Summary
We beschrijven een set van technieken voor het bestuderen van spontaan gedrag van vrij zwemmen zwak elektrische vissen over een langere periode van tijd, door synchroon meten van elektrische orgel ontlading timing van het dier, lichaamshouding en houding zowel nauwkeurig en betrouwbaar in een speciaal ontworpen aquarium tank in een zintuiglijke isolatiekamer.
Abstract
Langdurige gedragsproblemen tracking kan vastleggen en kwantificeren natuurlijke dierlijke gedrag, ook die welke zich zelden. Gedrag, zoals exploratie en sociale interacties kunnen het beste worden bestudeerd door het observeren van ongeremde, vrij gedragen dieren. Zwak elektrische vissen (WEF) scherm gemakkelijk waarneembare verkennend en sociaal gedrag door het uitzenden van elektrische orgel ontlading (EOD). We beschrijven hier drie effectieve technieken synchroon meten EOD, lichaamshouding en houding van een vrijzwemmende WEF gedurende langere tijd. Eerst beschrijven we de bouw van een experimentele tank binnenkant van een isolatiekamer ontworpen om externe zintuiglijke prikkels zoals licht, geluid en trillingen te blokkeren. Het aquarium werd verdeeld tot vier proefstukken tegemoet te komen, en automatische poorten op afstand toegang van de dieren aan de centrale arena beheersen. Ten tweede, beschrijven we een nauwkeurige en betrouwbare real-time EOD timing meetmethode van vrij rond te zwemmen WEF. Signaalvervormingen veroorzaakt door bewegingen van het lichaam van het dier worden gecorrigeerd door ruimtelijke middeling en temporele verwerking fasen. Ten derde, beschrijven we een onderwater nabij-infrarood imaging setup om onverstoord nachtdier gedrag te observeren. Infrarode lichtpulsen werden gebruikt om de timing tussen de video en de fysiologische signaal synchroniseren over een lange opnameduur. Onze geautomatiseerde tracking software meet lichaamshouding en houding van het dier betrouwbaar in een aquatisch scene. In combinatie, deze technieken in staat langdurige observatie van spontaan gedrag van vrij zwemmen zwak elektrische vissen in een betrouwbare en nauwkeurige wijze. Wij geloven dat onze werkwijze kan eveneens betrekking op de fysiologische signalen verkennende of sociaal gedrag worden toegepast op de studie van andere waterdieren.
Introduction
Achtergrond. Kwantitatieve experimenten op het gedrag van dieren (bijvoorbeeld gedwongen keuze, schokken vermijden, T-doolhof, enz.) Worden meestal gebruikt om specifieke hypotheses te onderzoeken met betrekking tot sensorische-motorische vaardigheden, leren en geheugen vorming. Echter, deze beperkende experimenten missen een groot deel van de rijkdom van het natuurlijke gedrag van dieren en zullen waarschijnlijk leiden tot ongenuanceerde modellen van de onderliggende neurale basis van gedrag. Experimenten onder meer naturalistische omstandigheden zijn daarom een belangrijke aanvulling waarmee we meer volledig een soort gedragsrepertoire verkennen. Experimenten met vrij bewegende dieren moeten echter aanpakken unieke technische uitdagingen zoals-beweging geïnduceerde opname artefacten. Unlike-stimulus opgewekte responsen kunnen spontaan optredende verkennende gedrag te voorspellen, dus proefpersonen moeten voortdurend worden gecontroleerd en gevolgd gedurende een langere tijdsperiode. Specifieke onderzoeksvragen can best worden aangepakt door zorgvuldig geselecteerde organismen en beschikbare technische hulpmiddelen. Bijvoorbeeld zijn optische registratie-en stimulatie technieken zoals genetisch gecodeerde calcium sensoren 1 en 2 optogenetics succes toegepast op vrijdraaiende genetisch modelorganismen 3-5. Als alternatief kan geminiaturiseerde neurale telemetrie systemen op te nemen en vrij te stimuleren bewegende kleine dieren 6,7.
Elektrische vissen. WEF soorten genereren elektrisch orgel ontladingen (EODs), die hen in staat stellen om hun directe omgeving te voelen of om te communiceren over grotere afstanden. Temporele patronen van EODs afwijken onder andere omstandigheden zoals zelf-bewegingen 8,9, zintuiglijke prikkels 10,11, en sociale interacties 12,13. Pulsvormig WEF soorten produceren een trein van discrete pulsen, in tegenstelling tot golf-achtige soorten die voortdurend quasi-sinusoïdale golfvormen genereren. In het algemeen, pulse soorten ingevoerd tentoonstelling more variabele EOD in vergelijking met de golf-achtige soorten, en de dieren 'EOD tarieven nauw weerspiegelen nieuwigheid inhoud van hun zintuiglijke omgeving 10,14. Puls-achtige soorten kunnen direct verkorten van de interval tussen pulsen (BIV) binnen een enkele puls cyclus reageren op een nieuwe zintuiglijke verstoring (novelty reactie 10,11,14). De lopende elektrische gedrag van deze vis kan worden verstoord door ongecontroleerde sensorische prikkels uit externe bronnen, en verschillende soorten stimuli zoals trilling, geluid, elektriciteit en licht zijn bekend trekker nieuwheid reacties. Daarom moeten speciale voorzorgsmaatregelen worden genomen om tijdens een langdurige observatie van vrij zwemmende WEF externe zintuiglijke prikkels blokkeren of verzwakken. Zo kunnen veranderingen in EOD snelheid en beweging trajecten specifiek toegeschreven aan stimuli door de experimentator.
Aquariumtank en isolatiekamer. We meerdere lagen van vibratie absorberende materialen geplaatst dus under een groot aquarium tank (2,1 mx 2,1 mx 0,3 m), en omringden de tank met een geïsoleerde behuizing voor externe lichtbronnen, elektrische ruis, geluids-en warmte flux blokkeren. EOD is afhankelijk van de omgevingstemperatuur 15,16, waardoor de temperatuur van het water is strak gereguleerd op een tropisch bereik (25 ± 1 ° C) voor Zuid-Amerikaanse WEF soorten. We bouwden een groot en ondiep (10 cm waterdiepte) tank naar ruimtelijke verkennende gedrag van WEF hoofdzakelijk beperkt in twee dimensies (figuur 1A) te observeren. De tank werd verdeeld in een centrale arena om ruimtelijke gedrag te observeren, en vier hoeken compartimenten afzonderlijk te huisvesten afzonderlijke vissen (Figuur 1B). Elk compartiment is gebouwd waterdichte elektrische communicatie tussen individuen te voorkomen. Toegang dieren aan de centrale arena werd gecontroleerd van buitenaf door vier gemotoriseerde poorten. De hekken werden geplaatst tussen de compartimenten, en zij werden waterdicht indien geslotendoor nylon vleugel-moeren. Geen metalen onderdelen werden onderwater gebruikt sinds WEF reageren gevoelig voor metalen.
