Summary
土壌細胞外酵素活性の潜在的な速度を測定するために、蛍光色素に結合している合成基質を土壌試料に添加される。蛍光色素は、より高い蛍光基質分解を示す酵素触媒反応によって基質から放出される酵素活性を測定する。
Abstract
土壌や他の環境中の微生物は、それらがエネルギーと栄養素同化することができるように有機高分子を解重合し、加水分解する外酵素を産生する。土壌微生物の酵素活性を測定することは、土壌生態系の機能のダイナミクスを理解する上で非常に重要です。蛍光酵素アッセイの一般的な概念は、合成C-、N-、又は蛍光色素と結合したP-に富む基質が土壌試料に添加されることである。ときはそのまま、標識された基質は、蛍光を発しない。酵素活性は、蛍光色素は、それらが蛍光を発することができ、それらの基質から切断されると蛍光の増加として測定される。酵素測定は、モル濃度または活性の単位で表すことができる。このアッセイを行うために、土壌スラリーは、pH緩衝液で汚れを組み合わせることによって調製される。 pH緩衝剤（典型的には50 mM酢酸ナトリウムまたは50mM Tris緩衝液）は、最高の土壌のSAと一致するように、バッファの特定の酸解離定数（pKa）のために選択されるmpleのpHは。土壌スラリーは、蛍光標識の非限定的な量（ すなわち、C-、N-又はP-リッチ）基板を用いて接種する。アッセイにおいて土壌スラリーを使用すると、酵素と基質の拡散に制限を最小限に抑えるのに役立つ。従って、この基質制限、拡散速度、土壌pH条件の相違のためのアッセイ対照、したがって（サンプルあたり）酵素濃度の差の関数としての潜在的な酵素活性率を検出する。
蛍光酵素アッセイは、典型的には、分光光度（ すなわち比色）アッセイより敏感であるが、不純物や光にさらされ、多くの蛍光化合物の不安定性に起因する干渉が発生することがよくあり、そのように蛍光基質を処理する際には注意が必要です。基板は、限定されていない場合も同様に、この方法は、実験室条件下で電位酵素活性を評価する。クロスを表すデータを解釈する際には注意が必要ですその場での土壌の種類や温度などの異なる温度や土壌の種類とサイトの比較は、酵素反応速度に影響を与えることができる。
Introduction
陸域生態系における細胞外酵素土壌細菌、真菌、および古細菌によって生成（のEE）は無数の生物地球化学的過程に関与しており、処理の中心である、安定化、および土壌有機物の不安定化や栄養循環1。のEEを生成することによって、土壌の微生物が分解することにより、植物や微生物が土壌から利用可能な栄養素を吸収することができ、以前にバインドされたミクロおよび主要栄養素を遊離する、より小さな水溶性分子に高分子有機物を変換。直接酵素を検出し定量することは非常に困難であるためのEEは、主に実験室アッセイ2-4での活動を測定することにより、数十年にわたって研究されている。
細胞外酵素活性（EEA）が最も強く酵素および対応する基質の濃度によって制御される。の存在量の異なるC-、N-、及び土壌におけるP-分解酵素は、多くの因子により制御されるiを微生物バイオマス、群集組成、基質利用、微気候、および化学量論的な要求5,6 ncluding。しかし、土壌環境内のインサイツ EEAS でも土壌の粘土と腐植特性2、そして最終的に活性酵素プールを規制拡散制約9、サイズの点で、基質利用に酵素の結合を、温度7,8の影響を受けている、および離職率10から12。異なる環境のサイトにわたって土壌微生物機能を解釈するために実験室用酵素アッセイを使用して、したがって、 その場で土壌条件に肯定応答することが重要である。
EEAの多くの異なるクラスが（詳細については、「試薬表一覧」をご参照ください）合成基質のさまざまな方法を使って実験用アッセイで定量化することができる。いくつかのプロトコルは、wは、分光光度計で検出することができる比色反応に接続されているアッセイにおいて基質を利用我々はここで説明するプロトコルを含む他の人を、hile、蛍光部分に結合された基板を利用している。蛍光EEアッセイは、典型的には、（合成基質とリンクし、発色性部分を使用してください）比色アッセイ12月14日より（一桁）より敏感である。 1、目的の化合物の量に関係して検出され、検出可能な最低の潜在的な酵素活性の他の関連：EEA検出における感度は二つの側面が含まれています。比色p-ニトロフェノールのための方法（PNP）に基づくアッセイは、過去に記載されています15,16に動作します。簡単に説明すると、土壌（典型的に<2mm及び空気乾燥に篩い分け）が最適かフィールド関連の温度およびpHでインキュベートする。反応生成物が放出される速度は、分光光度計14と比色決定される。蛍光酵素アッセイの高感度は、SUBSTRに関連した蛍光性部分の分離をより高感度な検出に一部起因する劣化を食べたのではなく、特定の波長で特定の色素産生の部分を分離した後、吸光度を記録する。二つの最も一般的に使用される合成蛍光指示薬は、4 -メチルウンベリフェロン（MUB）17および7 -アミノ-4 -メチルクマリン（MUC）18,19である。 MUC-結合基質は、一般に、タンパク質及び/又はアミノ酸のようなN-リッチな合成基質と関連している。蛍光技術は第一の水生サンプル20,21のために開発され、土壌への応用は、信号の消光と干渉22,23のコントロールを必要とした。アッセイは、大容量の従来の「ベンチトップ」化学を用いて行うことができるか、スループットの向上はなく、おそらく、より高い測定誤差と、マイクロプレートベースのプロトコルで使用することができる。 EEASの蛍光検出のためのいくつかの広く引用プロトコルが土壌24にありますが、多くのラボでは、多くの場合、不注意や違いによる、これらのプロトコルに微妙な変化を採用実験装置や試薬中のS。一見プロトコルの詳細の小さな違いを強く測定さEEAS 25,26および標準化された酵素の欠如は、異なる研究室間のアッセイを校正することがやりがいに影響を与えることができる。このように、EEAアッセイの標準化を促進するための詳細なプロトコルの普及のための重要な必要性がある。
我々のプロトコルにおいては、土壌試料は、pH緩衝液で土壌試料を組み合わせ、ブレンダーでホモジナイズすることにより調製される。スラリーは、次いで、C-、N-、P-またはリッチ目的の特定の研究課題に応じて選択された基質、蛍光標識の非限定的な量を接種する。酵素アッセイの土壌スラリーを使用すると、基板拡散の制限を最小化するための対照として機能します。蛍光部分は、それらがそれらのそれぞれの基質から切断されるまで急冷され、蛍光色素は、基板10bから放出されるように、このようにして酵素活性を検出することができるY酵素触媒反応。時間を通じて増加した蛍光強度は、酵素触媒反応の速度を反映している。
