Summary
유전자 타겟팅 도구의 최근 발전은 녹아웃의 생산 (KO) 토끼가 가능하게한다. 본 연구에서는 아연 핑거 뉴 클레아 제 (ZFN)를 사용하여 다섯 아포 지질 단백질 (아포) C-III KO 토끼를 생성합니다. 이 작품은 ZFN은 KO 토끼를 생산하는 매우 효율적인 방법이라고 설명했다.
Abstract
아포지 단백질 (아포) C-III (ApoCIII)는 플라즈마 카이로 미크론 (CM)의 표면에 초 저밀도 지단백질 (VLDL) 및 고밀도 지단백질 (HDL)을 상주. 그것은 인식 된 심장 혈관 질환에 대한 플라즈마 ApoCIII의 constitutea 위험 인자 (CVD)의 높은 수준. 상승 된 혈장 ApoCIII 레벨은 종종 인슐린 내성, 비만, 고 중성 지방 혈증 및과 상관. 그러나,이 마우스에서 지방 단백질의 대사는 많은 측면에서 인간의 다른 지적되고 ApoCIIIin 지질 대사와 CVD의 역할에 대한 귀중한 지식 ApoCIII 녹아웃 (KO) 마우스 등의 유전자 변형 마우스 모델에서 얻은되었습니다. 그것은 지금 상승 플라즈마 ApoCIII 직접 동맥 경화 여부까지 알 수 없습니다. 우리는 토끼는 인간의 지질 대사 및 동맥 경화증을 공부 reasonablemodelfor 역할을 할 수있는 가설에 기초하여 본 연구에서 ApoCIII KO 토끼를 개발했다. 징크 핑거 뉴 클레아 제 (ZFN) 세트 대상 토끼 AP 통신oCIIIgene 전에 배아 미세 주입에 체외 검증을 실시 하였다. mRNA의 35 토끼 전핵 단계의 배아의 세포질에 주입하고, 배반포 상태의 변이 속도를 평가 하였다. 분석 하였다 십육 배반포, 표적 부위에서 만족 50 % 돌연변이율 (8 / 16)가 생체 내 실험을위한 한 세트의 이용을 지원하고, 달성 하였다. 다음으로, 우리는 세트 1의 mRNA 145 배아를 미세 주입하고, 7받는 사람 토끼 이러한 배아를 전송. 30 일 임신 후 21 키트는 다섯이 PCR 염기 서열 분석 후 ApoCIII KO 토끼로 확인되었다 밖으로있는, 태어났다. KO 동물 속도는 (# KO 키트 / 전체 출생) 23.8 %였다. 전체적인 생산 효율 (5 kits/145 배아 전사) 6.8 %이다. 본 작품은 ZFN은 KO 토끼를 생산하는 매우 효율적인 방법이라고 설명했다. 이 ApoCIII KO 토끼는 지질 대사에 ApoCIII의 역할을 연구하는 새로운 자원입니다.
Introduction
아포 지단백 (아포) C-III (ApoCIII)은 간과 소장에서 주로 합성되는 작은 O-당화 분비 단백질이다. 그것은, 플라즈마 카이로 미크론 (CM)의 표면에 초 저밀도 지단백질 (VLDL) 및 고밀도 지단백질 (HDL)을 상주. ApoCIII 심혈관 질환 1의 위험 인자로 인식되고있다. ApoCIII의 유전 적 결함을 가진 환자는 낮은 혈장 중성 지방 (TG) 수치 감소 무증상 관상 동맥 죽상 경화증 2,3있다. 상승 된 혈장 ApoCIII 레벨은, 반면에, 종종 인슐린 내성, 비만, 고 중성 지방 혈증 및 (HTG) 4,5과 상관.
