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Medicine

Ensayo de alto rendimiento basado en células citometría de flujo para detectar anticuerpos a la N-metil-D-aspartato receptor o dopamina-2 del receptor en suero humano

Published: November 23, 2013 doi: 10.3791/50935

Summary

Durante los últimos años, los ensayos basados ​​en células vivas se han utilizado con éxito para detectar anticuerpos contra antígenos de superficie y conformacionales. Aquí se describe un método que utiliza el flujo de alto rendimiento citometría permite el análisis de grandes cohortes de pacientes. La detección de nuevos anticuerpos será mejorar el diagnóstico y el tratamiento de trastornos del sistema inmune-mediada.

Abstract

Durante los últimos años, los anticuerpos contra las proteínas de superficie y conformacionales implicados en la neurotransmisión se han detectado en las enfermedades autoinmunes del sistema nervioso central en niños y adultos. Estos anticuerpos se han utilizado para guiar el diagnóstico y el tratamiento. Ensayos basados ​​en células han mejorado la detección de anticuerpos en el suero del paciente. Se basan en la expresión de superficie de antígenos del cerebro en las células eucariotas, que luego se incubaron con sueros de paciente diluida seguido por anticuerpos secundarios conjugados con fluorocromo. Después del lavado, el anticuerpo secundario de unión se analizó a continuación por citometría de flujo. Nuestro grupo ha desarrollado un flujo de alto rendimiento de la citometría de ensayo basado en células vivas para detectar de forma fiable anticuerpos contra los receptores de neurotransmisores específicos. Este método de citometría de flujo es sencillo, cuantitativa, eficiente, y el uso de un sistema de toma de muestras de alto rendimiento permite grandes cohortes de pacientes que se sometieron a ensayo fácilmente en un corto espacio de tiempo. Además, esta basado en células comodecir se puede adaptar fácilmente para detectar anticuerpos a muchas dianas antigénicas diferentes, tanto desde el sistema nervioso central y la periferia. El descubrimiento de biomarcadores de anticuerpos novela adicionales permitirá un diagnóstico precoz y preciso y mejorar el tratamiento de los trastornos autoinmunes.

Introduction

En los últimos años, se han identificado formas autoinmunes del sistema nervioso central (SNC) enfermedades. Se ha demostrado que estas enfermedades están asociadas y definen por la presencia de autoanticuerpos. Estos anticuerpos se unen a los receptores neuronales o proteínas sinápticas implicadas en la neurotransmisión 1,2. Diferentes antígenos se han detectado, tales como receptor de N-metil-D-aspartato (NMDAR) 3-5, receptor de γ-aminobutírico B (GABA B) del receptor 6, α-amino-3-hidroxi-5-metil-4- ácido isoxazolpropiónico (AMPA) 7, el canal de potasio dependiente de voltaje (VGKC) proteínas asociadas: rica en leucina 1 glioma proteínas activadas (LGL-1) y contactina asociada a la proteína 2 (capsr2) receptor de 8,9, glutamato 5,10 , y la dopamina-2 del receptor (D2R) 11. En el pasado, estos trastornos del SNC autoinmunes (principalmente llamados encefalitis) eran a menudo sin diagnosticar y sin tratar. Estos biomarcadores de anticuerpos novedosos, por ejemplo,Anticuerpos NMDAR o anticuerpo D2R, han mejorado sustancialmente el diagnóstico y la sensibilización, y se han abierto las opciones de tratamiento para los pacientes. De hecho, el tratamiento temprano con inmunoterapias se asocia con un mejor resultado 11,12.

