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Medicine

La producción de la apolipoproteína C-III Conejos Knockout utilizando nucleasas de dedos de zinc

doi: 10.3791/50957 Published: November 18, 2013

Summary

El reciente desarrollo de herramientas de mutagénesis dirigida hace que la producción de knockout (KO) conejos posible. En el presente trabajo, hemos generado cinco conejos apolipoproteína (Apo) C-III KO utilizando nucleasas de dedos de zinc (ZFN). Este trabajo demostró que ZFN es un método muy eficiente para producir conejos KO.

Abstract

La apolipoproteína (apo) C-III (ApoCIII) reside en la superficie de quilomicrones en plasma (CM), las lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL) y lipoproteínas de alta densidad (HDL). Se ha reconocido que los altos niveles de plasma de apoCIII factor de riesgo sonuna para enfermedades cardiovasculares (ECV). ApoCIII nivel de plasma elevada a menudo se correlaciona con la resistencia a la insulina, la obesidad, y la hipertrigliceridemia. Valioso conocimiento sobre las funciones de los metabolismos de lípidos ApoCIIIin y ECV se ha obtenido a partir de modelos de ratones transgénicos que incluyen knockout (KO) ratones ApoCIII, sin embargo, se observa que el metabolismo de la lipoproteína en ratones es diferente de la de los humanos en muchos aspectos. No se sabe hasta ahora si plasmática elevada ApoCIII es directamente aterogénico. Trabajamos para desarrollar conejos ApoCIII KO en el presente estudio basado en la hipótesis de que los conejos pueden servir como reasonablemodelfor el estudio del metabolismo de los lípidos y la aterosclerosis humana. Conejo nucleasa dedo de zinc (ZFN) juegos focalización ApoCIIIgene se somete a la validación in vitro antes de la microinyección de embriones. El ARNm se inyecta en el citoplasma de embriones en la etapa 35 de conejo pronucleares, y evaluó las tasas de mutación en el estado de blastocisto. De dieciséis blastocistos que se ensayaron, se logró una tasa satisfactoria 50% mutación (8/16) en el sitio de la orientación, el apoyo a la utilización de Set 1 para experimentos in vivo. A continuación, microinjected 145 embriones con Set 1 mRNA, y transferimos estos embriones a 7 conejos receptores. Después de 30 días de gestación, 21 kits han nacido, de los cuales cinco fueron confirmados como conejos ApoCIII KO después de los ensayos de secuenciación de PCR. La tasa de los animales KO (# kits KO / total de nacidos) fue de 23,8%. La eficiencia de la producción global es de 3,4% (5 kits/145 embriones transferidos). El presente trabajo demuestra que ZFN es un método muy eficiente para producir conejos KO. Estos conejos ApoCIII KO son nuevos recursos para el estudio de las funciones de los ApoCIII en metabolismo de lípidos.

Introduction

La apolipoproteína (apo) C-III (ApoCIII) es una pequeña proteína secretora-O-glicosilado que se sintetiza principalmente en el hígado y el intestino. Reside en la superficie de quilomicrones en plasma (CM), las lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL) y lipoproteínas de alta densidad (HDL). ApoCIII ha sido reconocido como un factor de riesgo para la enfermedad cardiovascular 1. Los pacientes con deficiencia hereditaria de ApoCIII tienen bajos niveles de triglicéridos en plasma (TG) y la reducción de la aterosclerosis coronaria subclínica 2,3. ApoCIII nivel de plasma elevada, por otro lado, a menudo se correlaciona con la resistencia a la insulina, la obesidad, y la hipertrigliceridemia (HTG) 4,5.

