Summary
V3ワークフローは、染色フリーゲルを使用したウェスタンブロット手順です。この染色フリー技術により、研究者はタンパク質分離の質を可視化し、転写効率を検証し、最も重要なのは、信頼性の高いローディングコントロールとしてタンパク質の総定量を使用して目的のタンパク質の変化を検証することが可能です。
Abstract
ウェスタンブロットは非常に有用で広く採用されているラボ技術ですが、その実行は困難です。実験者は、それがいくつかのステップの最後まで正常に実行されたかどうかを知らないので、ワークフローはしばしば「ブラックボックス」として特徴付けられます。さらに、ウェスタンブロットのデータの品質は、ウェスタンブロッティングプロセス全体で効果的な品質管理ツールが不足しているため、時には挑戦されます。ここでは、従来のウェスタンブロットプロトコルに関連する主要な懸念事項に対処するために、汚れのない技術を適用するV3 westernワークフローについて説明します。このワークフローは研究者を可能にする:1)約20〜30分でゲルを実行する。2)ゲルの実行後5分以内にサンプル分離品質を可視化する。3)3-10分でタンパク質を移す。4)転送効率を定量的に検証する。そして最も重要な5)総タンパク質負荷制御を使用して関心のあるタンパク質のレベルの変化を検証する。この新しいアプローチは、βアクチン、βチューブリン、GAPDHなどのハウスキーピングタンパク質のブロットを除去して再探査する必要 を排除しますV3 染色フリーワークフローは、ウェスタンブロットプロセスをより速く、透明、より定量的で信頼性の高いものにします。
Introduction
ウェスタンブロットは非常に便利な技術9ですが、ウェスタンブロッティングには長くて労働集約的なプロセスとデータの質という2つの大きな課題があります。従来のプロトコルは約2日を要します。サンプル調製、ゲルキャスティング、タンパク質電気泳動および転写、膜遮断、抗体インキュベーション、イメージング、そして非常に頻繁に剥離、再探査、および最後のデータ分析を含む多くのステップが含まれます。このプロセスを通して、プロセス制御のための信頼性と柔軟性のあるツールはありません。そのため、各ステップでエラーが発生する可能性があり、これらのエラーはデータアーティファクトを生成する可能性があります。したがって、ローディングコントロールは、エラーを識別して修正するために、ウェスタンブロッティングで不可欠です。ローディング制御は通常、各サンプルの参照タンパク質のタンパク質レベルをチェックして、それが等しく提示されているかどうかを確認することによって行われます。人々はしばしば、β-アクチン、β-tubulin、GAPDHなどのハウスキーピングタンパク質をローディングコントロールとして使用します。
ウェスタンブロットデータの品質は、信頼性の高いローディング制御に依存します。しかし、ローディングコントロールにハウスキーピングタンパク質を使用する場合には、2つの正当な懸念があります:1)ハウスキーピングタンパク質バンドの抗体ベースの免疫検出はしばしば飽和しているため、サンプル30の間の負荷の違いを区別することはできません。2)ハウスキーピングタンパク質発現量は、ある特定の実験条件下でサンプル中で変化し得るが、例えば、siRNA処理、細胞死、細胞分化、11、28、3、6、10、21などである。これらの懸念から、科学雑誌は「定量的比較のために、適切な試薬、制御および線形信号範囲を用いるイメージング法を使用すべきである」(Natureガイドライン)を要求している。同様に、臨床調査のジャーナルからの編集者は、より信頼性の高いローディングコントロール24を求めています。これらの理由から、ローディングコントロールとして使用するためにハウスキーピングタンパク質を検証する必要があります。まず、免疫検出方法14,29の線形ダイナミックレンジで測定されていることを確認する必要がある。第二に、すべてのサンプル26,31,25,19,20で一貫して表現されていることを確認する必要があります。