Los métodos tradicionales para detectar anticuerpos, tales como el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y Western Blot se han utilizado para la detección de anticuerpos en el suero. Sin embargo, no permiten fácilmente el reconocimiento de epítopos extracelulares o de superficie y, más bien, pueden revelar inmunorreactividad hacia un epítopo intracelular. Además, los anticuerpos que se unen al dominio extracelular de las proteínas importantes implicadas en la neurotransmisión es probable que sean 2,3,7,13,14 patógena. Por lo tanto, el desarrollo de ensayos precisos y sensibles para descubrir superficie de la célula relevante o los objetivos de anticuerpos extracelulares en los pacientes es de suma importancia. El método estándar de oro en el campo se basa en el uso de células vivas, en la así llamada "célula-BAensayos de sed ". Este método implica la expresión de un antígeno en la superficie de células de mamíferos (de riñón (293) más a menudo células embrionarias humanas HEK293) en su forma nativa por la transfección de vectores que contienen la secuencia completa de ADNc del antígeno de interés. Nonpermeabilized células vivas se incubaron después con suero diluido del paciente y seguidas por-fluorocromo conjugado anti-inmunoglobulina humana (Ig) anticuerpo secundario. Después se detecta la intensidad o nivel de fluorescencia y se asocia con el nivel de unión de autoanticuerpos. Esta técnica es específica, ya que sólo un antígeno se sobreexpresa en las células. El más ampliamente utilizado "lectura" ha sido el análisis de microscopía confocal después de inmunocitoquímica 4,5,8-10. Sin embargo, la citometría de flujo ensayos basados ​​en células se han utilizado con éxito para detectar anticuerpos en pacientes con enfermedades desmielinizantes 15-17. En particular, Waters et al. 15 compararon la detección de anticuerpos usando una cacerolaEL de técnicas de detección de anticuerpos, incluyendo ensayos basados ​​en células, seguido por microscopía o el flujo de análisis de citometría, y ha demostrado citometría de flujo ensayo basado en células para ser el método más sensible, preciso y fiable. Por lo tanto, citometría de flujo ensayo basado en células es ventajosa, ya que es cuantitativo, no investigador-dependiente, y no implica ningún uso de material radiactivo. También es conveniente, ya que permite a las grandes cohortes de pacientes que se sometieron a ensayo en un corto período de tiempo.

Más recientemente, hemos optimizado un flujo de alto rendimiento citometría de ensayo basado en células para detectar anticuerpos de NMDAR y D2R anticuerpo en pacientes con enfermedades autoinmunes del sistema nervioso central 11. Nuestro grupo detectado recientemente anticuerpo de NMDAR en sueros de pacientes usando citometría de flujo ensayo basado en células. Estos NMDAR sueros anticuerpos positivos fueron analizados previamente por microscopía confocal y también resultaron ser positivos 11. Este protocolo describe una citometría de flujo ensayo basado en células para la detección de canticuerpo SNC onformation-sensible en el suero del paciente utilizando un muestreador automatizado de alto rendimiento.

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Protocol

1. Subclonación Estrategia para Construir pIRES2-EGFP vector que codifica D2R o NMDAR

  1. Obtener ADNc de longitud completa clon de D2R humano o de NMDAR subunidad 1 (NR1).
  2. Elija un vector de expresión, tal como pIRES2-EGFP, que es adecuado para la expresión de proteínas de transmembrana con una proteína verde fluorescente (GFP) indicador bajo el control de un sitio de entrada interna del ribosoma (IRES), permite que tanto los antígenos y GFP para ser coexpressed en células por separado.
  3. Subclónese ADNc humano dentro de pIRES2-EGFP del vector.
    1. Para subclonar ADNc, utilizar enzimas de restricción apropiadas (por ejemplo NheI y XhoI para D2R ADNc humano).
    2. CDNA corte Ligar insertar dentro restringido vector pIRES2-EGFP.
    3. Secuencia ligada pIRES2-EGFP D2R o NMDAR vector para comprobar si el vector contiene la secuencia correcta.
    4. Purifica y amplificar D2R pIRES2-EGFP o NMDAR vector para su posterior uso en la transfección.
í tulo "> 2. HEK293 La transfección de células para la expresión de antígeno neuronal