유전자 녹아웃 (KO)는 유전자의 기능을 연구 할 수있는 강력한 수단이다. 인간의 돌연변이 집단의 관찰과 일치, 생쥐의 ApoCIII 유전자의 녹아웃은 플라즈마 TG의 감소와 식후 HTG 6으로부터 보호되었다. ApoCIII의 이러한 긍정적 인 역할 등장아포과 ApoCIII 모두의 결핍 생쥐도 식후 고지혈증 7에서 보호 될 때, 아포 지질 단백질 E (아포) 독립적이어야합니다. 이러한 ApoCIII KO 마우스 모델은 인간의 ApoCIII의 가능한 기능에 대한 귀중한 정보를 제공하고 있지만, 그것은 쥐의 지방 단백질의 신진 대사가 여러 측면에서 인간의 그것과 다르다는 것을 알 수있다. 예를 들어, 마우스 혈장 콜레 스테 릴 에스테르 전달 단백질 (CETP), VLDL, LDL의 수송에 관련된 주요 효소 및 HDL 8 부족하다. 따라서, 상기 생체 ApoCIII의 생리적 역할을 이해하기 위하여 적절한 동물 모델을 개발하는 것이 필요하다.
토끼는 클래식 모델 동물 종 9-11입니다. 그것은 짧은 임신 기간 (30-31일), 대형 쓰레기의 크기 (4-12/litter)가 실내 시설에서 편리하게 수납 할 수 있습니다. 마우스에 비해, 토끼 인간 10 계통 발생 학적으로 더 가깝다. 중요한 것은, 같은 HU남자는하지만, 마우스와 달리, 토끼는 LDL이 풍부한 포유류 및 CETP (10, 12)의 상당한 수준을 가지고. 게다가, 그들은 인간 아테롬 13에서 본 것과 유사한 병변 콜레스테롤이 풍부한식이 유도 아테롬에 민감하다. 이러한 이유로, 우리는 ApoCIII KO 토끼는 인간의 지질 대사 및 동맥 경화에 ApoCIIIplay의 역할을 조사하기 위해 자신의 마우스에 비해 더 나은 모델이 될 수 있다는 가설을 세웠다.
유전자의 생산 (GTT) 토끼가 도전을했습니다 유전자를 대상으로. 이는 배아 줄기 세포 (ESC)를 전송하는 생식 세포의 부족, 그리고 토끼의 체세포 핵 이식 (SCNT)의 매우 낮은 효율에 주로 기인한다. 및 SCNT가 성공적으로 돼지, 양, 소,하지만 토끼 등의 생식 전송 줄이고 ESCs를, 부족한 종에 KO 동물을 생성하기 위해 적용된 반면 ESC는 GTT 마우스를 생성하는 기본 도구입니다. 최근 아연 핑거 뉴 클레아 제 (ZFN), 트란scription 활성제 - 드 이펙터 클레아 제 (TALEN) (14), 및 RNA 유도 효소 (RGEN) (15)는 게놈 편집을위한 강력한 수단을 나왔다. 그래서 "분자 가위"라는이 클레아는 대상 유전자의 기능 KO로 이어질 나있는 게놈의 특정 현장에서 DNA 시퀀스를 통합 할 수있는 게놈에있는 이중 가닥 휴식 (DSB)를 생성하는 효율적인 종 (16)의 수. 2011 년, ZFN 기술을 적응 첫번째의 사이에서, 우리는 SCNT 17 일이 세포를 사용한 후이 방법을 성공적으로 생성 된 PPARγ KO 돼지를 통해 페 록시 솜 증식 자 활성화 수용체 감마 (PPARγ) KO의 돼지 세포를 생성합니다. 같은 해, 효율적인 면역 글로불린 유전자의 중단도 ZFN을 사용하여 토끼를 대상으로 교체가 18보고되었다.
(그림 1 참조 ZFN 세트를 사용하여, PCR 시퀀싱에 의해 확인 된 본 연구에서는 다섯 ApoCIII KO 토끼는 생성 된
Protocol
모든 동물의 유지 보수, 관리 및 사용 절차는 미시간 대학의 동물의 사용 및 관리에 대한 검토 및 대학위원회에 의해 승인되었다.
1. ZFN 디자인하고
- 제조 업체에 관심의 유전자 (예를 들어 토끼 ApoCIII)의 게놈 서열 정보를 제공합니다. ZFN 점수에 따라 실험을 위해 ZFN 세트 (들)을 선택합니다.