信頼性の高いローディング制御に代わる解決策は、ブロットからの総タンパク質測定を使用することです。一部の研究者は、クーマシー、フラミンゴピンク、シプロルビー、アミドブラック、ポンソーS、および汚れのない技術などの総タンパク質汚れでブロットを染色し、各レーンの総タンパク質シグナルをローディングコントロール16,20,13,27,1,4,12として測定しています。総タンパク質ローディング制御は、ハウスキーピングタンパク質に関連する落とし穴を回避します。まず、各サンプルに対してロードされるタンパク質の量を真に反映したものである。第2に、全タンパク質染色は、ウェスタンブロット分析のための共通のローディング範囲(複雑な細胞ライセートの10〜50μgタンパク質)において優れた線形ダイナミックレンジを示し、サンプル12間の負荷差を正確に区別する。
染色フリー技術は、アクリルアミドゲル溶液にユニークな化合物を混合し、キャストされたゲルに均等に分布する新規の全タンパク質染色法です。電気泳動が完了した後、ゲルは最低1分間UV光にさらされ、染色化合物がタンパク質中のトリプトファン残基と反応するようになる。タンパク質はUV光下で興奮し、ChemiDoc MPシステムのような染色を含まないイメージャーで視覚化および定量することができる強力な蛍光シグナルを与えます。しかし、染色を含まない化合物自体はUV光を吸収せず、ゲル画像の背景が低くなる。トリプトファン残基の修飾は不可逆的であり、タンパク質はゲルだけでなく、タンパク質の転写後いつでもブロット上で視覚化することができます。
この染色を含まない技術は、V3 Western ワークフロー (図 1)に適用され、従来のワークフローに関する主な不満、特にローディング コントロールとしてのハウスキーピングタンパク質の使用に関する懸念事項に対処します。このワークフローを使用すると、1)約20〜30分でゲルを実行し、2)ゲルラン後5分でサンプルの完全性とタンパク質分離品質をチェックすることができます。3)3-10分でタンパク質を移動します。4)転送効率を定量的に確認してください。そして5)最も重要なことは、総タンパク質負荷制御を使用して、目的のタンパク質のレベルの変化を検証する。
Protocol
1. タンパク質サンプルの準備
(細胞培養からタンパク質を抽出する一般的な手順について説明します)
- 氷の中にHeLa細胞培養皿を置き、氷冷トリス緩衝生理食酒(TBS;20 mM Tris-HCl、pH 7.5、150 mM NaCl)で細胞を洗います。
- TBSを吸引し、100mm皿の氷冷RIPAバッファー(50 mM Tris-HCl pH 8.0、150 mM NaCl、1%NP-40、0.5%デオキシコール酸ナトリウム、0.1%SDS)にホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤を加えます。
- 冷たいプラスチックセルスクレーパーを使用して、皿から接着細胞を削り取ります。細胞懸濁液を予冷したマイクロ遠心チューブにそっと移します。
- 回転器の4°Cで30分間一定の撹拌を維持する。
- 4°Cの予冷遠心分離機で20分間16,000 x gでスピンします。
- 遠心分離機からチューブをそっと取り出し、氷の上に置きます。上清を氷の上に置いた新鮮なチューブに移し、ペレットを捨てます。
- タンパク質アッセイを行うために、少量のリセート(10~20 μl)を除去します。RC DCアッセイキットを用いて、各サンプルのタンパク質濃度を決定します。
- 必要に応じて、タンパク質サンプルを-20°Cで長期保存する。 凍結と解凍サイクルを繰り返すとタンパク質の分解を引き起こし、避けるべきです。
- 各サンプルの約20 μgを取り、2xレムミリサンプルバッファー(4%SDS、10%2メルカプトエタノール、20%グリセロール、0.004%ブロモフェノールブルー、125 mM Tris-HCl、pH 6.8)の等量を加えます。
- 各細胞のライセートを95°Cのサンプルバッファーで5分間加熱します。
- マイクロ遠心分離機で16,000 x gの遠心分離機を1分間用いた。
2. 染色フリーゲルを用いたゲル電気泳動(30分)
- 基準TGX任意のKD染色フリープレキャストゲル(ミディフォーマットゲル)を取り、カセットの底から櫛とテープを取り外します。
- カセットを基準セルに入れ、統合された上部バッファーチャンバーに60 mlのランニングバッファ(25 mMトリス、190 mMグリシン、0.1%SDS、pH 8.3)を充填します。ランニングバッファで井戸をすすいします。
- 400 ml のランニングバッファを備えた下のバッファータンクの半分を、マークされた充填ラインに充填します。
- タンパク質サンプルと適切なタンパク質マーカーをロードします。