  1. Células de cultivo HEK293 en matraces de cultivo de tejidos con medio Eagle modificado fresco de Dulbecco (1x) (DMEM) completo con 4,5 g / l de D-glucosa, L-glutamina y 110 mg / piruvato de sodio L suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS), 2 mM de GlutaMAX, y 50 mg / ml de gentamicina.
  2. Separar las células HEK293 usando tripsina y la transferencia a un tubo cónico.
    1. Lavar las células por centrifugación a 250 xg durante 6 min y resuspender el sedimento de células en DMEM completo fresco.
  3. Contar las células y placas de semillas 6 pocillos a aproximadamente 8 x 10 5 células / pocillo y la cultura durante la noche en DMEM 2 ml a 37 ° C y 5% de CO 2 en una incubadora.
  4. Una vez que han llegado a cerca del 70% de confluencia, transfectar las células HEK293 con pIRES2-EGFP NR1 (células HEK293 NMDAR +), pIRES2-EGFP D2R (+ células HEK293 D2R), y (células HEK293 CTL; control de vectores) pIRES2-EGFP de la siguiente manera.Mantenga algunas células HEK293 transfectadas de indemnización más adelante.
    1. Preparar el volumen necesario de mezcla de transfección que comprende 2,5 g de ADN, 200 l de cloruro de sodio 0,9% y 4 mg / ml de polietilenimina / pocillo (cada uno conteniendo 2 ml de DMEM completo fresco).
    2. Inmediatamente agite la mezcla durante 10 s y se incuba a temperatura ambiente (TA) durante 10 min, antes de la adición de volumen de mezcla de transfección a los pocillos apropiados.
    3. Cubrir la placa, envuelva los lados con Parafilm, y centrifugar a 280 xg durante 5 minutos para ayudar a la transfección de células.
    4. Retire el Parafilm y luego colocar en la incubadora para cultivo a 37 ° C.
    5. Vuelva a colocar los medios de cultivo de 18 horas más tarde con DMEM completo fresco, y mantener en cultivo durante otras 72 horas.
    6. Opcional: 72 horas después de la transfección, las células transfectadas se pueden seleccionar mediante el cultivo en DMEM completo suplementado con 250 g / ml de geneticina, con el fin de obtener un transfectante estable policlonal.
  1. Separar HEK293 NMDAR +, HEK293 D2R +, y células HEK293 de CTL mediante incubación con 500 l / pocillo Versene durante aproximadamente 5 min a 37 ° C.
    1. Resuspender en 2ml/well de PBS (-Ca 2 + / Mg 2 +) suplementado con FBS al 2% (PBS / FBS) y traslado a unas 15 ml o 50 ml tubo cónico.
    2. Lavar las células por centrifugación a 250 xg durante 6 min y resuspender el sedimento celular en 15-50 ml de PBS / FBS. Repita lavado 2x.
    3. Contar las células y luego volver a suspender en PBS / FBS al 1 x 10 6 células / ml.
  2. Diseño de la plantilla de 96 pocillos para la adquisición de citometría de flujo, teniendo en cuenta que + células HEK293 D2R + o HEK293 NMDAR, así como células HEK293 CTL tendrán que ser incubados con cada muestra de paciente o anticuerpo primario.
  3. Se siembran las células en una placa de 96 pocillos de fondo en V a 50 000 células / nosotrosLL de acuerdo con la citometría de flujo plantilla de adquisición.
  4. Sedimentar las células por centrifugación de la placa de 96 pocillos a 450 xg durante 5 min y suavemente eliminar el sobrenadante usando una pipeta multicanal electrónica o manual, inclinando la placa en un ángulo y teniendo cuidado de no aspirar el sedimento celular.
  5. Incubar HEK293 D2R +, HEK293 NMDAR +, y células HEK293 CTL durante 1 hora a temperatura ambiente en la oscuridad con:
    1. Diluciones seriadas de anticuerpo primario con el fin de evaluar la expresión del antígeno de superficie.
    2. Las muestras de pacientes con el fin de detectar anticuerpos.
  6. Utilice flujo apropiado citometría controles de compensación, por ejemplo. células HEK293 no transfectadas no teñidas, GFP + células HEK293 (AF647 -), y AF647 + células HEK293 no transfectadas (GFP).
  7. Lavar las células por centrifugación a 450 xg durante 5 min y resuspender el sedimento de células en 170 l de PBS / FBS. Repita el paso de lavado dos veces más.
  8. Se incuban las células durante 1 hr a TA en la oscuridad con una dilución 1:100 de anticuerpo secundario AF647-conjugado (IgG anti-humana para el suero del paciente y anti-IgG de ratón para el anti-NR1 o anti-D2R anticuerpos primarios).
  9. Lavar las células tres veces, como en el paso 3.7, y volver a suspender en 35 l de PBS / FBS para citometría de flujo de células de adquisición.
  10. Configure el muestreador de alto rendimiento (HTS) en el citómetro de flujo (BDLSRII).
  11. Adquirir 10.000 eventos / pocillo de acuerdo con la citometría de flujo plantilla de adquisición.
  12. Export y luego analizar los datos para el análisis utilizando una citometría de flujo paquete de software, tales como FlowJo v7.5:
    1. En primer lugar, puerta de las células HEK293 vivos basada en adelante (tamaño) y lateral (granularidad) dispersa.
    2. HEK293 células vivas Además de puerta basado en alta GFP-positividad para analizar sólo las células transfectadas.
    3. Determinar la intensidad de fluorescencia media (MFI) de la canal AF647 dentro de las células positivas para GFP en vivo.
    4. Exportar datos a Excel o Prism para el análisis:
      1. Terreno concentrations de anticuerpo primario (anti-NMDAR o anticuerpo anti-D2R) frente al IMF obtuvieron a partir de las células incubadas con estos anticuerpos.
      2. Para cada paciente y control de ejemplo, determinar el ΔMFI restando el MFI de las células HEK293 de CTL de la IMF de las células HEK293 NMDAR + D2R + HEK293 o, respectivamente.
      3. Calcule el umbral de positividad de anticuerpos mediante la adición de tres desviaciones estándar por encima de la ΔMFI media de la cohorte de control.
      4. Muestras individuales Parcela agrupan de acuerdo a su tipo de suero en un gráfico y representan el umbral como una línea.