2. 토끼 배아 컬렉션
- Superovulate 성적 (6-18개월) 성숙 뉴질랜드 화이트 (NZW) 처음 두 주사, 다음 두 주사 6 밀리그램 5 밀리그램 3 밀리그램의 복용량과 난포 자극 호르몬 (FSH)의 피하 (SC) 주사 회 / 일까지 여성 토끼 지난 주사에 대한.
- 배란을 유도하는 최초의 난포 자극 호르몬 주사 후 72 시간에서 200 IU hCG의 단일 정맥 주사 (IV) 주사를 관리. 바로 hCG의 주입 후 남성 토끼 교배 여성 메이트.
- Euthani'제 펜 토바 비탈 나트륨과 교배 기증자 토끼 (150 ㎎ / kg, IV) 16 ~ 18 시간 포스트 인공 수정 (PSI)에.
- 조심스럽게 전체 난관과 난소 구조를 수집하여 난관 ampullae을 복구 할 수 있습니다.
- HEPES 10 ㎖ 조작 배지로 각각 수란관 플러시 TCM 199 수란관의 자궁 단부로부터 매체를 주입하여, 10 % 소 태아 혈청이 보충 된 버퍼링. 페트리 접시에 난관의 난소 엔드 오프닝에서 플러시 매체를 수집합니다.
- 관찰하고, 플러시 매체에 복구 된 배아를 식별하는 조작 매체에 배아를 세 번 씻어, 공기 38.5 ° C에서 조작 매체에 보관하고, 수정의 발생에 대한 실체 현미경을 관찰합니다. 전핵 단계의 배아에 미세 주입을위한 준비 19 ~ 21 시간 PSI
3. ZFN의 mRNA의 준비
- RNase가없는 0.1X TE (1 mM 트리스로-C1 pH의 재 부상하기 전에 생성 된 mRNA의 정화8.0, 0.1 mM의 EDTA). 농도를 측정하고 사용할 때까지 -80 ° C에서의 mRNA를 저장합니다.
- 10 ㎕의 작은 유리 병에 ZFN 쌍 (산도 7.5에서 1 mMTris로-C1, 0.1 mM의 EDTA에 4-10 NG / μL), 나누어지는 인코딩의 mRNA를 준비합니다. 사용 준비가 될 때까지 -80 º C에서 보관하십시오. 미세 주입하기 전에 RNA 유리 병 (들)을 해동하고, 얼음에 보관.
4. 배아 미세 주입
- 제거 미디어 챔버가 1 잘 챔버 슬라이드 조작 매체의 5 μL 드롭을 배치하여 미세 주입 플랫폼을 준비합니다. 가열 현미경 단계에 미네랄 오일과 장소와 매체 드롭을 커버.
- 미세 조작기의 홀더 팔에 들고 피펫 (120 μm의 직경)를 배치하고 조작 매체의 드롭에 위치.
- 마이크로 피펫 끌어 당기는 장치에 붕규산 유리 모세관 튜브를 가열 당겨 주입 마이크로 피펫을 제작합니다. 주입 피펫으로 주입되는 mRNA를 넣습니다.
- microinjector에 연결되어있는 압축 공기 공급 장치의 전원을 켭니다.
- 조작 매체의 드롭에 미세 조작기와 위치를에 넣어 주입 홀더에 주입 피펫을 놓습니다.
- 설치 다음과 같은 제안 매개 변수를 사용하여 microinjector : holdP = 2 PSI, InjP = 20 PSI, ClearP = 60 PSI, 1-5 (PL)의 주입 부피가 발생합니다 Injtime = 1 초.
- 부드럽게 고정 용 피펫에 대해 그것을 감청하여 주입 피펫의 팁을 엽니 다.
- 플랫폼의 미세 조작 드롭에 배아 (30 ~ 50)를 전송합니다. 배아를 캡처하고 주사 바늘, 배아 및 x-축을 따라 홀딩 피펫을 정렬하는 홀딩 피펫을 사용한다.
- 400 배 배율에서 배아를 주입 피펫을 진행. 핵 않도록주의하십시오. 세포막을 관통되면, 눌러 발 페달을 주입한다. 주사 후, 바늘을 철회 배아를 놓습니다. 나머지 그들에 대한 과정을 반복합니다bryos.
