Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

पश्चिमी ब्लॉटिंग में व्यावहारिक, सुविधाजनक और विश्वसनीय कुल प्रोटीन लोडिंग नियंत्रण के लिए V3 दाग मुक्त वर्कफ़्लो

Published: December 30, 2013 doi: 10.3791/50948
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Bio-Rad Laboratories

Summary

वी 3 वर्कफ्लो दाग मुक्त जैल का उपयोग करके एक पश्चिमी दाग प्रक्रिया है। दाग मुक्त प्रौद्योगिकी शोधकर्ताओं को प्रोटीन जुदाई की गुणवत्ता की कल्पना करने की अनुमति देता है, हस्तांतरण दक्षता को सत्यापित करने के लिए, और सबसे महत्वपूर्ण बात, एक विश्वसनीय लोडिंग नियंत्रण के रूप में कुल प्रोटीन मात्राकरण का उपयोग कर ब्याज के प्रोटीन में परिवर्तन को मान्य करने के लिए ।

Abstract

पश्चिमी दाग एक बहुत ही उपयोगी और व्यापक रूप से अपनाई गई प्रयोगशाला तकनीक है, लेकिन इसका निष्पादन चुनौतीपूर्ण है। वर्कफ़्लो को अक्सर "ब्लैक बॉक्स" के रूप में चित्रित किया जाता है क्योंकि एक प्रयोगवादी को पता नहीं होता है कि इसे कई चरणों के आखिरी तक सफलतापूर्वक किया गया है या नहीं। इसके अलावा, पश्चिमी दाग डेटा की गुणवत्ता को कभी-कभी पश्चिमी ब्लॉटिंग प्रक्रिया में प्रभावी गुणवत्ता नियंत्रण उपकरणों की कमी के कारण चुनौती दी जाती है। यहां हम V3 पश्चिमी कार्यप्रवाह का वर्णन करते हैं, जो पारंपरिक पश्चिमी दाग प्रोटोकॉल से जुड़ी प्रमुख चिंताओं को दूर करने के लिए दाग मुक्त तकनीक लागू करता है। यह कार्यप्रवाह शोधकर्ताओं को अनुमति देता है: 1) लगभग 20-30 मिनट में एक जेल चलाने के लिए; 2) जेल चलाने के बाद 5 मिनट के भीतर नमूना जुदाई गुणवत्ता की कल्पना करने के लिए; 3) 3-10 मिनट में प्रोटीन स्थानांतरित करने के लिए; 4) हस्तांतरण दक्षता को मात्रात्मक रूप से सत्यापित करने के लिए; और सबसे महत्वपूर्ण बात 5) कुल प्रोटीन लोडिंग नियंत्रण का उपयोग कर ब्याज के प्रोटीन के स्तर में परिवर्तन को मान्य करने के लिए। यह उपन्यास दृष्टिकोण β-ऐक्टिन, β-ट्यूबलिन, गपध आदि जैसे हाउसकीपिंग प्रोटीन के लिए दाग को अलग करने और फिर से लागू करने की आवश्यकता को समाप्त करता है । V3 दाग मुक्त कार्यप्रवाह पश्चिमी दाग प्रक्रिया को तेज, पारदर्शी, अधिक मात्रात्मक और विश्वसनीय बनाता है ।

Introduction

पश्चिमी दाग एक बहुत ही उपयोगी तकनीक है9,हालांकि, पश्चिमी ब्लॉटिंग के साथ दो प्रमुख चुनौतियां हैं: लंबी और श्रम गहन प्रक्रिया और डेटा की गुणवत्ता। एक पारंपरिक प्रोटोकॉल के बारे में 2 दिनों की आवश्यकता है। इसमें नमूना तैयारी, जेल कास्टिंग, प्रोटीन इलेक्ट्रोफोरेसिस और स्थानांतरण, एंटीबॉडी इनक्यूबेशन, इमेजिंग, और अक्सर अलग करना, पुनर्प्राण और अंत में डेटा विश्लेषण के बाद झिल्ली अवरुद्ध सहित कई कदम शामिल हैं। इस प्रक्रिया के दौरान, प्रक्रिया नियंत्रण के लिए कोई विश्वसनीय और लचीला उपकरण नहीं हैं। जैसे, त्रुटियों को प्रत्येक चरण में पेश किया जा सकता है, और इन त्रुटियों में डेटा कलाकृतियों को उत्पन्न करने की क्षमता है; इसलिए, त्रुटियों की पहचान करने और सही करने के लिए पश्चिमी ब्लॉटिंग में लोडिंग नियंत्रण आवश्यक हैं। लोडिंग नियंत्रण आमतौर पर प्रत्येक नमूने में एक संदर्भ प्रोटीन के प्रोटीन स्तर की जांच करके किया जाता है ताकि यह देखा जा सके कि क्या इसे समान रूप से प्रस्तुत किया गया है। लोग अक्सर लोडिंग कंट्रोल के रूप में हाउसकीपिंग प्रोटीन जैसे β-ऐक्टिन, β-ट्यूबलिन, गपध का इस्तेमाल करते हैं।

पश्चिमी दाग डेटा की गुणवत्ता विश्वसनीय लोडिंग नियंत्रण पर निर्भर करता है। लेकिन लोडिंग नियंत्रण के लिए हाउसकीपिंग प्रोटीन का उपयोग करते समय दो वैध चिंताएं हैं: 1) हाउसकीपिंग प्रोटीन बैंड का एंटीबॉडी-आधारित इम्यूनोडेटेक्शन अक्सर संतृप्त होता है और इसलिए कोई भी नमूनों के बीच लोडिंग मतभेदों को अलग नहीं कर सकता30; 2) हाउसकीपिंग प्रोटीन अभिव्यक्ति का स्तर कुछ प्रायोगिक परिस्थितियों में नमूनों में भिन्न हो सकता है,उदाहरण के लिए, सिरना उपचार, सेल डेथ, सेल भेदभाव, आदि11,28,3,6,10,21। इन चिंताओं के कारण, वैज्ञानिक पत्रिकाओं को अब यह आवश्यकता होती है कि "मात्रात्मक तुलना के लिए, उचित अभिकर्षक, नियंत्रण और रैखिक सिग्नल पर्वतमाला के साथ इमेजिंग विधियों का उपयोग किया जाना चाहिए" (नेचर दिशानिर्देश)। इसी तरह, जर्नल ऑफ क्लीनिकल इन्वेस्टिगेशन के संपादक अधिक विश्वसनीय लोडिंग नियंत्रण24की मांग कर रहे हैं । इन कारणों से, लोडिंग नियंत्रण के रूप में उपयोग किए जाने के लिए हाउसकीपिंग प्रोटीन को मान्य करने की आवश्यकता होती है। सबसे पहले, किसी को यह सुनिश्चित करना होगा कि इसे इम्यूनोडेटेक्शन विधि14,29की रैखिक गतिशील रेंज में मापा जाता है। दूसरा, किसी को यह सुनिश्चित करना होगा कि यह सभी नमूनों में लगातार व्यक्त किया जाता है26,31,25,19,20।