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Representative Results

HEK293 células vivas D2R + y CTL HEK293 fueron adquiridas en el citómetro de flujo usando un muestreador de alto rendimiento. Durante el análisis, las células fueron cerrada sobre la base de dispersión frontal (tamaño) y los parámetros de dispersión lateral (granularidad) (Figuras 1A y 1D). Células HEK293 transfectadas expresan la molécula informadora, GFP, en el citoplasma, y las células no transfectadas fueron excluidos del análisis (Figuras 1B y 1E). Dentro de la GFP + puerta, la IMF asociada con AF647-anti-humano conjugado anticuerpo secundario unión de IgG se midió (Figuras 1C y 1F). Con el fin de eliminar la fluorescencia de fondo en el análisis de sueros humanos, la ΔMFI se calculó restando la MFI de las células HEK293 de CTL de la MFI de las células HEK293 D2R + (Figura 1G). Los datos mostrados son representativos de análisis de anticuerpos D2R, yla misma estrategia de activación periódica y análisis de datos se puede utilizar para la detección de anticuerpos de NMDAR (datos no mostrados).

La detección de anticuerpos por citometría de flujo ensayo basado en células se basa en la expresión de la superficie celular del antígeno de interés. Como se muestra en la Figura 2, las células HEK293 NMDAR + altamente expresado NMDAR superficie (Figura 2A) y células HEK293 D2R + altamente expresado D2R superficie (Figura 2B), mientras que las células HEK293 CTL expresan ninguno de estos antígenos (Figuras 2A y 2B).

Los grupos de pacientes usados ​​en este trabajo consistieron en una cohorte de pacientes con encefalitis de NMDAR (NMDAR Enc, n = 4, una encefalitis definido por la detección de superficie NMDAR subunidad NR1-1 anticuerpo 3), D2R encefalitis anticuerpo-asociado (D2R Enc, n = 6, una encefalitis definido por la detección de anticuerpo D2R superficie 11), y una cohorte de control wiotras enfermedades inflamatorias ª neurológicos (OND, n = 26), tales como la epilepsia, derrame cerebral y trastornos del desarrollo o neurodegenerativas. Las muestras de pacientes han sido previamente validados por NMDAR 5 y D2R 11 positividad IgG. Los cuatro pacientes positivos para anticuerpos NMDAR tenían un síndrome clínico típico de la encefalitis de NMDAR tal como se describe y 3 muestras de suero se ha demostrado positivo usando ensayos basados ​​en células para anticuerpos NMDAR tal como se describe y disponibles en el uso comercial 3,4. Los seis pacientes positivos para anticuerpos D2R tenían un síndrome clínico típico de la encefalitis ganglios basales como se describe 11, y las muestras de suero se probaron positivas para anticuerpos D2R D2R utilizando knock-out secciones del cerebro, las células transfectadas y las neuronas 11.