蛍光酵素アッセイの一般的な概念は、蛍光分子（蛍光色素）と結合した合成基質が、土壌サンプル27に添加されることである。酵素触媒基質分解の際に、結合は、蛍光色素と基板との間に分割します。基質から遊離蛍光色素が、その結果、酵素活性の間接的評価として使用され、色素の蛍光強度を検出するためにマイクロプレートリーダーを用いて定量することができる。遊離色素が異なる波長の光を吸収した後に一つの波長の光を放出するように簡単に説明すると、蛍光定量が達成される。蛍光強度は、励起および検出の両方が可能なプレートリーダーにより記録される。酵素活性は、その後、公知の蛍光色素conceに基づいて定量することができるアッセイにおいて使用される基板の特定の部分のために、蛍光の蛍光強度の標準希釈曲線を参照するとともに、基板のntrations（ すなわち、合成基質の既知量を土壌試料に添加）（ すなわち、4 -メチルウンベリフェロン（MUB）または7 -アミノ-4 - メチルクマリン（MUC））。 （酵素活性の定量化に関する特定の詳細のためのプロトコルのセクションを参照してください）。
実験室土壌酵素アッセイは、微生物群集機能を評価するために有用であるが、ユーザーが10を認識するべきであるいくつかの技術的な限界がある。蛍光アッセイは、光にさらされたときに不純物および/ または多くの蛍光化合物の不安定性によって引き起こされる干渉に苦しむことができるので、蛍光基質25を取り扱う際には注意が必要である。土壌スラリー中の土壌粒子および/ または有機材料はまた、クエンチング効果26として知られている蛍光強度を妨げることができる。さらに、実験室での酵素アッセイは、実験室条件下での潜在的EEASを評価しています。in vitroアッセイは、基板拡散と豊かさが非限定されている条件の下でEEASを測定する。したがって、これらのアッセイによって提供されるデータは、10 その場の土壌条件の下EEASのために良いプロキシできない場合があります。全体的に、酵素活性は、土壌の種類が類似している相対的な比較のために非常に有用である。物理的または化学的特性が異なる土壌の中で活性を比較するために、このメソッドを使用するときしかし、注意が必要です。これは、土壌の種類や温度差が急激にその場で酵素反応速度での状態を変化させることができるという事実によるものである。別の制限は、比較的少数の基質が（自然環境と比較して）市販されていることである。さらに、酵素アッセイのために使用される合成基質は、比較的単純である（易溶性）を正確に存在するか、ご利用できます土壌の基板を表していない可能性がその場での E。考慮すべきもう一つの要因は、土壌のスラリーを使用すると、 その場で条件2 で下にアクティブになっていない（ つまり、有機物や粘土で固定化された）いくつかの安定化酵素の活性を取り入れるということです。実験室での酵素アッセイは、土壌（酵素回転率）中の酵素や土壌の酵素を生産している特定の微生物種に関する情報の持続性に関する情報を提供していません。
Protocol
1。アッセイセットアップ
- ラベル3ディープウェルプレート：「サンプル」、「MUB標準」、および「MUCスタンダード」。
- 各標準（0のMUB、2.5、5、10、25、50、および100μM）と基板（BG、CB、NAG、PHOS、XYL、AG、LAPは）（行指向）は、別々のきれいな、前標識貯水池に注ぐ。
- MUB標準プレート（ 表1）の対応するウェルに適切なMUB標準をピペット。
- ピペットMUB標準プレートの列Aに0μMMUB200μlの。
- ピペットMUB標準プレートの列Bに2.5μMMUB200μlの。
- ピペットMUB標準プレートの列Cに5μMMUB200μlの。
- ピペットMUB標準プレートの列Dに、10μMMUB200μlの。
- MUB標準プレートの列Eピペット25μMのMUB200μlの。
- ピペット50μMのMUB標準プレートの列FにMUB200μlの。
- 100μのピペット200μLMUB標準プレートの列GへのM MUB。
- MUC標準プレートの対応するウェルにMUC規格の1.3.8 - を繰り返して、1.3.1を繰り返します。
- 各土壌サンプルのための準備土壌スラリー。
- ブレンダーにフィールド湿った土の2.75グラムを秤量する。
- 50 mMのバッファの91ミリリットルを追加します。 1分間ハイにブレンド。
- 少なくとも同じ幅攪拌棒付きの8チャンネルピペットなどの清浄なガラスボウルにブレンダーの内容を注ぐ。
- 低オン土壌スラリーを混合、撹拌プレート上に置きます。
- ピペットサンプルプレート（ 表2）の最初のカラムに土壌スラリー800μlの。
- MUB標準およびMUC標準プレート（ 表1）の1 列目に繰り返す。
- DI H 2 Oでブレンダー、撹拌プレートおよび撹拌棒をすすぐか、土壌試料との間のバッファ。
- 後続の各土壌サンプル（ 表1を次の列に移動し、各サンプルについて）1.4.7と-を繰り返して、1.4.1ステップ2）。
- サンプルプレート（ 表2）の対応するウェルに、適切な基質（この例では、200μMの濃度）をピペット。
- ピペットサンプルプレートのA列にはBG基板200μlの。
- ピペットサンプルプレートの列BにCB基板を200μl。
- ピペットサンプルプレートの列CにNAG基板200μlの。
- ピペットサンプルプレートの列DにPHOS基板200μlの。
- ピペットサンプルプレートの列EにXYL基板200μlの。
- サンプルプレートの行のFピペットAG基板200μlの。
- サンプルプレートの列GピペットLAP基質200μlの。
- 各インキュベーション温度サンプル版用1.5.7 - を繰り返して、1.5.1を繰り返します。
2。アッセイプレートのインキュベーション
- ディープウェルプレート（「サンプル」、「MUB標準」、および「MUC標準を封印プレートマットで4 ;)。
- 溶液が完全に混合されるまで、手でそれぞれの（密閉）プレートを反転（〜10倍）。
- 必要なインキュベーション時間（ 表3）のために適切な培養器でプレートを置きます。
- 時間0として初期時間を記録します。インキュベーター（ 表3）から、プレートを削除するときに知っているので、適切なインキュベーション時間を記録します。
- それぞれのインキュベーション期間、遠心〜2,900×gで3分間、シールしたプレートの端で。
- 認証の後に、（一方黒色プレートをインキュベートし、各ディープウェルプレートのために使用される）、黒色平底96ウェルプレートの対応するウェル中でインキュベートディープウェルプレートの各ウェルから250μlのを転送する。なお、黒色平底96ウェルプレートの同じウェル（ すなわち、A1 ... A12 など ）中にインキュベートしたディープウェルプレートからサ ンプルを転送することが重要である（ 表1,2）。