एक विश्वसनीय लोडिंग नियंत्रण का एक वैकल्पिक समाधान दाग से कुल प्रोटीन माप का उपयोग करना है। कुछ शोधकर्ताओं ने कुल प्रोटीन दाग के साथ दाग दाग, जैसे Coomassie, राजहंसो गुलाबी, Sypro रूबी, Amido काले, Ponceau एस, और दाग मुक्त प्रौद्योगिकी, लोडिंग नियंत्रण के रूप में प्रत्येक लेन में कुल प्रोटीन संकेत को मापने के लिए16,20,13,27,1,4,12। कुल प्रोटीन लोडिंग नियंत्रण हाउसकीपिंग प्रोटीन से जुड़े नुकसान से बचा जाता है। सबसे पहले, यह प्रत्येक नमूने के लिए लोड प्रोटीन की मात्रा का एक सच्चा प्रतिबिंब है। दूसरा, कुल प्रोटीन दाग पश्चिमी दाग विश्लेषण (एक जटिल कोशिका lysate के 10-50 μg प्रोटीन) के लिए आम लोडिंग रेंज में उत्कृष्ट रैखिक गतिशील रेंज प्रदर्शित करता है और सही नमूनों के बीच लोडिंग अंतर को अलग करता है12।

दाग मुक्त तकनीक एक उपन्यास कुल प्रोटीन धुंधला विधि है जहां एक अद्वितीय यौगिक एक्रिलैमाइड जेल समाधान में मिलाया जाता है और समान रूप से कास्ट जेल में वितरित किया जाता है। इलेक्ट्रोफोरेसिस पूरा होने के बाद, जेल को कम से कम 1 मिनट के लिए यूवी प्रकाश के संपर्क में आता है ताकि दाग यौगिक प्रोटीन में ट्राइप्टोफन अवशेषों के साथ प्रतिक्रिया करता है। प्रोटीन यूवी प्रकाश के तहत उत्तेजनीय हो जाते हैं ताकि एक मजबूत फ्लोरोसेंट संकेत दिया जा सके जिसे केमिडोक एमपी सिस्टम जैसे दाग-मुक्त सक्षम इमेजर में कल्पना और मात्रात्मक किया जा सकता है। दाग मुक्त यौगिक ही, हालांकि, यूवी प्रकाश को अवशोषित नहीं करता है, जिसके परिणामस्वरूप जेल छवि की पृष्ठभूमि कम होती है। ट्रिप्टोफान अवशेषों का संशोधन अपरिवर्तनीय है और प्रोटीन को न केवल जेल में बल्कि प्रोटीन हस्तांतरण के बाद किसी भी समय दाग पर भी कल्पना की जा सकती है।

दाग मुक्त प्रौद्योगिकी V3 पश्चिमी कार्यप्रवाह(चित्रा 1)में लागू किया जाता है पारंपरिक कार्यप्रवाह के बारे में प्रमुख शिकायतों को संबोधित करने के लिए, विशेष रूप से लोडिंग नियंत्रण के रूप में हाउसकीपिंग प्रोटीन का उपयोग करने के साथ चिंताओं । इस कार्यप्रवाह का उपयोग करके, एक सकता है: 1) जेल चलाने के बाद 5 मिनट में नमूना अखंडता और प्रोटीन पृथक्करण गुणवत्ता की जांच करें; 3) 3-10 मिनट में प्रोटीन स्थानांतरित; 4) हस्तांतरण दक्षता मात्रात्मक रूप से जांचें; और 5) सबसे महत्वपूर्ण बात, कुल प्रोटीन लोडिंग नियंत्रण का उपयोग कर ब्याज के प्रोटीन के स्तर में परिवर्तन मान्य।

Protocol

1. प्रोटीन नमूना तैयारी

(सेल संस्कृति से प्रोटीन निकालने के लिए एक विशिष्ट प्रक्रिया का वर्णन किया गया है)

  1. हेला सेल कल्चर डिश को बर्फ में रखें और कोशिकाओं को बर्फ से ठंडा ट्राइस-बफर खारा (टीबीएस; 20 एमएम ट्रिस-एचसीएल, पीएच 7.5, 150 mm NaCl) से धोएं।
  2. टीबीएस को एस्पिरेट करें, फिर 1 मिलीलीटर प्रति 100 मिमी डिश बर्फ-ठंडे रिपा बफर (50 एमएम ट्रिस-एचसीएल पीएच 8.0, 150 एमएन एनएसीएल, 1% एनसीएल, 1% एनपी-40, 0.5% सोडियम डेऑक्सीकोटल, 0.1% एसडी) फॉस्फेट और प्रोटीज अवरोधकों के साथ पूरक जोड़ें।
  3. ठंडे प्लास्टिक सेल स्क्रैपर का उपयोग करके पकवान से अनुयायी कोशिकाओं को कुरेदना; धीरे-धीरे सेल सस्पेंशन को प्रीकूल्ड माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  4. एक रोटेटर पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए लगातार आंदोलन बनाए रखें।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस प्रीकूल्ड सेंट्रलाइज में 20 मिनट के लिए 16,000 एक्स ग्राम पर स्पिन करें।
  6. धीरे-धीरे ट्यूब को सेंट्रलाइज से हटा दें और बर्फ पर रखें। सुपरनैंट को बर्फ पर रखी एक ताजा ट्यूब में स्थानांतरित करें, और गोली को त्याग दें।
  7. प्रोटीन परख करने के लिए एक छोटी मात्रा (10-20 माइक्रोन) को निकालें। आरसी डीसी परख किट का उपयोग कर प्रत्येक नमूने के लिए प्रोटीन एकाग्रता निर्धारित करें।
  8. यदि आवश्यक हो, तो प्रोटीन के नमूनों को -20 डिग्री सेल्सियस पर दीर्घकालिक भंडारण के लिए अलीकोट करें। दोहराएं फ्रीज और गल चक्र प्रोटीन क्षरण का कारण बनता है और इससे बचा जाना चाहिए।
  9. प्रत्येक नमूने के लगभग 20 माइक्रोग्राम लें, 2x लाममली नमूना बफर (4% एसडी, 10% 2-मर्केप्टोथेनॉल, 20% ग्लाइसेरोल, 0.004% ब्रोमोफेनॉल ब्लू, 125 एमएमएम ट्रिस-एचसीएल, पीएच 6.8) की बराबर मात्रा जोड़ें।
  10. प्रत्येक सेल को 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर नमूना बफर में गर्म करें।
  11. 1 मिनट के लिए एक माइक्रोसेंट्रफ्यूज में 16,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।