EOD opnemen. EODs worden gegenereerd in een stereotiepe wijze door activering van enkele (in Mormyrids) of meerdere ruimtelijk verdeeld elektrische orgels (in Gymnotiforms) 17,18. Temporal modulaties in de EOD tarief kan onthullen hogere neurale activiteiten, omdat het medullaire pacemaker ontvangt directe neurale input van hogere hersengebieden zoals de diencephalic prepacemaker kern, die omgekeerd is axonale projecties van de voorhersenen 19. Wel moet de EOD timing zorgvuldig worden geëxtraheerd uit een ruwe golfvormregistratie en niet beïnvloed door beweging geïnduceerde verstoringen van het dier. Het elektrische veld dat door een WEF kan worden benaderd als een dipool, dus EOD pulsamplitude bij registrerende elektroden afhankelijk van de relatieve afstanden en oriëntaties tussen het dier en de elektroden 8,20. Self-movem dierouders veranderen de relatieve geometrie tussen het dier en de elektroden, waardoor bewegingen veroorzaken de EOD amplitudes op verschillende elektroden te variëren in de tijd in een vluchtige wijze (zie figuur 2B in juni et al.. 8). Bovendien, self-bewegingen ook veranderen de vorm van opgenomen EOD golfvormen, omdat de relatieve bijdragen van de verschillende set van de elektrische organen afhankelijk van hun locaties langs de lichaamslengte en hun lokale krommingen geïntroduceerd door staart buigen. De beweging veroorzaakt verstoringen in de EOD amplitudes en vormen kunnen leiden tot onnauwkeurige en onbetrouwbare EOD timing metingen. We losten deze problemen door het ruimtelijk gemiddelde van meerdere EOD golfvormen opgenomen op verschillende locaties, en door het toevoegen van een envelop extractie filter om precies te bepalen de EOD timing van een vrij zwemmende WEF. Bovendien, onze techniek meet ook de EOD amplitudes, die aangeeft wanneer een dier rust of actief bewegen gebaseerd op de verandering van de EODamplitudes in de tijd (zie de figuren 2E en 2F). We namen differentieel versterkte signalen van de registratie-elektrode paren common-mode ruis. Omdat de EOD pulsen worden gegenereerd op onregelmatige tijdsintervallen, de EOD event time-serie hebben een variabele sampling rate. De EOD tijdreeksen kan een constante sampling rate worden geconverteerd door interpolatie indien vereist door een analytisch instrument van keuze.
Video-opname. Hoewel EOD opname een grove beweging activiteit van een dier kan monitoren, video-opname maakt directe metingen van het lichaam van positie en houding van een dier. Nabij-infrarood (NIR) verlichting (λ = 800 ~ 900 nm) maakt onverstoorbaar visuele waarneming van vrij zwemmende vissen 21,22, omdat WEFs zijn het meest actief in de duisternis en hun ogen zijn niet gevoelig voor NIR spectrum 23,24. De meeste digitale beeldsensoren (bijv. CMOS of CCD) kan NIR spectrum vastleggen met de wavelength range tussen 800-900 nm, na het verwijderen van een infrarood (IR) sperfilter 25. Sommige high-end consumenten-grade webcams bieden high-definition, grote kijkhoek en goede gevoeligheid bij weinig licht, die kan produceren een beeldkwaliteit die vergelijkbaar is met of beter dan professionele IR-camera's beschikbaar tegen veel hogere kosten. Daarnaast worden bepaalde consumenten-grade webcams gebundeld met opname-software die een langere opnameduur mogelijk maakt door video comprimeren zonder kwaliteitsverlies. De meeste professionele camera's bieden tijdsynchronisatie TTL impulsuitgangen of trigger TTL pulsingangen 26 voor het uitlijnen van de timing tussen de video met de gedigitaliseerde signalen, maar deze functie is veelal afwezig in consumenten-grade webcams. Echter, de timing tussen een video-opname en een signaal digitizer nauwkeurig worden geëvenaard door gelijktijdig vastleggen van een periodiek knipperende IR LED met de camera en het signaal digitizer. De eerste en de laatste puls IR timing kan worden gebruikt eens twee tijdkalibratiesig markering voor de framenummers omzetten om het signaal digitizer tijdseenheid en vice versa.
Verlichting & achtergrond. Vastleggen van het beeld door het water kan zijn technisch uitdagend door lichtreflecties in het water oppervlak. Het wateroppervlak kan fungeren als een spiegel om een visuele scène boven water, en obscure visuele kenmerken onderwater weerspiegelen, dus de scène boven water moet karakterloze worden gemaakt om visuele interferentie te voorkomen. Om het imago van de hele aquarium, een camera moet direct boven het water te worden geplaatst, en het moet worden verborgen achter het plafond over een kleine doorkijk naar de reflectie op het water oppervlak te voorkomen. Bovendien kan het water oppervlak glans en ongelijkmatige verlichting opleveren als lichtbronnen verkeerd worden geprojecteerd. Indirecte verlichting kan een uniforme helderheid te bereiken over het gehele aquarium door te streven de lichtbronnen in de richting van het plafond, zodat het plafond en de omringende walls kunnen reflecteren en verspreiden de lichtstralen vóór het bereiken van het wateroppervlak. Kies een IR schijnwerper die overeenkomt met een spectrale respons van de camera (bijv. 850 nm piek golflengte). Elektrische ruis van de lichtbronnen kan worden geminimaliseerd door het gebruik van LED-verlichting en het plaatsen van hun DC-voedingen buiten de kooi van Faraday. Plaats een witte achtergrond onder de tank, omdat vis contrasteert heel mooi in een witte achtergrond bij NIR golflengten. Ook het gebruik van matte kleur op de binnenoppervlakken van de isolatiekamer levert uniforme en heldere achtergrondverlichting.
Video tracking. Na een video-opname, kan een geautomatiseerde beeldtracking algoritme van het dier lichaamshoudingen en houdingen in de tijd te meten. De video-tracking kan automatisch worden uitgevoerd door een van beide kant-en-klare software (Viewpoint of Ethovision), of door de gebruiker programmeerbare software (OpenCV of MATLAB Beeldverwerking toolbox). Als eerste stap van beeldtracking,een geldig tracking gebied moet worden gedefinieerd door het tekenen van een geometrische vorm om buiten het gebied uit te sluiten (maskeren werking). Vervolgens afbeelding van een dier nodig heeft van de achtergrond te worden geïsoleerd door een achtergrondafbeelding af te trekken van een afbeelding met het dier. De afgetrokken beeld wordt omgezet in een binair formaat door toepassing van een intensiteit drempel, zodat het zwaartepunt en de oriëntatie as kan worden berekend uit binaire morfologische bewerkingen. In Gymnotiforms 27-29 en Mormyrids 30-32, de Elektroreceptor dichtheid is de hoogste in de buurt van het hoofd regio, dus de positie van het hoofd op ieder moment duidt op een locatie van de hoogste zintuiglijke scherpte. De kop en de staart locaties kan automatisch worden bepaald door toepassing van de beeldrotatie en begrenzingsvak operaties. De kop en de staart uiteinden kunnen worden van elkaar onderscheiden door ze handmatig te definiëren in het eerste frame, en door het bijhouden van hun locaties uit de vergelijking van twee opeenvolgende frames.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deze procedure voldoet aan de eisen van de Universiteit van Ottawa Animal Care Comite. Geen belangenconflict wordt verklaard. Raadpleeg de tabel van materialen en reagentia voor de merken en modellen van de apparatuur en de hieronder genoemde materialen. Op maat geschreven Spike2 en MATLAB scripts, en sample gegevens worden verstrekt in de aanvullende File.