- タンクに蓋を置き、色分けされたバナナプラグを蓋の上の対応するジャックと位置合わせします。
- ゲルを200Vで~30分間、300Vで20分間動かします。
3. ケミドックMPシステムを用いた染色を含まないゲルイメージングでタンパク質分離品質を確認(~5分)
- ゲルカセットを細胞から取り出します。基準セル蓋のゲルカセット開口ツールを使用してカセットを開け、ゲルを放出します。
- ChemiDoc MPイメージャーのUVサンプルトレイの中心に水のカップルを適用します。慎重にカセットからゲルを持ち上げ、トレイの上に置きます。
- イメージラボソフトウェアを起動し、次の設定で、染色のないゲルイメージ(図1A)をキャプチャします。
用途:無染色ゲル
ゲル活性化時間:1分
イメージング領域:基準ゲル
画像露出時間:最も強烈なバンドに自動的に最適化 - サンプルトレイからゲルを取り出し、すぐに転送ステップに進みます。
4. トランスブロットターボシステムによるタンパク質の移動(10分)
- トランスブロットターボミディPVDF転送パックを開きます。転写カセットの基部に底面の積み重ね(膜を含む)を置きます。
- ゲルを膜の上に置き、上部のスタックをゲルの上に置き、泡をロールアウトします。
- カセットベースに蓋を置き、ダイヤルを回してロックします。
- カセットをブロッターベイに挿入します。
- プリセットターボプログラムを選択し、基準ゲルサイズ(MIDI)を選択して転送を開始し、RUNキーを押します。典型的な走行時間はわずか7分です。
- 転写が終わったら、ブロッティングサンドイッチを分解し、ブロットとゲルの両方を脱イオン水で容器に入れます。
5. ケミドックMPシステムを用いた染色不要ゲルおよびブロットイメージングによるタンパク質転写効率と品質の確認(~5分)
- トランスファー後ゲルをケミドック MP イメージャーのサンプルトレイに置きます。
- Image Labソフトウェアを起動し、次の設定で転写後ゲルの染色のないイメージ(図1B)をキャプチャします。
用途:無染色ゲル
ゲル活性化時間:なし
イメージング領域:基準ゲル
画像露光時間:予写ゲル画像の露光時間と同じ - サンプルトレイからゲルを取り出し、次の設定でブロット(図1C)をイメージします。イメージング時に水またはTBSTの数滴で濡れたブロットを保ちます。
アプリケーション:汚れのないブロット
イメージング領域:基準ゲル
画像露出時間:最も強烈なバンドに自動的に最適化 - サンプルトレイからブロッティング膜を取り出し、TBST(TBSで0.1%Tween 20)の容器に入れます。
6. 抗体インキュベーション
- ブロックは、1時間の部屋温度でTBSTで3%ウシ血清アルブミン(BSA)の溶液にブロットを配置することによって。
- 第1の標的タンパク質に対して上げられたマウス一次抗体およびウサギ一次抗体に対して第2の標的タンパク質に対して上昇したマウス一次抗体を含む溶液中の4°Cで一晩ブロットをインキュベートする。
- 一次抗体を含む溶液を注ぎ出す。次に、20mlのTBSTで5分間撹拌してブロットを洗います。合計 5 回の操作で 4 倍の操作を繰り返します。
- Dylight 650コンジュゲートヤギ抗マウス抗体とDylight 549共役ヤギ抗ウサギ抗体を含む二次抗体溶液中の室温で1時間インキュベート。
- 一次抗体を含む溶液を注ぎ出す。次に、20mlのTBSTで5分間撹拌してブロットを洗います。合計 5 回の操作で 4 倍の操作を繰り返します。
7. 画像実験ソフトウェアによるイメージングとデータ解析- 全タンパク質正規化(~5分)
- 新しいマルチチャンネルプロトコルを開いてブロットの蛍光画像(図1E)を多重化して取得し、3つの蛍光チャネルを設定してプロトコルを実行します。
チャンネル1:
アプリケーション:ブロットダイライト650
イメージング領域:基準ゲル
画像露出時間:最も強烈なバンドに自動的に最適化
チャンネル2:
アプリケーション:ブロットダイライト549
イメージング領域:基準ゲル
画像露出時間:最も強烈なバンドに自動的に最適化
チャンネル3:
アプリケーション:汚れのないブロット
イメージング領域:基準ゲル画像露光時間:最も強いバンドに対して自動的に最適化 - [解析] ツール ボックスの [正規化] アイコンをクリックし、[はい] をクリックして車線とバンドを検出します。