2. दाग मुक्त जैल (~ 30 मिनट) के साथ जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस

  1. एक कसौटी TGX किसी भी केडी दाग मुक्त प्रीकास्ट जेल (एक मिडी प्रारूप जेल), कैसेट के नीचे से कंघी और टेप को हटा दें।
  2. कसौटी सेल में कैसेट रखें और 60 मिलीलीटर रनिंग बफर (25 एमएम ट्रिस, 190 एमएम ग्लाइसिन, 0.1% एसडीएस, पीएच 8.3) के साथ एकीकृत ऊपरी बफर चैंबर को भरें। बफर चलाने के साथ कुओं कुल्ला।
  3. चिह्नित भरने लाइन के लिए बफर चल 400 मिलीलीटर के साथ निचले बफर टैंक के प्रत्येक आधे भरें।
  4. प्रोटीन के नमूने और उचित प्रोटीन मार्कर लोड करें।
  5. ढक्कन को टैंक पर रखें, ढक्कन पर इसी जैक के साथ रंग-कोडित केले प्लग को संरेखित करें।
  6. 200 वी पर ~ 30 मिनट या 300 वी पर 20 मिनट के लिए जेल चलाएं।

3. स्टेन मुक्त जेल इमेजिंग प्रोटीन जुदाई गुणवत्ता की जांच करने के लिए Chemidoc एमपी सिस्टम का उपयोग (~ 5 मिनट)

  1. सेल से जेल कैसेट निकालें। कैसेट खोलने और जेल जारी करने के लिए कसौटी सेल ढक्कन में जेल कैसेट खोलने उपकरण का प्रयोग करें।
  2. केमिडोक एमपी इमेजर के यूवी नमूना ट्रे के केंद्र में कुछ मिलीलीटर पानी लगाएं। जेल को कैसेट से सावधानी से उठाएं और ट्रे पर रखें।
  3. इमेज लैब सॉफ्टवेयर लॉन्च करें और निम्नलिखित सेटिंग्स के साथ दाग मुक्त जेल छवि(चित्रा 1A)कैप्चर करें:
    आवेदन: दाग मुक्त जेल
    जेल सक्रियण समय: 1 मिनट
    इमेजिंग क्षेत्र: कसौटी जेल
    छवि एक्सपोजर समय: स्वचालित रूप से सबसे तीव्र बैंड के लिए अनुकूलित
  4. नमूना ट्रे से जेल निकालें और कदम स्थानांतरित करने के लिए तुरंत आगे बढ़ें।

4. ट्रांस-ब्लॉट टर्बो सिस्टम (~ 10 मिनट) के साथ प्रोटीन ट्रांसफर

  1. एक ट्रांस-ब्लॉट टर्बो मिडी पीवीडीएफ ट्रांसफर पैक खोलें; स्थानांतरण कैसेट के आधार पर नीचे ढेर (जिसमें झिल्ली शामिल है) रखें।
  2. जेल को झिल्ली के शीर्ष पर रखें, जेल पर शीर्ष ढेर रखें, और बुलबुले को रोल करें।
  3. कैसेट बेस पर ढक्कन रखें और इसे लॉक करने के लिए डायल को चालू करें।
  4. कैसेट को ब्लॉटर बे में डालें।
  5. एक पूर्व निर्धारित टर्बो कार्यक्रम का चयन करके और कसौटी जेल आकार (मिडी) का चयन करके स्थानांतरण शुरू करें, और फिर रन दबाएं। एक ठेठ रन केवल 7 मिनट लेता है ।
  6. जब स्थानांतरण खत्म हो जाता है, तो ब्लॉटिंग सैंडविच को अलग करें और दाग और जेल दोनों को एक कंटेनर में डियॉनाइज्ड पानी के साथ रखें।

5. स्टेन-फ्री जेल और दाग इमेजिंग प्रोटीन ट्रांसफर दक्षता और गुणवत्ता (~ 5 मिनट) की जांच करने के लिए Chemidoc एमपी सिस्टम का उपयोग कर

  1. केमिडोक एमपी इमेजर के सैंपल ट्रे पर ट्रांसफर के बाद के जेल रखें।
  2. इमेज लैब सॉफ्टवेयर लॉन्च करें और निम्नलिखित सेटिंग्स के साथ पोस्ट-ट्रांसफर जेल(चित्रा 1B)की दाग-मुक्त छवि को कैप्चर करें:
    आवेदन: दाग मुक्त जेल
    जेल सक्रियण समय: कोई नहीं
    इमेजिंग क्षेत्र: कसौटी जेल
    छवि एक्सपोजर समय: प्रीट्रांसफर जेल छवि के लिए एक्सपोजर समय के समान
  3. नमूना ट्रे से जेल निकालें और फिर निम्नलिखित सेटिंग्स के साथ दाग(चित्रा 1C)छवि। इमेजिंग करते समय पानी या टीबीस्ट की कुछ बूंदों से दाग गीला रखें।
    आवेदन: दाग मुक्त दाग
    इमेजिंग क्षेत्र: कसौटी जेल
    छवि एक्सपोजर समय: स्वचालित रूप से सबसे तीव्र बैंड के लिए अनुकूलित
  4. नमूना ट्रे से ब्लॉटिंग झिल्ली निकालें और इसे टीबीएसटी (टीबीएस में 0.1% ट्वीन 20) के साथ एक कंटेनर में रखें।