1. Aquarium Tank en isolatiekamer Setup
- Anti-v ibration vloer. Construeren van een anti-vibratie oppervlak (2,1 mx 2,1 m) door het stapelen van rubberen pads, akoestische piepschuim, multiplex paneel, en polyurethaanschuim pads van de bodem naar de top (Figuur 1A). Leg vier houten tapeinden (5 cm x 10 cm) op de multiplex plaat aan de randen van de aquariumtank ondersteunen.
- Vloerverwarming. Leg een elektrisch afgeschermde verwarmingselement dan thermisch graded schuimvulling (zie figuur 1D onderaan). Bedek het verwarmingselement met een metalenlic. mesh voor elektrische afscherming.
- Ruimtelijke tank. Construct een breed en ondiep aquarium tank (1,8 mx 1,8 mx 30 cm) met behulp van 1,3 cm dik gehard glas panelen, L-vormig aluminium frame en aquarium-grade siliconen (zie figuur 1A). Bedek de onderkant van de tank met een groot vel witte achtergrond hoge beeldvorming contrast bieden (zie Protocol nr. 3).
- Verdeel het aquarium tank in een centrale arena (1,5 m diameter) en vier hoeken compartimenten (zie figuur 1B) door het installeren van muren (22,5 cm hoog) gemaakt van acryl platen (mat wit, 0,64 cm dik).
- Bend vier acrylplaten (22,5 cm x 102,7 cm) door het toepassen van warmte aan vier gebogen wanddelen creëren, en voeg ze toe aan de bodem van de tank met behulp van siliconenkit om de centrale arena te scheiden van de vier hoeken compartimenten. Verlaat 20 cm ruimte tussen de gebogen secties voor de installatie gate.
- Aparte naburige hoek compartimenten door het installeren van vier dubbele wanden wie 15 cm gaten, die extra elektrische isolatie en plaatsen voor onderwater sensoren zoals een hydrofoon bieden.
- Monteer vier gemotoriseerde poorten, en installeer ze tussen de hoek compartimenten en de centrale arena.
- Monteer vier deurkozijnen zoals weergegeven in figuur 1C. Maak zes putten (0,64 cm diep) op elke deurpost, insluiten nylon eikelnoten (draad diameter 0,64 cm) en zet ze vast met epoxy.
- Snijd vier deurpanelen uit acryl en rubber platen, en het creëren van zes gaten (0,64 cm diameter) op de acryl en rubberen panelen voor de vergrendeling. Word lid van de acryl en rubberen panelen met behulp van siliconen afdichting.
- Installeer acryl scharnieren aan de deurpanelen samen met de deurkozijnen.
- Mount swingende armen op servomotoren, en installeer ze op de top van de deurkozijnen (zie figuur 1C). Maak lussen met kabelbinders aan de zwenkarmen koppelen aan de deurpanelen.
- Plaats de poort assemblages op de gaps gemaakt tussen de gebogen wanddelen, en zet ze met behulp van siliconen afdichting.
- Verbind alle servomotoren een servo-controller, en sluit deze aan op een voedingsbron en een computer via een actieve USB-verlengkabel. Test de poorten met behulp van controle met de servo-controller meegeleverde software.
- Na de siliconen verhardt, controleren op waterdichtheid door het blokkeren van alle poorten met nylon schroeven en vullen van een compartiment op een moment.
- Isolatiekamer. Construct een isolatiekamer naar het aquarium omsingelen en te blokkeren externe bronnen van licht, geluid en elektrische ruis (zie figuur 1D).
- Maak drie wandpanelen (2 mx 2 mx 5 cm) en vier deurpanelen (1,9 mx 0,95 mx 5 cm). Voor elk paneel, join aluminium sierlijsten (5 cm x 2,5 cm) om een rechthoekig frame te maken, en klinknagel een witte gegolfde kunststof paneel op het aluminium frame. Vul akoestische glasvezel batts in de panelen, en sluit af met een zwarte gegolfde kunststof paneel.
- Plaats drie wandpanelen op de anti-vibratie vloer, en installeer piano scharnieren aan de vier deurpanelen mee op de wandpanelen.
- Omringen de isolatiekamer met aluminium mazen, en gemalen mazen aan alle kanten om een kooi van Faraday te maken.
- Luchtvochtigheid. Installeer een geluidsarme ventilator (Figuur 1F boven) om het overtollige vocht ophoping van verhitting. Plaats de ventilator ten minste 2 m afstand van de opname plaats, en installeer een luchtkanaal tussen de isolatiekamer en de afzuigventilator.
- Routinematig monitoren en de voorwaarden van de tank water en dieren te behouden.
- Zorg voor een constante water omstandigheden op 10 cm diepte, 100 mS / cm geleidbaarheid en pH 7,0 door toevoeging van water of zout stock oplossing (zie Knudsen 33 voor het recept). Voeg een zak met gemalen koraal indien de pH beneden 6,5.
- Installeer verticale aquarium filters die kunnen opereren vanuit ondiep water voor het reinigen enbeluchten doeleinden (Figuur 1F onderaan). Koppel de filters en neem ze uit de centrale arena tijdens de opname sessies.
- Lever levende meelwormen op de bodem van de tank door ze op zuignappen met elastiek. Vermijd vrij zwevende prooien zoals blackworms ongecontroleerde toevoer van verdwaalde prooien tijdens de opname te voorkomen.
2. EOD Tracking
- Elektroden installatie. Monteer acht grafiet elektroden, en ruimte ze even op de gebogen wand van de centrale arena.
- Verkrijgen tekening leads (15 cm lang; Mars Carbon 2 mm HB) en afscheren de buitenste schil van de leads.
- Snijd acht 10 cm segmenten van coaxkabel (RG-174), wikkel de kabel kern waaromheen het ene uiteinde van het grafiet staven, en toe te passen krimpkous over hen voor een sterke en stabiele elektrische aansluiting. Bevestig BNC jack-aansluitingen aan de tegenovergestelde uiteinden (Figuur 2A links). </ Li>
- Plaats de elektroden op de muur met tape, en dunne reepjes van afplakband toepassing op de elektrode oppervlakken te beschermen tegen siliconen. Solliciteer siliconen afdichting niet permanent de elektroden, en verwijder alle tape voordat de siliconen verhardt (Figuur 2A rechts).