- 비 필수 아미노산 (NEAA), 필수 아미노산 (EAA), 1 ㎜의 L-글루타민, 0.4 mM의 피루브산 나트륨, 10 %로 보충 얼의 균형 소금 용액 (EBSS)로 구성 배아 배양액에 주입 배아 세 번 씻으 FBS.
- 그들은 수술 동기화 된받는 여성 NZW 토끼 (단계 5.1 참조)의 난관에 전송하기 전에 1 ~ 2 시간 동안 공기 중 5 % CO 2에서 38.5 ° C에서 배아를 품어. 그들은 체외 유효성 검사 또는 분석에 사용되기 전에 다른 방법으로, 문화 배아들은 배반포 단계에 도달 할 때까지.
5. 배아 전송
- 약 무게 건강에 5~12개월 된 여성 NZW 토끼를 선택합니다. 받는 사람 동물로 4.0-5.0 kg. 생식샘 자극 (단계 2.2 참조) 공여체 동물 발 행 hCG의 주입의 것과 동일한 시점에서 수신자에게 호르몬 (GnRH에) 주입 근육 내 (IM, 50의 mcg / ㎖, 0.3 ㎖ / 동물)을 떼면 관리. 미세 주입을 완료 한 후, 배아 전송 (성선 자극 호르몬 방출 호르몬 주사 후 일반적으로 16 ~ 24 시간)에 대한받는 사람 토끼를 준비합니다. 10 ~ 40 ㎎ / kg 케타민 (IM)과 토끼를 마취 및 / 또는 증발 이소 플루 란 (2-4 %) 흡입에 의한. 멸균 안과 연고의 응용 프로그램에서 과도한 건조 토끼의 눈을 보호합니다. 그것은 즉, 완전히 의식이 될 때까지 동물을 관찰한다. 발 패드는 적절한 마취의 표시입니다 페달 반사의 부족을 확인하는 데 사용됩니다 압박, 페달 반사에 응답하지 않습니다.
- 토끼의 복부를 면도, 소독액 다음, 살균 스크럽, 세척 및 멸균 거즈 스폰지와 면도 영역을 닦습니다.
- 무균 조건 하에서 수술을 시행, 수술 전반에 걸쳐받는 사람 토끼마다 약 15 분의 생체 신호를 기록한다.
- 배아의 사용 가능한 수에 따라받는 사람의 동물에 10-25 배아를 전송합니다.
- 끝에수술 절차는 코팅 흡수성 봉합사와 근육층을 닫는다. 흡수성 봉합사를 사용하여 봉합 subcuticular 하나 또는 nonabsorable 봉합 (예를 들어, 모노 필라멘트 나일론 또는 유사)를 사용하여 간단한 중단 피부 봉합사로 피부를 봉합.
- 동물을 따뜻하게 유지 및 흉골 드러 누움이 달성 될 때까지 모니터링합니다.
- 매일 동물을 모니터링합니다. 동물 돌보는 수의사의 지시를 따릅니다. 통증을 완화 및 / 또는 수의사에 의해 필요한 결정하면 발열 매일 게시 작업을 줄이기 위해 멜 록시 캄 (SC 1.0 ㎎ / ㎏)을 관리 할 수 있습니다.
- 대략 10-14 일 게시 작업에 nonabsorable 피부 봉합사를 제거합니다.
6. ZFN 유도 유전자 중단의 검출
- 체외 검증의 경우, 체외 배양 된 배아에 유전자형을 수행합니다. 5 μL의 NP40 용액 (1 % NP40 + 1 UG에 morula / 배반포 단계로 개발 / ㎖의 Taq 버퍼에 테 K를 Lyse 개별 배아) 55 ° C에서 0.5 시간, 95 ℃에서 10 분 동안
- 자손의 유전자형를 들어, 신생아 키트에서 귀 피부 샘플을 수집 게놈 DNA를 추출하고 PCR 시퀀싱을위한 템플릿으로 사용합니다. 출혈을 멈추게과 불편을 줄이기 위해 수집 한 후 샘플링 영역에 KWIK 스톱을 적용합니다.