6. एंटीबॉडी इनक्यूबेशन

  1. 1 घंटे के लिए कमरे में अस्थायी पर टीबीस्ट में 3% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) के घोल में दाग रखकर ब्लॉक करें।
  2. दूसरे लक्ष्य प्रोटीन के खिलाफ उठाए गए माउस प्राथमिक एंटीबॉडी वाले समाधान में 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर दाग को इनक्यूबेट करें।
  3. प्राथमिक एंटीबॉडी युक्त समाधान डालें। इसके बाद, 5 मिनट के लिए टीबीस्ट के 20 मिलीलीटर में आंदोलन करके दाग धोएं। कुल 5 वॉश के लिए 4x दोहराएं।
  4. माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान में कमरे में अस्थायी में 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट एक डाइलाइट 650 संयुग्मित बकरी-विरोधी माउस एंटीबॉडी और एक डाइलाइट 549 संयुग्मित बकरी विरोधी खरगोश एंटीबॉडी युक्त।
  5. प्राथमिक एंटीबॉडी युक्त समाधान डालें। इसके बाद, 5 मिनट के लिए टीबीस्ट के 20 मिलीलीटर में आंदोलन करके दाग धोएं। कुल 5 वॉश के लिए 4x दोहराएं।

7. इमेजिंग और इमेज लैब सॉफ्टवेयर द्वारा डेटा विश्लेषण- कुल प्रोटीन सामान्यीकरण (~ 5 मिनट)

  1. एक नया मल्टीचैनल प्रोटोकॉल खोलकर दाग(चित्रा 1E)की एक मल्टीप्लेक्सिंग फ्लोरोसेंट छवि प्राप्त करें, तीन फ्लोरोसेंट चैनलों को कॉन्फ़िगर करें और प्रोटोकॉल चलाएं।
    चैनल 1:
    आवेदन: दाग डाइलाइट 650
    इमेजिंग क्षेत्र: कसौटी जेल
    छवि एक्सपोजर समय: स्वचालित रूप से सबसे तीव्र बैंड के लिए अनुकूलित
    चैनल 2:
    आवेदन: दाग डाइलाइट 549
    इमेजिंग क्षेत्र: कसौटी जेल
    छवि एक्सपोजर समय: स्वचालित रूप से सबसे तीव्र बैंड के लिए अनुकूलित
    चैनल 3:
    आवेदन: दाग मुक्त दाग
    इमेजिंग क्षेत्र: कसौटी जेल छवि एक्सपोजर समय: स्वचालित रूप से सबसे तीव्र बैंड के लिए अनुकूलित
  2. विश्लेषण टूल बॉक्स से सामान्यीकरण आइकन पर क्लिक करें और लेन और बैंड का पता लगाने के लिए हां पर क्लिक करें।
  3. यदि आवश्यक हो तो लेन और बैंड में समायोजन करने के लिए "लेन और बैंड टूल" का चयन करें और उपयोग करें।
  4. सामान्यीकरण चैनल के रूप में दाग मुक्त छवि का चयन करें।
  5. मेगावाट विश्लेषण उपकरण का चयन करें और उनके नीचे बक्से की जांच करके मेगावाट मानक लेन आवंटित करें।
  6. सामान्यकृत वॉल्यूम देखने के लिए, टूल बार पर विश्लेषण तालिका पर क्लिक करें। सभी गणनाएं सॉफ्टवेयर द्वारा स्वचालित रूप से की जाएंगी, जिसमें सामान्यीकरण कारक और सामान्यीकृत वॉल्यूम शामिल हैं। लक्ष्य प्रोटीन बैंड तीव्रता मान अब प्रोटीन लोड में भिन्नता के लिए समायोजित कर रहे हैं । यह नमूनों के बीच लक्षित प्रोटीन की सटीक तुलना की अनुमति देगा।

Representative Results

1. नमूना अखंडता, प्रोटीन जुदाई की गुणवत्ता, और दाग मुक्त जेल छवियों के साथ दक्षता हस्तांतरण का आकलन।

हेला कोशिकाओं से प्रोटीन निकालने के लिए एक 18 अच्छी तरह से कसौटी AnyKD TGX दाग मुक्त जेल पर 20 मिनट के लिए ३०० वी पर अलग किया गया । प्रोटीन नमूनों को चार अलग-अलग मात्रा में 3x लोड किया गया था (लेन 1-3, 40 माइक्रोग्राम; लेन 4-6, 30 माइक्रोन; लेन 7-9, 20 माइक्रोन; लेन 10-12, 10 माइक्रोन) । जेल को यूवी लाइट के तहत 1 मिनट के लिए सक्रिय किया गया था। चित्रा 2 ए प्रोटीन पृथक्करण के ठीक बाद हासिल की गई जेल छवि को दर्शाता है। प्रोटीन नमूना अखंडता(जैसे गिरावट) और जुदाई गुणवत्ता(जैसे प्रोटीन वर्षा) नेत्रहीन इस जेल छवि के साथ मूल्यांकन किया जा सकता है । प्रोटीन तो ट्रांस-ब्लॉट टर्बो का उपयोग कर एक नाइट्रोसेल्यूलोस झिल्ली के लिए 7 मिनट के लिए स्थानांतरित किया गया । चित्रा 2B स्थानांतरण के बाद जेल की दाग मुक्त छवि दिखाता है। दोनों छवियों को एक ही एक्सपोजर समय (6.8 सेकंड) के साथ अधिग्रहीत किया गया था। स्थानांतरण दक्षता को मापने के लिए लेन 3 और 12 का चयन किया गया था । इमेज लैब सॉफ्टवेयर में वॉल्यूम टूल का उपयोग करके, दोनों जेल छवियों पर लेन 3 और 12 को कवर करने के लिए एक आयताकार बॉक्स (नीला) आकर्षित किया गया था। इन बक्सों से मात्रा मूल्यों के आधार पर गणना से संकेत मिलता है कि दोनों लेन की हस्तांतरण दक्षता 80%(चित्रा 2 सी)थी। इस प्रयोग में, AnyKD TGX जेल छोटे से मध्यम आकार के लक्ष्य प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए चुना गया था और यह बड़े प्रोटीन के हस्तांतरण के लिए अनुकूलित नहीं किया गया था । हस्तांतरण दक्षता का अनुकूलन करने के लिए कम प्रतिशत जेल के उपयोग की आवश्यकता होगी(उदाहरण के लिए 4-20%) और/या बड़े प्रोटीन के हस्तांतरण को सुगम बनाने के लिए हस्तांतरण समय का समायोजन । 2. दाग मुक्त कुल प्रोटीन लोडिंग नियंत्रण ब्याज के प्रोटीन के स्तर में एक छोटे से परिवर्तन की मात्रा निर्धारित करने के लिए पश्चिमी ब्लॉटिंग में हाउसकीपिंग लोडिंग नियंत्रण के लिए एक विश्वसनीय विकल्प है।