- Bouw acht bekabeling door de afstand van elke elektrode tot de versterkereenheid, en snijden coaxkabels (RG-54) in lengte. Bevestig BNC-connectors aan beide uiteinden van de kabels.
- Gebruik de kabel assemblies om alle elektroden aan te sluiten op de versterker. Differentieel versterken door het koppelen van twee 90 °-georiënteerde elektroden (zie figuur 2B), en op de grond alle coaxiale afscherming zijn door ze aan te sluiten op de kooi van Faraday.
- Stel de gain onder de verzadiging van het signaal te beperken, en pas een band-pass filter (200 Hz-5 kHz) om ruis te verwijderen. Digitaliseren van de vier registratie-elektrode paren bij 40 kS / sec.
- Onlinesignaalverwerking. De handleiding is geschreven voor de Spike2 software, en de parameter instellingen zijn geoptimaliseerd voor Gymnotus sp. (Zie figuur 2C voor samenvatting).
- Voeg een DC verwijderen proces (τ = 0,1 sec) om alle opnamen kanalen.
- Voeg een rectificeert proces om alle opnamen kanalen.
- Maak een virtueel kanaal door het optellen van alle vier de opname kanalen.
- Extract een unimodaal envelop per EOD puls door toevoeging van een RMS (root-mean-squared,
) Proces (τ = 0,25 msec) aan de virtuele kanaal, voor het genereren van een enkele piek per EOD cyclus eenduidig bepalen van de timing van pulsen. - Maak een realmark kanaal uit de virtuele kanaal en noteer de tijd en de waarde van de piek amplitudes, na het instellen van een passende drempel om alle EOD pulsen wi vastleggenthout missen van een puls, terwijl valse positieven.
- Monitor de momentane EOD tarief in real-time door het kanaal weergave-optie van de realmark kanaal naar een momentane frequentie modus.
- Bewaken van de vis beweging in real-time door het dupliceren van de realmark kanaal, en de optie display om een golfvorm modus.
- Kwantificeren een activiteit niveau van de RMS van de EOD amplitude helling door het creëren van een virtueel kanaal van de realmark kanaal (0.01 sec bemonsteringsperiode), en voeg de helling (τ = 0,25 msec) en RMS (τ = 0,5 msec) processen.
- De realmark kanaal exporteren in de Spike2 software om de MATLAB-formaat.
) Proces (τ = 0,25 msec) aan de virtuele kanaal, voor het genereren van een enkele piek per EOD cyclus eenduidig bepalen van de timing van pulsen. 3. Gesynchroniseerd Video Tracking
- Maak een achtergrond scene.
- Verberg een object dat een reflectie op het wateroppervlak door ze met een matte witte aanrecht film werpt.
- Installeer een matte wittegegolfde kunststof paneel 15 cm onder het plafond naar de camera en de ontluchter te verbergen.
- Print rasterpatronen op een groot vel wit papier voor het kalibreren van een camera, en leg het onder de tank een hoog contrast achtergrond bieden.
- Installeer lichtbronnen.
- Verkrijgen IR LED-verlichting en, verwijder ingebouwde ventilatoren om ruis te verminderen. Rijd de LED met een stroom-geregelde DC voeding buiten de kooi van Faraday geplaatst.
- Installeer IR LED-verlichting voor de beeldvorming in de duisternis, en witte LED-verlichting voor het besturen van een dagelijkse licht-cyclus in de test vis. Direct alle lichtbronnen naar het plafond te indirect en gelijkmatige verlichting (figuur 3A) te bereiken.
- Regelen de dagelijkse licht-cyclus door het rijden van de witte LED-lampen met een timer-gestuurde schakelaar (bijv. 12 uur on/12 uur uit).
- Installeer een camera recht boven het aquarium.
- Verkrijgen van een NIR-gevoelige camera, of verwijder een IR blocking filter van het breken van een dun vel van getint glas achter in het lenzensamenstel. Zorg ervoor dat de kijkhoek is breed genoeg om het imago van de hele centrale arena.
- Maak een kleine doorkijk in het midden van het plafondpaneel en plaats de camera recht boven het gat.
- Installeer een witte ring bewaker rond de lens als de lichtbronnen genereren blikken.
- Maak een time-gesynchroniseerde video-opname.
- Plaats een IR LED op een van de vier hoeken tank tijdsynchronisatiepulsen (1 msec duur, 10 sec periode) te genereren. Voeg een lastbegrenzers weerstand (1 kOhm) in serie, en rijden de IR LED's van een digitale output poort van de digitizer hardware.
- Gebruik video-opname-software meegeleverd met de camera, indien beschikbaar. Selecteer de hoogste opnamekwaliteit (bijv. lossless compressie) en de hoogste resoluties ondersteund.
- Start de video-opname onmiddellijk voor aanvang van de EOD opname, en stop de video-opname onmiddellijkdellijk na de EOD opname.
- Na de opname, zet het beeld framenummers aan de digitizer tijdseenheid door lineair interpoleren tussen de eerste en de laatste lichtpulsen gevangen genomen door het signaal digitizer en de video-opname.
- Geautomatiseerde beeldtracking
De handleiding is geschreven voor de MATLAB Beeldverwerking toolbox, en gebruik maken van haar taken. Een aangepaste MATLAB script is voorzien van dit middel voor automatische image tracking.- Importeer video. Importeer een video-opname-bestand rechtstreeks naar de MATLAB werkruimte met "Videoreader. Lezen" functie.
- Maak afbeelding een composiet achtergrond door het combineren van twee beeld frames. Vervang het beeldgebied bezet door een dier met een leegstaand beeld van dezelfde regio in een ander frame (zie figuur 3B).
- Geef een beeldgebied te volgen door het tekenen van een cirkelvormig masker rond de centrale arena om de een te sluitenrea buiten (Figuur 3B bodem), en vermenigvuldigen met een constante (r int) een minimumdrempel voor de intensiteit verschil ingesteld. Bijvoorbeeld, waarin rint = 0.85 zal de intensiteit fluctuaties onderdrukken 15% = - onder de achtergrond (1 r int).
- Beeldsubstractie. Trek een beeld frame (= IM k) van de achtergrondafbeelding (= IM 0) om verschil beeld (= ΔIM k) te verkrijgen. Gebruik unsigned integer numerieke precisie om het beeld intensiteit waarden als niet-negatieve gehele getallen op te slaan.
- Segment verschil afbeelding door toepassing van een intensiteit drempel bepaald uit de graythresh functie het. Reinig het binair beeld met behulp van de bwmorph functie en selecteer de grootste blob overeenkomt met een dier na het berekenen van alle blob gebieden met behulp van de regionprops functie.