- LA-DNA 형성 촉매 및 ZFN 대상 사이트의 상류에 위치 (5'-TGAGGCCGGGAAGGGAGCAGTCG-3 ')와 (5'-GCCAGGCCCACCCACGGAACAGC-3 하류')하는 PCR 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을위한 템플릿으로 단계 6.2 또는 6.3에서 용해를 사용 .
- PCR 제품을 정화하고 시퀀싱 프라이머 (5'-TCTGCACGCTTGGGGCTGGAG-3 ')로 시퀀스.
- 타겟팅 사이트 주위의 시퀀스 다이어그램에서 두 곡선을 찾아 돌연변이 샘플을 확인합니다. "긍정적"으로 두 배 곡선에 그들 레이블을 지정합니다.
- , TA 클로닝 벡터에 "긍정적 인"PCR 제품을 복제 10-20 클론, 순서 삽입을 선택하고, T 주위에 돌연변이를 확인argeting 사이트.
Representative Results
ZFN 쌍의 체외 검증에
열 여섯 ZFN 쌍은 초기 설계되었습니다. 세트 1의 표적으로 중단 시퀀스는 토끼 ApoCIII의 엑손 2 (그림 2A) 부근에 자리 잡고 있습니다. 세 쌍 (세트 1, 2, 3,도 2a)이 선택과 ZFN 활동 (도 2B)를 결정하기 위하여 효모 MEL-1 리포터 분석법을 행 하였다. 1 세트 2 (196.9 %)와 3 세트 (177.8 %)보다 높고 선택의 임계 값 (내부 양성 대조군의 예 : 50 %)보다 훨씬 높은 224.2 %의 ZFN 점수를 가지고 설정합니다. 따라서 세트 1은 체외 검증 실험을 위해 선정되었다.
특히 세트는 내부 검증 기준에 따라 체외 배아 유효성 검사를 통과하는 10 % 이상의 배아에 긍정적 인 요금 발생합니다. 세트 1의 mRNA의 (5 ㎍ / ㎖)을 35 전핵 단계 토끼 배아 (그림 3A <의 세포질에 미세 주입 하였다/ strong>을). 마이크로 인젝션 처리 (N = 31)없이 플러시 배아는 대조군으로 사용 하였다. 미세 주입 군의 여덟 배아 십육 시퀀싱 된 건, D5에 BL 단계로 발전하고, 팔은 (BL # 1 에이 팍-3, 4, 5, 7, 11, 13, 15, 17,도 3b, 적색 밑줄) 표시 변이 타겟팅 사이트 (블랙 박스, 그림 2B, 윗줄, apoC3wt.seq)의 순서. 미세 주입 군 (51.4 %)의 BL 속도는 미세 주입 배아의 발달이 약간 저하 능력을 나타내는 대조군 (77.4 %)보다 낮다. 미세 주입 배아 긍정적 돌연변이율이 선택 임계 값보다 훨씬 높은 50.0 % (8 / 16), (즉, 10 %)이다. 이러한 결과는 세트 1은 토끼 ApoCIII의 타겟팅 사이트에서 돌연변이를 유도 할 수있는 효과적인 ZFN 세트입니다 것으로 나타났습니다. 따라서 세트 1은 ApoCIII KO 토끼의 생체 내 생산을 위해 선택되었다.
ApoCIII KO 토끼의 생산
mRNA의 오F ZFN 세트 1은 토끼 전핵 단계의 배아의 세포질에 미세 주입하고, 7 의사 임신받는 사람 토끼 (그림 4A)에 145 미세 주입 배아를 전송했다. ZFN의 미세 주입하지 않고 갓 플러시 배아 (N = 75)가 수신자에게 전송 된 (N = 6) 대조군으로. 임신 후 30 일 이후, 21 키트는 미세 주입 그룹에서 태어났다. PCR 연속 긍정적 KO 키트 (그림 4B)로 오 (apoC3-R1, R9, R11, R12 및 R16)을 확인했다. 속도가 대조군 (75분의 22) 29.3 % 인 반면 전체 용어 키트 / 전체 배아로서 산출 기간 비율은 14.5 % (145분의 21)이다. 총 KO 키트 / 총 기간으로 계산 KO 율은 23.8 % (5 / 21)입니다. 하나 KO 키트 (APOC-R16)는 5 일, 산후 (20.0 %, 2 / 10)를 사망했다. 타겟팅 사이트 indelsat 두 삽입과 세 개의 삭제를 포함, 그들은 토끼 각각 # R1, R9, R11, R12, 및 R16 (그림 4B)에 대해,, +1, +1, Δ20 및 Δ21을 areΔ1.