एमसीएम-7 एक डीएनए लाइसेंसिंग प्रतिकृति कारक है जिसका स्तर विकिरण उपचार के बाद लिम्फोब्लास्टोलास्टोइड सेल लाइनों (एलसीएल) में 20-50% तक कम हो जाता है। इस प्रयोग में, चार नियंत्रण और विकिरण-उपचारित लिम्फोब्लास्टोइड सेल लाइन (एलसीएल) संस्कृतियों के लिसेट्स (30 माइक्रोग्राम प्रत्येक) को 12-अच्छी तरह से मापदंड AnyKD TGX दाग मुक्त जेल पर अलग किया गया था। जेल को यूवी लाइट के तहत 1 मिनट के लिए सक्रिय किया गया था और ट्रांस-ब्लॉट टर्बो द्वारा इम्यूनोब्लोटिंग के लिए पीवीडीएफ झिल्ली में स्थानांतरित किया गया था। हाउसकीपिंग प्रोटीन GAPDH (ग्रीन) एक खरगोश एंटीबॉडी (सेल सिग्नलिंग प्रौद्योगिकी, संयुक्त राज्य अमेरिका, 1:2,500) और एक डाइलाइट ५४९ संयुग्मित बकरी विरोधी खरगोश एंटीबॉडी (रॉकलैंड, संयुक्त राज्य अमेरिका, 1:20,000) के साथ जांच की गई थी । ब्याज एमसीएम-7 (लाल) के प्रोटीन एक माउस एंटीबॉडी (Abcam, संयुक्त राज्य अमेरिका, 1:1,000) और एक डाइलाइट ६४९ संयुग्म बकरी विरोधी माउस एंटीबॉडी (रॉकलैंड, 1:10,000) का उपयोग कर जांच की गई थी ।

चित्रा 3 ए चार नियंत्रण और विकिरण उपचारित एलसीएल नमूनों में पाए गए कुल प्रोटीन (नीले), एमसीएम-7 (लाल) और गपध (ग्रीन) की एक मल्टीप्लेक्स फ्लोरोसेंट छवि दिखाता है । चित्रा 3B प्रत्येक नमूने (30 μg) में कुल प्रोटीन पैटर्न दिखा एक ही दाग की एक दाग मुक्त छवि है । इमेज लैब सॉफ्टवेयर ने प्रत्येक लेन में एमसीएम-7, गपध और कुल प्रोटीन मात्रा को मापने के लिए नमूना लेन (ब्लू बॉक्स) का चयन किया। एमसीएम-7 के स्तर को या तो दाग मुक्त कुल प्रोटीन माप के खिलाफ या GAPDH के खिलाफ सामान्यीकृत किया गया था । सामान्यीकृत एमसीएम-7 प्रोटीन स्तरों का सांख्यिकीय विश्लेषण किया गया और औसत एमसीएम-7 प्रोटीन बैंड वॉल्यूम और मानक विचलन (एन = 4) चार्ट(चित्रा 3 सी)में प्रस्तुत किए गए हैं। दोनों सामान्यीकरण विधियों में एक छोटी सी कमी का पता चला (लगभग 25%) विकिरण उपचार के बाद एमसीएम-7 प्रोटीन के स्तर में। कुल प्रोटीन सामान्यीकरण के साथ डेटा लोडिंग नियंत्रण के रूप में GAPDH के साथ की तुलना में एक छोटे मानक विचलन का प्रदर्शन किया ।

Figure 1
चित्रा 1. V3 पश्चिमी कार्यप्रवाह। V3 कार्यप्रवाह 4 चरणों में बाएं कॉलम में चित्रित किया गया है। वर्कफ्लो में इस्तेमाल होने वाले प्रमुख इंस्ट्रूमेंट्स और रिएजेंट्स को हर स्टेप पर दिखाया जाता है। प्रत्येक चरण के लिए अनुमानित समय भी शामिल है। सही कॉलम से पता चलता है कि V3 वर्कफ़्लो में न्यूनतम 4 छवियां उत्पन्न की जा सकती हैं। डेटा के प्रत्येक टुकड़े का उपयोग वर्णित है। प्रीट्रांसफर जेल, पोस्ट-ट्रांसफर जेल, और दाग(ए, बी, सी)की दाग-मुक्त छवियां पारंपरिक पश्चिमी ब्लॉटिंग तकनीकों के साथ आसानी से उत्पन्न नहीं की जा सकती हैं; ये छवियां और डेटा वैज्ञानिक के नियंत्रण और पश्चिमी दाग कार्यप्रवाह की प्रजनन क्षमता में सुधार करने के लिए प्रक्रिया के साथ महत्वपूर्ण जानकारी और चौकियों प्रदान करते हैं । लक्ष्य प्रोटीन संकेतों को या तो एक रसायनीय ब्लॉट इमेज(डी)पर कब्जा किया जा सकता है यदि एचआरपी-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी का पता लगाने में या फ्लोरोसेंट ब्लॉट इमेज(ई)पर लागू किया गया था, यदि एक ही दाग पर एक साथ एक से अधिक लक्षित प्रोटीन का पता लगाने के लिए फ्लोरोसेंट वेस्टर्न ब्लॉटिंग का प्रदर्शन किया गया था। बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2। नमूना अखंडता, जुदाई गुणवत्ता, और हस्तांतरण दक्षता का आकलन करने के लिए V3 पश्चिमी कार्यप्रवाह में प्रीट्रांसफर और पोस्ट-ट्रांसफर जैल की दाग-मुक्त छवियां। (A)प्रीट्रांसफर जेल दाग मुक्त छवि। (ख)पोस्ट-ट्रांसफर जेल दाग मुक्त छवि। (ग)प्रोटीन ट्रांसफर एफिशिएंसी मेजरमेंट। बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3। ब्याज के प्रोटीन के स्तर को सामान्य करने के लिए लोडिंग नियंत्रण के रूप में गैपध इम्यूनोडेटेक्शन के लिए दाग मुक्त कुल प्रोटीन माप की तुलना करना। (A)फ्लोरोसेंट वेस्टर्न ब्लॉट इमेज । (ख)दाग मुक्त दाग छवि । (C)सामान्यीकृत एमसीएम-7 प्रोटीन का स्तर। बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