- 必要に応じて「レーンとバンド」を選択して、レーンとバンドを調整します。
- 正規化チャネルとして、染色のない画像を選択します。
- MW 解析ツールを選択し、MW 標準レーンの下にあるチェックボックスをオンにして、MW 標準レーンを割り当てます。
- 正規化されたボリュームを表示するには、ツールバーの[解析テーブル]をクリックします。すべての計算は、正規化係数と正規化されたボリュームを含むソフトウェアによって自動的に実行されます。ターゲットタンパク質バンド強度値は、タンパク質負荷の変動に合わせて調整されるようになりました。これにより、サンプル間の標的タンパク質の正確な比較が可能になります。
Representative Results
1. 染色を含まないゲル画像を用いたサンプルの完全性、タンパク質分離品質、および転写効率の評価。
HeLa細胞からのタンパク質抽出物を、18ウェル基準AnyKD TGX染色フリーゲルで20分間300Vで分離した。タンパク質サンプルは、4つの異なる量(レーン1-3、40 μg)で3倍にロードされました。レーン 4-6, 30 μg;レーン7-9、20 μg;レーン10-12、10 μg)。このゲルを1分間UV光下で活性化した 図2A は、タンパク質分離直後に取得したゲル画像を示す。タンパク質サンプルの完全性(例えば 分解)および分離品質(例えば タンパク質沈殿)は、このゲル画像で視覚的に評価することができる。その後、トランスブロットターボを用いてニトロセルロース膜に7分間タンパク質を移した。 図2B は転写後ゲルの染色を含まない画像を示す。両方の画像は、同じ露光時間(6.8秒)で取得されました。レーン3および12は、転写効率を測定するために選択した。イメージ ラボ ソフトウェアのボリューム ツールを使用して、両方のゲル イメージのレーン 3 と 12 をカバーするために長方形のボックス (青) を描きました。これらのボックスからの体積値に基づく計算は、両方の車線の転送効率が80%であることを示した(図2C)。この実験では、中小の標的タンパク質を研究するためにAnyKD TGXゲルを選択し、大きなタンパク質の転写に最適化されませんでした。転写効率を最適化するには、より低いパーセントゲル(例えば 4-20%)の使用が必要です大きなタンパク質の転写を容易にする転送時間の調整および/または調整。2.染色フリーの全タンパク質ローディングコントロールは、対象タンパク質のレベルの小さな変化を定量化するために、ウェスタンブロッティングにおけるハウスキーピングローディングコントロールに代わる信頼性の高い代替手段です。
MCM-7は、照射処理後のリンパ芽球細胞株(LCL)で20〜50%減少するレベルのDNAライセンス複製因子である。この実験では、4つの対照および照射処理されたリンパ芽球細胞株(LCL)培養液のライセート(それぞれ30μg)を、12ウェル基準AnyKD TGX染色フリーゲルで分離した。このゲルをUV光下で1分間活性化し、トランスブロットターボでPVDF膜に移して免疫ブロッティングを行った。ハウスキーピングタンパク質GAPDH(緑色)をウサギ抗体(米国細胞シグナリング技術、1:2,500)とダイライト549コンジュゲートヤギ抗ウサギ抗体(ロックランド、米国、1:20,000)でプローブしました。目的のMCM-7(赤)のタンパク質をマウス抗体(米国、1:1000)およびダイライト649共役ヤギ抗マウス抗体(ロックランド、1:10,000)を用いてプローブした。
図3A は、LCLサンプルの4つの制御および照射処理で検出された総タンパク質(青色)、MCM-7(赤)およびGAPDH(緑色)の多重蛍光像を示す。 図3B は、各試料(30μg)における全タンパク質パターンを示す同じブロットの染色を含まない画像である。画像ラボソフトウェアは、各レーンのMCM-7、GAPDH、および総タンパク質量を測定するためにサンプルレーン(青いボックス)を選択しました。MCM-7レベルを、染色を含まない全タンパク質測定またはGAPDHに対して正規化した。正規化されたMCM-7タンパク質レベルを統計的に分析し、MCM-7タンパク質バンドの平均容量と標準偏差(n=4)をチャートに示した(図3C)。両方の正規化方法は、小さな減少を明らかにしました (約 25%)照射処理後のMCM-7タンパク質レベルで。総タンパク質正規化を有するデータは、負荷制御としてGAPDHを用いたデータよりも標準偏差が小さくなった。