양성이전 17 설명한대로 oinformatics 분석, 1 순서를 설정하는 7 개 이하의 불일치와 오프 대상 가능성 ZFN을 식별하는 데 사용되었다. 하나만 14 번 염색체 상에 위치 가능한 오프 목표 부위를 예측은 7 일치 BPS로 확인되었다. PCR 분석은 창업자의 동물 중 하나에 오프 대상 이벤트를 감지하지 않습니다.
Discussion
본 연구에서는 다섯 ApoCIII KO 토끼는 ZFN 기술을 사용하여 생성되었다. 이전 GTT 토끼의 생산만을보고는 또한 ZFN 기술 (18)을 사용했다. 본 작품은 ZFN 효과적으로 토끼의 유전자를 대상으로 유용하다는 것을 확인했다.
본 연구에서, 토끼의 이전 ZFN 보고서 (30.8 %, 52분의 16) (18)에 필적하고, 그보고 형질 전환 속도 (긍정적 키트 / 총 출생) is23.8 % (5 / 21), 얼룩말 물고기 19, 쥐 20, 쥐 (21)와 돼지 (17) 등 다른 동물 종에 ZFN을 사용. 이 비율은 5-20 %의 범위에 빠질 많은 종래의 트랜스 제닉 토끼 생산 연구의 속도보다 더 높은 사실이다. 예를 들어, 기존의 DNA의 미세 주입을 통해 제품 ApoCIII 형질 전환 토끼하기위한 노력의 일환으로, 종소리 등. (5.6 %) 22 태어난 새끼 54 개 만점에 3 개 양의 설립자를 얻을.
이전의 연구 결과와 일치, 대상 사이트의 돌연변이 (다섯 KO 토끼에서 1-21까지) 기지의 다른 번호로 구성된 삭제 또는 삽입 등의 변수입니다. 설립자 동물의 특정 서열 정보를 바탕으로, 그것은 (Δ1, +1, +1, 또는 Δ20 돌연변이를 함유하는, 즉.) ApoCIII의 기능 손실이있을 것입니다 적어도 네 개의 예측된다. 이 돌연변이는 일곱 아미노산의 유일한 원인이 손실을 예측하지만, 독서 프레임 변화되지 않는 동물 R-16 Δ21와 함께, 기능 손실이 표시되지 않을 수 있습니다. 궁극적으로, 표현형 분석이 설립자 동물이 진정 ApoCIII 기능의 손실을 표시 여부를 확인하기 위해 필요합니다.
본 연구에서 생성 된 다섯 KO 토끼 중 어느 것도 biallelic 수정 사항을 포함하지 않습니다. 흥미롭게도,이 또한 이전 ZFN 토끼 보고서의 경우입니다. 대조적으로, ZFNs α1 ,3-갈 락토을 타겟팅은 돼지에 적용된세포, 23 어 내고 biallelic 한 단계를 만드는 돌연변이의 약 3 분의 1로, 7~46% 원거리 하나의 대립 유전자를 표적으로의 주파수. TALEN 돼지는 섬유 아세포에 도포 할 때와 일관되게, biallelic 변형은 전체 포지티브 클론 (14)의 약 15-40%에서 발견되었다. 또한, 본 연구에서 biallelic KO 토끼를 생성하는 오류가 표적 핵산 분해 효소 유전자를 기반으로 같은 용량의 종 차이 (즉, 토끼 대 돼지)를 나타낼 수있을 수 있습니다. 그것은,이 프로젝트에서 생성 KO 토끼의 수는 상대적으로 작기 때문에이 단순히이라고하지만, 가능성이 높습니다. 우리는 ZFN은 ZFN 기반 GTT 토끼 생산의 또 다른 잠재적 인 이점으로 간주되어야 토끼 bialleic 돌연변이를 생성 할 수 있다고 생각합니다. 추가 실험은 토끼 ZFN 같은 용량을 확인하기 위해 필요합니다.