ऊपर वर्णित V3 दाग मुक्त प्रोटोकॉल मल्टीप्लेक्सिंग फ्लोरोसेंट वेस्टर्न ब्लॉटिंग के लिए है। यह भी केमिल्यूमिनेसेंट का पता लगाने का उपयोग कर पश्चिमी दाग में लागू किया जा सकता है। मल्टीप्लेक्स फ्लोरोसेंट वेस्टर्न ब्लॉट प्रोटोकॉल में, दाग मुक्त दाग छवियों को दो समय बिंदुओं पर प्राप्त किया जाता है: 1) प्रोटीन हस्तांतरण के ठीक बाद; 2) एंटीबॉडी इनक्यूबेशन के बाद मल्टीप्लेक्स फ्लोरोसेंट इमेजिंग स्टेप पर। पहली दाग मुक्त छवि हस्तांतरण दक्षता की गणना करने के लिए प्रयोग किया जाता है और दूसरी दाग मुक्त छवि लोडिंग नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता है। जब केमिल्यूमिनेसेंट विधि लागू की जाती है, तो दाग मुक्त और लक्षित प्रोटीन संकेतों के लिए मल्टीप्लेक्स छवि लेना संभव नहीं है, क्योंकि केमिल्यूमिनेसेंट सिग्नल दाग मुक्त चैनल में भी दिखाई देगा। इस मामले में, हम लोडिंग नियंत्रण और सामान्यीकरण विश्लेषण के लिए प्रोटीन हस्तांतरण कदम के ठीक बाद ली गई दाग मुक्त छवि का उपयोग करने की सलाह देते हैं।

V3 पश्चिमी वर्कफ्लो पारंपरिक पश्चिमी दाग वर्कफ़्लो की तुलना में निम्नलिखित अद्वितीय लाभ प्रदान करता है जो लोडिंग नियंत्रण के रूप में हाउसकीपिंग प्रोटीन का उपयोग करता है:

सबसे पहले, V3 कार्यप्रवाह ब्याज के प्रोटीन के स्तर में परिवर्तन को मान्य करने के लिए एक व्यावहारिक, सुविधाजनक और अधिक विश्वसनीय लोडिंग नियंत्रण प्रदान करता है। V3 प्रोटोकॉल प्रत्येक नमूने में मापा ब्याज के प्रोटीन के स्तर को सामान्य करने के लिए कुल प्रोटीन लोडिंग नियंत्रण का उपयोग करता है। यह लोडिंग नियंत्रण के रूप में हाउसकीपिंग प्रोटीन का उपयोग करने के दो नुकसान से बचा जाता है: संतृप्त इम्यूनोडेटेक्शन और कुछ प्रायोगिक परिस्थितियों में नमूनों के बीच असंगत हाउसकीपिंग प्रोटीन अभिव्यक्ति का स्तर। हाउसकीपिंग के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी के साथ अलग करना और पुनर्प्राण कदम अब आवश्यक नहीं है। दाग मुक्त तकनीक का उपयोग करके, कुल प्रोटीन माप के लिए कूमासी या सिप्रो रूबी जैसे दागों के साथ दाग और दाग को दागने की कोई आवश्यकता नहीं है। इमेज लैब सॉफ्टवेयर का उपयोग करके कुल प्रोटीन सामान्यीकरण करने के लिए एक दाग छवि प्राप्त करने में कुछ सेकंड लगते हैं और लगभग 5 मिनट।

दूसरा, V3 कार्यप्रवाह वैज्ञानिकों को पश्चिमी प्रक्रिया का बेहतर नियंत्रण लेने की अनुमति देता है क्योंकि यह प्रक्रिया को अधिक पारदर्शी बनाता है और गुणवत्ता नियंत्रण के लिए कई चौकियों का परिचय देता है । दाग मुक्त तकनीक की मदद से शोधकर्ता जेल और दाग दोनों पर अपने प्रोटीन के नमूनों की कल्पना कर सकते हैं । वैज्ञानिक प्रोटीन नमूना अखंडता (अपमानित या नहीं), जुदाई गुणवत्ता (उपजी या नहीं), हस्तांतरण दक्षता और हस्तांतरण गुणवत्ता (यहां तक कि हस्तांतरण या नहीं) का आकलन कर सकते हैं । ये चौकियां इस प्रक्रिया में बड़ी खामियों को देखते समय शोधों को प्रयोग समाप्त करने में मदद करती हैं और खराब नमूनों और दाग पर समय बर्बाद करने से बचते हैं। यह तकनीक वैज्ञानिकों को यह आकलन करने में भी मदद करती है कि झिल्ली अलग करने के बाद प्रोटीन की कमी हुई है या नहीं और क्या यह दाग एक अलग लक्ष्य 4को फिर से तैयार करने के लिए उपयुक्त है ।

V3 पश्चिमी कार्यप्रवाह का उपयोग करके अच्छे अनुभव और गुणवत्ता वाले डेटा को सुनिश्चित करने के लिए यहां कुछ सुझाव दिए गए हैं।