Con el fin de determinar la positividad de anticuerpo en los pacientes, el umbral, o de corte, de positividad de anticuerpo se calculó en cada experimento mediante la adición de tres desviaciones estándar por encima de lasignifica ΔMFI de los controles OND. Los 4/4 pacientes con NMDAR Enc fueron confirmados positivos para anticuerpo de superficie NMDAR humana de IgG (Figura 3A), mientras que los 6/6 pacientes con D2R Enc fueron positivos para anticuerpos IgG humana superficie D2R (Figura 3B). Ninguno de los pacientes positivos fueron doble positivo para los anticuerpos dirigidos NMDAR y D2R. Anticuerpos NMDAR y D2R no se detectaron en ninguno de los controles OND analizadas (Figuras 3A y 3B). Las muestras de pacientes se consideraron positivos si estaban por encima del umbral en al menos dos de los tres experimentos repetidos.

Figura 1
Figura 1. La detección de anticuerpo por el flujo de alto rendimiento citometría de ensayo basado en células:. Gating estrategia y análisis de datos Liv células HEK293 e CTL y HEK293 D2R + estable transfectants fueron cerrada en base a la dispersión frontal (FSC) y la dispersión lateral (SSC) (74,7% y 68,5%, respectivamente; A, D). Células positivas para GFP en HEK293 y CTL + células HEK293 D2R (32,8% y 95,4%, respectivamente; B, E) fueron cerrada más para excluir GFP untransfected - células (67,2% y 4,6%, respectivamente; B, E). Dentro de las células GFP +, la intensidad media de fluorescencia (IMF) asociado con anticuerpo anti-humana AF647-conjugado de IgG secundaria; se midió (C, F) (HEK293 CTL = 3,657 HEK293 D2R + = 9,128). Para las muestras de humanos, la ΔMFI se calculó restando la MFI de las células HEK293 de CTL de la de las células D2R + HEK293 (G). Se muestran los datos representativos de la detección de anticuerpos D2R. ank "> Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Figura 2
Figura 2. Expresión de NMDAR superficie y D2R determinado por el flujo de alto rendimiento citometría de ensayo basado en células. HEK293 NMDAR + (A), HEK293 D2R + (B), y células de CTL HEK293 fueron teñidas con diluciones seriadas de anticuerpo primario, seguido por el anticuerpo secundario apropiado. Se observó expresión de alta superficie de NMDAR y D2R. Valores de MFI correlacionados con el título de anticuerpos, ya que aumentó de forma constante con concentraciones crecientes de anticuerpo primario. Como era de esperar, no hubo detección de NMDAR superficie o D2R en células HEK293 de CTL. Se muestra datos representativos.blank "> Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Figura 3
Figura 3. Confirmado detección de anticuerpos NMDAR superficie y D2R en una cohorte de pacientes. Sueros de NMDAR encefalitis (NMDAR Enc, n = 4), la encefalitis D2R anticuerpo-asociado (D2R Enc, n = 6) de los pacientes, o los controles con otras enfermedades neurológicas (OND , n = 26 o 24) se incubaron con HEK293 vivo de NMDAR +, HEK293 D2R +, y células HEK293 CTL, seguido de anticuerpo secundario anti-IgG humana AF647-conjugado. Se han detectado anticuerpos NMDAR superficie y D2R en el suero de 4/4 pacientes de NMDAR Enc (A) y 6/6 pacientes D2R Enc (B), respectivamente, mientras que ninguno de los controles (OND 0/26 ó 0/24) tenía ya sea anticuerpo (A, B). Dottelíneas d en los gráficos representan el umbral de positividad se calcula sumando tres desviaciones estándar de la media de los controles ΔMFI OND. Se muestran diagramas de puntos representativos de tres experimentos. Haga clic aquí para ver la imagen más grande .