결론적으로, 본 연구는 보여주는 Z접근을 대상으로 FN 기반의 유전자는 KO 토끼를 생산하는 효과가 있습니다. 특히, 우리는 23.8 %의 만족 형질 전환 속도와 다섯 ApoCIII KO 토끼를 생성합니다. 이 동물은 해당 마우스 모델보다 인간의 지질 대사에이 단백질의 역할에 대한보다 의미있는 정보를 제공 할 것으로 생각된다. 우리는 ZFN 기반 유전자 타겟팅뿐만 아니라, TALEN 및 RGEN 등의 핵산 분해 효소 기반의 기술을 예측, nonmurine 동물에 상당히 다양한 인간의 질병을 연구하는 새로운 동물 모델의 개발을 촉진 할 것이다.
그림 1. ZFN 기술을 사용하여 녹아웃 토끼의 생산 흐름도. ZFN 기술을 사용하여 KO 토끼의 생산은 그 유전자의 선택과 함께 시작합니다. 시퀀스 정보는 ZFN 세트 설계되어 제공되고, 피사체된다ected 효모 자체 유효성 검사를 기반으로. 체크 포인트 (CP) 1 (CP-1)에서 자체 검증 (내부 양성 대조군의 50 % 이상)을 통과 세트 만이 선택을 사용자에게 제공됩니다. 제공된 세트 CP-1을 통과하지 않으면, 추가적인 시퀀스 효과적인 ZFN 세트를 설계를 위해 필요할 수도있다. 체외 배아 검증 선택한 ZFN 세트가 선택한 사이트 (CP-2)에서 돌연변이를 유도 할 수 있도록하기 위해옵니다. 이 (시험관 배아> = 10 %의 돌연변이 비율) CP-2를 통과하면 ZFN 세트 (들) 만 사용됩니다. CP-2의 실패는 ZFN 세트의 재 설계가 필요합니다. 배아 기증자 준비하고 전핵 단계의 배아는 검증 ZFN 세트 미세 주입됩니다. 이러한 미세 주입 배아는 동기화 배아받는 사람에게 전송됩니다. 한 달 임신 기간 후에, 신생아 (CP-3) 유전자형됩니다. 신생아 중에 긍정적 없으면 추가적인 미세 주입이 수행 될 것이다. 그것은 N 가정, CP-2 프로젝트의 시작부터 2-3개월 소요과정에서 입출력 오류가 발생했습니다. 이 CP-3 CP-2에서 추가 2~3개월 걸립니다. 그러므로 ZFN 기술을 사용하여 4 ~ 6 개월의 시간 프레임에서 녹아웃 토끼를 생성 할 수있다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 2. ZFN 디자인. 세 ZFN 세트 (2 세트 1, 3)은 엑손 1 또는 토끼 ApoCIII (A)의 엑손 2에 다른 시퀀스를 대상으로 설계되었습니다. 세 세트 ZFN 활동을 결정하는 효모 MEL-1 리포터 분석법을 행 하였다. 제조의 프로토콜에 따르면, 제조의 내부 양성 대조군의> 50 %를 보여 ZFNs 활동은 시험 관내 및 생체 게놈 편집 실험에 유용한 것으로 간주된다.ZFN 활동 따라서 (1) 본 연구에서 선택한 설정, 설정 1 224.2 %, 세트 2 196.9 % 및 3 종 세트 (B)에 대한 177.8 %였다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
ZFN의 그림 3. 시험관 배아 검증. 세트 1의 mRNA의 (5 ㎍ / ㎖)을 35 전핵 단계 토끼 배아 (A)의 세포질에 미세 주입 하였다. 마이크로 인젝션 처리 (N = 31)없이 플러시 배아는 대조군으로 사용 하였다. BL 개발 속도가 대조군에서 77.4 %였다. 미세 주입 군에서는 BL 비율은 51.4 %였다. PCR 시퀀싱을 실시 16 BLS의, 8 (50 %)가 긍정적으로 확인하고, 설정 1을 나타내는 것은 타지에서 돌연변이를 유도 할 수있는 효과적인 ZFN 세트입니다팅 사이트 (B, apoc3wt.seq, 블랙 박스) 토끼 ApoCIII의. 돌연변이를 함유 BLS는 BL # 1 에이 팍-3, 4, 5, 7, 11, 13, 15, 그리고 17의 (B, 붉은 밑줄). 나머지 BLS는 (# 1 에이 팍-2, 6, 9, 10, 12, 14, 16)는 표적 사이트에 돌연변이가 없습니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 4. ApoCIII KO 토끼의 제조. ZFN 세트 1의 mRNA와 미세 주입 한 백 사십 오 배아는 7 의사 임신받는 사람 토끼 (A)에 전달했다. ZFN의 미세 주입하지 않고 갓 플러시 배아 (N = 75)가 수신자에게 전송 된 (N = 6) 대조군으로. 실험 그룹의 총 기간 키트 / 전체 배아로 계산 기간의 비율은 14입니다0.5 % (145분의 21), 속도가 대조군 (75분의 22) 29.3 % 인 반면, (A). 미세 주입 군, 오 (R1, R9, R11, R12 및 R16)에서 태어나 21 키트 중 PCR 시퀀싱 (B) 후 긍정적 KO 키트를 확인 하였다. 타겟팅 사이트에서 삽입이나 삭제는 두 개의 삽입 (R9 및 R11 모두 +1)와 세 개의 삭제 (각각 Δ1, Δ (20), R1, R12와 R16에 대한 Δ 21) 있습니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