  1. जेल चलाने के तुरंत बाद जेल की छवि। प्रक्रिया में पहली इमेजिंग से पहले किसी भी बफर में जेल को भिगोएं नहीं क्योंकि यह दाग यौगिक को धो सकता है।
  2. प्रोटोकॉल में सभी छवियों को प्राप्त करने के लिए एक ही इमेजिंग क्षेत्र का उपयोग करें। यह सॉफ्टवेयर को कुल प्रोटीन सामान्यीकरण जैसे डेटा विश्लेषण के लिए छवियों को ओवरले करने की अनुमति देगा।
  3. प्रीट्रांसफर और पोस्ट-ट्रांसफर जैल इमेजिंग करते समय एक्सपोजर समय को सुसंगत रखें। इससे सॉफ्टवेयर को ट्रांसफर एफिशिएंसी को मात्रात्मक रूप से मापने का काम करने का काम होगा।
  4. दाग छवि प्राप्त करते समय झिल्ली को पानी या टीबीस्ट की कुछ बूंदों के साथ गीला रखें। यह लक्ष्य प्रोटीन का पता लगाने के लिए संभावित गंदे पृष्ठभूमि की समस्याओं से बचना होगा।
  5. मल्टीप्लेक्सिंग फ्लोरोसेंट वेस्टर्न ब्लॉटिंग के लिए कम फ्लोरोसेंट पीवीडीएफ झिल्ली का उपयोग करें।

यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि यूवी-एक्टिवेशन के बाद दाग मुक्त अणु अपरिवर्तनीय रूप से ट्राइप्टोफन अवशेषों के लिए बाध्य है। यह अपरिवर्तनीय संशोधन संभावित रूप से एंटीजन मान्यता को प्रभावित कर सकता है जब मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग करके यदि एपिटोप में ट्रिप्टोफान होता है। पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी प्रभावित होने की संभावना नहीं है क्योंकि वे एंटीजन पर कई एपिटोप को पहचानते हैं। अनबाउंड दाग मुक्त अणुओं को आसानी से जेल और झिल्ली से धोया जाता है और इसलिए एंटीबॉडी-एंटीजन इंटरैक्शन में हस्तक्षेप नहीं करेगा।

अंत में, V3 पश्चिमी कार्यप्रवाह पश्चिमी दाग प्रक्रिया को तेज, अधिक पारदर्शी, मात्रात्मक और अधिक विश्वसनीय बनाता है। शोधकर्ता अब आसानी से अपने डेटा को और अधिक भरोसेमंद बनाने के लिए एक पश्चिमी दाग प्रयोग में कुल प्रोटीन लोडिंग नियंत्रण लागू कर सकते हैं । V3 दाग मुक्त कार्यप्रवाह प्रयोगशालाओं के एक नंबर द्वारा अपनाया गया है, और उनके प्रकाशनों का प्रदर्शन किया है कि पत्रिकाओं पश्चिमी दाग22,17,7,8,5,23,18,15में लोडिंग नियंत्रण के रूप में दाग मुक्त डेटा स्वीकार करते हैं ।

Disclosures

लेखक, एंटोन पोच, जोनाथन कोह्न, केनेथ ओह, मैट हैमंड, और निंग लियू बायो रेड प्रयोगशालाओं, इंक के कर्मचारी हैं ।

Acknowledgments

लेखक डॉ वुल्फ-डाइटर स्टैल्ज, डॉ अरनॉड रेमी, डॉ एंटोन पोच, डॉ पेट्रीसिया पित्ती, टॉम डेविस, किरिस सिमोयी और जेफ डरबन को इस पांडुलिपि की आलोचनात्मक समीक्षा और संपादन के लिए धन्यवाद देते हैं । लेखक भी तकनीकी सहायता के लिए एलीसन श्वार्ट्ज का शुक्रिया अदा करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
4-20% Criterion TGX Stain-Free Precast Gel Bio-Rad 567-8093 Choose a gel size and percentage that meet the specific need in a experiment
Trans-Blot Turbo Midi PVDF Transfer Packs Bio-Rad 170-4157 Choose either PVDF or nitrocellulose and match the membrane size to the gel size
Clarity Western ECL Substrate, 500 ml Bio-Rad 170-5061
EQUIPMENT
Criterion Cell Bio-Rad 165-6100
Trans-Blot Turbo Transfer Starter System Bio-Rad 170-4155
ChemiDoc MP System Bio-Rad 170-8280

