Abstract
ستروما عنصرا أساسيا من بنية العقدة الليمفاوية وظيفة. ومع ذلك، لا يعرف إلا القليل عن أصله، وتكوين الخلوية الدقيقة والآليات التي تنظم تشكيلها. يتم تغليف الغدد الليمفاوية دائما في الأنسجة الدهنية، ونحن في الآونة الأخيرة أظهرت أهمية هذه العلاقة لتشكيل العقدة الليمفاوية سدى. خلايا خلية شحمية السلائف تهاجر إلى العقدة الليمفاوية أثناء تطوره وعلى إشراك سم لمفي، ب مستقبلات إيقاف تكون الشحم وتفرق في الخلايا اللحمية اللمفاوية (Bénézech وآخرون 14). استنادا إلى إمكانات سدى اللمفاوية من الأنسجة الدهنية، ونحن نقدم وسيلة باستخدام الليمفاوية عقدة / الدهون وسادة الوهم الذي يسمح بتعقب نسب الليمفاوية عقدة اللحمية السلائف الخلية. وتبين لنا كيفية عزل الغدد الليمفاوية الوليد وEYFP + الأنسجة الدهنية الجنينية وجعل LN / EYFP + الدهون وسادة الوهم. بعد نقل تحت كبسولة الكلى على فأرة الحاسوب المضيف،يتضمن العقدة الليمفاوية خلايا السلائف الأنسجة الدهنية المحلية وانتهاء تشكيلها. تحليل ذرية EYFP + لوحة الخلايا الدهنية في الغدد الليمفاوية مما يؤدي لا يمكن أن يؤديها من خلال تحليل تدفق cytometric من الغدد الليمفاوية هضم إنزيمي أو عن طريق التحليل المناعي من الغدد الليمفاوية cryosections. باستخدام منصات الدهون من نماذج مختلفة بالضربة القاضية الماوس، سوف توفر هذه الطريقة وسيلة فعالة لتحليل أصل العقدة الليمفاوية مختلف السكان الخلية اللحمية.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
50 mm Sterilin Petri Dish | Appleton Woods | SC265 | |
90 mm Sterilin Petri Dish | Appleton Woods | SC260 | |
Adhesive slides | Surgipath | 00202 | |
Anti-mouse CD31 eFluor 450 | eBioscience | 48-0311 | |
Anti-mouse CD4 Alexa 647 | eBioscience | 51-0041 | |
Anti-mouse CD45 PerCP-Cy5.5 | eBioscience | 45-0451 | |
Anti-mouse IgM Rhodamine Red | Stratech | 715-296-020-JIR | |
Anti-mouse Podoplanin PE/Cy7 | Biolegend | 127411 | |
Anti-mouse Podoplanin purified | eBioscience | 14-5381 | |
Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
DMEM Medium | Sigma | D5671 | |
DNase I | Sigma | DN25-1G | |
Dumont #5 Forceps Inox Biologie | FST | 11252-20 | Extra fine forceps for embryonic and newborn dissections |
EDTA solution 0.5 M | Sigma | E7889 | |
ERTR-7 | Biogenesis | ||
Fetal bovine serum | Sigma | F9665 | |
Hardened fine iris scissors straight 11 cm | FST | 14090-11 | Small scissors for dissection |
HEPES solution | Sigma | H0887 | |
Isopore Membrane Filters 0.8 μm ATTP | Millipore | ATTPO 1300 | |
L-Glutamine solution | Sigma | G7513 | |
MEM Nonessential Amino Acid Solution (100x) | Sigma | M7145 | |
O.C.T. Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4458 | |
Plastic box with lid | Watkins and Doncaster | E6052 | Sandwich box for in vitro organ culture. Drill two holes in the lid to allow gas exchange in the CO2 incubator. |
RPMI 1640 Medium | Sigma | R0883 | |
Sponges Vulkan Underwrap | Patterson Medical | 004383 | |
Stereomicroscope | Leica | LEICA MZ95 | Dissecting microscope with zoom |
Thermomixer | Eppendorf | 5436 | |
Vectashield Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 |
References
- Mueller, S. N., Germain, R. N. Stromal cell contributions to the homeostasis and functionality of the immune system. Nat. Rev. Immunol. 9, 618-629 (2009).
- Roozendaal, R., Mebius, R. E. Stromal cell-immune cell interactions. Annu. Rev. Immunol. 29, 23-43 (2011).
- Turley, S. J., Fletcher, A. L., Elpek, K. G. The stromal and haematopoietic antigen-presenting cells that reside in secondary lymphoid organs. Nat. Rev. Immunol. 10, 813-825 (2010).
- Katakai, T., et al. Organizer-like reticular stromal cell layer common to adult secondary lymphoid organs. J. Immunol. 181, 6189-6200 (2008).
- Link, A., et al. Fibroblastic reticular cells in lymph nodes regulate the homeostasis of naive T cells. Nat. Immunol. 8, 1255-1265 (2007).
- Benezech, C., et al. Ontogeny of stromal organizer cells during lymph node development. J. Immunol. 184, 4521-4530 (2010).
- Cupedo, T., et al. Presumptive lymph node organizers are differentially represented in developing mesenteric and peripheral nodes. J. Immunol. 173, 2968-2975 (2004).
- Avan de Pavert, S., Mebius, R. E. New insights into the development of lymphoid tissues. Nat. Rev. Immunol. 10, 664-674 (2010).
- Vondenhoff, M. F., et al. LTbetaR signaling induces cytokine expression and up-regulates lymphangiogenic factors in lymph node anlagen. J. Immunol. 182, 5439-5445 (2009).
- Dougall, W. C., et al. RANK is essential for osteoclast and lymph node development. Genes Dev. 13, 2412-2424 (1999).
- Kim, D., et al. Regulation of peripheral lymph node genesis by the tumor necrosis factor family member TRANCE. J. Exp. Med. 192, 1467-1478 (2000).
- Carragher, D., et al. A stroma-derived defect in NF-kappaB2-/- mice causes impaired lymph node development and lymphocyte recruitment. J. Immunol. 173, 2271-2279 (2004).
- White, A., et al. Lymphotoxin a-dependent and -independent signals regulate stromal organizer cell homeostasis during lymph node organogenesis. Blood. 110, 1950-1959 (2007).
- Benezech, C., et al. Lymphotoxin-beta receptor signaling through NF-kappaB2-RelB pathway reprograms adipocyte precursors as lymph node stromal cells. Immunity. 37, 721-734 (2012).
- Anderson, G., Jenkinson, E. J., Moore, N. C., Owen, J. J. MHC class II-positive epithelium and mesenchyme cells are both required for T-cell development in the thymus. Nature. 362, 70-73 (1993).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Transplantation of pancreatic islets into the kidney capsule of diabetic mice. J. Vis. Exp. (9), e404 (2007).
- Krautler, N. J., et al. Follicular dendritic cells emerge from ubiquitous perivascular precursors. Cell. 150, 194-206 (2012).