3。蛍光測定にマイクロプレート蛍光光度計
- 使用される蛍光プレートリーダーのための製造業者の使用説明書は、450nm〜365nmの発光波長と励起波長を設定する（または適切なフィルタを使用する）を以下。
- 蛍光光度計での3枚をお読みください。重要：サンプルおよび標準プレート（ すなわち MUBまたはMUC）が同じゲインを使用して読み取る必要があります。
- 自動ゲインに分光光度計を設定し、MUCとMUB標準プレートをお読みください。
- セットマニュアルゲイン、次に低い数に最適の値を小さくするには、各標準プレートについて、最も近い5に丸め。各プレートについて2倍を繰り返します。
- 自動にゲインを設定し、サンプルプレートを実行します。標準プレート（ すなわち MUBおよびMUC）のそれぞれについて、最も高いゲインに合わせて手動でサンプルプレートを再実行します。
4。データ解析
- MUBのためにスプレッドシートに標準曲線の蛍光データを入力します（ 表4a）およびMUC標準（ 表4B）
- （マイクロモル）に（μM）濃度に変換する（ 表4aおよび図4b）。
- 各サンプルの検量線蛍光データの場合は、傾き、y切片、およびR MUBおよびMUC（マイクロモル）標準濃度用の2値を計算します。許容されるR 2の値が各サンプルについて0.98を超えるべきである（ 表4aおよび4b）。蛍光は、従属変数（y軸）としてプロット読み出し及び標準濃度（マイクロモル）は独立変数（x 軸）（ 図1）としてプロットして、それは散布図で標準曲線を視覚化するのに有用であり得る。
- あなたが潜在的なEEASへのサンプル+基板生の蛍光データを算出するMUBおよびMUC標準曲線の傾きとy切片値を使用します。まず新しいスプレッドシート（ 表5aにサンプル+基板生の蛍光データを入力する必要があります表5B）を入力する必要があります。試料は25°C（ 表3）でインキュベートしたので注意、この例では入力された時間値は、3時間である。
- 対応するサンプルの蛍光値から標準曲線の切片の値を減算してから、対応する標準曲線（ 表5C）の傾きで割る。 [Y =サンプルの蛍光生読み取り、MUBまたはMUC標準曲線からB =切片であり、m = MUBからスロープ：X =（YB）/ M;これを実現するために、サンプル酵素濃度（X）を求めるために、標準的な一次方程式を再配置またはMUC標準曲線]。
- 91ミリリットル（土壌スラリーで使用されるバッファ量）（ 表5D）により、上記のステップ4.3.1から、サンプルマイクロモルを掛けます。
- [酵素AMT：分周値は、サンプル固有のインキュベーション時間および乾燥土壌の質量（ 表5E）、ステップ4.3.2で得られた。 （＆＃956;モル）×91ミリリットルXインキュベーション（HR）は乾燥土壌（G）×0.8ミリリットル×1,000]をX
注：0.8mlを各ウェルに使用されるスラリーの体積であり、1000は各ウェルにおける実際の土壌量を補正する。 - 希望する単位（ナノモル活動/ g乾燥土壌/時）（ 表5F）を取得するために千、ステップ4.3.3で得られた値を掛けます。
Representative Results
酵素アッセイは、潜在的なEEASを定量化するために、同様の試料間で活性を比較するために使用することができる。ここでは、上昇し、CO 2と加熱処理（EHN）（ 図2-6）にさらされた土壌に周囲の気候条件（ACN）を経験した土壌を比較する実験的な気候研究から代表的な結果を提示する。全てのプロットにおける植物カバー（HBK）C4草Bouteloua薄によって支配北部混合草の草原の特性LAGた。および2のC3の草、Hesperostipa comata TRINとRupr。とPascopyrumスミシー （Rydb.）は、植物の約20％がスゲや広葉草本で構成されている。サイトの説明とフィールド実験計画の詳細については、参考文献28〜30に記載されています。土壌は、改変された気候cに応答して、土壌EEASを評価するために、直径1.5cmのコアを用いた治療プロットの各々内の2つの異なる深さ（0〜5センチ、5〜15センチメートル）から回収したonditions。我々の例では（ すなわち、 図2-6）、サンプルサイズは、（N = 3）。この関係なく最小のサンプルサイズのばらつきは、ほとんどの場合、比較的小さい（エラーバーによって示されるように）及びロバスト処理区のうちEEAS電位の変動を反映している。分散（ANOVA）およびテューキーの事後多重比較の分析は、処置プロット及び土壌の深さのうち、酵素活性の有意なシフトを同定するために使用した。
以下の代表的な結果は、このハイスループット蛍光アッセイ（2）がどのようにEEA化学量論（3）の関係エコシステムレベルプロセスを示すことができ、土壌中（1）全体的なEEAを試験するために使用することができる方法を示すために提供されている培養温度とEEAの間。土壌EEAのは、一般的に土壌の栄養循環に微生物の機能の変化を関連付ける研究され、気候変動、植物群落のに応じて、微生物の栄養要求を評価するための有用な指標hifts、およびより広範に31-33を機能して生態系。 EEAの化学量論は、より最近の環境条件5に該当する可能性のある微生物の栄養の不均衡を評価するために生態化学量論的理論と生態学の代謝理論を交差させることにより、土壌生化学栄養循環を評価するための指標として採用されている。多くの研究は、広い化学量論比が栄養生長の制限34-36の指標であることが示唆されていると、土壌養分が限られるようになり、微生物は、栄養素欠乏37を取得する特定の酵素を産生する代謝資源を割り当てることによって応答する。 Ecoenzymatic C：N：Pの化学量論比は、様々な環境摂動に応じて潜在的な微生物群集の栄養需要の相対的なシフトを識別するのに有用である5。最後に、EEASの温度感度は、土壌微生物コミュニティの機能的多様性は可能性が温度変化に影響されるかを評価するのに役立ちます。<SUP> 7,38。酵素の温度感受性は、広く歴史的条件7から気候の変化に対応する酵素活性の変化を示した酵素を生産する単一の酵素クラスの土壌、および微生物群集の間で変化することができる。このためのEEの熱生態に関連する酵素活性の質問は39,40を変更し 、気候に応じて、微生物の機能的なダイナミクスと地下部生態系プロセスを評価するための便利な方法です。
この例では、潜在的なC-、N-、および0-5センチメートルの深さで土壌アッセイP-酵素捕捉活性は実験的治療（図2a）で差がなかった。しかし,5-15センチの土壌の深さで、いくつかの潜在的なEEASは有意に（ 図2b）を異なるました。 ACNプロットに比べて、例えば、C分解酵素は、β-1、4 -グルコシダーゼ、β-D-セロビオはEHNプロット（ 図2b 0.038≤P）で低かった。 NおよびP鉱夫5〜15センチメートル土壌深さでACNに比べて、alizing酵素は、（β-1、4-N-アセチルおよびホスファターゼ、それぞれ）EHNプロット（ 図2b 0.012≤P）も低かった。
の和を計算し、プロットするすべてのC-、N-又はP-サイクリングEEAS電位が電位土壌C-、N-及び/又はP-サイクル（ 図3）に関する広範なパターンを観察するための有用なアプローチであることができる。この例では、β-1、4 - グルコシダーゼ、β-D-セロビオヒドロラーゼ、β-キシロシダーゼ、及びα-1、4 - グルコシダーゼ電位EEASの合計が電位Cサイクリング活動を表すために計算された。 β-1 ,4-N-アセチルグルコサミニダーゼ、およびL-ロイシンアミノペプチダーゼとの和は、潜在的なNサイクリング活動を表すために計算された。ホスファターゼ電位Pサイクリング活動を表すために使用した。この例では、合計の潜在EEAS Cは-、N-およびP-サイクリング5-15センチメートルの深さで土壌ACNプロット（ ふぃぎゅに比べEHNプロットに低い傾向再3）。しかし、この傾向は（0.046≤P; 図3）全NとPサイクリング活動のためにのみ有意であった。土壌EEASは有意に（ 図3）0〜5センチメートル土壌深度で治療プロット間で差は認められなかった。この実施例の知見は、土壌の深さに応じて処置プロット（EHN対ACN）の間で、酵素活性官能基（ すなわち、C-、N-、P又は分解酵素）に対照的な傾向を示唆している。例えば、周囲のプロット（ACN）中のC-、N-およびP-分解する土壌EEASは、逆のパターン（図3a〜cを実証高められたCO 2及び加熱（EHN）に露出土壌に比べて、より低い深さにおいてより高い傾向）。
酵素化学量論は、環境（ 図4）の潜在的な酵素活性を評価するためのもう一つの有用なアプローチである。栄養素微生物の需要は、環境に関連した微生物バイオマスの元素の化学量論によって決定されます栄養素利用32。同様に、微生物はまた、生態学的な化学量論41と称されるそれらの土壌の環境内での栄養要求を満たすために、特定の酵素（ すなわち、C-、N-又はP-分解酵素）を産生する。潜在EEASの割合は微生物の栄養要求性を評価する一つの方法です。例えば、（Cの例：N栄養素買収）の官能基を酵素2間の1:1の比率は、微生物バイオマスCを考慮した場合、Nの需要は、Cの需要に比べて高いであることを示唆している。N比コミュニティレベルで典型的には、8時01分42である。この例では、土壌の酵素化学量論C：N、C：P、又はN：P活性は有意に0〜5センチメートル土壌の深さ（ 図4a〜c）に処置プロット間で異なる。しかし、潜在的な酵素のC：PおよびN：P比はEHNに高かった5〜15センチメートル土壌深さでACNプロットと比較したプロット（P = 0.05; 図4Bおよび4C）。この観察結果は示唆していることがある相対的に高いP無機化EEAS 5-15センチの土壌の深さで、CおよびN EEAに（EHNに比べて）のACNプロットを比較する。酵素のC：NのためEHNと比較して、低い深さで、ACNプロットにおける高い電位C EEASに（ 図4a）：N買収活動率が高いCとの合計、C EEASによって証明と同様の傾向を示した。
温度が強く、土壌EEASに影響を与えることができる。しかし、典型的な実験室アッセイにおいて、土壌酵素はその場温度条件にに対応しない場合が単一の温度で測定される。私たちの蛍光酵素アッセイ法は、私たちは、比較のために、複数の研究室のインキュベーション温度を組み込むことにより、 その場の温度効果に考慮することができます。複数の温度で実験室のインキュベーションを使用したボランティアアレニウスプロットとQ 10の計算を用いた温度依存性酵素動力学データを解析することを可能にする。アレニウスプロットは、活性化エネルギーを可視化するために使用されると、我々をプロットするx軸上ケルビン度（1 / K）に変換し、逆温度の関数としての酵素活性の対数（y軸従属変数）ING（ すなわち、独立変数、 図5a-c）の 。活性化エネルギーは、一般に、化学反応（ すなわち、より小さな製品に所定の基質を分解する）を触媒するのに必要な最小エネルギーとして定義される。我々の目的のために、活性化エネルギーは、酵素触媒反応の温度感受性のプロキシとして機能する。より高い活性化エネルギーは、酵素温度感受性を示している。同様に、活性化エネルギー（ すなわち 、図5D-F）は 、直接、Q 10値（ すなわち 図6a-C）に対応しています。活性化エネルギーと実用化を計算するために使用される数式の詳細な説明が多く、過去に記載されています40,43-45に動作します。アレニウスプロット、活性化エネルギー、及びQ 10のプロットは、冗長な情報を提供しないはずすべての出版物についてのデータを提示するために、同じ原稿に使用すること（ 図5および6）。動態データ10 -これらの技術を使用した場合、したがって、それは、酵素の温度に最も適したプロットタイプを選択する必要がある。すべてのプロットタイプ（アレニウスとQ 10）は、デモ目的のためにここに提示された。酵素の結果を提示する方法の視覚的な例を提供する。
我々の例では、潜在的なC-、N-、二つの土壌深さで両方の治療プロット間のP-EEASのための潜在的な酵素動力学評価した （ 図5、図6）。発見は、EEASの温度感受性がアレニウスプロット（ 図5a-c）、および対応する活性化エネルギー（ 図DF）と（驚くべきことではないが）、Qのために示されているように活性化エネルギーのための土壌の深さのいずれかでの治療プロット間で有意差は認められなかったことを示した10 PLOtsは（15°Cと25°Cの実験室のインキュベーションの間に、この例では、 図6A〜図6C）。これは、酵素反応速度論は、この特定の研究におけるフィールド実験処理によって影響を受けなかったことを示唆している。
表1。土壌サンプルの蛍光標準濃度用のディープウェルプレートのデザイン。テンプレート前インキュベートするディープウェルプレートに土壌サンプルの蛍光基準（MUBまたはMUC）を組織し、ロードするため。注：列は、同じ土壌サンプル（土壌スラリー添加の800μl）を表す。蛍光標準濃度の勾配は、各行（200μL追加）のためにロードされます。各セルは、蛍光標準濃度プラス土壌スラリーの追加を表しています。例えば、S1 - S12が土壌サンプル（土壌スラリー800μl）を表し、MUB 0〜100μM= 4 - Methylumbelliferone濃度（200μlの追加）。この例では、行Hは開放されており、必要に応じて、より高い蛍光標準濃度を含むように結果的に利用可能である。標準曲線濃度を増加させるために、この決定は、特定の土壌サンプルについて（および/または基質濃度を用いる）より高い電位酵素活性に必要であり得る。あなたのサンプルのための潜在的な酵素活性は、標準曲線の値の範囲内にある必要があります。 大きなテーブルを表示するには、ここをクリックしてください 。
表2。整理前インキュベートするディープウェルプレートに土壌サンプルと基板をロードするための基板。テンプレートを使用した土壌サンプルのためのディープウェルプレート設計 。注：列は、同じ土壌サンプル（SO800μlのを表している書記スラリー付加）。異なる基板は、各行（200μL添加物）を横断ロードされます。各セルは、土壌サンプルを加えた基質添加を表す。例えば、S1 - S12がユニークな土壌サンプル（土壌スラリー800μl）を表す。基板（200μL添加物）としては、BG = 4 - メチルβ-D-グルコピラノシドを、CBは= 4 - メチルβ-D-セロビオシド、NAGは、4 - メチルN-アセチル-β-D-グルコサミニドを=; PHOS = 4 - メチルウンリン酸塩：XYL = 4 - メチルウンベリフェリル-β-D-キシロピラノシド、AG = 4 - メチルウンベリフェリルα-D-グルコピラノシド;及びLAP = L-ロイシン-7-アミド-4 - メチルクマリン塩酸塩。この例では、行Hは開放されており、必要に応じて別の潜在的な酵素活性を評価するために別の基板を含めるようにし、結果として提供されています。 大きなテーブルを表示するには、ここをクリックしてください 。
| 温度 | 時間 |
| 4℃ | 〜23時間 |
| 15℃ | 6時間 |
| 25°C | 3時間 |
| 35°C | 1.5時間 |
表3。インキュベーション時間期間を対応するために必要なインキュベーター温度。インキュベーション温度および酵素アッセイ法のための対応する時間期間。
表4。 MUBおよびMUC標準曲線の計算。A）を整理する方法を示しMUBとb）MUC未加工の蛍光データ（マイクロモル）を、その後、傾き、y切片、およびR二乗値を計算する。あなたの標準濃度曲線から傾き、y切片、およびR二乗値を計算し選択する（またはプロット）独立変数（x軸）のような従属変数（y軸）及び標準濃度（マイクロモル）としてMUBおよび/またはMUC生の蛍光データ。注意：MUB = 4 -メチルウンベリフェロン; MUC = 7 -アミノ-4 -メチル。 大きなテーブルを表示するには、ここをクリックしてください 。
表5。 。マイクロモルの活動/ g乾燥土壌/時： 酵素活性の計算は、a）試料生の蛍光データを整理し、その後にEEASを計算する（BF）を必要なステップを実行する方法を示します。注意：S1 - S12のユニークな土壌サンプルを表しています。基板は、次のとおりです。= 4 - メチルβ-D-グルコピラノシド、BG、CB = 4 - メチルβ-D-セロビオシド、NAGは4 - メチルウンN-アセチル-β-D-グルコサミニドを=; PHOS = 4 - メチルウンフォーをsphate：XYL = 4 -メチル-β-D-キシロピラノシド; AG = 4 -メチルα-D-グルコピラノシド、およびLAP = L-ロイシン-7-アミド-4 -メチルクマリン塩酸塩。 大きなテーブルを表示するには、ここをクリックしてください 。
図1。 MUB従属変数（y軸）としての生の蛍光データを標準曲線の検量線プロット。散布図の可視化と標準濃度（マイクロモル）独立変数（x 軸）とする。
図2。 C、NおよびPサイクリング酵素活性 。プレーリー暖房や高架のCO 2エン電位EEASrichment対照区における（PHACE）部位（ACN：周囲気候条件に曝露）および処置プロット（EHN：温度上昇にさらされ、CO 2の上昇）。土壌の酵素は、A）0〜5センチメートル土壌の深さと、b）5〜15センチメートル土壌の深さで測定した。 。EHN =上昇、CO 2と加熱プロット、気候プロット- ACN =周囲：縦のバーは±SE（注）を意味表す大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。
図3。総C、NおよびPサイクルの化学量論比酵素a）の Cと、b）N、およびc）P-PHACE用の0〜5センチメートルにおける実験及び5の両方の処置群の獲得に関与電位EEASの合計。 - 15cmの土壌の深さ。 V。EHN =上昇、CO 2と加熱プロット、気候プロット- ACN =周囲：erticalバーは±SE（注）を意味表す大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。
図4。総C、NおよびPサイクリング酵素活性のための酵素の化学量論酵素買収活動の化学量論比対照区におけるプレーリー暖房や高架のCO 2濃縮（PHACE）サイトで。（ACN：周囲の気候条件にさらさ）や治療法のプロット（EHN：温度上昇にさらされ、上昇したCO 2）。総土壌a）は、C：N、b）は、C：P及びc）N：Pが0〜5センチメートルおよび5〜15センチメートルの深さで土壌の両治療群についてプロットした。垂直バーは、平均値±標準誤差（注）を表しています。ACN=アンビエント-気候プロット; EHN =上昇、CO 2と加熱プロットは。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。
図5。総C、NおよびPサイクル酵素の活性化エネルギーポテンシャルEEASの温度感受性合計a）の Cと、b）N、およびc）P分解酵素に対するアレニウスプロットを使用して表示;ならびにdの合計に対応する活性化エネルギー値）C 、E）N、およびF）、Pプレーリー暖房や高架のCO 2濃縮（PHACE）サイトでの処理プロットや土壌の深さの中で分解酵素。 ACN = A：活性化エネルギー（ すなわち DF）のために縦線が±SE（注）を意味表すmbient -気候プロット; EHN =上昇、CO 2と加熱プロット。出版物のためには、著者が、通常、アレニウスプロット（ すなわち AC）や活性化エネルギー値（ つまり DF）、両方ではなく、プロット·タイプのいずれかを提示することを選択するだろうことに注意することが重要である。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。
図6。総C、NおよびPサイクリング酵素Q10（15〜25°C）の温度合計a）の Cと、b）N 15°Cおよび25°Cで実験用のインキュベーションに基づいて、Q 10として測定電位EEASの感受性、およびプレーリー暖房や高架のCO 2 <での処理プロットや土壌の深さの中でC）、P分解酵素/サブ>エンリッチメント（PHACE）サイト。 Q10用の垂直バーは±SE（注）平均表しACN =アンビエント-気候プロットを、EHNは=上昇、CO 2と加熱プロット大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。
Discussion
潜在的な土壌EEASの実験室ベースの測定は、微生物のその非生物的環境への対応、および生態系の機能のための彼らの結果に重要な洞察を提供することができます。この例では、データセットの結果は、最小限の違いは、気候処置プロットのうち、土壌酵素活性または速度論で存在することを示唆している。しかし、プロットの中で逆の傾向では、土壌水分、土壌pHや植物の成長のような微生物EEASの生産に影響を与える可能性共変量のさらなる調査を奨励しています。全体的に、土壌中の（1）全体的なEEAに関してEEASを評価すること、（2）EEA化学量論（3）アレニウスプロット/活性化エネルギー、及び（4）Q 10は、エコシステム·レベルのプロセスを示すことができるアプローチの広いスペクトルを提供するロバスト土壌生態系の機能のダイナミクスを特徴づけるために、そこから。
ハイスループット蛍光ベースEEAアッセイは広く土壌中の潜在的なEEASを調べるために使用されている便利なツールであり、他の環境。重要なのは、潜在的な活動は、酵素プールサイズを反映してあるが、それだけでは酵素生産や離職率46を定量化しないでください。技術は比較的簡単ですが、実験室のプロトコルの間で、一見わずかな違いが、結果13の比較可能性を妨げることができます。残念ながら、我々は現在、EEAS適した標準化されたポジティブコントロールを持っていません。化学量論比の使用は、これらの課題を克服するための一つのアプローチである。そうでなければ、ハイスループット技術の出現は4環境中の酵素の研究を進めてきた。これらのアッセイによって生成されるデータの慎重な解釈は、微生物活性の重要な傾向を解明できる。
プロトコルのロバスト性は、個々のサンプルに特異的な条件を選択する能力に由来するが、これも限界が生じ得る。変更の一連のサンプルを正確にするために測定されていることを確認する必要があります個々のフィールドサイト：
バッファ
選択したバッファは、土壌のpHに依存します。バッファリングはまた、高pH値27,47依存する、蛍光標準の蛍光強度を安定させる。試料のpHレベル - 我々は、典型的には土壌スラリーを作る為に必要なpH緩衝剤は、ベストマッチ土壌にバッファの特定の酸解離定数（pKa）のために選択される50 mM酢酸ナトリウムまたはトリス緩衝液である。酢酸ナトリウムは、4.76のpKaを有し、トリス8.06のpKaを有するので、これらの2つのバッファ量は、個々のサンプルのために所望のpKaを達成するために変化するであろう。リン酸塩緩衝液（pKa = 7.2）、中性/わずかに塩基性の土壌のために提案されている。しかし、我々は、高リン酸塩濃度は、酵素活性を妨害することができるように、このバッファを使用する前に、予備的研究における分析の変動をテストするために警告する。
蛍光基質の取り扱いと保管
jove_content ">蛍光アッセイが光にさらされると、不純物および/または多くの蛍光化合物の不安定性による干渉に苦しむことができるので、蛍光基質の取り扱いには注意が必要です。私たちは強く、蛍光基質とMUBおよびMUC基準をラベル付けするために任意の光の露出を最小限に抑えることをお勧めします。強くお勧めしアンバーガラスボトルを使用したり、蛍光基質と基準を作り、保存するために使用のガラス器具や容器をカバーする、ガラス製品や容器をラップするアルミニウム箔がうまく機能同様に、効率的にプレートに接種し、暗いインキュベーターに移すことをお勧めしますお勧め。 （5℃）および解凍基板〜24〜48時間前に、酵素アッセイ（複数可）を開始する、基板と基準を（-20℃）のために、もはや2ヶ月未満（光からそれらを保護しながら）を格納する。デザインとレプリケーション
よくよくサンプルのバリエーションに、negativ実施するための最良の口座へEアッセイコントロールと（可能な場合）アッセイが複製することをお勧めします。バリエーションは、典型的に、各ウェル中の土壌粒子の量の違いやピペッティングエラーのために発生します。そのため、強力なミキシングと良好な分注技術は、実質的にうまく変化に十分に最小化されます。さらに、我々は経時的に強く基板の不整合を監視するためのアッセイ陰性対照（緩衝液+基質溶液）を実装示唆する。 （我々は、典型的には、96ウェルプレートの最後の列を使用して）陰性対照ウェルを比較することにより、酵素プレートを読み取るとき、これは容易にモニターすることができる。負の基板コントロールは典型的に安定であるので、ウェル検出限界を超える信号が増加すると、それは、基板および/または標準溶液の交換を必要とする汚染または基質の不安定性の指標である。
他のプロトコルの1種類を実行しますが、スループットを最大化するために、我々のプロトコルは、単一のディープウェルマイクロプレート内のいくつかの潜在的なEEASが含まれてい異なるEEAS以来プレート（プレート当たりすなわち 1の基板）あたりのアッセイは、異なる速度で起こる。いずれにしても、酵素の最適化は、アプローチまたは単板のアプローチを通じて、この高を実行する前に、土壌上で実行する必要があります。反応速度は、インキュベーションの期間内に各酵素について比較的一貫している場合は、複数の基板は、単一のプレート上で使用することができる。
〜1グラムは他のプロトコルでは24を推奨している間に我々のプロトコルは、スラリー溶液を作るために〜2.75グラムの土を推奨しています。我々はより多くの土壌（可能な場合）を使用すると、酵素活性レベルの中で、サンプル土壌の変化より良く取り込むために効果的なアプローチであることを示唆している。他の人が唯一の基質50μlと土壌スラリー200μlのインキュベートしながら、このプロトコルでは、我々は、200μlの基質と土壌スラリー800μlのインキュベートする。これは、単に最終的に測定された活性を変えないことをスケールアップの関数である。実用上の利点もありますより大きなボリュームを使用するため。 One、それは蛍光光度計での強度を記録する前に、黒色平底96ウェルプレート中にピペッティングしながら、対応する土壌粒子を回避することが容易である。酵素関連の蛍光強度を記録する前に、蛍光光度計に黒色平底96ウェルプレートを搬送しながら第二に、付加的な容積は、偶発的な流出の場合に有用である。ボリュームのわずかなずれが大幅に井戸の中で蛍光を減少します。最後に、このプロトコルのためのハイスループット性質のために、我々は一般的にかなりのアッセイが複製実行するよりも酵素活性レベルの変化を表現するために実験的な複製に依存することを選択する。それは、常に分析の複製を含めることをお勧めしますが、実際には、我々のプロトコルは限られた資源与えられた分析と実験の反復の間にバランスのとれたトレードオフを提供しています感じています。同様に、我々のアプローチは、内在する、これアッセイ25あたりに比較的よく均質化した土壌（2.75グラム）を使用していますntly内土壌の変化を減少させる。分析の複製を使用するという決定は、慎重に予備試験48で分析誤差のためにテストすることによって考慮されるべきである。しかし、我々はより少ない4治療群が複製した実験計画を強くアッセイ複製物の使用を検討することをお勧めします。
土壌、バッファボリューム、および基質濃度の最適化
土壌緩衝液：基質濃度比酵素アッセイを行う際に強く測定された蛍光に影響を与える重要な変数である。スラリー中の土壌の量は、アッセイするか、基質の濃度は、土壌試料中の酵素の活性に応じて調整する必要があるかもしれ添加した。この例では選択された量は、その基質利用は、非限定したことを確認するために、これらの土壌の前のテストに基づいて、我々はアッセイ条件下で、最大の潜在的速度（V maxは）44,4測定されたことをされました5。しかしながら、酵素の高い濃度を有する土壌試料について、土壌または基質濃度の量が増加しなければならない。我々は、基質濃度を増加させる（それに応じて標準曲線を調整する）曲線の直線性に影響を与えることができることを見出した。したがって、我々は、必要に応じてボリュームをバッファリングするために土壌の量および/または比例調整を減らすことをお勧めします。測定EEASは飽和及び準飽和基質濃度26間のより大きな大きさの程度によって区別することができるのでかかわらず、それはアッセイごと土壌タイプのための基質濃度を最適化することが重要である。したがって実験処置（ 等 ）の違いは、タイプII統計誤差およびサブ飽和条件下で検出されにくく、かつ統計誤差27,35の影響を受けやすい。基質濃度を最適化するために、予備的な酵素アッセイは、基質濃度の広い範囲を使用して、代表的な土壌サンプルに対して実施すべきである。後に蛍光を記録し、単純に（同様に標準曲線の例を、 図1）にデータをプロット場所スロープ横ばい活性（y軸）酵素に対応する基質濃度（x軸）を識別するために（〜0）。同様に、スロープレベルはオフ（〜0）、その特定の土壌に最適な基質濃度の良い指標である点に対応する基質濃度。
このアッセイは、最終的に酵素媒介基質解重合の結果、基板から切断されている蛍光性部分によって生成与え経時的な蛍光を測定します。したがって、ステップ5（基質添加）が重要であり、基板を土壌に添加されるとアッセイが培養されるときとの間の時間を最小にするために可能な限り効率的に実行されなければならない。基板は、サンプルと接触するいったん同様に、酵素反応が起こり始めます。我々は、マルチチャンネルの使用をお勧めしますこのような理由のためのピペット。ことを強く前日に、あなたの酵素アッセイを実行しているマルチチャンネルピペットを使用して効率的になることが示唆されている。簡単にあなたのピペッターで96ウェルプレートにボリュームを転送できるようになるまで、これを実現するためには、水でピペッティングを練習することができます。
土壌焼入れ
クエンチングは、土壌スラリー-26のインキュベーション中の微粒子及び/又は有機材料に起因する蛍光強度を減少させることを意味する。バッファ比25：急冷土壌を調整することによって影響され得る。による個々の試料からのバックグラウンド蛍光を、バックグラウンド（消光）蛍光を説明するために試料と標準を実行することが重要である。いくつかのプロトコルは、信号が線形であることをテストした後、単一の濃度を使用していますが、私たちは強く消光の影響のための最高のコントロールに各試料の標準クエンチ制御を実現するお勧めします。これを怠ると、スタンドになりますサンプルには適用されませんARDカーブ、および酵素活性の誤推定。標準添加試料のバックグランド蛍光に影響を与えない土壌スラリーへの基準の追加は、時間に敏感ではありません。
NaOH添加
合成基質から放出された蛍光染料が、pH> 9.0 26,49にピーク蛍光を示すので、NaOHの添加は、蛍光、酵素活性測定を最適化するためにいくつかのプロトコルで使用される。この提案を検討する場合、土壌スラリーpH（ すなわち、pH> 9）に必要なNaOH濃度は、特定の土壌によって異なり、pH緩衝剤26を使用した 。しかしながら、他の信号強度がさらに低いpHで一般的に非常に高いので、それは測定誤差の追加のソースを導入するためのNaOHが必要ないかもしれないと主張している。例えば、スラリーpH、したがってMUBまたはMUC fluoreにNaOHを添加の効果時間25以上のscence変わります。最大60分26についての蛍光を減少させたMUCが安定実証されていながら、MUBリンクされた基板は、レベルが先細りする前のNaOHの追加を次の20分間の一貫した増加した蛍光を発揮することが示されている。したがって、NaOHを添加し、蛍光測定の間の時間を標準化することが重要である。蛍光レベルは、NaOHを添加することなくアッセイを行う、添加なしで十分に検出可能である場合に代替的に均等に許容される代替的な26として提案されている。
温度
インキュベーション温度を決定する際の温度感度を考慮に入れるべきである。主な関心が示されているように（結果のセクションで）アレニウスプロットを使用して3つ以上の温度を用いて、酵素反応速度を理解している場合は、堅牢なアプローチです。サンプルサイトは、永久凍土の土壌、そしてduratioとして特徴的に低温を持っている場合インキュベーションのnは寒いインキュベーション温度に反応する酵素をできるように拡張する必要があるかもしれません。温度の上昇は、増大した酵素活性をもたらすはずであることを示唆している伝統的な酵素動力学が、我々は、酵素が温度感受性50の観点で部位特異的であり得ることを見出した。そのため、サイト固有の酵素活性のポテンシャルを理解するには、培養温度と持続時間は現場の値を反映するように調整することが重要です。
結論
のEEは、土壌中の生物地球化学的プロセスの重要なドライバであるため、我々は彼らの活動を測定することができるようにする必要があります。干渉や阻害を含む土壌中EEASを測定するには多くの課題があります。これらの課題にもかかわらず、（ここに記載されるものなど）標準化されたプロトコルは、普遍的に酵素の幅広いEEASを測定するために適用することができる。それは中に、これらのプロトコル以下の品質データを生成するために非常に簡単ですが生態学的文脈でこのデータのterpretationは、これらのアッセイが実際に測定しているかを慎重に検討する必要があり、どのようにアッセイ条件下でEEASは、 その場での条件での下では異なる場合があります。
Disclosures
利害の対立が宣言されていません。
Acknowledgments
本書は、米国国立科学財団（DEB番号1021559）でサポートされる環境研究調整ネットワーク研究中の酵素によって資金を供給された。この研究は、米国国立科学財団（DEB番号1021559）、およびエネルギー省科学局（生物環境研究）の米国部門によってサポートされていました。本資料に表明いかなる意見、発見、結論や提言は、著者自身によるもので、必ずしも米国NSFの見解を反映するものではありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents: | |||
| 4-Methylumbelliferyl α-D-glucopyranoside (AG) | Sigma Aldrich | M9766 | Sugar degradation |
| 4-Methylumbelliferyl β-D-glucopyranoside (BG) | Sigma Aldrich | M3633 | Sugar degradation |
| 4-Methylumbelliferyl β-D-cellobioside (CB) | Sigma Aldrich | M6018 | Cellulose degradation |
| L-Leucine-7-amido-4-methylcoumarin hydrochloride (LAP) | Sigma Aldrich | L2145 | Protein degradation |
| 4-Methylumbelliferyl N-acetyl-β-D-glucosaminide (NAG) | Sigma Aldrich | M2133 | Chitin degradation |
| 4-Methylumbelliferyl phosphate (PHOS) | Sigma Aldrich | M8883 | Phosphorus mineralization |
| 4-Methylumbelliferyl-β-D-xylopyranoside (XYL) | Sigma Aldrich | M7008 | Hemicellulose degradation |
| 4-Methylumbelliferone (MUB) | Sigma Aldrich | M1381 | |
| 7-Amino-4-methylcoumarin (MUC) | Sigma Aldrich | A9891 | |
| 50 mM Sodium acetate anhydrous buffer | Fisher Scientific | S210-500 | acidic and neutral soils |
| 50 mM Tris base buffer | Fisher Scientific | BP154-1 | basic soils |
| Equipment | |||
| Bel-Art Scienceware disposable pipetting reservoirs | Fisher Scientific | 14-512-65 | pipetting reservoir |
| Electronic; Eppendorf Xplorer; 8-channel | Fisher Scientific | 13-684-265 | 8-channel pipette, range: 50-1,200 μl |
| TipOne 101-1,250 μl extended length natural tips | USA Scientific | 1112 - 1720 | 10 racks of 96 tips (960 tips) |
| Hotplate; heating surface: 10 in x 10 in. | Fisher Scientific | 11-100-100SH | Lab disc magnetic stir plate |
| Waring blender | Fisher Scientific | 14-509-7P | Two-speed; 1 L (34 oz) stainless steel container |
| BRAND Dispensette III bottle-top dispensers | Fisher Scientific | 13-688-231 | Dispenser; range: 5-50 ml |
| Wheaton Unispense μP peristaltic pumps | Fisher Scientific | 13-683-7 | Optional dispenser |
| Fisherbrand magnetic stir bar | Fisher Scientific | 1451363SIX | Used to stirr soil slurry afer blending |
| Pyrex glass bowls | World Kitchen | 5304218 | Pyrex 10 oz rimmed custard cup |
| Costar 96-well black solid plates | Fisher Scientific | 07-200-590 | Used for plate reader step |
| Costar 96-well assay blocks | Fisher Scientific | 07-200-700 | V-bottom; 2 ml; sterile |
| Thermo Scientific Nunc 96-well cap mats | Fisher Scientific | 14-387-93 | Sterile 96-well cap mat for square wells |
| Centrifuge equipped with holders for deep-well plates | Thermo Scientific | 3121 | Centra-GP8 (this model is no longer available) |
| Tecan Infinite 200 series multifunctional microplate reader | Tecan | 30016058 | Plate reader (this model is no longer available) |
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