図 1.V3ウェスタンワークフロー。 V3 ワークフローは、4 つの手順の左側の列に示されています。ワークフローで使用される主要な計測器と試薬は、各ステップで示されています。各ステップの推定時間も含まれます。右の列は、V3 ワークフローで最低 4 つのイメージを生成できることを示しています。各データの使用について説明します。前転写ゲル、転写後ゲル、およびブロット(A、B、C)の染色を含まない画像は、従来のウェスタンブロッティング技術では容易に生成できません。これらの画像とデータは、科学者のコントロールとウェスタンブロットワークフローの再現性を向上させるための手順に沿った重要な情報とチェックポイントを提供します。この標的タンパク質シグナルは、検出にHRP結合二次抗体を適用した場合は化学発光ブロット画像(D)、または蛍光ブロット画像(E)に多重化蛍光性ウェスタンブロット法を実施し、同じブロット上で同時に複数の標的タンパク質を検出した場合に、いずれも捕捉することができる。
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図 2.V3 Western ワークフローの前移送ゲルおよび転写後ゲルの染色を含まない画像で、サンプルの完全性、分離品質、および転送効率を評価します。(A)事前転写ゲル染色フリー画像。(B)転写後ゲル染色不要画像。(C)タンパク質の移動効率測定。
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図 3.対象タンパク質のレベルを正常化するための負荷制御として、GAPDH免疫検出との染色を含まない全タンパク質測定を比較する。(A)蛍光ウェスタンブロット画像。(B)汚れのないブロット画像。(C) 正規化 MCM-7 タンパク質レベル.
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Discussion
上記のV3染色フリープロトコルは、蛍光ウェスタンブロッティングを多重化するためのものである。また、化学発光検出を用いたウェスタンブロッティングにも適用できる。多重蛍光ウェスタンブロットプロトコルでは、染色のないブロット画像は、2つの時点で取得されます:1)タンパク質の転写直後。2)抗体インキュベーション後の多重蛍光イメージング工程で。第1の染色自由画像は、転写効率を計算するために使用され、第2の染色自由画像は、負荷制御として使用される。化学発光法を適用すると、染色無発光シグナルも染色フリーチャネルに現れるため、染色フリーおよびターゲットタンパク質シグナルの多重化画像を撮ることは不可能です。この場合、タンパク質転写工程直後に撮影した染色のない画像を、ローディング制御および正規化解析に使用することを推奨します。
V3 western ワークフローは、ロード制御としてハウスキーピングタンパク質を使用する従来のウェスタン ブロット ワークフローと比較して、次のような独自の利点を提供します。
まず、V3ワークフローは、実用的で便利で信頼性の高いローディング制御を提供し、目的のタンパク質のレベルの変化を検証します。V3プロトコルは、各サンプルで測定された対象タンパク質のレベルを正規化するために、総タンパク質負荷制御を使用します。これは、ローディングコントロールとしてハウスキーピングタンパク質を使用する2つの落とし穴を回避します: 飽和免疫検出と特定の実験条件下でのサンプル間の一貫性のないハウスキーピングタンパク質の発現レベル。ハウスキーピングに対する抗体を用いたストリッピングとリプロブステップは不要になりました。染色フリー技術を使用すると、タンパク質の全測定にクーマシーやシプロルビーなどの汚れでブロットを汚して脱染色する必要はありません。イメージラボソフトウェアを使用して全タンパク質の正規化を行うには、ブロット画像を取得するのにわずか数秒、約5分かかります。
第二に、V3ワークフローは、手順をより透明にし、品質管理のためのいくつかのチェックポイントを導入するので、科学者が西洋の手順のより良い制御を取ることを可能にします。染色フリー技術の助けを借りて、研究者はゲルとブロットの両方でタンパク質サンプルを視覚化することができます。科学者は、タンパク質サンプルの完全性(分解されたかどうか)、分離品質(沈殿または沈殿しない)、伝達効率と転送品質(転送または転送しない)を評価することができます。これらのチェックポイントは、研究がプロセスに大きな欠陥を見たときに実験を終了し、貧弱なサンプルやブロットに時間を無駄にしないようにするのに役立ちます。この技術はまた、科学者が膜剥離後にかなりの量のタンパク質損失があるかどうか、およびブロットが別の標的 4を再探査するのに適しているかどうかを評価するのに役立ちます。