Gene knockout (KO) es un medio poderoso para estudiar la función de un gen. En consonancia con las observaciones en poblaciones mutantes humanos, knockout del gen ApoCIII en ratones dio lugar a una reducción de los TG plasmáticos y la protección de HTG postprandial 6. Tal papel positivo de ApoCIII aparecióser independiente de la apolipoproteína E (ApoE), como los ratones deficientes de ApoE y tanto ApoCIII también están protegidos de la hiperlipidemia postprandial 7. Aunque estos modelos de ratón ApoCIII KO han proporcionado valiosa información sobre las posibles funciones de ApoCIII en los seres humanos, se observa que el metabolismo de la lipoproteína de ratones es diferente de la de los seres humanos en muchos aspectos. Por ejemplo, el ratón carece de plasma de colesterilo proteína de transferencia de éster (CETP), una enzima importante implicada en el transporte de las VLDL, LDL, y HDL 8. Por lo tanto, es necesario desarrollar un modelo animal apropiado para comprender mejor el papel fisiológico de ApoCIII in vivo.

El conejo es un modelo clásico de especies animales 9-11. Tiene un corto período de gestación (30-31 días), gran tamaño de la camada (4-12/litter) y puede alojar cómodamente en una instalación cubierta. En comparación con los ratones, conejos son filogenéticamente más cerca de los seres humanos 10. Es importante destacar que, al igual que huhombre, pero a diferencia de los ratones, conejos son mamíferos LDL ricas y tienen importantes niveles de CETP 10,12. Además, son susceptibles a la aterosclerosis inducida por la dieta rica en colesterol con las lesiones similares a las observadas en la aterosclerosis humana 13. Por estas razones, la hipótesis de que los conejos ApoCIII KO pueden servir como un modelo mejor que sus homólogos de ratón para investigar los papeles de ApoCIIIplay en el metabolismo de lípidos y la aterosclerosis en seres humanos.

Producción de gen transgénico destinado (GTT) conejos ha sido un reto. Esto se debe principalmente a la falta de la línea germinal de transmisión de las células madre embrionarias (ESC) y la muy baja eficiencia de la transferencia nuclear de células somáticas (SCNT) en conejos. ESC es la principal herramienta para generar ratones GTT, mientras que SCNT y se ha aplicado con éxito para generar animales KO en las especies que carecen de los CES de transmisión de la línea germinal, como los cerdos, las ovejas y el ganado, pero no conejos. Recientemente Zinc Finger nucleasa (ZFN), Trancripción Activador-Like Efector nucleasa (TALEN) 14, y el ARN endonucleasa guiada (RGEN) 15 surgieron como medios poderosos para la edición del genoma. Estos nucleasas, los llamados "tijeras moleculares", son eficientes en la generación de roturas de la doble hebra (DSB) en el genoma que pueden conducir a un KO funcional del gen diana o usados ​​para integrar una secuencia de ADN en un locus específico en el genoma en un número de especies 16. En 2011, uno de los primeros que se adapta la tecnología ZFN, generamos peroxisoma receptor gamma activado por el proliferador células porcinas KO (PPAR) a través de este enfoque y cerdos PPAR KO generados con éxito después de usar estas células para la SCNT 17. En el mismo año, eficiente inmunoglobulina interrupción de genes y el reemplazo orientado en conejos que también lo usen ZFN se informó 18.

En el presente estudio, se generaron cinco conejos ApoCIII KO como se confirma por secuenciación PCR, utilizando ZFN Set 1 (ver Figura 1

Protocol

Todos los procedimientos de mantenimiento de los animales, el cuidado y uso fueron revisadas y aprobadas por el Comité de la Universidad de Uso y Cuidado de los Animales de la Universidad de Michigan.

1. ZFN Diseño y selección

  1. Suministro de la información de la secuencia genómica del gen de interés (por ejemplo, conejo ApoCIII) para el fabricante. Seleccione ZFN conjunto (s) de los experimentos basados ​​en las puntuaciones ZFN.

2. Embrión Rabbit Collection

  1. Superovular madurado sexualmente (6-18 meses) Nueva Zelanda White (NZW) conejas por (sc) por inyección subcutánea de FSH dos veces / día con una dosis de 3 mg para las dos primeras inyecciones, 5 mg para los próximos dos inyecciones y 6 mg para las dos últimas inyecciones.
  2. Administrar una única intravenosa (iv) la inyección de 200 UI de hCG a las 72 horas después de la primera inyección de FSH para inducir la ovulación. Mate de las hembras superovuladas con un conejo macho inmediatamente después de la inyección de hCG.
  3. Euthanize los conejos donantes superovuladas con pentobarbital sódico (150 mg / kg, iv) al 16-18 h después de la inseminación (psi).
  4. Recuperar las ampollas oviducto mediante la recopilación cuidadosamente la estructura oviductos y los ovarios enteras.
  5. Vaciar cada oviducto con 10 ml de medio de manipulación de tamponada con HEPES TCM 199 suplementado con suero bovino fetal al 10%, mediante la inyección del medio desde el extremo útero del oviducto. Recoger el medio enrojecida en la abertura en el extremo de ovario del oviducto a una placa de Petri.
  6. Observar e identificar los embriones que se obtienen en el mediano enrojecida, lavar los embriones tres veces en el medio de la manipulación, mantenerlos en el medio de la manipulación a 38.5 ° C en el aire, y observarlos bajo un microscopio estereoscópico para la ocurrencia de la fertilización. Prepárese para la microinyección de embriones en fase pronuclear 19-21 h psi

3. Preparación de ARNm ZFN

  1. Se purificó el mRNA resultante antes de la resuspensión en RNasa libre 0.1X TE (1 mM Tris-Cl pH8,0, EDTA 0,1 mM). Medir la concentración y almacenar el ARNm a -80 ° C hasta su uso.
  2. Preparar los ARNm que codifican ZFN par (4-10 ng / l en 1 mMTris-Cl, EDTA 0,1 mM a pH 7,5), alícuota en 10 viales mu l. Almacenarlos a -80 º C hasta que esté listo para su uso. Antes de la microinyección, descongele el vial (s) de ARN, y mantener en hielo.

4. Microinyección de embriones

  1. Preparar la plataforma microinyección mediante la colocación de una gota 5 l de medio de manipulación en un portaobjetos de cámara de 1-bien que tiene la cámara de los medios de comunicación eliminado. Cubra la caída media con aceite mineral y el lugar en la platina del microscopio calentado.
  2. Coloque la pipeta de sujeción (120 m de diámetro) en el brazo de soporte del micromanipulador y posicionarlo en la gota de medio de manipulación.
  3. Fabrique micropipetas inyección calentando y tirando de tubos capilares de vidrio borosilicato en un dispositivo extractor de micropipeta. Cargar el ARNm para ser inyectado en la pipeta de inyección.
  4. Abra el suministro de aire comprimido que está conectado a un microinyector.
  5. Coloque la pipeta de inyección en el soporte de la inyección, lo puso en el micromanipulador y colóquelo en la gota de medio de manipulación.
  6. Configuración de la microinyector, con los siguientes parámetros sugeridos: holdP = 2 psi, InjP = 20 psi, ClearP = 60 psi, Injtime = 1 seg, lo que resultará en un volumen de inyección de 1-5 pl.
  7. Abra la punta de la pipeta de inyección golpeando suavemente contra la pipeta de sujeción.
  8. Transferencia de embriones (30-50) a la gota de micromanipulación en la plataforma. Utilice la pipeta de sujeción para capturar un embrión y alinear la aguja de inyección, embrión y la pipeta de sujeción a lo largo del eje x.
  9. Bajo una ampliación de 400X, avanzar en la pipeta de inyección a través del embrión. Tenga cuidado de evitar el núcleo. Una vez que se perfora la membrana plasmática, pedal del pie de prensa para inyectar. Después de la inyección, retire la aguja, suelte el embrión. Repita el proceso para todos los em restantebryos.
  10. Lavar embriones inyectados tres veces en medio de cultivo de embriones, que consiste de la solución de Earle salina equilibrada (EBSS) suplementado con aminoácidos no esenciales (NEAA), aminoácidos esenciales (EAA), 1 mM de L-glutamina, piruvato de sodio 0,4 mM, y 10% de FBS.
  11. Incubar los embriones a 38.5 ° C en el 5% de CO 2 en el aire durante 1-2 horas antes de ser transferidos quirúrgicamente en los oviductos de una NZW conejo hembra receptora sincronizada (véase el paso 5.1). Alternativamente, la cultura de los embriones hasta que llegan a la etapa de blastocisto antes de que se usan para la validación in vitro o ensayos.

5. Transferencia de Embriones

  1. Seleccione una hembra de conejo de 5-12 meses de edad NZW, en buen estado de salud, con un peso aprox. 4,0 de 5,0 kg como animal receptor. Administrar Hormona Liberadora de Gonadotropina (GnRH) por vía intramuscular inyección (im, 50 mcg / ml, 0,3 ml / animal) para el destinatario en el mismo punto de tiempo con la de hCG inyección al animal (s) donante (véase el paso 2.2). Tras la finalización de la microinyección, preparar el conejo de destinatarios para la transferencia de embriones (normalmente 16-24 horas después de la inyección de GnRH). Se anestesia el conejo con 10-40 mg / kg de ketamina (im), y / o isoflurano vaporizado (2-4%) a través de la inhalación. Proteger los ojos del conejo de secado excesivo mediante la aplicación de una pomada oftálmica estéril. Observar el animal hasta que esté totalmente inconsciente, es decir. no responde a los reflejos de pedal; apretando la almohadilla del pie se utiliza para comprobar si hay falta de reflejo de pedal que es una indicación de la anestesia adecuada.
  2. Afeitarse el abdomen del conejo, lavar con matorrales antiséptico, seguido de una solución antiséptica, y limpie la zona afeitada con gasas estériles.
  3. Realizar la cirugía en condiciones estériles, grabar los signos vitales del conejo destinatario aproximadamente cada 15 min durante toda la cirugía.
  4. Transferencia 10-25 embriones a un animal receptor, en función del número de embriones disponibles.
  5. Al final de laprocedimientos quirúrgicos, cierran la capa muscular con sutura absorbible recubierto. La sutura de la piel, ya sea con una sutura subcuticular usando sutura absorbible o con suturas interrumpidas simples de la piel utilizando sutura nonabsorable (por ejemplo, monofilamento de nylon o similar).
  6. Mantenga al animal caliente y monitorearla hasta alcanzar su decúbito esternal.
  7. Monitorear el animal al día. Siga las instrucciones del veterinario para el cuidado de los animales. Administrar meloxicam (sc 1,0 mg / kg) para aliviar el dolor y / o reducir el funcionamiento fiebre posterior al día, si lo considera necesario por el veterinario.
  8. Retire las suturas de la piel nonabsorable en unos 10 a 14 días después de la operación.

6. La detección de la interrupción de genes ZFN inducido

  1. Para la validación in vitro, lleve a cabo el genotipado de los embriones cultivados in vitro. Lyse embriones individuales que se desarrollaron a las etapas de mórula / blastocisto en 5 solución l NP40 (NP40 al 1% más 1 ug / ml de proteinasa K en Taq Buffer) Durante 0,5-1 horas a 55 ° C, y 10 min a 95 ° C.
  2. Para la genotipificación de la descendencia, recolectar muestras de piel de oreja de kits nacidos, extraer el ADN genómico, y usarlos como plantillas para la secuenciación PCR. Aplicar Kwik-Stop para el área de muestreo después de la recolección para detener la hemorragia y aliviar el malestar.
  3. Utilice la lisis de la etapa 6.2 o 6.3 como molde para la PCR utilizando LA-Taq y par de cebadores de PCR, que se encuentra aguas arriba (5 '-TGAGGCCGGGAAGGGAGCAGTCG-3') y aguas abajo (5'-GCCAGGCCCACCCACGGAACAGC-3 ') del sitio diana ZFN .
  4. Purificar los productos de PCR y la secuencia con cebador de secuenciación (5'-TCTGCACGCTTGGGGCTGGAG-3 ').
  5. Identificar las muestras mutantes mediante la búsqueda de doble curva en el diagrama de secuencia alrededor del sitio de acceso. Etiquetar los que tienen curvas dobles como "positivo".
  6. Clonar los productos de PCR "positivos" en TA clonación vector, recoger 10-20 clones, secuencia de las inserciones, y confirmar las mutaciones en todo el tsitio argeting.

Representative Results

En la validación in vitro de pares ZFN
Dieciséis pares ZFN fueron diseñados inicialmente. La secuencia de alteración dirigida de Set 1 se encuentra en el exón 2 de conejo ApoCIII (Figura 2A). Se seleccionaron tres pares (Set 1, 2, y 3, Figura 2A) y se sometieron a la levadura MEL-1 reportero de ensayo para determinar las actividades ZFN (Figura 2B). Ajuste 1 tiene una puntuación ZFN de 224,2%, más altos que los de Set 2 (196,9%) y Juego de 3 (177,8%) y mucho más alto que el umbral de selección (es decir, 50% del control positivo interno). Por lo tanto Set 1 fue seleccionado para los experimentos in vitro de validación.

Un conjunto particular debe resultar en un tasas positivas en los embriones de 10% o mayor para aprobar la validación de embriones in vitro, basado en los criterios de validación interna. El ARNm (5 g / ml) de Set 1 se microinyectó al citoplasma de 35 embriones pronucleares etapa de conejo (Figura 3A </ Strong>). Embriones eliminará sin tratamiento microinyección (n = 31) fueron utilizados como grupo de control. Dieciocho embriones del grupo microinyección desarrollaron a la etapa de BL en D5, de los cuales dieciséis fueron secuenciados, y ocho (BL # APOC-3, 4, 5, 7, 11, 13, 15, 17, Figura 3B, subrayada en rojo) muestran mutados secuencias en el sitio de la focalización (negro en caja, la Figura 2B, fila superior, apoC3wt.seq). La tasa de BL del grupo de microinyección (51,4%) es menor que la del grupo de control (77,4%), lo que indica la competencia de desarrollo ligeramente alterada de embriones microinyectados. La tasa de mutación positiva de los embriones microinyectados es 50,0% (8/16), mucho más alto que el umbral de selección (es decir, 10%). Estos resultados revelaron que el Set 1 es un conjunto ZFN eficaz para inducir mutaciones en el sitio de la focalización de ApoCIII conejo. Por lo tanto Conjunto 1 se eligió para la producción in vivo de los conejos ApoCIII KO.

Producción de conejos ApoCIII KO
El ARNm Of ZFN Set 1 se microinyectó al citoplasma de conejo embriones en estadio de pronúcleos, y se transfirió 145 embriones microinyectados a 7 conejos receptores pseudopreñadas (Figura 4A). Embriones recién enrojecida (n = 75) sin ZFN microinyección fueron transferidas a receptores (n = 6) como el grupo de control. Después de 30 días de gestación, 21 kits nacieron en el grupo microinyectado. Secuenciación PCR identificó cinco (APOC3-R1, R9, R11, R12 y R16) como kits KO positivos (Figura 4B). La tasa de término calculado como kits totales plazo / embriones totales es del 14,5% (21/145), mientras que la tasa es de 29,3% (22/75) en el grupo control. La tasa KO calculado como kits totales KO / term total es de 23,8% (5/21). Un kit de KO (APOC-R16) murió cinco días después del parto (20,0%, 1/5). El indelsat el sitio diana incluyen dos inserciones y tres deleciones, sino que areΔ1, 1, 1, Δ20 y Δ21, para Conejos # R1, R9, R11, R12, y R16, respectivamente (Figura 4B).

BiSe utilizó el análisis oinformatics para identificar el potencial ZFN fuera de los objetivos con 7 o menos desajustes a Set 1 secuencia, como se describió anteriormente 17. Sólo uno predijo posible lugar fuera del objetivo, que se encuentra en el cromosoma 14, se identificó con 7 puntos básicos que no coinciden. Ensayo de PCR detecta ningún evento fuera de objetivo en ninguno de los animales fundadores.

Discussion

En el presente trabajo, cinco conejos ApoCIII KO se generaron utilizando la tecnología ZFN. Anteriormente el único informe de la producción de conejos GTT también utiliza la tecnología ZFN 18. El presente trabajo confirmó que ZFN es útil para hacer frente eficazmente genes en conejos.

En el presente estudio, la tasa de transgénicos (nacido positivo kits / total) is23.8% (5/21), que es comparable a la del informe anterior ZFN en conejos (30,8%, 16/52) 18, y los reportados de utilizar ZFN en otras especies animales, incluidos los peces cebra 19, los ratones 20, 21 ratas y cerdos 17. Esta tasa es de hecho superior a las tasas de muchos estudios de producción de conejo transgénico convencionales, que normalmente caen en el rango de 5-20%. Por ejemplo, en un esfuerzo por producto ApoCIII conejos transgénicos por medio de microinyección de ADN convencional, Ding et al. Obtenido 3 fundadores positivos de 54 cachorros nacidos (5,6%) 22.

En consonancia con los resultados anteriores, las mutaciones en los sitios dirigidos son variables, incluyendo deleciones o inserciones consistentes diferente número de bases (que van desde 1 hasta 21 en los cinco conejos KO). Con base en la información de la secuencia específica de los animales fundadores, se predice que al menos cuatro (es decir. Los que contienen Δ1, 1, 1, o Δ20 mutaciones) tendría la pérdida de función de ApoCIII. Animal de R-16 con Δ21 no puede mostrar la pérdida funcional, ya que esta mutación se prevé que sólo causa pérdida de siete aminoácidos, pero no un cambio del marco de lectura. En última instancia, los ensayos de fenotipo son necesarios para determinar si estos animales fundadores realmente muestran la pérdida de las funciones ApoCIII.

Ninguno de los cinco conejos KO generados en el presente estudio contiene modificaciones bialélicos. Curiosamente, este es también el caso en el anterior informe de conejo ZFN. En contraste, cuando ZFNs focalización α1 ,3-galactosiltransferasa se aplicaron a cerdocélulas, la frecuencia de dirigidas a un único alelo oscilado 7-46%, con aproximadamente un tercio de la creación de mutaciones de un solo paso bialélico Troqueles 23. Consistente con esto, cuando TALEN se aplicó a las células de fibroblastos de cerdo, las modificaciones bialélicos se encuentran en aproximadamente el 15-40% del total de 14 clones positivos. Es posible que el hecho de no generar conejos KO bialélicas en el presente estudio puede indicar una diferencia de especies (es decir, los conejos frente a los cerdos) para tal capacidad de gen de la nucleasa basado focalización. Es, sin embargo, es más probable que esto es simplemente porque el número de conejos KO generados en este proyecto es relativamente pequeño. Creemos que ZFN es capaz de generar mutaciones bialleic en conejos, los cuales deben ser considerados como otra ventaja potencial de producción de conejos GTT basado ZFN. Son necesarios más estudios para confirmar esa capacidad de ZFN en conejos.

En conclusión, el presente trabajo demuestra que ZGénica basada FN focalización enfoque es eficaz en la producción de conejos KO. En particular, se generaron cinco conejos ApoCIII KO con una tasa transgénico satisfactoria de 23,8%. Estos animales se cree que proporcionan información más significativa sobre el papel de esta proteína en el metabolismo de los lípidos en los seres humanos que los modelos de ratón correspondientes. Podemos predecir la orientación de genes basados ​​ZFN, así como otras tecnologías basadas nucleasa como TALEN y RGEN, en animales nonmurine facilitará significativamente el desarrollo de nuevos modelos animales para el estudio de diversas enfermedades humanas.

Figura 1
Figura 1. Diagrama de flujo de la producción de conejos knockout que utilizan la tecnología ZFN. Producción de conejos KO utilizando la tecnología ZFN comienza con la selección del gen de interés. La información de la secuencia se proporciona, conjuntos ZFN están diseñados y subjeja a la levadura a base de validación interna. En el punto (CP) 1 (CP-1) cheque, sólo los conjuntos pasaron la validación interna (50% o más del control positivo interno) se proporcionará a los usuarios para su selección. Si no hay conjuntos pasan CP-1, puede ser necesaria secuencia adicional para el diseño de conjuntos de ZFN eficaces. Una validación del embrión en vitro se sigue asegurar del conjunto ZFN seleccionados puede producir mutaciones de lugares seleccionadas (CP 2). ZFN (s) sólo será utilizada si pasa CP-2 (> = 10% las tasas de mutación en los embriones in vitro). El fracaso en la CP-2 requerirá un rediseño de los conjuntos ZFN. Donantes de embriones se prepararán y embriones en estadio pronuclear se microinyectaron con los conjuntos ZFN validados. Estos embriones microinyectados se transfieren a hembras receptoras sincronizadas. Después de período de un mes de gestación, los recién nacidos se genotipo (CP-3). Si ninguno de los recién nacidos son positivos, se realizará la microinyección adicional. Se tarda 2-3 meses desde el inicio del proyecto de CP-2, en el supuesto nfallo o durante el proceso. Se necesita adicionales 2-3 meses de CP-2 a CP-3. Por lo tanto, es posible generar un conejo golpe de gracia en un plazo de 4-6 meses usando la tecnología ZFN. Haga clic aquí para ver la imagen más grande .

Figura 2
Figura 2. Diseño ZFN. Tres conjuntos ZFN (Set 1, 2 y 3) fueron diseñados dirigidos a diferentes secuencias en el exón 1 o Exon 2 de conejo ApoCIII (A). Los tres conjuntos se sometieron a la levadura MEL-1 reportero de ensayo para determinar las actividades ZFN. De acuerdo con los protocolos del fabricante, ZFNs que muestran> 50% de las actividades que de control positivo interno de la fabricación se consideran útiles para in vitro e in vivo del genoma experimentos de edición.Las actividades ZFN fueron 224,2% para el Grupo 1, 196.9% para el Juego 2 y 177,8% para el Juego 3 (B), por lo tanto, Set 1 fue seleccionada en el presente estudio. Haga clic aquí para ver la imagen más grande .

Figura 3
Figura 3. Validación de embriones in vitro de ZFN. El ARNm (5 g / ml) de Set 1 se microinyectó al citoplasma de 35 embriones pronucleares etapa de conejo (A). Embriones eliminará sin tratamiento microinyección (n = 31) fueron utilizados como grupo de control. La tasa de desarrollo BL era 77,4% en el grupo de control. En el grupo microinyectado, la tasa fue del 51,4% BL. De 16 BLs sometidos a secuenciación PCR, 8 (50%) fueron identificados como positivos, lo que indica Set 1 es un conjunto ZFN eficaz para inducir mutaciones en el targeting sitio (B, apoc3wt.seq, negro-caja) de ApoCIII en conejos. El BLS que contienen las mutaciones son BL # APOC-3, 4, 5, 7, 11, 13, 15, y 17 (B, subrayada en rojo). El BLS restantes (# APOC-2, 6, 9, 10, 12, 14 y 16) no tienen mutaciones en el sitio de la focalización. Haga clic aquí para ver la imagen más grande .

Figura 4
Figura 4. Producción de conejos ApoCIII KO. Ciento cuarenta y cinco embriones microinyectados con ZFN Serie 1 mRNAs fueron trasladados a 7 conejos receptores pseudopreñadas (A). Embriones recién enrojecida (n = 75) sin ZFN microinyección fueron transferidas a receptores (n = 6) como el grupo de control. La tasa de término calculado como kits totales plazo / embriones totales en el grupo experimento es 140,5% (21/145), mientras que la tasa es de 29,3% (22/75) en el grupo de control (A). Fuera de kits de 21 nacidos en el grupo de microinyección, cinco (R1, R9, R11, R12 y R16) se identificaron como positivos kits de KO después de la secuenciación de PCR (B). Los indeles en el sitio de focalización incluyen dos inserciones (1 tanto para R9 y R11) y tres deleciones (Δ1, Δ 20, Δ 21 para R1, R12 y R16, respectivamente). Haga clic aquí para ver la imagen más grande .

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo ha sido parcialmente financiado por becas de los Institutos Nacionales de Salud (HL105114, HL088391, NS066652 y HL068878 de YEC), la American Heart Association (Nacional de Desarrollo Científico 0835237N a JZ). YEC es apoyado financieramente como dotado Frederick Huetwell Profesor de Medicina Cardiovascular de la Universidad de Michigan Medical Center (UMMC). Este trabajo utiliza los Servicios principales apoyados por el Centro de Modelos Avanzados para las Ciencias y Terapéutica (CAMTraST) al UMMC.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
APOC3-ZFN Sigma Aldrich CSTZFNY-1KT Target Gene: APOC3, Lot Number: 12201118MN
mMESSAGE kit Invitrogen AM1344M mRNA synthesis
MEGAclear Kit  Invitrogen AM1908M mRNA purification
Follicle-stimulating hormone Bioniche Life Sciences Folltropin-V Treating embryo donor rabbits
Human chorionic gonadotropin Intervet Chorulon Treating embryo donor rabbits
Gonadotropin-releasing hormone Prospecbio HOR-255 Treating embryo recipient rabbits
Earle's Balanced Salt Solution (EBSS)  Thermo Fisher Scientific SH30029.02 Embryo culture, base medium
MEM (nonessential amino acid) Sigma Aldrich M7145 Embryo culture, supplements
BME AMINO ACIDS solution Sigma Aldrich B6766 Embryo culture, supplements
Glutamine Gibco 25030-149 Embryo culture, supplements
Sodium pyruvate  Gibco 11360-070 Embryo culture, supplements
Fetal bovine serum Sigma Aldrich 12003C Embryo culture, supplements
HEPES buffered TCM 199  Gibco 12350039 Embryo manipulation medium
Incubator Eppendorf Galaxy 170 Embryo culture equipment
Micromanipulator  Eppendorf TransferMan NK 2 Embryo manipulation equipment
Micropipette puller Sutter Instruments Inc. P-1000 Embryo manipulation equipment
Microinjector  Tritech Research MINJ-D Embryo manipulation equipment
Borosilicate glass capillary tubes  World Precision Instruments, Inc. TW100F-6 Embryo manipulation supply
Euthasol (pentobarbitol sodium) Virbac AH, Inc. ANADA#200-071 Euthanization of embryo donor rabbits

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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La producción de la apolipoproteína C-III Conejos Knockout utilizando nucleasas de dedos de zinc
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Yang, D., Zhang, J., Xu, J., Zhu, T., Fan, Y., Fan, J., Chen, Y. E. Production of Apolipoprotein C-III Knockout Rabbits using Zinc Finger Nucleases. J. Vis. Exp. (81), e50957, doi:10.3791/50957 (2013).More

Yang, D., Zhang, J., Xu, J., Zhu, T., Fan, Y., Fan, J., Chen, Y. E. Production of Apolipoprotein C-III Knockout Rabbits using Zinc Finger Nucleases. J. Vis. Exp. (81), e50957, doi:10.3791/50957 (2013).

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