- Bepaal het zwaartepunt en de grote oriëntatie eenXIS van de grootste blob door toepassing van de regionprops functie, en draai de afbeelding om de hoofdas met de x-as uitlijnen. Verdeel de afbeelding om de kop en staart delen op het zwaartepunt (Figuur 3D-top).
- Bepaal de hoofdas van het hoofd gedeelte, en draai de gehele afbeelding aan te sluiten bij de x-as (Figuur 3D linksonder). Fit begrenzingsvak vakken rond de kop en staart delen parallel aan hun grote assen met de regionprops functie.
- Bepaal de mediaan y-coördinaten van de blob links, midden en rechts verticale randen van de omsluitende kaders (groene stippen in figuur 3D bodem), en deze toewijzen aan vijf kenmerkende punten (hoofd-tip, mid-head, mid-body , mid-staart, staart-tip).
- Verwerken opeenvolgende frames na een beeld knippen frame gecentreerd in zwaartepunt van het dier bepaald uit haar vorige frame.
- Het hoofd oriëntatie handmatig toe te wijzen voor het eerste frame, en gebruik een dot-product between de oriëntatie vectoren van twee opeenvolgende frames om het hoofd oriëntatie automatisch te bepalen. Inspecteer het resultaat, en handmatig flip het hoofd oriëntatie als verkeerd wordt toegewezen.
- Plot een dier traject door toetreding tot de hoofd-tips, en glad met behulp van mediaan en gemiddelde filters (n = 3) als het een nerveuze uitstraling. Superimpose het traject met een achtergrondafbeelding en interpoleren vis middellijnen met behulp van de vijf kenmerkende punten (zie figuur 2E).
- Bereken de gemiddelde EOD snelheid elk beeld vastleggen keer door herbemonsteren de momentane EOD tarief (100 Hz sampling rate) en gemiddeld (0,0625 sec tijdvenster). Plot het traject in pseudo-kleuren bepaald uit de tijd afgestemd EOD tarief, en superponeren een achtergrondafbeelding (zie figuur 2F) met.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
EOD traceerresultaten
De opgenomen EOD golfvormen uit verschillende elektrodeparen gevarieerd in amplitudes en vormen zoals verwacht van hun unieke posities en oriëntaties (figuur 2C boven). Het gebruik van meerdere elektrodeparen gewaarborgd sterk signaal op alle mogelijke posities en oriëntaties van WEF in de tank. De envelop golfvorm (figuur 2C bodem, groen trace) altijd bevatte een enkele piek per EOD cyclus, die diende als een betrouwbare tijd marker voor nauwkeurig bepalen van de inter-puls-intervallen en de momentane EOD tarief (= IPI -1). De opeenvolgende EOD pieken werden samengevoegd en lineair geïnterpoleerde constante tijdsintervallen (figuur 2D, zwart spoor), en de momentane EOD tarief werd op dezelfde geïnterpoleerd bij constante tijdsintervallen (figuur 2D bodem, roze trace). De constante-time resampling procedure vergemakkelijkt de tijd synchronisatie zijnsen de beweging traject en de EOD signaal, en maakt het mogelijk om gebruik te maken van een groter aantal analytische hulpmiddelen voor het voortdurend bemonsterd tijdreeksen. De EOD amplitudes opgenomen met externe elektroden constant gebleven, terwijl een dier was in rust (figuur 2E top), maar het varieerde in de tijd, terwijl het dier verplaatst als gevolg van veranderende dipool locatie en oriëntatie (figuur 2F top). Zo zou de vis beweging worden afgeleid uit het observeren van de verandering van de EOD amplitudes in de tijd. De basislijn EOD bleef laag, terwijl vis was bij rust (figuur 2E onder), maar de EOD tarief werd aanzienlijk hoger, terwijl de vis actief zwom (figuur 2F top). Onze waarneming is consistent met de positieve correlatie tussen de EOD koers en de vis beweging als eerder gemeld 8,9,34,35.
Video traceerresultaten
Wijze en middellijnen het dier worden getoond in Fig Ure 3E met het eerste en het laatste beeld frames gelegd. Het tijdsverloop van houding veranderen is opgeslagen terwijl vis werd abrupt draaien van twee seconden, en de vis middellijnen worden uitgezet elke 200 msec. De vis middellijn goed begonnen aan het hoofd-tip en beëindigd op de staart-uiteinde van vis. De vis beelden nauw overleg met de automatisch bijgehouden middellijnen ondanks de schaduwen gegoten door het dier. Figuur 3F illustreert de tijd variërende gemiddelde EOD-tarief (τ = 0.0625 sec) in kleur, die bovenop met de tijd afgestemd traject van het hoofd vis -tip. Tijdens de 2 seconden draaien duur, de gemiddelde EOD bereikte een hoogtepunt terwijl het dier zich in het midden van de draaiende fase en daalde aan het einde van het draaien. Deze vertegenwoordiger resultaat illustreert dat onze methode succesvol kan worden toegepast op de relatie tussen self-guided bewegingen en de EOD tarief modulatie tijdens de vrije-zwemmen te bestuderen.