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aldridge, G. M., Podrebarac, D. M., Greenough, W. T., Weiler, I. J. The use of total protein stains as loading controls: an alternative to high-abundance single-protein controls in semi-quantitative immunoblotting. J. Neurosci. Methods. 172 (2), 250-254 (2008).
  2. Bauer, D. E., Haroutunian, V., McCullumsmith, R. E., Meador-Woodruff, J. H. Expression of four housekeeping proteins in elderly patients with schizophrenia. J. Neural. Transm. 116 (4), 487-491 (2009).
  3. Castaño, Z., Kypta, R. M. Housekeeping Proteins: Limitations as References During Neuronal Differentiation. Open Neurosci. J. 2, 36-40 (2008).
  4. Colella, A. D., Chegenii, N., Tea, M. N., Gibbins, I. L., Williams, K. A., Chataway, T. K. Comparison of Stain-Free gels with traditional immunoblot loading control methodology. Anal. Biochem. 430 (2), 108-110 (2012).
  5. Cully, T. R., Edwards, J. N., Friedrich, O., Stephenson, D. G., Murphy, R. M., Launikonis, B. S. Changes in plasma membrane Ca-ATPase and stromal interacting molecule 1 expression levels for Ca2+ signaling in dystrophic mdx mouse muscle. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 303 (5), (2012).
  6. Dittmer, A., Dittmer, J. Beta-actin is not a reliable loading control in Western blot analysis. Electrophoresis. 27 (14), 2844-2845 (2006).
  7. Dutka, T. L., Lamboley, C. R., McKenna, M. J., Murphy, R. M., Lamb, G. D. Effects of carnosine on contractile apparatus Ca2+ sensitivity and sarcoplasmic reticulum Ca2+ release in human skeletal muscle fibers. J. Appl. Physiol. 112 (5), 728-736 (2012).
  8. Elliott, S., Busse, L., Swift, S., McCaffery, I., Rossi, J., Kassner, P., Begley, C. G. Lack of expression and function of erythropoietin receptors in the kidney. Nephrol. Dial. Transplant. 27 (7), 2733-2745 (2012).
  9. Eslami, A., Lujan, J., Western, Blotting: Sample Preparation to Detection. J. Vis. Exp. (44), (2010).
  10. Ferguson, R. E., Carroll, H. P., Harris, A., Maher, E. R., Selby, P. J., Banks, R. E. Housekeeping proteins: a preliminary study illustrating some limitations as useful references in protein expression studies. Proteomics. 5 (2), 566-571 (2005).
  11. Greer, S., Honeywell, R., Geletu, M., Arulanandam, R., Raptis, L. Housekeeping genes; expression levels may change with density of cultured cells. J. Immunol. Methods. 355 (1-2), 76-79 (2010).
  12. Gürtler, A., Kunz, A., Gomolka, M., Hornhardt, S., Friedl, A. A., McDonald, K., Kohn, J. E., Posch, A. Stain-Free Technology as Normalization Tool in Western Blot Analysis. Anal. Biochem. 433 (2), 105-111 (2013).
  13. Hagiwara, M., Kobayashi, K., Tadokoro, T., Yamamoto, Y. Application of SYPRO Ruby- and Flamingo-stained polyacrylamide gels to Western blot analysis. Anal. Biochem. 397 (2), 262-264 (2010).
  14. Heidebrecht, F., Heidebrecht, A., Schulz, I., Behrens, S. E., Bader, A. Improved semiquantitative Western blot technique with increased quantification range. J. Immunol. Methods. 345 (1-2), 40-48 (2009).
  15. Jensen, R. B., Ozes, A., Kim, T., Estep, A. Kowalczykowski SC BRCA2 is epistatic to the RAD51 paralogs in response to DNA damage. DNA Repair. , (2013).
  16. Lanoix, D., St-Pierre, J., Lacasse, A. A., Viau, M., Lafond, J., Vaillancourt, C. Stability of reference proteins in human placenta: general protein stains are the benchmark. Placenta. 33 (3), 151-156 (2012).
  17. Larkins, N. T., Murphy, R. M., Lamb, G. D. Influences of temperature, oxidative stress, and phosphorylation on binding of heat shock proteins in skeletal muscle fibers. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 3 (6), (2012).
  18. Laurie, K. J., Dave, A., Straga, T., Souzeau, E., Chataway, T., Sykes, M. J., Casey, T., Teo, T., Pater, J., Craig, J. E., Sharma, S., Burdon, K. P. Identification of a Novel Oligomerization Disrupting Mutation in CRYΑA Associated with Congenital Cataract in a South Australian. , (2012).
  19. Li, X., Bai, H., Wang, X., Li, L., Cao, Y., Wei, J., Liu, Y., Liu, L., Gong, X., Wu, L., Liu, S., Liu, G. Identification and validation of rice reference proteins for western blotting. J. Exp. Bot. 62 (14), 4763-4772 (2011).
  20. Liu, N. K., Xu, X. M. Beta-tubulin is a more suitable internal control than beta-actin in western blot analysis of spinal cord tissues after traumatic injury. J. Neurotrauma. 23 (12), 1794-1801 (2006).
  21. Lowe, D. A., Degens, H., Chen, K. D., Alway, S. E. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase varies with age in glycolytic muscles of rats. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 55 (3), 160-164 (2000).
  22. Mollica, J. P., Dutka, T. L., Merry, T. L., Lamboley, C. R., McConell, G. K., McKenna, M. J., Murphy, R. M., Lamb, G. D. S-glutathionylation of troponin I (fast) increases contractile apparatus Ca2+ sensitivity in fast-twitch muscle fibres of rats and humans. J. Physiol. 590, 1443-1463 (2012).
  23. Murphy, R. M., Dutka, T. L., Horvath, D., Bell, J. R., Delbridge, L. M., Lamb, G. D. Ca2+-dependent Proteolysis of Junctophilin 1 and Junctophilin 2 in Skeletal and Cardiac. 591, 719-729 (2012).
  24. Neill, U. S. All Data are not created Equal. J. Clin. Invest. 119, 224 (2009).
  25. Pérez-Pérez, R., López, J. A., García-Santos, E., Camafeita, E., Gómez-Serrano, M., Ortega-Delgado, F. J., Ricart, W., Fernández-Real, J. M., Peral, B. Uncovering suitable reference proteins for expression studies in human adipose tissue with relevance to obesity. PLoS One. 7 (1), (2012).
  26. Rocha-Martins, M., Njaine, B., Silveira, M. S. Avoiding Pitfalls of Internal Controls: Validation of Reference Genes for Analysis by qRT-PCR and Western Blot throughout Rat Retinal Development. PLoS One. 7 (8), (2012).
  27. Romero-Calvo, I., Ocón, B., Martínez-Moya, P., Suárez, M. D., Zarzuelo, A., Martínez-Augustin, O., de Medina, F. S. Reversible Ponceau staining as a loading control alternative to actin in Western blots. Anal. Biochem. 401 (2), 318-320 (2010).
  28. Said, H. M., Polat, B., Hagemann, C., Anacker, J., Flentje, M., Vordermark, D. Absence of GAPDH regulation in tumor-cells of different origin under hypoxic conditions in-vitro. BMC Res. Notes. 13 (2), 8 (2009).
  29. Suzuki, O., Koura, M., Noguchi, Y., Uchio-Yamada, K., Matsuda, J. Use of sample mixtures for standard curve creation in quantitative western blots. Exp. Anim. 60 (2), 193-196 (2011).
  30. Welinder, C., Ekblad, L. Coomassie staining as loading control in Western blot analysis. J. Proteome Res. 10 (3), 1416-1419 (2011).
  31. You, J., Hodge, C., Wen, L., McAvoy, J. W., Madigan, M. C., Sutton, G. Using soybean trypsin inhibitor as an external loading control for Western blot analysis of tear proteins: application to corneal disease. Exp. Eye Res. 99, 55-62 (2012).

Tags

जीव विज्ञान अंक 82 जैव प्रौद्योगिकी फार्मास्यूटिकल प्रोटीन इलेक्ट्रोफोरेसिस पश्चिमी दाग दाग मुक्त लोडिंग नियंत्रण कुल प्रोटीन सामान्यीकरण दाग मुक्त प्रौद्योगिकी
पश्चिमी ब्लॉटिंग में व्यावहारिक, सुविधाजनक और विश्वसनीय कुल प्रोटीन लोडिंग नियंत्रण के लिए V3 दाग मुक्त वर्कफ़्लो
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Posch, A., Kohn, J., Oh, K.,… More

Posch, A., Kohn, J., Oh, K., Hammond, M., Liu, N. V3 Stain-free Workflow for a Practical, Convenient, and Reliable Total Protein Loading Control in Western Blotting. J. Vis. Exp. (82), e50948, doi:10.3791/50948 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter