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संभावित मिट्टी कोशिकी एंजाइम गतिविधियों के उच्च throughput fluorometric मापन

Published: November 15, 2013 doi: 10.3791/50961
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3, 1
1Natural Resource Ecology Laboratory, Colorado State University, 2Biosciences Division, Oak Ridge National Laboratory, 3Department of Bioengineering, University of Colorado

Summary

मिट्टी बाह्य एंजाइम की गतिविधियों की संभावित दर को मापने के लिए, एक फ्लोरोसेंट डाई करने के लिए बाध्य कर रहे हैं कि सिंथेटिक substrates मिट्टी के नमूने लिए जोड़ रहे हैं. फ्लोरोसेंट डाई उच्च प्रतिदीप्ति अधिक सब्सट्रेट गिरावट को इंगित करता है, जहां एक एंजाइम उत्प्रेरित प्रतिक्रिया, द्वारा सब्सट्रेट से जारी है के रूप में एंजाइम गतिविधि मापा जाता है.

Abstract

मिट्टी और अन्य वातावरण में रोगाणुओं वे ऊर्जा और पोषक तत्वों के लिए आत्मसात किया जा सकता है, ताकि जैविक अणुओं depolymerize और hydrolyze के लिए बाह्य एंजाइमों का उत्पादन. मिट्टी माइक्रोबियल एंजाइम की गतिविधि को मापने मिट्टी पारिस्थितिकी तंत्र कार्यात्मक गतिशीलता को समझने में महत्वपूर्ण है. प्रतिदीप्ति एंजाइम परख की सामान्य अवधारणा सिंथेटिक सी, एन, या एक फ्लोरोसेंट रंजक के साथ ही पी युक्त substrates मिट्टी के नमूने के लिए जोड़ रहे हैं. जब बरकरार, लेबल substrates प्रतिदीप्ति नहीं है. एंजाइम गतिविधि फ्लोरोसेंट रंगों उन्हें प्रतिदीप्ति की अनुमति देता है जो उनके substrates, से चिपके रहते हैं के रूप में प्रतिदीप्ति में वृद्धि के रूप में मापा जाता है. एनजाइम माप molarity या गतिविधि की इकाइयों में व्यक्त किया जा सकता है. इस परख करने के लिए, मिट्टी slurries एक पीएच बफर के साथ मिट्टी के संयोजन से तैयार कर रहे हैं. पीएच बफर (आम तौर पर एक 50 मिमी सोडियम एसीटेट या 50 मिमी Tris बफर), सर्वश्रेष्ठ मिट्टी सा मैच के लिए बफर के विशेष एसिड हदबंदी निरंतर (PKA) के लिए चुना जाता हैmple पीएच. मिट्टी slurries की fluorescently (यानी सी, एन, या पी युक्त) सब्सट्रेट लेबल एक nonlimiting राशि के साथ inoculated हैं. परख में मिट्टी slurries का प्रयोग एंजाइम और सब्सट्रेट प्रसार पर सीमाओं को कम करने के लिए कार्य करता है. इसलिए, सब्सट्रेट सीमा में मतभेद, प्रसार की दर, और मिट्टी पीएच स्थितियों के लिए इस परख नियंत्रण है, इस प्रकार (नमूना प्रति) एंजाइम सांद्रता में अंतर का एक समारोह के रूप में संभावित एंजाइम गतिविधि दरों का पता लगाने.

प्रतिदीप्ति एंजाइम assays आमतौर पर spectrophotometric (यानी वर्णमिति) assays की तुलना में अधिक संवेदनशील होते हैं, लेकिन दोष और प्रकाश के संपर्क में जब कई फ्लोरोसेंट यौगिकों की अस्थिरता की वजह से हस्तक्षेप से ग्रस्त कर सकते हैं, तो फ्लोरोसेंट substrates निपटने जब ​​सावधानी की आवश्यकता है. Substrates सीमित नहीं रहे हैं जब इसी तरह, इस विधि केवल प्रयोगशाला परिस्थितियों में संभावित एंजाइम की गतिविधियों का आकलन है. पार का प्रतिनिधित्व डेटा की व्याख्या सावधानी जब इस्तेमाल किया जाना चाहिएसीटू मिट्टी के प्रकार और तापमान में के रूप में भिन्न तापमान या मिट्टी के प्रकार, साथ साइट तुलना एंजाइम कैनेटीक्स प्रभावित कर सकते हैं.

Introduction

मिट्टी बैक्टीरिया, कवक, और आर्किया द्वारा उत्पादित कोशिकी एंजाइमों (EES) असंख्य biogeochemical प्रक्रियाओं में शामिल है, और प्रसंस्करण, स्थिरीकरण, और स्थलीय पारितंत्रों 1 में मिट्टी में कार्बनिक पदार्थ और पोषक तत्व सायकलिंग की अस्थिरता के लिए केंद्रीय हैं. EEs का निर्माण करके, मिट्टी रोगाणुओं विघटित और इस तरह के पौधों और रोगाणुओं मिट्टी से उपलब्ध पोषक तत्वों को आत्मसात करने की अनुमति देता है, जो पहले से बाध्य सूक्ष्म और macronutrients, मुक्ति, छोटे घुलनशील अणु में polymeric कार्बनिक पदार्थ बदलना. यह सीधे एंजाइमों का पता लगाने और यों तो बहुत मुश्किल है क्योंकि EES, मुख्य रूप से प्रयोगशाला assays 2-4 में उनकी गतिविधियों को मापने के द्वारा, दशकों के लिए अध्ययन किया गया है.

कोशिकी एंजाइम गतिविधि (ईईए) सबसे ज्यादा मजबूती एंजाइम और इसी substrates की एकाग्रता द्वारा नियंत्रित किया जाता है. की बहुतायत अलग सी, एन, और मिट्टी में पी अपमानजनक एंजाइमों कई कारकों द्वारा नियंत्रित किया जाता है मैंमाइक्रोबियल बायोमास, सामुदायिक संरचना, सब्सट्रेट उपलब्धता, microclimate, और stoichiometric मांगों 5,6 ncluding. हालांकि, मिट्टी पर्यावरण के भीतर सीटू EEAs में भी आकार, सब्सट्रेट उपलब्धता के मामले में, तापमान 7,8, मिट्टी चिकनी मिट्टी और humic गुण 2 एंजाइमों के बंधन, और अंततः सक्रिय एंजाइम पूल विनियमित जो प्रसार की कमी के 9, से प्रभावित हैं , और कारोबार दरों में 10-12. विभिन्न पर्यावरण साइटों में मिट्टी माइक्रोबियल समारोह की व्याख्या करने के लिए प्रयोगशाला एंजाइम assays का उपयोग करते हैं, इसलिए, सीटू मिट्टी की स्थिति में स्वीकार करने के लिए महत्वपूर्ण है.

ईईए के कई अलग अलग वर्गों (और अधिक विस्तार के लिए "अभिकर्मकों टेबल की सूची" देखें) सिंथेटिक substrates की एक किस्म का उपयोग कर प्रयोगशाला assays में मात्रा निर्धारित किया जा सकता है. कुछ प्रोटोकॉल डब्ल्यू, एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ पता लगाया जा सकता है कि एक वर्णमिति प्रतिक्रिया के लिए मिलकर कर रहे हैं कि assays में substrates उपयोगहम एक फ्लोरोसेंट आधा भाग ही रहे हैं कि substrates के उपयोग, यहाँ का वर्णन प्रोटोकॉल सहित hile दूसरों को. प्रतिदीप्ति ई assays आमतौर पर वर्णमिति assays से (परिमाण के एक आदेश से) और अधिक संवेदनशील होते हैं (एक सिंथेटिक सब्सट्रेट के साथ जुड़ा हुआ एक वर्णजनीय आधा भाग का उपयोग करता है) 12-14. एक ब्याज के परिसर की मात्रा से संबंधित है पता लगाया और सबसे कम detectable संभावित एंजाइम की गतिविधि को अन्य संबंधित: ईईए का पता लगाने में संवेदनशीलता दो पहलुओं में शामिल हैं. वर्णमिति पी nitrophenol के लिए तरीके (PNP) आधारित assays अतीत में पाया जा सकता है 15,16 काम करता है. संक्षिप्त, मिट्टी में इष्टतम या क्षेत्र के प्रासंगिक तापमान और पीएच पर incubated (आमतौर <2 मिमी और हवा सूखे को sieved). जारी की प्रतिक्रिया उत्पाद एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर 14 के साथ colorimetrically निर्धारित किया जाता है जिस दर पर. प्रतिदीप्ति एंजाइम assays के उच्च संवेदनशीलता substr के साथ जुड़े fluorogenic आधा भाग जुदाई की अधिक संवेदनशील पता लगाने के कारण भाग में हैएक विशिष्ट तरंग दैर्ध्य में एक विशिष्ट वर्णजनीय आधा भाग की जुदाई के बाद गिरावट के बजाय रिकॉर्डिंग absorbance खा लिया. दो सबसे अधिक इस्तेमाल सिंथेटिक फ्लोरोसेंट संकेतक 4-methylumbelliferone (MUB) 17 और 7 अमीनो-4-methylcoumarin (MUC) 18,19 हैं. MUC से जुड़े substrates आमतौर पर ऐसी प्रोटीन और / या अमीनो एसिड के रूप में एन युक्त सिंथेटिक substrates के साथ जुड़े रहे हैं. फ्लोरोसेंट तकनीक पहले जलीय नमूने 20,21 के लिए विकसित की है, और मिट्टी के लिए उनके आवेदन संकेत शमन और हस्तक्षेप 22,23 के लिए नियंत्रण की आवश्यकता थे. Assays या तो बड़ी मात्रा के साथ पारंपरिक "बेंच शीर्ष" रसायन विज्ञान का उपयोग किया जा सकता है या बढ़ा throughput लेकिन संभवतः उच्च माप त्रुटि के साथ, microplate आधारित प्रोटोकॉल में नियोजित किया जा सकता. मिट्टी 24 में EEAs के फ्लोरोसेंट का पता लगाने के लिए कई व्यापक रूप से उद्धृत प्रोटोकॉल रहे हैं, कई प्रयोगशालाओं अक्सर अनजाने या कारण अंतर करने के लिए, इन प्रोटोकॉल पर सूक्ष्म परिवर्तनों को रोजगारप्रयोगशाला के उपकरण या अभिकर्मकों में है. प्रोटोकॉल के विवरण में उचित रूप में छोटे मतभेदों को दृढ़ता से EEAs 25,26 मापा प्रभावित और मानकीकृत एंजाइमों की कमी विभिन्न प्रयोगशालाओं के बीच assays जांच करने के लिए यह चुनौतीपूर्ण बनाता है. इस प्रकार, ईईए assays के मानकीकरण के लिए प्रोत्साहित करने के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल के प्रसार के लिए एक महत्वपूर्ण आवश्यकता है.

हमारे प्रोटोकॉल में, मिट्टी के नमूने एक पीएच बफर के साथ मिट्टी के नमूने के संयोजन और एक ब्लेंडर के साथ homogenizing द्वारा तैयार हैं. slurries तो fluorescently लेबल एक nonlimiting राशि के साथ inoculated हैं सी, एन, या पी अमीर सब्सट्रेट, ब्याज की विशेष अनुसंधान प्रश्न के आधार पर चुना. एंजाइम assays में मिट्टी slurries का प्रयोग सब्सट्रेट प्रसार सीमाओं को कम करने के लिए एक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है. फ्लोरोसेंट moieties वे अपने संबंधित substrates से चिपके रहते हैं जब तक बुझती हैं, और फ्लोरोसेंट डाई सब्सट्रेट बी से जारी है के रूप में इस तरह के एंजाइम की गतिविधि का पता लगाया जा सकता हैY एक एंजाइम उत्प्रेरित प्रतिक्रिया. समय के माध्यम से बढ़ती प्रतिदीप्ति तीव्रता एंजाइम उत्प्रेरित प्रतिक्रिया की दर को दर्शाता है.

प्रतिदीप्ति एंजाइम परख की सामान्य अवधारणा एक fluorogenic आधा भाग (फ्लोरोसेंट डाई) के साथ ही सिंथेटिक substrates, मिट्टी के नमूने 27 में शामिल कर रहे हैं. एंजाइम उत्प्रेरित सब्सट्रेट गिरावट के दौरान, बंधन फ्लोरोसेंट डाई और सब्सट्रेट के बीच टूट जाता है. सब्सट्रेट से मुक्त फ्लोरोसेंट डाई फलस्वरूप एंजाइम गतिविधि का एक अप्रत्यक्ष मूल्यांकन के रूप में प्रयोग किया जाता है, और डाई प्रतिदीप्ति तीव्रता का पता लगाने के लिए एक microplate रीडर का उपयोग मात्रा निर्धारित किया जा सकता है. मुक्त डाई एक अलग तरंग दैर्ध्य के प्रकाश को अवशोषित करने के बाद एक तरंगदैर्ध्य के प्रकाश का उत्सर्जन करता है के रूप में संक्षेप में, प्रतिदीप्ति मात्रा का ठहराव पूरा किया है. प्रतिदीप्ति तीव्रता उत्तेजना और पहचान दोनों में सक्षम एक प्लेट रीडर द्वारा दर्ज की गई है. एंजाइम गतिविधि बाद में जाना जाता फ्लोरोसेंट डाई conce पर आधारित मात्रा निर्धारित किया जा सकता हैपरख (यानी 4-methylumbelliferone (MUB) या 7 एमिनो में इस्तेमाल किया सब्सट्रेट के विशिष्ट fluorogenic आधा भाग के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता का एक मानक कमजोर पड़ने की अवस्था को संदर्भित के साथ सब्सट्रेट (सिंथेटिक सब्सट्रेट यानी ज्ञात मात्रा मिट्टी के नमूने के लिए जोड़ा) की ntrations -4-methylcoumarin (MUC)). (एंजाइम गतिविधि मात्रा का ठहराव पर विशेष जानकारी के लिए प्रोटोकॉल अनुभाग को देखें).

प्रयोगशाला मिट्टी एंजाइम assays माइक्रोबियल समुदाय समारोह का आकलन करने के लिए उपयोगी होते हैं, लेकिन उपयोगकर्ताओं को 10 की पहचान करनी चाहिए कि कई तकनीकी सीमाएं हैं. प्रतिदीप्ति assays के प्रकाश के संपर्क में जब दोष और / या कई फ्लोरोसेंट यौगिकों की अस्थिरता की वजह से हस्तक्षेप से ग्रस्त कर सकते हैं, तो फ्लोरोसेंट substrates 25 हैंडलिंग जब सावधानी की आवश्यकता है. मिट्टी slurries में मिट्टी particulates और / या जैविक सामग्री भी शमन प्रभाव 26 के रूप में जाना जाता है प्रतिदीप्ति तीव्रता के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं.इसके अलावा, प्रयोगशाला एंजाइम assays केवल प्रयोगशाला परिस्थितियों में संभावित EEAs का आकलन है. इन विट्रो assays सब्सट्रेट प्रसार और बहुतायत nonlimiting है जहां परिस्थितियों में EEAs उपाय. इसलिए, इन assays द्वारा उपलब्ध कराए गए आंकड़ों सीटू मिट्टी की स्थिति 10 में के तहत EEAs के लिए एक अच्छा प्रॉक्सी नहीं हो सकता है. कुल मिलाकर, एंजाइम गतिविधि मिट्टी के प्रकार के समान हैं जिसमें रिश्तेदार की तुलना के लिए बहुत उपयोगी है. भौतिक या रासायनिक गुणों में मतभेद है कि मिट्टी के बीच गतिविधियों तुलना करने के लिए इस पद्धति का उपयोग हालांकि, जब सावधानी प्रयोग किया जाना चाहिए. इस मिट्टी के प्रकार और तापमान में अंतर काफी सीटू एंजाइम कैनेटीक्स में की स्थिति बदल सकते हैं कि इस तथ्य के कारण है. एक और सीमा अपेक्षाकृत कुछ substrates (प्राकृतिक वातावरण की तुलना में) व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हो जाता है. इसके अलावा, एंजाइम assays के लिए इस्तेमाल किया सिंथेटिक substrates सही वर्तमान या उपलब्ध नही मिट्टी substrates का प्रतिनिधित्व नहीं कर सकते हैं (आसानी से घुलनशील) अपेक्षाकृत सरल हैंबगल में ई. विचार करने के लिए एक और पहलू मिट्टी slurries का उपयोग सीटू की स्थिति 2 में के तहत सक्रिय नहीं हो सकता है कि (यानी कार्बनिक पदार्थ या चिकनी मिट्टी द्वारा immobilized) कुछ स्थिर एंजाइमों की गतिविधि को शामिल करेंगे. प्रयोगशाला एंजाइम assays भी मिट्टी (एंजाइम कारोबार दरों) या मिट्टी एंजाइमों का उत्पादन कर रहे हैं कि विशिष्ट माइक्रोबियल प्रजातियों के बारे में जानकारी में एंजाइमों की हठ के बारे में जानकारी प्रदान नहीं करते हैं.

Protocol

1. परख सेट अप

  1. 3 लेबल गहरी अच्छी तरह प्लेटें: "नमूना", "MUB मानक", और "MUC मानक".
  2. प्रत्येक मानक (0, 2.5, 5, 10, 25, 50, और 100 माइक्रोन के MUB) और सब्सट्रेट अलग स्वच्छ, prelabeled जलाशयों में (बीजी, सीबी, नाग, फॉसफोरस, XYL, एजी, एलएपी) (पंक्तियों में उन्मुख) डालो .
  3. MUB मानक प्लेट (तालिका 1) के इसी कुओं में उपयुक्त MUB मानक पिपेट.
    1. MUB मानक प्लेट की पंक्ति में 0 माइक्रोन MUB की पिपेट 200 μl.
    2. पिपेट 200 MUB मानक प्लेट की पंक्ति बी में 2.5 माइक्रोन MUB के μl.
    3. MUB मानक प्लेट की पंक्ति सी में 5 माइक्रोन MUB की पिपेट 200 μl.
    4. MUB मानक प्लेट की पंक्ति डी में 10 माइक्रोन MUB की पिपेट 200 μl.
    5. MUB मानक प्लेट की पंक्ति ई में 25 माइक्रोन MUB की पिपेट 200 μl.
    6. MUB मानक प्लेट की पंक्ति एफ में 50 माइक्रोन MUB की पिपेट 200 μl.
    7. 100 μ की पिपेट 200 μlMUB मानक प्लेट की पंक्ति जी में एम MUB.
    8. MUC मानक थाली की इसी कुओं में MUC मानकों के लिए 1.3.8 - दोहराएँ 1.3.1 दोहराएँ.
  4. प्रत्येक मिट्टी के नमूने लिए तैयार मिट्टी slurries.
    1. ब्लेंडर में क्षेत्र नम मिट्टी की 2.75 ग्राम वजन.
    2. 50 मिमी बफर के 91 मिलीलीटर जोड़ें. 1 मिनट के लिए उच्च पर ब्लेंड.
    3. कम से कम के रूप में व्यापक हलचल पट्टी के साथ 8 चैनल विंदुक के रूप में एक स्वच्छ कांच का कटोरा में ब्लेंडर सामग्री डालो.
    4. कम पर मिट्टी गारा मिश्रण, हलचल प्लेट पर रखें.
    5. पिपेट नमूना प्लेट (तालिका 2) के प्रथम स्तंभ में मिट्टी गारा के 800 μl.
    6. MUB मानक और MUC मानक प्लेट (तालिका 1) के 1 सेंट स्तंभ में दोहराएँ.
    7. डि एच 2 ओ के साथ ब्लेंडर, हलचल प्लेट और हलचल बार कुल्ला या मिट्टी के नमूने के बीच बफर.
    8. प्रत्येक बाद मिट्टी के नमूने (1 टेबल्स के साथ अगले स्तंभ के लिए आगे बढ़, प्रत्येक नमूने के लिए) 1.4.7 और - दोहराएँ 1.4.1 कदमों2).
  5. नमूना प्लेट (तालिका 2) की इसी कुओं में (इस उदाहरण में, 200 माइक्रोन सांद्रता) उपयुक्त सब्सट्रेट पिपेट.
    1. नमूना थाली की पंक्ति में बीजी सब्सट्रेट के पिपेट 200 μl.
    2. पिपेट नमूना थाली की पंक्ति बी में सीबी सब्सट्रेट के 200 μl.
    3. नमूना थाली की पंक्ति सी में नाग सब्सट्रेट के पिपेट 200 μl.
    4. पिपेट नमूना थाली की पंक्ति डी में फॉसफोरस सब्सट्रेट के 200 μl.
    5. पिपेट नमूना थाली की पंक्ति ई में XYL सब्सट्रेट के 200 μl.
    6. नमूना थाली की पंक्ति एफ में एजी सब्सट्रेट के पिपेट 200 μl.
    7. नमूना थाली की पंक्ति जी में एलएपी सब्सट्रेट के पिपेट 200 μl.
    8. प्रत्येक ऊष्मायन तापमान नमूना थाली के लिए 1.5.7 - दोहराएँ 1.5.1 दोहराएँ.

2. परख प्लेटें की ऊष्मायन

  1. गहरे अच्छी तरह से प्लेट ("नमूना", "MUB मानक", और "MUC मानक सील4 ;) प्लेट मैट के साथ.
  2. समाधान अच्छी तरह मिलाया जाता है जब तक हाथ से प्रत्येक (सील) थाली उलटें (~ 10x).
  3. आवश्यक ऊष्मायन समय अवधि (3 टेबल) के लिए उपयुक्त इनक्यूबेटर में प्लेटें प्लेस.
  4. समय 0 के रूप में पहली बार रिकार्ड. आप इनक्यूबेटर (3 टेबल) से थाली को दूर करने के लिए पता है जब इतनी भी उचित ऊष्मायन बार रिकॉर्ड.
  5. प्रत्येक ऊष्मायन अवधि, अपकेंद्रित्र ~ 2900 x जी पर 3 मिनट के लिए सील प्लेटों के अंत में.
  6. प्रमाणीकरण के बाद (एक काले रंग की थाली प्रत्येक incubated गहरी अच्छी तरह से थाली के लिए उपयोग किया जाएगा) काला फ्लैट तली 96 अच्छी तरह प्लेटें में इसी कुओं में incubated गहरी अच्छी तरह से प्लेटों के प्रत्येक अच्छी तरह से 250 μl हस्तांतरण. यह काला फ्लैट तली 96 अच्छी तरह प्लेटें में यही वेल्स (यानी A1 ... A12, आदि) में incubated गहरी अच्छी तरह से प्लेटों से नमूने हस्तांतरण करने के लिए महत्वपूर्ण है (तालिका 1, 2).

3. फ्लोरोसेंट माप परएक microplate fluorometer

  1. इस्तेमाल किया fluorometric प्लेट रीडर के लिए निर्माता के निर्देशों, 450 एनएम के लिए 365 एनएम और उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य को उत्तेजना तरंगदैर्ध्य सेट (या उपयुक्त फिल्टर का उपयोग) के बाद.
  2. Fluorometer पर तीन प्लेटों पढ़ें. महत्वपूर्ण: नमूने और मानक प्लेट (यानी MUB या MUC) एक ही लाभ का उपयोग कर पढ़ा जाना चाहिए.
    1. स्वत: प्राप्त करने के लिए स्पेक्ट्रोफोटोमीटर सेट और MUC और MUB मानक प्लेटों पढ़ा.
    2. सेट का मार्गदर्शन करने के लिए लाभ, और इष्टतम से अगले सबसे कम संख्या के मूल्य में कमी, प्रत्येक मानक थाली के लिए, सबसे पास से पांच गोल. प्रत्येक थाली के लिए 2x दोहराएँ.
    3. स्वचालित करने के लिए लाभ निर्धारित और नमूना थाली चलाते हैं. स्टैंडर्ड प्लेट (यानी MUB और MUC) में से प्रत्येक के लिए उच्चतम लाभ मिलान करने के लिए मैन्युअल रूप से नमूना थाली फिर से चलाएँ.

4. डेटा विश्लेषण

  1. MUB के लिए स्प्रेडशीट में मानक वक्र प्रतिदीप्ति डेटा दर्ज (तालिका -4 ए) और MUC मानक (तालिका 4 बी)
    1. (Μmol) के लिए (माइक्रोन) सांद्रता कन्वर्ट (टेबल्स -4 ए और 4 बी).
  2. प्रत्येक नमूने के मानक वक्र प्रतिदीप्ति डेटा के लिए, ढाल, Y-अवरोधन, और आर MUB और MUC (μmol) मानक सांद्रता के लिए 2 मूल्यों की गणना. स्वीकार्य आर 2 मूल्यों प्रत्येक नमूने के लिए 0.98 से अधिक होना चाहिए (टेबल्स -4 ए और 4 बी). प्रतिदीप्ति निर्भर चर (y-अक्ष) और मानक एकाग्रता (μmol) स्वतंत्र चर (एक्स अक्ष) (चित्रा 1) के रूप में प्लॉट प्लॉट के रूप में पढ़ता के साथ, यह एक तितर बितर साजिश में मानक घटता कल्पना करने के लिए उपयोगी हो सकता है.
  3. आप संभावित EEAs में नमूना + सब्सट्रेट कच्चे प्रतिदीप्ति डेटा की गणना करने के MUB और MUC मानक वक्र ढलान और y-अवरोधन मूल्यों का उपयोग करेगा. जब आप पहली बार एक नई स्प्रेडशीट में नमूना + सब्सट्रेट कच्चे प्रतिदीप्ति डेटा दर्ज (तालिका 5a चाहिए (तालिका 5 ब) में प्रवेश करने की आवश्यकता होगी. नमूनों 25 डिग्री सेल्सियस (3 टेबल) पर incubated रहे थे क्योंकि इस उदाहरण में प्रवेश के समय मूल्यों, 3 घंटा कर रहे हैं, ध्यान दें.
    1. इसी नमूना प्रतिदीप्ति मूल्यों से मानक वक्र अवरोधन मूल्यों घटाना और फिर इसी मानक वक्र (तालिका 5C) की ढलान से विभाजित. [Y = नमूना प्रतिदीप्ति कच्चे पढ़ें, MUB या MUC मानक वक्र से बी = अवरोधन, एम = MUB से ढलान: एक्स = (वाई बी) / मी, जहां इसे पूरा करने के लिए नमूना एंजाइम एकाग्रता (एक्स) के लिए हल करने के लिए मानक लाइन समीकरण को पुनर्व्यवस्थित या MUC मानक वक्र].
    2. 91 मिलीलीटर (मिट्टी गारा में इस्तेमाल किया बफर मात्रा) (तालिका 5D) से, ऊपर कदम 4.3.1 से, नमूना μmol गुणा करें.
    3. [एंजाइम राशि: फूट डालो मूल्य नमूना विशिष्ट ऊष्मायन समय और सूखी मिट्टी जन (तालिका 5e) द्वारा कदम 4.3.2 में प्राप्त की. (& #956; मोल) मिलीलीटर x 1000 0.8 x 91 मिलीलीटर एक्स ऊष्मायन (मानव संसाधन) सूखी मिट्टी (G) एक्स एक्स]
      नोट: 0.8 मिलीलीटर अच्छी तरह से प्रत्येक में इस्तेमाल किया घोल की मात्रा है, और 1000 में अच्छी तरह से प्रत्येक में वास्तविक मिट्टी राशि के लिए सही.
    4. वांछित इकाइयों (nmol गतिविधि / ग्राम सूखी मिट्टी / घंटा) (तालिका 5F) पाने के लिए 1,000 से कदम 4.3.3 में प्राप्त मूल्य गुणा.

Representative Results

एनजाइम assays संभावित EEAs यों को और इसी तरह के नमूने के बीच गतिविधियों तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यहाँ, हम ऊंचा सीओ 2 और ताप उपचार (EHN) (आंकड़े 2-6) से अवगत कराया गया है कि मिट्टी के परिवेश जलवायु परिस्थितियों (ACN) का अनुभव है कि मिट्टी की तुलना करना एक प्रयोगात्मक जलवायु अध्ययन से प्रतिनिधि परिणाम प्रस्तुत करते हैं. सभी भूखंडों में संयंत्र कवर अंतराल C4 घास Bouteloua gracilis (HBK) के वर्चस्व वाले उत्तरी मिश्रित घास प्रेयरी की विशेषता थे. और दो ​​C3 घास, Hesperostipa comata Trin और Rupr. और Pascopyrum smithii (Rydb.), वनस्पति के बारे में 20% sedges और forbs से बना है. साइट विवरण और क्षेत्र प्रयोगात्मक डिजाइन के बारे में अधिक जानकारी के संदर्भ 28-30 में पाया जा सकता है. मिट्टी बदल जलवायु सी के जवाब में मिट्टी EEAs का आकलन करने के लिए एक 1.5 सेमी व्यास कोर का उपयोग कर उपचार भूखंडों में से प्रत्येक के भीतर दो अलग गहराई (0-5 सेमी और 5-15 सेमी) से एकत्र किए गएonditions. हमारे उदाहरण में (यानी 2-6 आंकड़े), नमूना आकार है (n = 3). भले ही यह कम से कम नमूना आकार का, भिन्नता ज्यादातर मामलों में अपेक्षाकृत छोटा है (त्रुटि सलाखों के द्वारा प्रदर्शन के रूप में) और मजबूती के साथ इलाज के भूखंडों के बीच संभावित EEAs में परिवर्तनशीलता को दर्शाता है. विचरण (एनोवा) और Tukey पद अस्थायी कई तुलना के विश्लेषण उपचार भूखंडों और मिट्टी गहराई के बीच एंजाइम गतिविधि में महत्वपूर्ण पारियों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया.

निम्नलिखित प्रतिनिधि परिणाम इस उच्च throughput, fluorometric परख (2) कैसे ईईए stoichiometry (3) रिश्ते पारिस्थितिकी तंत्र स्तर प्रक्रियाओं का संकेत हो सकता है और मिट्टी में (1) कुल ईईए परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि कैसे प्रदर्शित करने के लिए प्रदान किया गया है ऊष्मायन तापमान और ईईए के बीच. मृदा ईईए के आमतौर पर मिट्टी के पोषक तत्व सायकलिंग के लिए माइक्रोबियल समारोह में बदलाव से संबंधित करने के लिए अध्ययन कर रहे हैं, जलवायु परिवर्तन, वनस्पति समुदाय है के जवाब में माइक्रोबियल पोषक तत्व की मांग का आकलन करने के लिए उपयोगी संकेतकhifts, और अधिक मोटे तौर पर 31-33 कामकाज पारिस्थितिकी तंत्र. ईईए stoichiometry अधिक हाल ही में पर्यावरण की स्थिति में 5 को इसी संभावित माइक्रोबियल पोषक असंतुलन का आकलन करने के लिए पारिस्थितिक stoichiometric सिद्धांत और पारिस्थितिकी के चयापचय सिद्धांत अन्तर्विभाजक द्वारा मिट्टी जैव रासायनिक पोषक तत्व सायकलिंग का आकलन करने के लिए एक सूचकांक के रूप में अपनाया गया है. कई अध्ययनों से विस्तृत stoichiometric अनुपात पोषक विकास सीमाओं 34-36 का संकेत कर रहे हैं कि सुझाव दिया है, और मिट्टी के पोषक तत्वों सीमित हो जाते हैं, रोगाणुओं की कमी पोषक तत्वों 37 प्राप्त करने के लिए विशिष्ट एंजाइमों का उत्पादन करने के लिए चयापचय संसाधनों के आवंटन से जवाब. Ecoenzymatic सी: एन: पी stoichiometry अनुपात विभिन्न पर्यावरण perturbations के जवाब में संभावित माइक्रोबियल समुदाय पोषक मांगों में रिश्तेदार पारियों की पहचान करने के लिए इस प्रकार उपयोगी होते हैं 5. अन्त में, EEAs का तापमान संवेदनशीलता मिट्टी माइक्रोबियल समुदाय कार्यात्मक विविधता संभावना तापमान परिवर्तन से प्रभावित होता है कि कैसे आकलन करने के लिए उपयोगी हो सकता है <> 7,38 समर्थन. एनजाइम तापमान संवेदनशीलता व्यापक रूप से एक एंजाइम वर्ग के लिए मिट्टी के बीच भिन्न हो सकते हैं, और एंजाइमों के उत्पादन माइक्रोबियल समुदायों ऐतिहासिक स्थितियों 7 से जलवायु में बदलाव को इसी एंजाइम की गतिविधि में बदलाव दिखा दिया है. इस प्रकार EEs के थर्मल पारिस्थितिकी से संबंधित एंजाइम गतिविधि सवालों 39,40 परिवर्तन जलवायु के जवाब में माइक्रोबियल कार्यात्मक गतिशीलता और belowground पारिस्थितिकी तंत्र प्रक्रियाओं का आकलन करने के लिए एक उपयोगी तरीका हो सकता है.

इस उदाहरण में, संभावित सी, एन, और 0-5 सेमी मिट्टी गहराई में assayed पी एंजाइम अधिग्रहण गतिविधियों प्रयोगात्मक उपचार (चित्रा 2A) द्वारा अलग नहीं किया था. हालांकि, 5-15 सेमी मिट्टी गहराई में, कई संभावित EEAs काफी चित्रा (2 बी) अलग था. उदाहरण के लिए, β-1 सी अपमानजनक एंजाइमों ,4-ग्लुकोसिडेस और β-D-cellobiohydrolase (0.038 ≤ पी, चित्रा 2 बी) EHN भूखंडों में कम थे ACN भूखंडों की तुलना में. एन पी खान में काम करनेवालाएंजाइमों (क्रमशः β-1 ,4-N-acetylglucosaminidase और फॉस्फेट,) alizing (0.012 ≤ पी, चित्रा 2 बी) EHN भूखंडों में भी कम थे 5-15 सेमी मिट्टी गहराई में ACN की तुलना में.

की राशि की गणना और साजिश रचने के सभी सी, एन, या पी साइकिल संभावित EEAs संभावित मिट्टी सी, एन, और / या पी चक्र (चित्रा 3) के बारे में व्यापक पैटर्न का पालन करने के लिए एक उपयोगी तरीका हो सकता है. इस उदाहरण में, β-1 ,4-ग्लुकोसिडेस, β-D-cellobiohydrolase, β-Xylosidase, और α-1 ,4-ग्लुकोसिडेस संभावित EEAs की राशि संभावित सी साइकिल चालन गतिविधियों का प्रतिनिधित्व करने के लिए गणना की गई. β-1 ,4-N-acetylglucosaminidase और एल leucine Aminopeptidase की राशि संभावित एन साइकिल चालन गतिविधियों का प्रतिनिधित्व करने के लिए गणना की गई. फॉस्फेट संभावित पी सायकलिंग गतिविधियों का प्रतिनिधित्व करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. इस उदाहरण में, कुल सी, एन और पी से साइकिल के लिए संभावित EEAs EHN 5-15 सेमी मिट्टी गहराई में ACN भूखंडों की तुलना ज़मीन जायदाद (figu में कम trendedपुन 3). हालांकि, इस प्रवृत्ति (0.046 ≤ पी, चित्रा 3) के कुल एन पी सायकलिंग गतिविधियों के लिए ही महत्वपूर्ण था. मृदा EEAs काफी चित्रा (3) 0-5 सेमी मिट्टी गहराई में उपचार भूखंडों के बीच अलग नहीं किया था. इस उदाहरण के लिए निष्कर्ष मिट्टी गहराई के जवाब में एंजाइम गतिविधि कार्यात्मक समूह में विषम प्रवृत्तियों उपचार भूखंडों के बीच (यानी सी, एन, या पी अपमानजनक एंजाइमों) (EHN बनाम ACN) का सुझाव है. उदाहरण के लिए, सी, एन और परिवेश ज़मीन जायदाद (ACN) में पी अपमानजनक मिट्टी EEAs एक उलटा पैटर्न (चित्रा 3 ए सी का प्रदर्शन किया जो ऊंचा सीओ 2 और ताप (EHN), के संपर्क में मिट्टी की तुलना में कम गहराई में उच्च trended ).

एनजाइम stoichiometry पर्यावरण (चित्रा 4) में संभावित एंजाइम की गतिविधियों का आकलन करने के लिए एक और उपयोगी तरीका है. पोषक तत्वों के लिए माइक्रोबियल मांग पर्यावरण के संबंध में माइक्रोबियल बायोमास की मौलिक stoichiometry द्वारा निर्धारित किया जाता हैपोषक तत्वों की उपलब्धता 32. इसी तरह, रोगाणुओं भी पारिस्थितिक stoichiometry 41 के रूप में भेजा उनके मिट्टी के वातावरण के भीतर पोषक मांगों को पूरा करने के लिए विशेष एंजाइमों (यानी सी, एन, या पी अपमानजनक एंजाइमों) का उत्पादन. संभावित EEAs के अनुपात माइक्रोबियल पोषक तत्व की मांग का आकलन करने के लिए एक ही रास्ता है. उदाहरण के लिए, दोनों के बीच एक 1:1 अनुपात (सी में उदाहरण के लिए: एन पोषक अधिग्रहण) कार्य समूहों एंजाइम माइक्रोबियल बायोमास सी पर विचार जब एन की मांग के लिए सी के लिए मांग करने के लिए उच्च रिश्तेदार है कि सुझाव देना चाहूँगा: सामुदायिक स्तर पर एन अनुपात आमतौर पर 8:01 42 है. इस उदाहरण में, मिट्टी एंजाइम stoichiometry सी: एन, सी: पी, या एन: पी गतिविधियों में काफी 0-5 सेमी मिट्टी गहराई (आंकड़े -4 ए सी) में इलाज के भूखंडों के बीच मतभेद है. हालांकि, संभावित एंजाइम सी: पी और एन: पी अनुपात EHN में अधिक थे 5-15 सेमी मिट्टी गहराई में ACN भूखंडों की तुलना ज़मीन जायदाद (पी = 0.05; आंकड़े 4B और 4C). इस अवलोकन से पता चलता है कि वहाँअपेक्षाकृत उच्च पी खनिज EEAs सी और एन ईईए की तुलना में है 5-15 सेमी मिट्टी गहराई में (EHN की तुलना में) ACN भूखंडों. एनजाइम सी: R कारण EHN की तुलना में कम गहराई पर ACN भूखंडों में उच्च क्षमता सी EEAs (चित्रा -4 ए): एन अधिग्रहण गतिविधियों के अनुपात उच्च सी के साथ कुल सी EEAs द्वारा प्रदर्शन किया है कि एक समान प्रवृत्ति का प्रदर्शन किया.

तापमान दृढ़ता से मिट्टी EEAs प्रभावित कर सकते हैं. फिर भी, ठेठ प्रयोगशाला assays में, मिट्टी एंजाइमों सीटू तापमान की स्थिति में के अनुरूप नहीं हो सकता है कि एक ही तापमान पर मापा जाता है. हमारे प्रतिदीप्ति एंजाइम परख विधि हमें तुलना के लिए कई प्रयोगशाला ऊष्मायन तापमान को शामिल करके सीटू तापमान प्रभाव में विचार करने के लिए अनुमति देता है. कई तापमान पर प्रयोगशाला incubations का प्रयोग हमें Arrhenius साजिश और क्यू 10 गणना का उपयोग तापमान पर निर्भर एंजाइम कैनेटीक्स डेटा का विश्लेषण करने के लिए अनुमति देता है. Arrhenius साजिश सक्रियण ऊर्जा कल्पना करने के लिए उपयोग किया जाता है, और हमें प्लॉट किए जाते हैंएक्स अक्ष पर डिग्री केल्विन (1 / कश्मीर) के लिए परिवर्तित उलटा तापमान के एक समारोह के रूप में एंजाइम गतिविधि का लघुगणक (Y-अक्ष निर्भर चर) आईएनजी (यानी स्वतंत्र चर, आंकड़े 5A-C). सक्रियण ऊर्जा आमतौर पर एक रासायनिक प्रतिक्रिया (यानी छोटे उत्पादों में एक दिया सब्सट्रेट नीचा) को उत्प्रेरित करने के लिए आवश्यक न्यूनतम ऊर्जा के रूप में परिभाषित किया गया है. हमारे प्रयोजनों के लिए, ऊर्जा सक्रियण एंजाइम उत्प्रेरित प्रतिक्रियाओं का तापमान संवेदनशीलता के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में कार्य करता है. उच्च सक्रियण ऊर्जा एंजाइम तापमान संवेदनशीलता को दर्शाता है. इसी तरह, सक्रियण ऊर्जा (यानी आंकड़े 5D-च) सीधे क्यू 10 मूल्यों (यानी आंकड़े 6a सी) के अनुरूप हैं. सक्रियण ऊर्जा और व्यावहारिक अनुप्रयोग की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया सूत्रों के आगे स्पष्टीकरण कई अतीत में पाया जा सकता है 40,43-45 काम करता है. Arrhenius भूखंडों, सक्रियण ऊर्जा, और क्यू 10 भूखंडों अनावश्यक जानकारी और नहीं करना चाहिए प्रदानसभी प्रकाशन के लिए डेटा पेश करने के लिए एक ही पांडुलिपि में इस्तेमाल किया जा (आंकड़े 5 और 6). कैनेटीक्स डेटा 10 - इन तकनीकों का उपयोग करते हैं, इसलिए, यह आपके एंजाइम तापमान के लिए सबसे उपयुक्त साजिश प्रकार का चयन करने के लिए आवश्यक है. सभी साजिश प्रकार (Arrhenius और क्यू 10) प्रदर्शन प्रयोजनों के लिए यहां प्रस्तुत किए गए; एंजाइम परिणाम पेश करने के लिए कैसे का दृश्य उदाहरण प्रदान करने के लिए.

हमारे उदाहरण में, हम संभावित सी, एन, और दो ​​मिट्टी गहराई में दोनों को उपचार भूखंडों के बीच पी EEAs के लिए संभावित एंजाइम कैनेटीक्स का मूल्यांकन (चित्रा 5, 6 चित्रा). खोज EEAs का तापमान संवेदनशीलता Arrhenius भूखंडों (आंकड़े 5 ए सी) और इसी सक्रियण ऊर्जा (चित्रा लोमो) और (आश्चर्य नहीं) के लिए क्यू में प्रदर्शन के रूप में सक्रियण ऊर्जा के लिए मिट्टी गहराई में या तो इलाज के भूखंडों के बीच काफी अलग नहीं था कि प्रदर्शन किया 10 पीएलओ(; आंकड़े 6A-C 15 डिग्री सेल्सियस और 25 डिग्री सेल्सियस प्रयोगशाला incubations के बीच इस उदाहरण में) टीएस. इस एंजाइम कैनेटीक्स इस विशेष अध्ययन में क्षेत्र प्रयोगात्मक उपचार से प्रभावित नहीं थे कि पता चलता है.

तालिका 1
तालिका 1. पूर्व incubating को गहरी अच्छी तरह से थाली में मिट्टी के नमूने के साथ व्यवस्थित करने और लोडिंग प्रतिदीप्ति मानकों (MUB या MUC) के लिए मिट्टी के नमूने के साथ प्रतिदीप्ति मानक सांद्रता के लिए अच्छी तरह से गहरी प्लेट डिजाइन. टेम्पलेट. नोट: कॉलम में एक ही मिट्टी के नमूने (मिट्टी गारा परिवर्धन के 800 μl) का प्रतिनिधित्व करते हैं. प्रतिदीप्ति मानक सांद्रता के एक ढाल प्रत्येक पंक्ति (200 μl परिवर्धन) के लिए लोड किया जाता है. प्रत्येक सेल प्रतिदीप्ति मानक एकाग्रता के साथ साथ मिट्टी गारा फाईल का प्रतिनिधित्व करता है. उदाहरण के लिए, S1 - S12 मिट्टी के नमूने (मिट्टी गारा के 800 μl) प्रतिनिधित्व करते हैं, MUB 0-100 माइक्रोन = 4-Methylumbelliferone सांद्रता (200 μl परिवर्धन). इस उदाहरण में, पंक्ति एच खुला है, और यदि आवश्यक हो तो एक उच्च प्रतिदीप्ति मानक एकाग्रता शामिल करने के फलस्वरूप उपलब्ध है. मानक वक्र सांद्रता बढ़ाने के लिए यह निर्णय अपने विशिष्ट मिट्टी के नमूने के लिए उच्च क्षमता एंजाइम गतिविधि (और / या इस्तेमाल किया सब्सट्रेट सांद्रता) के लिए आवश्यक हो सकता है. अपने नमूने के लिए संभावित एंजाइम गतिविधि मानक वक्र मूल्यों की सीमा के भीतर गिर चाहिए. बड़ा टेबल देखने के लिए यहां क्लिक करें .

तालिका 2
तालिका 2. आयोजन और पूर्व incubating को गहरी अच्छी तरह से थाली में मिट्टी के नमूने और substrates लोड करने के लिए सब्सट्रेट. टेम्पलेट के साथ मिट्टी के नमूने के लिए अच्छी तरह से गहरी प्लेट डिजाइन. नोट: कॉलम में एक ही मिट्टी के नमूने (इतनी के 800 μl का प्रतिनिधित्वआईएल घोल परिवर्धन). विभिन्न substrates (200 μl परिवर्धन) प्रत्येक पंक्ति में लोड कर रहे हैं. प्रत्येक कक्ष मिट्टी के नमूने प्लस सब्सट्रेट अलावा प्रतिनिधित्व करता है. उदाहरण के लिए, S1 - S12 अद्वितीय मिट्टी के नमूने (मिट्टी गारा के 800 μl) का प्रतिनिधित्व करते हैं. Substrates (200 μl परिवर्धन) में शामिल हैं: बीजी = 4-Methylumbelliferyl β-D-glucopyranoside, सीबी = 4-Methylumbelliferyl β-D-cellobioside, नाग 4-Methylumbelliferyl N-acetyl-β-D-glucosaminide =; फॉसफोरस = 4-Methylumbelliferyl फॉस्फेट: XYL = 4-Methylumbelliferyl-β-D-xylopyranoside, एजी = 4-Methylumbelliferyl α-D-glucopyranoside, और गोद = एल leucine-7-amido-4-methylcoumarin हाइड्रोक्लोराइड. इस उदाहरण में, पंक्ति एच खुला है, और अगर वांछित एक और संभावित एंजाइम गतिविधि का आकलन करने के लिए एक और सब्सट्रेट शामिल करने के फलस्वरूप उपलब्ध है. बड़ा टेबल देखने के लिए यहां क्लिक करें .

तापमान समय
4 डिग्री सेल्सियस ~ 23 घंटा
15 डिग्री सेल्सियस 6 घंटा
25 डिग्री सेल्सियस 3 घंटा
35 डिग्री सेल्सियस 1.5 घंटा

तालिका 3. इनक्यूबेटर तापमान ऊष्मायन समय अवधि इसी के लिए जरूरी है. ऊष्मायन तापमान और एंजाइम परख प्रक्रिया के लिए इसी समय अवधि.

तालिका 4
तालिका 4. MUB और MUC मानक वक्र गणना. को व्यवस्थित करने के लिए दर्शाता एक) MUB और ख) MUC कच्चे प्रतिदीप्ति डेटा (μmol) बाद में ढाल, Y-अवरोधन, और आर चुकता मूल्यों की गणना करने के लिए. अपने मानक एकाग्रता घटता से ढलान, Y-अवरोधन, और आर चुकता मूल्यों की गणना का चयन करने के लिए (या प्लाट)MUB और / या स्वतंत्र चर (एक्स अक्ष) के रूप में निर्भर चर (y-अक्ष) और मानक एकाग्रता (μmol) के रूप में MUC कच्चे प्रतिदीप्ति डेटा. नोट:. MUB = 4-Methylumbelliferone; MUC = 7 एमिनो-4-methylcoumarin बड़ा टेबल देखने के लिए यहां क्लिक करें .

सारणी 5
सारणी 5. . Μmol गतिविधि / ग्राम सूखी मिट्टी / घंटा: एंजाइम गतिविधि गणना एक) नमूना कच्चे प्रतिदीप्ति डेटा को व्यवस्थित और बाद में EEAs गणना करने के लिए (बीएफ) आवश्यक कदम प्रदर्शन करने के लिए कैसे करें. नोट: S1 - S12 अद्वितीय मिट्टी के नमूने का प्रतिनिधित्व करते हैं. Substrates शामिल हैं: बीजी = 4-Methylumbelliferyl β-D-glucopyranoside, सीबी = 4-Methylumbelliferyl β-D-cellobioside, नाग 4-Methylumbelliferyl N-acetyl-β-D-glucosaminide =; फॉसफोरस = 4-Methylumbelliferyl फोटोsphate: XYL = 4-Methylumbelliferyl-β-D-xylopyranoside, एजी = 4-Methylumbelliferyl α-D-glucopyranoside, और गोद = एल leucine-7-amido-4-methylcoumarin हाइड्रोक्लोराइड. बड़ा टेबल देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 1
चित्रा 1. स्वतंत्र चर (एक्स अक्ष) के रूप में निर्भर चर है (y-अक्ष) और मानक एकाग्रता (μmol) के रूप में कच्चे प्रतिदीप्ति डेटा के साथ मानक घटता के MUB मानक वक्र साजिश है. Scatterplot दृश्य.

चित्रा 2
चित्रा 2. सी, एन और पी साइकिल चालन एंजाइम गतिविधियों. प्रेयरी ताप और ऊंचा सीओ 2 एन पर संभावित EEAsनियंत्रण भूखंडों में richment (phace) साइट (ACN: परिवेश जलवायु स्थितियों से अवगत कराया) और उपचार ज़मीन जायदाद (EHN: तापमान में वृद्धि और ऊंचा सीओ के संपर्क में 2). मृदा एंजाइमों एक) 0-5 सेमी मिट्टी गहराई और ख) 5-15 सेमी मिट्टी गहराई में assayed गया. ऊर्ध्वाधर सलाखों ± एसई नोट मतलब प्रतिनिधित्व: ACN = परिवेश - जलवायु भूखंडों; EHN = ऊंचा सीओ 2 और हीटिंग भूखंडों. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 3
चित्रा 3. कुल सी, एन और पी साइकिल चालन stoichiometric अनुपात एंजाइम एक) सी, बी) एन के अधिग्रहण में शामिल संभावित EEAs की राशि, और ग) phace प्रयोग में दोनों को उपचार समूहों पी के लिए 0-5 सेमी और 5 पर. - 15 सेमी मिट्टी में गहराई. वीertical सलाखों ± एसई नोट का मतलब प्रतिनिधित्व: ACN = परिवेश - जलवायु भूखंडों; EHN = ऊंचा सीओ 2 और हीटिंग भूखंडों. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 4
चित्रा 4. (: जलवायु स्थितियों परिवेश को उजागर ACN) और उपचार ज़मीन जायदाद (EHN. कुल सी, एन, पी और साइकिल चालन एंजाइम गतिविधियों प्रेयरी ताप और ऊंचा सीओ 2 संवर्धन नियंत्रण भूखंडों में (phace) साइट पर एंजाइम अधिग्रहण गतिविधियों stoichiometric अनुपात के लिए एंजाइम stoichiometry: बढ़ा तापमान के संपर्क में और ऊंचा सीओ 2). कुल मिट्टी एक) सी: A, B) सी: पी और ग) एन: पी 0-5 सेमी और 5-15 सेमी मिट्टी गहराई में दोनों को उपचार समूहों के लिए साजिश रची गई थी. ऊर्ध्वाधर सलाखों मतलब ± एसई नोट प्रतिनिधित्व: ACN= परिवेश - जलवायु भूखंडों; EHN = ऊंचा सीओ 2 और हीटिंग भूखंडों. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 5
चित्रा 5. . सी) के साथ ही कुल डी के लिए इसी सक्रियण ऊर्जा मूल्यों, संभावित EEAs की कुल सी, एन और पी साइकिल चालन एंजाइम सक्रियण ऊर्जा तापमान संवेदनशीलता कुल एक) सी, बी) एन के लिए Arrhenius भूखंडों का उपयोग कर, और ग) पी अपमानजनक एंजाइमों प्रदर्शित , ई) एन, और एफ) पी प्रेयरी ताप और ऊंचा सीओ 2 संवर्धन (phace) स्थल पर उपचार भूखंडों और मिट्टी गहराई के बीच अपमानजनक एंजाइमों. ACN = एक: सक्रियण ऊर्जा (यानी लोमो) के लिए ऊर्ध्वाधर सलाखों ± एसई नोट मतलब का प्रतिनिधित्वmbient - जलवायु भूखंडों; EHN = ऊंचा सीओ 2 और हीटिंग भूखंडों. प्रकाशन के लिए, यह लेखक आम तौर पर Arrhenius भूखंडों (यानी एसी) या सक्रियण ऊर्जा मूल्यों (यानी लोमो), लेकिन दोनों नहीं साजिश प्रकार या तो पेश करने के लिए चुनना होगा कि नोट करना महत्वपूर्ण है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 6
चित्रा 6. कुल सी, एन और पी साइकिल चालन एंजाइम Q10 (15-25 डिग्री सेल्सियस). तापमान कुल एक) सी, बी) एन के लिए 15 डिग्री सेल्सियस और 25 डिग्री सेल्सियस पर प्रयोगशाला incubations पर आधारित क्यू 10 के रूप में मापा संभावित EEAs, की संवेदनशीलता, और ग) पी प्रेयरी ताप और ऊंचा सीओ 2 <पर उपचार भूखंडों और मिट्टी गहराई के बीच अपमानजनक एंजाइमों/ उप> संवर्धन (phace) साइट. प्र. 10 के लिए ऊर्ध्वाधर सलाखों ± एसई नोट मतलब प्रतिनिधित्व: ACN = परिवेश - जलवायु भूखंडों; EHN = ऊंचा सीओ 2 और हीटिंग भूखंडों. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

Discussion

संभावित मिट्टी EEAs की प्रयोगशाला आधारित माप पारिस्थितिकी तंत्र के कामकाज के लिए महत्वपूर्ण उनके अजैव पर्यावरण के लिए माइक्रोबियल प्रतिक्रियाओं में अंतर्दृष्टि, और उनके परिणामों को प्रदान कर सकते हैं. इस उदाहरण डेटा सेट के परिणाम की न्यूनतम मतभेद जलवायु उपचार भूखंडों के बीच मिट्टी एंजाइम गतिविधि या कैनेटीक्स में मौजूद सुझाव है कि. हालांकि, भूखंडों के बीच व्युत्क्रम प्रवृत्तियों ऐसी मिट्टी की नमी, मिट्टी पीएच या पौधों की वृद्धि के रूप में माइक्रोबियल EEAs का उत्पादन प्रभावित हो सकता है कि covariates की आगे की जांच के लिए प्रोत्साहित करते हैं. कुल मिलाकर, मिट्टी में (1) कुल ईईए, (2) ईईए stoichiometry (3) Arrhenius भूखंडों / सक्रियण ऊर्जा, और (4) क्यू 10 पारिस्थितिकी तंत्र स्तर प्रक्रियाओं का संकेत हो सकता है कि तरीकों की एक व्यापक स्पेक्ट्रम उपलब्ध कराता के मामले में EEAs आकलन मजबूती के साथ मिट्टी पारिस्थितिकी तंत्र कार्यात्मक गतिशीलता विशेषताएँ जहाँ से.

उच्च throughput प्रतिदीप्ति आधारित ईईए assays व्यापक रूप से मिट्टी में संभावित EEAs जांच करने के लिए प्रयोग किया जाता है कि एक उपयोगी उपकरण हैंअन्य वातावरण. महत्वपूर्ण बात है, संभावित गतिविधियों एंजाइम पूल आकार प्रतिबिंबित करती हैं, लेकिन अपने आप से एंजाइम उत्पादन या कारोबार दरों में 46 यों नहीं है. तकनीक अपेक्षाकृत सरल है, प्रयोगशाला प्रोटोकॉल के बीच उचित रूप में मामूली अंतर परिणाम 13 की तुलनात्मकता प्रभावित कर सकते हैं. दुर्भाग्य से, हम वर्तमान में EEAs के लिए उपयुक्त मानकीकृत सकारात्मक नियंत्रण नहीं है. stoichiometric अनुपात का उपयोग इन चुनौतियों पर काबू पाने के लिए एक दृष्टिकोण है. अन्यथा, उच्च throughput तकनीक के आगमन से वातावरण 4 में एंजाइमों का अध्ययन उन्नत है. इन assays द्वारा उत्पन्न डेटा की सावधानी से व्याख्या माइक्रोबियल गतिविधि में महत्वपूर्ण रुझान स्पष्ट कर सकते हैं.

प्रोटोकॉल की मजबूती व्यक्ति के नमूनों के लिए विशिष्ट स्थितियों के लिए चयन करने की क्षमता की वजह से उपजी है, लेकिन यह भी सीमाओं में परिणाम कर सकते हैं. संशोधनों की एक श्रृंखला के नमूने सही के लिए मापा जाता है यह सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक हो जाएगा व्यक्तिगत क्षेत्र साइटें:

बफर

आप चयन बफर मिट्टी का पीएच पर निर्भर करेगा. बफरिंग भी 27,47 अत्यधिक पीएच निर्भर है जो फ्लोरोसेंट मानकों के प्रतिदीप्ति तीव्रता, स्थिर. नमूना पीएच स्तर - हम आम तौर पर मिट्टी गारा बनाने के लिए उपयोग किए जाने वाले पीएच बफर सबसे अच्छा मैच मिट्टी के लिए बफर के विशेष एसिड हदबंदी निरंतर (PKA) के लिए चुना जाता है जो एक 50 मिमी सोडियम एसीटेट या Tris बफर है. सोडियम एसीटेट 4.76 की एक pKa है, और Tris 8.06 की एक pKa है तो इन दो बफ़र्स की मात्रा व्यक्ति के नमूने के लिए वांछित pKa तक पहुंचने के लिए अलग अलग होंगे. फॉस्फेट बफर (PKA = 7.2) तटस्थ / थोड़ा बुनियादी मिट्टी के लिए सुझाव दिया गया है. हालांकि, हम उच्च फॉस्फेट सांद्रता एंजाइम गतिविधि के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं, यह बफर उपयोग करने से पहले प्रारंभिक अध्ययन में विश्लेषणात्मक परिवर्तनशीलता के लिए परीक्षण करने के लिए चेतावनी देते हैं.

फ्लोरोसेंट substrates के रख रखाव और भंडारण

jove_content "> प्रतिदीप्ति assays के प्रकाश के संपर्क में जब दोष और / या कई फ्लोरोसेंट यौगिकों की अस्थिरता की वजह से हस्तक्षेप से ग्रस्त कर सकते हैं, तो फ्लोरोसेंट substrates निपटने जब सावधानी की आवश्यकता है. हम दृढ़ता से fluorescently substrates और MUB और MUC मानकों लेबल के लिए किसी भी प्रकाश जोखिम को कम की सिफारिश . एम्बर कांच की बोतलों का उपयोग या फ्लोरोसेंट substrates और मानकों बनाने और भंडारण के लिए इस्तेमाल कांच के बने पदार्थ और कंटेनरों को कवर अत्यधिक की सिफारिश की है, कांच के बने पदार्थ और कंटेनरों को लपेटने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी में अच्छी तरह से काम करता है इसी तरह, कुशलता प्लेटें inoculating और अंधेरे इन्क्यूबेटरों को स्थानांतरित करने का सबसे अच्छा अभ्यास है हम सलाह देते हैं.. (-20 डिग्री सेल्सियस) के लिए अब दो महीने से (प्रकाश से उनकी रक्षा करते हुए) substrates और मानकों के भंडारण, और विगलन substrates (5 डिग्री सेल्सियस) ~ पूर्व एंजाइम परख (ओं) शुरू करने के लिए 24-48 घंटे.

डिजाइन और प्रतिकृति

अच्छी तरह से अच्छी तरह से नमूना बदलाव के लिए, negativ को लागू करने के लिए सबसे अच्छा खाते मेंई परख नियंत्रण और परख replicates (यदि संभव हो तो) की सिफारिश की है. रूपांतर कारण आम तौर पर अच्छी तरह से प्रत्येक में मिट्टी के कणों की मात्रा में अंतर और pipetting त्रुटियों के कारण होता है. इसलिए, मजबूत मिश्रण और अच्छा pipetting तकनीक काफी अच्छी तरह से बदलाव के लिए अच्छी तरह से कम कर देंगे. इसके अलावा, हम दृढ़ता से समय के साथ सब्सट्रेट विसंगतियां नजर रखने के लिए एक नकारात्मक परख नियंत्रण (बफर + सब्सट्रेट समाधान) को लागू करने का सुझाव. (हम आम तौर पर 96 अच्छी तरह से प्लेटों पर अंतिम स्तंभ का उपयोग करें) नकारात्मक नियंत्रण कुओं की तुलना द्वारा एंजाइम प्लेटें पढ़ने जब यह आसानी से नजर रखी जा सकती है. नकारात्मक सब्सट्रेट नियंत्रण इसलिए अच्छी तरह से पता लगाने की सीमा से ऊपर संकेत बढ़ जाती है, यह सब्सट्रेट और / या मानक के समाधान के प्रतिस्थापन की आवश्यकता होती है, संदूषण या सब्सट्रेट अस्थिरता का संकेत है, जो आम तौर पर स्थिर रहे हैं.

अन्य प्रोटोकॉल एक प्रकार का प्रदर्शन हालांकि throughput को अधिकतम करने के लिए, हमारे प्रोटोकॉल, एक भी गहरे कुएं microplate में कई संभावित EEAs शामिलविभिन्न EEAs के बाद प्लेट (प्लेट प्रति यानी एक सब्सट्रेट) प्रति परख अलग दरों पर होते हैं. भले ही, एंजाइम अनुकूलन दृष्टिकोण या एक थाली दृष्टिकोण में उच्च इस प्रदर्शन से पहले मिट्टी पर किया जाना चाहिए. प्रतिक्रिया दरों ऊष्मायन की समय अवधि के भीतर प्रत्येक एंजाइम के लिए अपेक्षाकृत संगत कर रहे हैं यदि एकाधिक substrates के एक ही थाली पर इस्तेमाल किया जा सकता है.

~ 1 ग्राम अन्य प्रोटोकॉल 24 में सिफारिश की है, जबकि हमारी प्रोटोकॉल, ~ घोल समाधान बनाने के लिए 2.75 ग्राम मिट्टी की सिफारिश की. हम अधिक मिट्टी (यदि संभव हो तो) का उपयोग कर के भीतर नमूना एंजाइम गतिविधि के स्तर में मिट्टी भिन्नता बेहतर कब्जा करने के लिए एक प्रभावी तरीका है कि सुझाव है. दूसरों को केवल substrates के 50 μl के साथ मिट्टी गारा के 200 μl सेते हैं, जबकि इस प्रोटोकॉल में, हम, 200 μl सब्सट्रेट के साथ मिट्टी गारा के 800 μl सेते हैं. यह बस अंततः मापा गतिविधि नहीं बदलता है कि स्केलिंग की एक समारोह है. व्यावहारिक लाभ भी कर रहे हैंबड़ी मात्रा में उपयोग करने के लिए. एक, यह fluorometer पर तीव्रता रिकॉर्डिंग से पहले काला फ्लैट तली 96 अच्छी तरह प्लेटें इसी में pipetting जबकि मिट्टी particulates से बचने के लिए आसान है. एंजाइम से संबंधित प्रतिदीप्ति तीव्रता रिकॉर्डिंग से पहले fluorometer को काला फ्लैट तली 96 अच्छी तरह प्लेटें स्थानांतरित दूसरा, जबकि अतिरिक्त मात्रा आकस्मिक फैल के मामले में उपयोगी है. मात्रा में भी मामूली विचलन काफी कुओं के बीच प्रतिदीप्ति में कमी होगी. अन्त में, इस वजह से यह प्रोटोकॉल के उच्च throughput प्रकृति के कारण, हम आमतौर पर नहीं बल्कि परख replicates प्रदर्शन से एंजाइम गतिविधि के स्तर में परिवर्तन का प्रतिनिधित्व करने के प्रयोगात्मक प्रतिकृति पर भरोसा करने के लिए चुनाव करते हैं. यह हमेशा विश्लेषणात्मक replicates शामिल करने के लिए सबसे अच्छा अभ्यास है, लेकिन व्यवहार में, हम अपने प्रोटोकॉल सीमित संसाधनों दिया विश्लेषणात्मक और प्रयोगात्मक प्रतिकृति के बीच एक संतुलित tradeoff प्रदान करता लग रहा है. इसी तरह, हमारे दृष्टिकोण सहज होना है, जो परख 25 प्रति अपेक्षाकृत अधिक अच्छी तरह से homogenized मिट्टी (2.75 ग्राम) का उपयोग करता हैntly भीतर मिट्टी विविधताओं कम हो जाती है. विश्लेषणात्मक प्रतिकृति का उपयोग करने के निर्णय को ध्यान से प्रारंभिक पढ़ाई 48 में विश्लेषणात्मक त्रुटि के लिए परीक्षण द्वारा विचार किया जाना चाहिए. हालांकि, हम कम से कम 4 उपचार समूह प्रतिकृति के साथ प्रयोगात्मक डिजाइन दृढ़ता परख replicates उपयोग करने पर विचार करना चाहिए कि सलाह देते हैं.

मिट्टी, बफर वॉल्यूम, और सब्सट्रेट एकाग्रता अनुकूलन

मिट्टी बफर: सब्सट्रेट एकाग्रता अनुपात एंजाइम assays के प्रदर्शन जब दृढ़ता से मापा प्रतिदीप्ति को प्रभावित करती है जो एक महत्वपूर्ण चर रहा है. घोल में मिट्टी की मात्रा परख या सब्सट्रेट की एकाग्रता मिट्टी के नमूने में एंजाइमों की गतिविधि के आधार पर समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती गयी. इस उदाहरण के लिए चयनित मात्रा कि सब्सट्रेट उपलब्धता हम परख शर्तों (वी मैक्स) के तहत अधिकतम क्षमता दर को मापने गया कि nonlimiting गया था, और यह सुनिश्चित करने के लिए इन मिट्टी के पिछले परीक्षण पर आधारित थे 44,45. हालांकि, एंजाइमों की उच्च सांद्रता है कि मिट्टी के नमूने लिए, मिट्टी या सब्सट्रेट एकाग्रता की राशि में वृद्धि की जानी चाहिए. हम सब्सट्रेट सांद्रता बढ़ रही है (और तदनुसार मानक वक्र समायोजन) वक्र के linearity प्रभावित कर सकते हैं कि मिल गया है. इसलिए, हम के रूप में आवश्यक मात्रा में बफर करने के लिए मिट्टी की मात्रा और / या आनुपातिक समायोजन को कम करने की सलाह देते हैं. भले ही, यह मापा EEAs संतृप्त और उप संतृप्त सब्सट्रेट सांद्रता 26 के बीच अधिक से अधिक परिमाण के एक आदेश से अलग कर सकते हैं क्योंकि assayed प्रत्येक मिट्टी के प्रकार के लिए सब्सट्रेट एकाग्रता का अनुकूलन करने के लिए महत्वपूर्ण है. इसलिए प्रयोगात्मक उपचार (आदि) के बीच मतभेद प्रकार द्वितीय सांख्यिकीय त्रुटि और उप saturating शर्तों में पता लगाया जा करने की संभावना कम है, और सांख्यिकीय त्रुटि 27,35 करने के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं. सब्सट्रेट सांद्रता का अनुकूलन करने के लिए, प्रारंभिक एंजाइम assays सब्सट्रेट सांद्रता की एक विस्तृत श्रृंखला का उपयोग प्रतिनिधि मिट्टी के नमूने पर प्रदर्शन किया जाना चाहिए. के बादप्रतिदीप्ति रिकॉर्डिंग, बस (इसी मानक वक्र उदाहरण के लिए, चित्रा 1) डेटा प्लॉट गतिविधि (Y-अक्ष) एंजाइम से मेल खाती है कि सब्सट्रेट एकाग्रता (एक्स अक्ष) की पहचान करने के लिए जहां ढाल के स्तर बंद (~ 0). इसी तरह, ढाल के स्तर बंद (~ 0) कि विशेष रूप से मिट्टी के लिए इष्टतम सब्सट्रेट एकाग्रता का एक अच्छा संकेत है इस मुद्दे पर जहां इसी सब्सट्रेट एकाग्रता.

यह परख अंततः एंजाइम की मध्यस्थता सब्सट्रेट depolymerization का एक परिणाम के रूप में सब्सट्रेट से cleaved है कि fluorogenic आधा भाग द्वारा उत्पादित एक निश्चित समय से अधिक प्रतिदीप्ति उपाय. इसलिए, चरण 5 (सब्सट्रेट अलावा) महत्वपूर्ण है और सब्सट्रेट मिट्टी में जोड़ा जाता है और जब assays incubated हैं जब बीच के समय को कम करने के क्रम में जितनी कुशलता से किया जाना चाहिए. सब्सट्रेट नमूने के साथ संपर्क में आता है एक बार इसी तरह, एंजाइमी प्रतिक्रियाओं हो शुरू कर देंगे. हम एक मल्टी चैनल का उपयोग करना चाहियेइस कारण से विंदुक. यह दृढ़ता से पिछले दिन के लिए आप अपने एंजाइम assays के प्रदर्शन कर रहे हैं मल्टी चैनल पिपेट का उपयोग कुशल बनने के लिए सुझाव दिया है. आप आसानी से अपने pipettor साथ 96 अच्छी तरह प्लेटें में संस्करणों हस्तांतरण कर सकते हैं जब तक यह पूरा करने के लिए, आप पानी के साथ pipetting अभ्यास कर सकते हैं.