t "fo: keep-together.within-page =" altijd ">
Figuur 1. Aquariumtank en isolatiekamer setup. A) De experimentele kamer bestaat uit een anti-vibratie vloer, aquarium tank, en een isolatiekamer. B) Het aquarium tank was verdeeld in de centrale arena voor het uitvoeren van experimenten, en vier hoeken compartimenten voor huisvesting individuele vis. Elk compartiment is gebouwd waterdichte elektrische communicatie tussen dieren. C) De gemotoriseerde poort wordt geïllustreerd op meerdere perspectief hoeken te voorkomen. De poort wordt waterdicht, indien gesloten door zes vleugelmoeren die de rubberen pakking (de lichtbruine vel) comprimeren. Eenmaal ontgrendeld, kan de poort op afstand worden bediend door de servomotor op de top. D) De isolatiekamer werd samengesteld door de toetreding tot drie walle panelen en vier deurpanelen, die de toegang tot het aquarium tank van twee kanten te voorzien. Het onderste paneel toont de houten rails voor het ondersteunen van de tank randen, en de vloer verwarming plaatsing. Een laagje aluminium gaas omvat de kachel voor de elektrische ruis. E schild) De wanden en deurpanelen van de isolatiekamer werden uit aluminium frames voor structurele steun (3). De binnenzijde van de kamer worden gedekt door witte kunststof panelen (5) naar interne lichtbronnen reflecteren, en de buitenkant zijn bedekt met zwarte kunststof panelen (2) naar externe lichtbronnen blokkeren. Een aluminium gaas (1) heeft betrekking op de buitenmuren van externe elektrische ruis te blokkeren. De wand is gevuld met akoestische glasvezel batts (4) F) De bovenste foto toont de ventilatie installatie voor het verwijderen van overtollig vocht gevormd bij opwarming;. En de onderste foto toont de waterfiltratie setup voor het reinigen, het verspreiden, en beluchten van de tank water tussen experimenteelsessies. Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 2. EOD recording setup en representatieve resultaten. A) Het linker paneel toont de elektrode samenstel bestaande uit een dunne grafiet elektrode, een kort segment van de coaxiale kabel en een BNC Jack. Het rechter paneel toont elektrode bevestiging instructies. Masking tape wordt gebruikt om tijdelijk de positie elektrodenpaar en siliconen afdichting is aangebracht op de elektrode. B) Het schakelvoorbeeld permanent vasthouden. Twee 90 ° georiënteerd elektroden zijn gekoppeld up, differentieel versterkt en gefilterd. Vier opname kanalen werden buiten de Faraday c gedigitaliseerdleeftijd. C) Illustratie van de EOD signaalverwerking stappen. De top sporen tonen ruwe golfvormen van vier elektroden paren, die zijn gerectificeerd en opgeteld om de grijze hieronder spoor te produceren. Unimodaal enveloppen worden gehaald uit de grijze golfvorm met behulp van de "Root-Mean-Square" (RMS) filter (groen trace). De EOD amplitudes en IPIS worden bepaald uit de envelop pieken. D) Het tijdsafhankelijke EOD amplitudes (boven) en de momentane EOD tarief (onder) worden getoond op een langere tijdschaal dan C). De EOD amplitudes en de momentane snelheid (= IPI -1) worden geïnterpoleerd op regelmatige tijdstippen door de toetreding tot de envelop pieken (zwarte sporen). E) Zelfde als D) maar uitgezet op een langere tijdschaal terwijl vis was in rust. F) Zelfde als E), terwijl vis was actief zwemmen. Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 3. Video bijhouden setup en representatieve resultaten. A) De verlichting en het instellen van de camera wordt weergegeven. De infrarood (IR) en zichtbare lichtbronnen zijn bevestigd op de muren en wees naar het plafond, zodat het plafond oppervlak reflecteert en verspreidt het licht voor het projecteren van een gelijkmatige verlichting over de gehele tank. De camera is boven het plafondpaneel verborgen voor reflectie op het wateroppervlak te voorkomen. Een IR LED is gepositioneerd op een van de vier hoeken tank tijdsynchronisatiepulsen genereren. B) beeld samengestelde achtergrond genereren geïllustreerd. Twee beeld frames (beelden op de top) worden gecombineerd om de samengestelde afbeelding achtergrond (linksonder) te vormen door het vervangen van de regio waarin het dier (dusdeksel rood vierkant) met de regio zonder het dier (onderbroken rode vierkant). Gebied buiten de centrale arena wordt gemaskeerd in zwart (rechtsonder). C) Het isoleren van de vis omtrek. Een beeld frame (linksboven) wordt afgetrokken van de achtergrondafbeelding (rechtsboven) op de foto het verschil te produceren (linksonder), en omgezet naar het binair beeld (rechtsonder) door het aanbrengen van een intensiteit drempel. D) Metingen van de lichaamshouding en houding worden geïllustreerd. De binaire beeld van het dier (blob) werd geroteerd om zijn hoofdas af te stemmen op de x-as (rechts boven), en gecentreerd op zijn zwaartepunt. De blob is gescheiden om het hoofd (rood) en staart (blauw) delen, en elk deel werd afzonderlijk gedraaid voor het bepalen van de bounding-box. De blob is gericht aan het frame van het dier van de referentie (linksonder), en vijf kenmerkende punten (head-end, mid-hoofd, half lichaam, mid-staart, staart-end) werden bepaald uit de middens van de bounding-box randen. E) Time-lapse imleeftijd van de vis middellijnen uitgezet elke 200 msec. De eerste en laatste beeld frames worden gelegd tijdens de 2 sec draaien duur. F) De gemiddelde EOD tarief is vertegenwoordigd in pseudo-kleur en bovenop met het traject van de vis kop. Dezelfde beelden worden gebruikt als E). Klik hier voor grotere afbeelding .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Betekenis van onze technieken. Kortom, we voor het eerst beschreven de bouw van een groot aquarium tank en een isolatiekamer spontane verkennende gedrag geproduceerd door WEF observeren. Vervolgens hebben we aangetoond dat de techniek van het opnemen en het bijhouden van de EOD snelheid en beweging toestanden van ongebreidelde vis realtime met meerdere elektrodeparen. Tenslotte beschrijven we de infrarood video-opnametechniek door water in een tijd gesynchroniseerde wijze en beeldtracking algoritme om de lichaamshouding en houding te meten. Als een experimentele opstelling, WEF biedt een belangrijk voordeel voor het onderzoeken van actieve zintuiglijke-geleid gedrag door aan te tonen gemakkelijk meetbaar zijn EOD tarief, dat gelijk is aan de actieve electrosensory sampling rate. Combinatie van deze technieken kan nauwkeurig en betrouwbaar op lange termijn observatie 8 van spontane gedrag van ongebreidelde WEF schakelen. Bovendien kan de meerderheid van onze opstelling worden opgebouwd frOM schaal beschikbaar bouwmaterialen en gemakkelijk verkrijgbaar elektronische componenten. De hier beschreven technieken zijn ontwikkeld en getest voor onze experimentele eisen afgelopen jaren voldoen. Daarom raden wij deze technieken voor toekomstige studies van spontane verkennende gedrag van vrij zwemmende WEF.
Isolatiekamer. De isolatiekamer biedt goed gecontroleerde experimentele omstandigheden door het blokkeren van externe bronnen van licht, trillingen, geluid en elektrische storing met variërende graden van effectiviteit. De licht blokkerende prestatie werd getest door het plaatsen van een gemotoriseerde camera in het donker isolatiekamer, en geen externe lichte lekkage werd waargenomen van de camera na het scannen van alle locaties met behulp van afstandsbediening pan controle. De trillingsdemping oppervlak onder de tank voorzien demping tegen externe trillingen gekanaliseerd van de vloer, en het stapelen van meerdere rubber en schuim lagen geïnstalleerd was werkzaam voor het blokkeren van de meesteexterne trillingen evenementen. Echter, periodieke trillingen evenementen, zoals luide deur sluiten in het nabijgelegen locaties deed triggeren nieuwigheid reacties in zeldzame gevallen. Hoewel een anti-vibratie lucht tafel superieure isolatie prestaties kan leveren vanuit achtergrond trillingen, zou het onbetaalbaar zijn om een lucht tafel groot genoeg voor onze aquariumtank kopen. Daarom plaatsten we een hydrofoon onderwater om gebeurtenissen als grote externe trillingen veroorzaakt nieuwigheid reacties op te sporen en uit te sluiten. Om de invloed van ruis nog verder te beperken buiten het laboratorium, werden onze experimenten uitgevoerd tijdens de daluren (na 18:00). Evenzo werd externe lucht akoestisch geluid gedempt via de isolatiekamer muren gevuld met glasvezel batts isolatie. Hoewel we niet objectief te kwantificeren de geluiddemping prestaties, het grootste deel van het achtergrondgeluid in een testomgeving niet leiden tot de nieuwigheid reacties. In zeldzame gevallen, een plotselinge harde geluid van buiten trekkered een noviteit respons, maar een dergelijke gebeurtenis werd gedetecteerd door de hydrofoon opname, en ze zelden opgetreden tijdens de daluren. Het aquarium tank verstrekt voldoende grote ruimte voor onze dieren om vrij te zwemmen en te verkennen. Het aquarium is gekozen in verhouding tot de lengte van species we gebruikten (tot 30 cm), maar de grootte tank kan worden verkleind als kleinere dieren gebruikt. We kozen Gymnotus sp. tussen verschillende pulse soorten ingevoerd voor hun grote schedel grootte om elektrofysiologische opnames tijdens de vrije-zwemmen 36 te vergemakkelijken. De elektrische opnamekwaliteit kan verbeteren van het gebruik van duurdere koper mazen, en het afschermen van de ventilator wordt gebruikt voor de luchtvochtigheid.