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Discussion

En este trabajo se describe una nueva aplicación de la citometría de flujo ensayo basado en células vivas para detectar anticuerpos dirigidos a proteínas neuronales específicas de la superficie celular usando un muestreador de alto rendimiento. Usando esta técnica, nos informan de que un subgrupo de pacientes afectados con enfermedades del SNC autoinmunes tienen anticuerpos séricos a aflorar a la superficie NMDAR o D2R.

Los pasos esenciales para la detección óptima de anticuerpos utilizando este flujo de alto rendimiento citometría de ensayo basado en células en vivo incluyen 1) la obtención de un alto rendimiento de células transfectadas sanos, 2) la verificación de la expresión de superficie celular de alta del antígeno de interés, 3) el establecimiento de un umbral de anticuerpo positividad utilizando una cohorte de controles, 4) y confirmar la reproducibilidad de los datos.

El cultivo de las células sanas es fundamental para el éxito de esta técnica. Células HEK293 son bien conocidas por su facilidad de la cultura, de alta eficiencia de la transfección, y su falta de expresión de neuronalproteínas, por lo que se han utilizado comúnmente en ensayos basados ​​en células para detectar anticuerpos frente a los antígenos neuronales específicas 4,5,8-10. Una tasa de transfección óptima para adquirir un alto porcentaje de células GFP + en vivo es crítico para este ensayo para calcular con precisión IMF. Por esta razón, la producción de un anticuerpo policlonal línea celular estable de GFP + células HEK293 NMDAR +, HEK293 D2R + o HEK293 CTL es ventajoso, ya que proporciona un alto nivel constante de células GFP +, con la comodidad añadida de no tener que repetidamente células transfectar antes de cada experimento. Se recomienda una visualización rápida de las células transfectadas a través de un microscopio invertido para detectar células sanas (células GFP + será fluorescente lámpara de mercurio si está disponible). Si la viabilidad no parece tan alta, puede ser beneficioso utilizar un colorante de viabilidad, tales como 7-amino-actinomicina D, antes de la adquisición de células en el citómetro de flujo y para añadir un paso gating extra en los Analyses excluir las células no viables.

En las enfermedades autoinmunes del sistema nervioso central, los anticuerpos que se unen a los dominios extracelulares de los antígenos del cerebro se cree que son 2,3,7,13,14 patógena, por lo tanto, se hace hincapié en la detección de anticuerpos utilizando células vivas y nonpermeabilized. Este protocolo logra este objetivo mediante el uso de células transfectadas que expresan antígenos de superficie. Por lo tanto, la exportación correcta de estos antígenos a la superficie necesita ser determinado por la tinción de las células transfectadas con diluciones seriadas de un anticuerpo primario comercial contra el antígeno de interés. Al evaluar el nivel de expresión del antígeno de superficie en células nonpermeabilized, es esencial el uso de un anticuerpo dirigido a un epítopo extracelular de la proteína. Si un anticuerpo específico no está disponible, puede ser necesario añadir una etiqueta en un dominio extracelular del antígeno, y a partir de entonces usar un anticuerpo comercial contra la etiqueta para determinar la expresión en superficie. Tenemos éxitoutilizado este enfoque mediante un D2R hemaglutinina-etiquetado y descartó inmunorreactividad del suero del paciente a la etiqueta en sí 11. También es fundamental que la totalidad de la secuencia de ADNc del antígeno de interés se subclona en un vector adecuado de modo que la expresión y la integridad estructural a la membrana celular no se vea comprometida. De hecho, se ha demostrado previamente que los dominios particulares de una proteína receptora son esenciales para el plegamiento correcto, la exportación, y la integración en la membrana de la célula 18.

