (6,2-14,4 g / L) 11, e sempre sera diluído com o mesmo fator de diluição. O estabelecimento de uma curva de titulação de soro individuais pode ser vantajoso a fim de comparar as concentrações de anticorpos entre os doentes. Além disso, cegueira inicial do investigador é recomendado durante ensaio de base celular, mas controles precisam ser unblinded, a fim de calcular a postularlimiar ivity.
Quando um anticorpo alvo plausível é encontrado, a validação apropriada é necessária para evitar a falsa positividade. As amostras de anticorpos positivos ou negativos detectados utilizando a citometria de fluxo de ensaio de base celular deve ser ensaiada utilizando um método alternativo que não se utilizam preferencialmente antigénios desnaturados ou linearizados. Por exemplo, diminuição da imunorreactividade em secções do cérebro de animais knock-out específico para o antigénio foi demonstrado com sucesso no caso dos recém-vários auto-antigénios do SNC relatada 9-11,21. Imunoabsorção de soros de doentes em células que expressam o antigénio, também têm sido utilizados para validar os resultados 9,11.
A citometria de fluxo Protocolo de ensaio de base celular descrito no presente documento pode ser facilmente alterada para avaliar a especificidade do anticorpo para uma multidão de diferentes alvos antigénicos, incluindo aqueles encontrados fora do SNC. É provável que existem e são anticorpos de outras especificidades desconhecidos ainda seridentificado. Além disso, esta técnica é adequado para a detecção de diferentes classes e subclasses de Ig, incluindo IgM, como mostrado nos nossos estudos anteriores 11,20. A determinação da subclasse IgG também pode revelar potencial para contribuir para a patogênese da doença. Por exemplo IgG1 ou IgG3 são capazes de mediar a citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos ou citotoxicidade dependente do complemento, que são relatados os mecanismos de patogenicidade induzida por auto-anticorpos 14,20,22. Excepto AF647 (vermelho longínquo) corantes fluorescentes podem também ser utilizados, desde que eles têm picos de emissão suficientemente longe a de a molécula repórter, a GFP. Qualquer sobreposição de espectros de emissão deve ter os requisitos de compensação corretas. Determinação da especificidade de um anticorpo para uma proteína intracelular também seria possível utilizar a citometria de fluxo, ainda que, em primeiro lugar as células têm de ser fixadas e permeabilizadas para tornar o antigénio disponível para a ligação do anticorpo. Esta técnica alternativa pode resultar em elevada background, devido à exposição de anticorpos para domínios intracelulares, bem como numerosos antigénios celulares, que foram de outro modo ocultos em células nonpermeabilized vivos. Estes factores de confusão pode reduzir a resistência do fluxo de citometria de ensaio à base de células e os controles adequados deve ser efectuada em conformidade.
A utilização de fluxo de alto rendimento citometria de ensaio de base celular proporciona um método fiável e preciso para a detecção de anticorpos no soro humano de grandes grupos de pacientes. Descobrindo novos anticorpos adicionais através desta técnica irá ajudá-diagnóstico e futuros tratamentos de pacientes com doenças auto-imunes do SNC.
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Disclosures
Conflito de interesse: A patente foi arquivada por FB e RCD (Universidade de Sydney) alegando D2R como alvo para auto-anticorpos.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo australiano Conselho Nacional de Saúde e Pesquisa Médica, Fundação Científica Star (Austrália), Síndrome de Tourette Association (EUA), A esclerose múltipla Trish Fundação de Pesquisa e Pesquisa da Esclerose Múltipla Austrália, Fundação Petre (Austrália), a Rebecca L. Cooper Medical Research Foundation (Austrália). Agradecemos a todos os pacientes e familiares que forneceram amostras para o nosso estudo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pIRES2-EGFP vector | Clontech | 6029-1 | |
| Human HA-Dopamine-2 receptor (D2R) cDNA | Missouri S&T cDNA Resource Centre | DRD020TN00 | |
| Human subunit 1 of NMDAR (NR1) cDNA | Gift from Prof A. Vincent (Oxford, UK) | ||
| Monoclonal purified mouse anti-human NR1 antibody (clone: 54.1) | BD Pharmingen | 556308 | |
| Mouse purified monoclonal anti-DRD2 IgG (clone: 1B11) | Sigma-Aldrich | WH0001813M1-50UG | |
| Alexa Fluor 647 donkey anti-mouse IgG (H + L) | Invitrogen | A31571 | |
| Alexa Fluor 647 goat anti-human IgG (H + L) | Invitrogen | A21445 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (1x) 4.5 g/L D-glucose, L-Glutamine and 110 mg/L sodium pyruvate | Invitrogen | 11995-065 | |
| Foetal bovine serum | Invitrogen | 10099-141 | |
| Gentamicin | Invitrogen | 15710-072 | |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050-061 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Geneticin | Invitrogen | 10131-035 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x) (-Ca2+/-Mg2+) | Invitrogen | 14190-144 | |
| TrypLE Express (1x) with Phenol Red | Invitrogen | 12605-028 | |
| 0.9% Sodium chloride | Baxter | AHF7975 | |
| Polyethylenimine | Polysciences Inc | 9002-98-6 | |
| Versene | Invitrogen | 15040-066 | |
| XhoI | Roche | 10899194001 | |
| NheI | Roche | 10885843001 | |
| PureLink PCR Purification Kit | Invitrogen | K3100-01 | |
| JetQuick Gel Extraction Spin Kit | Genomed | 420050 | |
| T4 DNA Ligase | Roche | 10481220001 | |
| Plasmid Plus Maxi Kit | Qiagen | 12963 | |
| Name of Equipment/Software | Company | Catalog Number | Model/Version |
| Flow cytometer with high-throughput sampler system | BD Biosciences | BDLSRII with HTS | |
| Inverted microscope | Olympus | CKX41 (with mercury lamp and U-RFLT50 power supply) | |
| Electronic multichannel pipette (15-300 μl) | Eppendorf | 613-2240P | 12-channel Xplorer Plus |
| Excel | Microsoft | 2010 | |
| Prism | GraphPad Software, Inc. | v4 | |
| FlowJo | Treestar | v7.5 | |
| 50 ml polypropylene conical tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| 6-well plate | BD Biosciences | 353046 | |
| Tissue culture flask (T75) | BD Biosciences | 353136 | |
| Parafilm | Pechiney Plastic Packaging | PM-992 | |
| V-bottom 96-well plate | Corning | 651180 | |
References
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