EOD meettechniek. Onze multi-channel EOD opnametechniek toegestaan nauwkeurige en betrouwbare EOD timing meting van vrij zwemmende vissen. Met behulp van onze techniek werden alle EOD pulsen gegenereerd door vrij rond te zwemmen WEF gedetecteerd zonder ontbreekt of het toevoegen van een zondegle puls voor een zes uur lange opnameduur (zie figuur 12 in juni et al.. 8). De EOD opname maatregelen niet alleen de EOD tarief, maar ook het activiteitsniveau van de tijd variërende EOD piekamplitudes opgenomen met externe elektroden. De opgenomen EOD amplituden worden bepaald door de relatieve geometrie tussen een dier en de registrerende elektroden, waardoor verplaatsingen van dieren veranderingen in de EOD amplitudes (figuur 2F) induceren. Het activiteitenniveau werd berekend op basis van de variabiliteit (RMS) van de EOD amplitude helling binnen een bewegend venster (0,5 sec). Met behulp van deze methode, zou video-opname niet vereist voor het meten van het activiteitenniveau over een lange periode, en de EOD opname alleen kan volstaan worden. In plaats van een video-opname kan de lichaamshouding en houding van WEF worden afgeleid uit de EOD opname alleen gebaseerd op de elektroden locaties, de geometrie van een tank en een theoretisch model van een stroom dipool. Met een soortgelijke recording setup, juni et al.. 20 voorgesteld een real-time elektrische volgen methode voor het bijhouden van meerdere WEFs in aanwezigheid van een object, dat gemeten signaalintensiteiten vergelijkt op verschillende registratie-elektrode paren met opzoektabel ingevoegd die voorspeld signaalintensiteiten op bekende huidige dipool locaties. De elektrische volgen methode biedt een verbeterde tracking-betrouwbaarheid in een visueel rommelige omgeving waar dieren krijgen vaak belemmerd uit het zicht, of tijdens het volgen van meerdere dieren. Naturalistische habitats WEF's bevatten veel visuele obstakels zoals waterplanten en wortels, waar de elektrische volgen methode betrouwbaarder volgen kon voorzien eenvoudigere setup eisen dan het visuele volgen. In principe, onze methode is rechtstreeks van toepassing op de golf-achtige WEF soorten na het wijzigen van filter tijd constanten. De rectificatie stap zal twee modi per EOD cyclus in te voeren, aangezien de EOD golfvorm is ongeveer sinusvormige in wave-achtige soorten. In dit gevalDe momentane EOD kan worden bepaald sla elke EOD tijd markeringen op de negatieve EOD fase negeren. WEF kunt de registrerende elektroden detecteren wanneer ze in de buurt zwemmen, dus we vermeden het gebruik van grote of metalen elektroden die kan worden waargenomen van verder weg 37, en in plaats daarvan gebruikte dunne grafiet elektroden (2 mm diameter). Dunnere coaxkabels (RG-174) werden gebruikt met de elektrodemontages flexibiliteit, maar dikkere coaxkabels (RG-54) werden gebruikt voor de bedrading over langere afstanden superieure elektrische afscherming. Langere EOD opnameduur kan worden bereikt door het verlagen van de sampling rate, maar tegen een lagere temporele resolutie als een trade-off. De gemiddelde en variabiliteit van de EOD varieert tussen soorten, waardoor het tijdvenster voor het effenen van de momentane snelheid EOD moet dienovereenkomstig aangepast. Een kortere tijd venster wordt aanbevolen voor species met kortere gemiddelde en kleinere variabiliteit in de IPIS (bijv. Gymnotiforms), en een langere tijd Window wordt aanbevolen voor soorten met langere gemiddelde en hogere variabiliteit in de IPIS (bijv. Mormyrids).
Verlichting en camera instellen. Video-opnamen bieden kwantitatieve en kwalitatieve gedragsobservaties, en hier beschreven we de procedures voor het opzetten, opnemen en verwerken van de beeldgegevens. Verlichtingsopstelling speelt een belangrijke rol in het produceren van beelden van hoge kwaliteit, en het licht projectie hoek is een belangrijke factor voor beeldvorming onderwater dieren. Onder suboptimale lichtomstandigheden, kan het water oppervlak glans en reflecties, die kunnen interfereren met het beeld volgen vooral als dieren genereren oppervlakte golven vormen. De verblinding en reflectie problemen worden opgeheven door het projecteren lichtbronnen van de bodem van een tank. Voor een kleine tank, arrays van LED kan direct onder de tank geplaatst en glans door een diffuser paneel uniforme lichtintensiteit 38 genereren. Zo ook voor een grotere tank, een lichtbron conder de tank een geplaatst en gelijkmatige lichtintensiteit kan worden bereikt door voldoende afstand voor licht diffuus 39. In onze opstelling, moesten we het licht projecteren van boven de tank als gevolg van de beperkte ruimte, stabiliteit van de constructie en de verwarming plaatsing onder de tank. We vermeden de schittering en reflectie problemen door het gebruik van indirecte verlichting, zodanig dat de lichtbronnen werden geprojecteerd naar het plafond. Door het verlenen van het bovenste deel van de kamer karakterloze en mat wit, geen reflecties zichtbaar waren op het wateroppervlak. Om het imago van de hele centrale arena, een groothoek lens kan op de camera worden gemonteerd, maar sommige objectieven (fish-eye lens) significant tonvormige vertekening kunnen veroorzaken. De tonvormige vertekening kan worden gecorrigeerd met behulp van een kalibratie raster onder de tank om de pixel coördinaten van de grid locaties bekeken worden op de tank midden meten. Samen met de bijbehorende rooster locaties in centimeters, kan een transformatie matrix berekend worden om samen terrect de tonvormige vertekening 40. We raden hoge resolutie camera's als een dier grootte is veel kleiner dan de grootte van de tank, zodat voldoende aantal pixels kan worden verkregen bij het dier naar zijn lichaamshouding correct te meten.