En citometría de flujo ensayos basados ​​en células, la evaluación de positividad de anticuerpos de sueros de pacientes en cada experimento se basa en el establecimiento de un umbral, o de corte, derivado de una cohorte de controles. Zhou et al. 19 calcula un umbral de positividad de anticuerpos mediante la adición de dos desviaciones estándar por encima de la media de intensidad de fluorescencia Δmedian, y esto corresponde aproximadamente a los 95 º percentil de la gama de control sano. Ennuestros estudios anteriores, que optaron por una corte más alta (adición de tres desviaciones estándar de la media Δ MFI de la cohorte de control), lo que corresponde a los 99 º percentil de la gama de controles sanos 11,20. Además, McLaughlin et al. 16 eligió para expresar la medición de la reactividad del anticuerpo específico como la relación de MFI entre las células que expresan el antígeno y las células negativas al antígeno. Una relación superior a 5 se consideró positiva y correspondió a tres desviaciones estándar por encima de proporción media de los controles, que es similar a nuestro trabajo. El uso de un umbral más alto aumenta la rigurosidad del protocolo y mejora la discriminación entre los controles y los pacientes positivos para anticuerpos. Es importante destacar que, en nuestra experiencia, la reactividad de los anticuerpos de la gama de controles sanos no fue significativamente diferente de la gama OND, permitiendo el uso de cualquiera de la población a calculate el umbral de positividad de anticuerpos 11,20.

Al igual que en todos los experimentos de investigación, la reproducibilidad de datos es de suma importancia. Los sueros de paciente se considera positiva para anticuerpos contra un antígeno neuronal específica si están por encima del umbral de positividad en al menos dos de tres experimentos independientes. Los pacientes individuales tienen diferentes concentraciones de IgG en el suero. Estas variaciones pueden tener una influencia en el nivel de unión de anticuerpos, en relación con otros pacientes. Todos los sueros de los pacientes utilizado en nuestro estudio anterior se midió por nefelometría y se encontró que dentro del rango normal (6,2 a 14,4 g / L) 11, y siempre diluyó sueros con el mismo factor de dilución. El establecimiento de una curva de titulación del suero individuo podría ser beneficiosa a fin de comparar las concentraciones de anticuerpos entre los pacientes. Además, se recomienda cegamiento inicial del investigador durante el ensayo basado en células, pero los controles deben ser no cegada con el fin de calcular el Positumbral ividad.

Cuando se encuentra un objetivo anticuerpo plausibles, se requiere la validación adecuada para evitar falsos positivos. Muestras de anticuerpo-positivo o negativo-detectados utilizando la citometría de flujo ensayo basado en células deberían analizarse mediante una metodología alternativa que preferentemente no utilizar antígenos desnaturalizados o linealizadas. Por ejemplo, la disminución de la inmunorreactividad en las secciones del cerebro de animales knock-out antígeno-específica se ha demostrado con éxito en el caso de varios SNC se acaba de informar-autoantígenos 9-11,21. Inmunoabsorción de suero del paciente sobre las células que expresan el antígeno también se han utilizado para validar los resultados 9,11.

La citometría de flujo protocolo de ensayo basado en células descrito en este documento puede alterar fácilmente para evaluar la especificidad del anticuerpo a una multitud de diferentes dianas antigénicas, incluyendo las que se encuentran fuera del SNC. Es probable que existen y son anticuerpos de otras especificidades desconocidas todavía seridentificado. Además, esta técnica es adecuado para la detección de diferentes clases y subclases de Ig, incluyendo IgM, como se muestra en nuestros estudios anteriores 11,20. La determinación de IgG subclase también puede revelar posibilidades de contribuir a la patogénesis de la enfermedad. Por ejemplo IgG1 o IgG3 son capaces de mediar en la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos o citotoxicidad dependiente del complemento, que se informó de los mecanismos de patogenicidad inducida por autoanticuerpos-14,20,22. Los tintes fluorescentes distintos de AF647 (rojo lejano) también se pueden utilizar siempre que tienen picos de emisión lo suficientemente lejos de la de la molécula informadora, GFP. Cualquier espectros de emisión se solapan debe contar con los requisitos de compensación adecuadas. La determinación de la especificidad de un anticuerpo a una proteína intracelular también sería posible usando citometría de flujo, aunque, las células necesitan primero que se fija y se permeabilizaron para hacer el antígeno disponible para la unión del anticuerpo. Esta técnica alternativa puede resultar en alto backgrouND debido a la exposición de los anticuerpos a los dominios intracelulares, así como numerosos antígenos celulares, que estaban ocultas de otro modo en las células nonpermeabilized vivo. Estos factores de confusión pueden reducir la fuerza de la citometría de flujo ensayo basado en células y los controles adecuados se deben realizar en consecuencia.