मृदा शमन

शमन मिट्टी slurries-incubations 26 में particulates और / या जैविक सामग्री की वजह से प्रतिदीप्ति तीव्रता को कम करने के लिए संदर्भित करता है. बफर अनुपात 25: शमन मिट्टी का समायोजन करके प्रभावित किया जा सकता है. कारण व्यक्ति के नमूनों से पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति के लिए, यह पृष्ठभूमि (शमन) प्रतिदीप्ति के लिए खाते में नमूनों के साथ मानकों को चलाने के लिए महत्वपूर्ण है. कुछ प्रोटोकॉल संकेत रैखिक है कि परीक्षण के बाद एक भी एकाग्रता का उपयोग हालांकि, हम दृढ़ता से शमन के प्रभावों के लिए सबसे अच्छा नियंत्रण करने के लिए प्रत्येक नमूने के लिए एक मानक बुझाना नियंत्रण लागू करने की सलाह देते हैं. ऐसा न करने पर एक स्टैंड में परिणाम होगानमूने के लिए लागू नहीं एआरडी वक्र, और enzymatic गतिविधि का एक गलत अनुमान. मानक अलावा नमूने की पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति को प्रभावित नहीं करता है के रूप में मिट्टी slurries के लिए मानकों के अलावा, समय के प्रति संवेदनशील नहीं है.

NaOH के अलावा

NaOH के अलावा सिंथेटिक substrates से जारी फ्लोरोसेंट डाई> पीएच 9.0 26,49 शिखर प्रतिदीप्ति दर्शाती है क्योंकि fluorometric एंजाइम गतिविधि माप अनुकूलन करने के लिए कुछ प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता है. इस सुझाव पर विचार कर, मिट्टी गारा पीएच (यानी पीएच> 9 के लिए) के लिए आवश्यक NaOH एकाग्रता विशेष मिट्टी के आधार पर अलग अलग होंगे और पीएच बफर 26 का इस्तेमाल किया. हालांकि, दूसरों के संकेत तीव्रता भी कम पीएच पर आम तौर पर बहुत अधिक है, और क्योंकि यह माप त्रुटि का एक अतिरिक्त स्रोत का परिचय क्योंकि NaOH आवश्यक नहीं हो सकता है कि लोगों का तर्क है. उदाहरण के लिए, गारा पीएच और इस तरह MUB या MUC fluore पर NaOH फाईल का प्रभावसमय 25 से अधिक Scence परिवर्तन. अप करने के लिए 60 मिनट 26 के लिए प्रतिदीप्ति कमी आई MUC स्थिर प्रदर्शन किया है, जबकि MUB जुड़ा हुआ substrates के स्तर को घटना से पहले NaOH परिवर्धन निम्नलिखित 20 मिनट के लिए लगातार वृद्धि हुई प्रतिदीप्ति प्रदर्शित करने के लिए दिखाया गया है. इसलिए, यह NaOH के अलावा और प्रतिदीप्ति माप के बीच समय मानकीकृत करने के लिए महत्वपूर्ण है. प्रतिदीप्ति स्तरों NaOH जोड़ने के बिना assays का आयोजन, इसके बिना पर्याप्त detectable हैं, तो वैकल्पिक रूप से, एक समान रूप से स्वीकार्य विकल्प 26 के रूप में सुझाव दिया गया है.

तापमान

ऊष्मायन तापमान जब तय तापमान संवेदनशीलता को ध्यान में रखा जाना चाहिए. प्राथमिक ब्याज के रूप में सचित्र (परिणाम अनुभाग में) Arrhenius भूखंडों का उपयोग कर तीन या अधिक तापमान का उपयोग कर, एंजाइम कैनेटीक्स समझ है, तो एक मजबूत दृष्टिकोण है. नमूना साइट ऐसे तो permafrost मिट्टी, duratio रूप विशेषता से कम तापमान है तोऊष्मायन के एन ठंडा ऊष्मायन तापमान में प्रतिक्रिया करने के लिए एंजाइमों के लिए अनुमति देने के लिए बढ़ाया जा करना पड़ सकता है. पारंपरिक एंजाइम कैनेटीक्स तापमान में वृद्धि वृद्धि हुई एंजाइम गतिविधि में परिणाम चाहिए पता चलता है कि एक ओर जहां, हम एंजाइमों तापमान संवेदनशीलता 50 के संदर्भ में विशिष्ट साइट हो सकता है कि मिल गया है. इसलिए साइट विशेष एंजाइम गतिविधि क्षमता को समझने के लिए यह ऊष्मायन तापमान और अवधि क्षेत्र साइट मूल्यों को प्रतिबिंबित करने के लिए समायोजित किया जाना महत्वपूर्ण है.

समापन

EEs मिट्टी में biogeochemical प्रक्रियाओं के महत्वपूर्ण ड्राइवर हैं, और इस तरह हम उनकी गतिविधियों को मापने के लिए सक्षम होना चाहिए. हस्तक्षेप और निषेध सहित मिट्टी में EEAs, को मापने के लिए कई चुनौतियों का सामना कर रहे हैं. इन चुनौतियों के बावजूद, (यहाँ वर्णित के रूप में) मानकीकृत प्रोटोकॉल सार्वभौमिक एंजाइमों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए EEAs को मापने के लिए लागू किया जा सकता है. इसे में, इन प्रोटोकॉल निम्न गुणवत्ता वाले डेटा उत्पन्न करने के लिए काफी आसान है जबकिएक पारिस्थितिकी के संदर्भ में इस डेटा के terpretation इन assays वास्तव में मापने रहे हैं की सावधानी से विचार करने की आवश्यकता है, और कैसे परख परिस्थितियों में EEAs सीटू की स्थिति में के तहत उन लोगों से भिन्न हो सकती है.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

इस प्रकाशन अमेरिका के राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (देब # 1021559) द्वारा समर्थित पर्यावरण अनुसंधान समन्वय नेटवर्क रिसर्च में एंजाइमों द्वारा वित्त पोषित किया गया. यह शोध अमेरिका के राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (देब # 1021559), और ऊर्जा विज्ञान के कार्यालय (जैविक और पर्यावरण अनुसंधान) के अमेरिकी विभाग द्वारा समर्थित किया गया. इस सामग्री में व्यक्त कोई राय, निष्कर्ष, और निष्कर्ष या सिफारिशों लेखकों के हैं और इनका अमेरिका NSF के विचारों को प्रतिबिंबित नहीं करते.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents:
4-Methylumbelliferyl α-D-glucopyranoside (AG) Sigma Aldrich M9766 Sugar degradation
4-Methylumbelliferyl β-D-glucopyranoside (BG) Sigma Aldrich M3633 Sugar degradation
4-Methylumbelliferyl β-D-cellobioside (CB) Sigma Aldrich M6018 Cellulose degradation
L-Leucine-7-amido-4-methylcoumarin hydrochloride (LAP) Sigma Aldrich L2145 Protein degradation
4-Methylumbelliferyl N-acetyl-β-D-glucosaminide (NAG) Sigma Aldrich M2133 Chitin degradation
4-Methylumbelliferyl phosphate (PHOS) Sigma Aldrich M8883 Phosphorus mineralization
4-Methylumbelliferyl-β-D-xylopyranoside (XYL) Sigma Aldrich M7008 Hemicellulose degradation
4-Methylumbelliferone (MUB) Sigma Aldrich M1381
7-Amino-4-methylcoumarin (MUC) Sigma Aldrich A9891
50 mM Sodium acetate anhydrous buffer Fisher Scientific S210-500 acidic and neutral soils
50 mM Tris base buffer Fisher Scientific BP154-1 basic soils
Equipment
Bel-Art Scienceware disposable pipetting reservoirs Fisher Scientific 14-512-65 pipetting reservoir
Electronic; Eppendorf Xplorer; 8-channel Fisher Scientific 13-684-265 8-channel pipette, range: 50-1,200 μl
TipOne 101-1,250 μl extended length natural tips USA Scientific 1112 - 1720 10 racks of 96 tips (960 tips)
Hotplate; heating surface: 10 in x 10 in. Fisher Scientific 11-100-100SH Lab disc magnetic stir plate
Waring blender Fisher Scientific 14-509-7P Two-speed; 1 L (34 oz) stainless steel container
BRAND Dispensette III bottle-top dispensers Fisher Scientific 13-688-231 Dispenser; range: 5-50 ml
Wheaton Unispense μP peristaltic pumps Fisher Scientific 13-683-7 Optional dispenser
Fisherbrand magnetic stir bar Fisher Scientific 1451363SIX Used to stirr soil slurry afer blending
Pyrex glass bowls World Kitchen 5304218 Pyrex 10 oz rimmed custard cup
Costar 96-well black solid plates Fisher Scientific 07-200-590 Used for plate reader step
Costar 96-well assay blocks Fisher Scientific 07-200-700 V-bottom; 2 ml; sterile
Thermo Scientific Nunc 96-well cap mats Fisher Scientific 14-387-93 Sterile 96-well cap mat for square wells
Centrifuge equipped with holders for deep-well plates Thermo Scientific 3121 Centra-GP8 (this model is no longer available)
Tecan Infinite 200 series multifunctional microplate reader Tecan 30016058 Plate reader (this model is no longer available)

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संभावित मिट्टी कोशिकी एंजाइम गतिविधियों के उच्च throughput fluorometric मापन
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Bell, C. W., Fricks, B. E., Rocca,… More

Bell, C. W., Fricks, B. E., Rocca, J. D., Steinweg, J. M., McMahon, S. K., Wallenstein, M. D. High-throughput Fluorometric Measurement of Potential Soil Extracellular Enzyme Activities. J. Vis. Exp. (81), e50961, doi:10.3791/50961 (2013).

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