이 작품은 부분적으로 건강의 국립 연구소에서 교부금에 의해 투자되었다 (HL105114, HL088391, NS066652 및 YEC에 HL068878), 미국 심장 협회 (JZ에 국가 과학자 개발 0835237N). YEC는 재정적 미시간 의료 센터의 대학 (UMMC)에서 심장 혈관 의학 부여 프레드릭 Huetwell 교수로 지원됩니다. 이 작품은 번역 상 과학 및 UMMC에서 치료학 (CAMTraST)의 고급 모델에 대한 센터에서 지원하는 핵심 서비스를 이용했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APOC3-ZFN | Sigma Aldrich | CSTZFNY-1KT | Target Gene: APOC3, Lot Number: 12201118MN |
| mMESSAGE kit | Invitrogen | AM1344M | mRNA synthesis |
| MEGAclear Kit | Invitrogen | AM1908M | mRNA purification |
| Follicle-stimulating hormone | Bioniche Life Sciences | Folltropin-V | Treating embryo donor rabbits |
| Human chorionic gonadotropin | Intervet | Chorulon | Treating embryo donor rabbits |
| Gonadotropin-releasing hormone | Prospecbio | HOR-255 | Treating embryo recipient rabbits |
| Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) | Thermo Fisher Scientific | SH30029.02 | Embryo culture, base medium |
| MEM (nonessential amino acid) | Sigma Aldrich | M7145 | Embryo culture, supplements |
| BME AMINO ACIDS solution | Sigma Aldrich | B6766 | Embryo culture, supplements |
| Glutamine | Gibco | 25030-149 | Embryo culture, supplements |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | Embryo culture, supplements |
| Fetal bovine serum | Sigma Aldrich | 12003C | Embryo culture, supplements |
| HEPES buffered TCM 199 | Gibco | 12350039 | Embryo manipulation medium |
| Incubator | Eppendorf | Galaxy 170 | Embryo culture equipment |
| Micromanipulator | Eppendorf | TransferMan NK 2 | Embryo manipulation equipment |
| Micropipette puller | Sutter Instruments Inc. | P-1000 | Embryo manipulation equipment |
| Microinjector | Tritech Research | MINJ-D | Embryo manipulation equipment |
| Borosilicate glass capillary tubes | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-6 | Embryo manipulation supply |
| Euthasol (pentobarbitol sodium) | Virbac AH, Inc. | ANADA#200-071 | Euthanization of embryo donor rabbits |
References
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