El uso de flujo de alto rendimiento citometría de ensayo basado en células proporciona un método fiable y preciso para la detección de anticuerpos en suero humano de grandes cohortes de pacientes. El descubrimiento de nuevos anticuerpos adicionales a través de esta técnica ayudará diagnóstico y los tratamientos futuros de los pacientes con enfermedades del SNC autoinmunes.

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Disclosures

Conflicto de intereses: Una patente ha sido presentada por el FB y el RCD (Universidad de Sydney), alegando D2R como objetivo para autoanticuerpos.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por el Health and Medical Consejo Australiano de Investigaciones Científicas, la Fundación Científica Star (Australia), el síndrome de Tourette Asociación (EE.UU.), la esclerosis múltiple Trish Fundación para la Investigación y la Investigación de Esclerosis Múltiple Australia, Fundación Petre (Australia), el Rebecca L. Cooper Medical Research Foundation (Australia). Agradecemos a todos los pacientes y familiares que proporcionaron muestras para nuestro estudio.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pIRES2-EGFP vector Clontech 6029-1
Human HA-Dopamine-2 receptor (D2R) cDNA Missouri S&T cDNA Resource Centre DRD020TN00
Human subunit 1 of NMDAR (NR1) cDNA Gift from Prof A. Vincent  (Oxford, UK)
Monoclonal purified mouse anti-human NR1 antibody (clone: 54.1) BD Pharmingen 556308
Mouse purified monoclonal anti-DRD2 IgG (clone: 1B11) Sigma-Aldrich WH0001813M1-50UG
Alexa Fluor 647 donkey anti-mouse IgG (H + L) Invitrogen A31571
Alexa Fluor 647 goat anti-human IgG (H + L) Invitrogen A21445
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (1x) 4.5 g/L D-glucose, L-Glutamine and 110 mg/L sodium pyruvate Invitrogen 11995-065
Foetal bovine serum Invitrogen 10099-141
Gentamicin Invitrogen 15710-072
GlutaMAX Invitrogen 35050-061
Penicillin-streptomycin Invitrogen 15140-122
Geneticin Invitrogen 10131-035
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x) (-Ca2+/-Mg2+) Invitrogen 14190-144
TrypLE Express (1x) with Phenol Red Invitrogen 12605-028
0.9% Sodium chloride Baxter AHF7975
Polyethylenimine Polysciences Inc 9002-98-6
Versene Invitrogen 15040-066
XhoI Roche 10899194001
NheI Roche 10885843001
PureLink PCR Purification Kit Invitrogen K3100-01
JetQuick Gel Extraction Spin Kit Genomed 420050
T4 DNA Ligase Roche 10481220001
Plasmid Plus Maxi Kit Qiagen 12963
Name of Equipment/Software Company Catalog Number Model/Version
Flow cytometer with high-throughput sampler system BD Biosciences BDLSRII with HTS
Inverted microscope Olympus CKX41 (with mercury lamp and U-RFLT50 power supply)
Electronic multichannel pipette (15-300 μl) Eppendorf 613-2240P 12-channel Xplorer Plus
Excel Microsoft 2010
Prism GraphPad Software, Inc. v4
FlowJo Treestar v7.5
50 ml polypropylene conical tubes BD Biosciences 352070
6-well plate BD Biosciences 353046
Tissue culture flask (T75) BD Biosciences 353136
Parafilm Pechiney Plastic Packaging PM-992
V-bottom 96-well plate Corning 651180

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References

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Medicina Número 81 citometría de flujo análisis basado en células autoanticuerpos muestreador de alto rendimiento la enfermedad autoinmune del SNC
Ensayo de alto rendimiento basado en células citometría de flujo para detectar anticuerpos a la N-metil-D-aspartato receptor o dopamina-2 del receptor en suero humano
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Amatoury, M., Merheb, V., Langer,More

Amatoury, M., Merheb, V., Langer, J., Wang, X. M., Dale, R. C., Brilot, F. High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum. J. Vis. Exp. (81), e50935, doi:10.3791/50935 (2013).

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