ここでは、V3 Western ワークフローを使用して優れたエクスペリエンスと品質データを確保するためのヒントをいくつか紹介します。
- ゲルを実行した直後にゲルをイメージします。汚れ化合物を洗い流す可能性があるため、手順の最初のイメージングの前にゲルを任意のバッファーに浸漬しないでください。
- 同じイメージング領域を使用して、プロトコル内のすべてのイメージを取得します。これにより、ソフトウェアは、総タンパク質正規化などのデータ分析のための画像をオーバーレイすることができます。
- 事前転写ゲルと転写後ゲルを撮像する際の露光時間を一貫して保ちます。これにより、ソフトウェアは転送効率を定量的に測定できます。
- ブロット画像を取得する際には、数滴の水またはTBSTで膜を濡らしてください。これにより、標的タンパク質検出に関する汚れた背景の問題を回避できます。
- 蛍光性ウェスタンブロッティングの多重化には低蛍光PVDF膜を使用してください。
UV活性化後の染色を含まない分子はトリプトファン残基に不可逆的に結合することに注意することが重要である。この不可逆的な修飾は、エピトープにトリプトファンが含まれている場合、モノクローナル抗体を使用する場合に抗原認識に影響を与える可能性があります。ポリクローナル抗体は、抗原上の複数のエピトープを認識するため、影響を受ける可能性は低い。結合されていない染色を含まない分子は、ゲルや膜から容易に洗い流されるため、抗体と抗原の相互作用を妨げない。
結論として、V3 Westernワークフローは、ウェスタンブロットプロセスをより速く、より透明で、定量的で信頼性が高くなります。研究者は、ウェスタンブロット実験で総タンパク質負荷制御を簡単に適用して、データをより信頼できるようにすることができます。V3染色フリーのワークフローは、多くのラボで採用されており、その出版物は、ジャーナルがウェスタンブロット22,17,7,8,5,23,18,15のローディング制御として汚れのないデータを受け入れることを実証しています。
Disclosures
著者のアントン・ポッシュ、ジョナサン・コーン、ケネス・オー、マット・ハモンド、寧劉はバイオ・ラッド・ラボラトリーズ社の従業員です。
Acknowledgments
著者らは、ウルフ・ディーター・スターツ博士、アルノー・レミー博士、アントン・ポッシュ博士、パトリシア・ピアッティ博士、トム・デイヴィス、クリス・シモニー、ジェフ・ダーバンがこの原稿の批判的なレビューと編集に感謝しています。著者らはまた、アリソン・シュワルツの技術サポートに感謝しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| 4-20% Criterion TGX Stain-Free Precast Gel | Bio-Rad | 567-8093 | Choose a gel size and percentage that meet the specific need in a experiment |
| Trans-Blot Turbo Midi PVDF Transfer Packs | Bio-Rad | 170-4157 | Choose either PVDF or nitrocellulose and match the membrane size to the gel size |
| Clarity Western ECL Substrate, 500 ml | Bio-Rad | 170-5061 | |
| EQUIPMENT | |||
| Criterion Cell | Bio-Rad | 165-6100 | |
| Trans-Blot Turbo Transfer Starter System | Bio-Rad | 170-4155 | |
| ChemiDoc MP System | Bio-Rad | 170-8280 | |
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