Afbeelding tracking en tijd synchronisatie. Het beeld volgalgoritme hier beschreven maakt gebruik van de regio-of-interest (ROI) operatie om de lichaamshouding en houding snel te meten. De ROI operatie vermindert de beeldgrootte te verwerken, en belemmert de tracking bereik in de buurt van het dier locatie van het vorige frame. We onttrokken de lichaamshouding (middellijn) met behulp van de beeldrotatie en begrenzingsvak operaties in plaats van het gebruikelijke beeld skeletvorming operatie, die soms niet in geslaagd een goed gedefinieerde enkele middellijn produceren. Referentiekader van het dier was bij het midden van het hoofd begrenzingsvak die egocentrisch gedragsanalyse toelaat. De belangrijkste bron van fouten in het beeld tracking was door het optische projectie-effect met een grote hoek. Idealiter dier verticale bewegingen laat de 2D positiemeting, maar verder van de centrale as beeldvorming wordt het grootste gedeelte van de verticale afmeting verwachting de camera. De breking aan het wateroppervlak verminderd de optische projectie-effect met 28% in onze beeldvorming setup (camera height = 1,8 m, diepte 10 cm, tank radius = 75 cm), en de slechtste positie fout was ± 1,4 cm aan de circulaire hek. De timing tussen de EOD en video-opnamen werden gesynchroniseerd met behulp van infrarood LED pulsen om rekening te houden met de tijd die drift tussen de video en het signaal digitizer klokken en verschillende opname opstarttijden. De verwachte onzekerheid in de tijdsynchronisatie tussen de video en EOD-opnamen is evenredig aan het frame capture interval, bijvoorbeeld 15 beelden per seconde (fps) lijst opnamesnelheid resulteert in Tijduitlijning onzekerheid van ± 33 msec. Een dergelijke mate van time precisie voldoende is voor het bijhouden van tragere vis, maar een high-speed camera kan nodig zijn voor het volgen van een snellere bewegende dieren. We raden helderder lichtintensiteit met een verhoogde framesnelheid, aangezien de blootstelling van de sensor is omgekeerd evenredig met de framesnelheid.
Toekomstige werkzaamheden. Sociale interacties tussen meerdere WEFs kan worden onderzocht door het volgen van de EOD signalen en lichaam locaties en het volgsysteem moet kunnen associëren EOD de locatie van hetzelfde individu. Volgens de dipool lokalisatie methode beschreven door Jun et al.. 20 met een gelijkaardige opstelling, het dier plaatsen afgeleid van de EOD signalen op meerdere elektroden kunnen worden aangepast aan de visuele uitgang bijhouden voor de correcte identificatie van de EOD pulsen van verschillende individuen. Afbeelding volgen van meerdere dieren kunnen worden uitgevoerd door een persoon in een tijd met behulp van de ROI operatie. Een ROI kan aanvankelijk worden gedefinieerd rond een individuworden gevolgd, en de ROI zal worden verplaatst naar elk frame met een bijgewerkte lichaamshouding. De andere vissen zullen uit het beeld volgen analyse worden uitgesloten wanneer het verschijnt buiten de ROI, en als binnen verscheen, kan het imago van de andere vissen automatisch verwijderd worden door te controleren of het imago raakt de ROI grens. Soms twee dieren met elkaar in contact en hun beelden samen te voegen, en zo ja, kan een masker met de hand worden gewezen op het imago van de andere vissen scheiden. Een andere interessante toekomstige werkzaamheden is de drie-dimensionale video-tracking om ingewikkelde beweging sequenties onthullen tijdens de voedselopname 22 of sociale interacties. MacIver et al.. Twee camera 22 gebruikt om een rechthoekig aquariumtank uitzicht vanaf de bovenkant en de zijkant voor het reconstrueren van een driedimensionaal lichaam model. Toch zou deze aanpak niet werkt in ons geval, want er zijn scheidingswanden die zijaanzichten en het aquarium heeft veel grotere breedte dan diepte te blokkeren. In plaats daarvan, zou het meer toepassingkabel om meerdere camera's op het plafond te installeren op ander perspectief hoeken gelijk aan de setup gebruikt door Hedrick 41. Voor een grotere nauwkeurigheid, zou de refractie-effect geïntroduceerd door het water en de schuine camerastandpunt moeten worden gecorrigeerd door het kalibreren van beelden in drie dimensies. Onze visueel volgen methode kan worden toegepast om de elektrische stroom op het lichaamsoppervlak vis 42,43 studeren wanneer vis zwemt nabijgelegen object. Zoals onderzocht door Hofmann et al.. 26, zou het interessant zijn om elektrische stroom afbeelding van het object te onderzoeken tijdens de vrije-zwemmen afhankelijk van het object afstand, vorm, grootte en materiaal. Uiteindelijk kan onze methodes gecombineerd met neurale opnames van vrij zwemmende vissen 44-46 nieuwe inzichten onthullen door waarnemingen van veranderingen in neurale activiteit en EOD tarief, terwijl de vis houdt zich bezig met object exploratie of sociale interacties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd mede mogelijk gemaakt door de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) en de Canadese Institutes of Health Research (CIHR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aquarium Construction | |||
| Electrically shielded floor heater | ThermoSoft Corp., IL, USA | ThermoTile | www.thermosoft.com |
| Tempered glass panel | generic | 0.5 in thick, used for the aquarium construction | |
| Aquarium grade silicone | generic | ||
| Acrylic sheet | generic | 0.25 in thick, matte white | |
| Natural rubber sheet | generic | 0.25 in thick | |
| Servomotor | HTECHRCD Inc., Korea | HS-325HB, 180deg rotation | www.servocity.com |
| Servomotor arm mount | HITECHRCD Inc., Korea | 56362 Large Spline | www.servocity.com |
| Servomotor controller (6 channels) | Sparkfun | ROB-09664 | Micro Maestro 6-channel USB Servo Controller |
| Active USB extension cable | C2G | 38990 | 12 m USB 2.0 A Male to A Female 4-Port Active Extension Cable |
| Exhaust fan | Nutone | ILFK120 | www.homedepot.com |
| Vertical aquarium filter | Tetra, Germany | Whisper Internal Power Filter - 40i | |
| Crushed coral | Used to increase the pH of the tank water | ||
| EOD Recording Setup | |||
| Graphite Electrodes | Staedtler, Germany | Mars Carbon 2-mm type HB | Shave the outer coating |
| Physiological Amplifier/Filter | Intronix, Canada | 2015F | |
| Coaxial Cable | generic | RG174 | For electrodes assembly |
| Coaxial Cable | generic | RG54 | For wiring use |
| BNC jack connector for RG-174 | Amphenol Connex | 112160 | For electrodes assembly |
| BNC plug connector for RG-54 | Amphenol Connex | 112116 | For wiring use |
| Signal digitizer hardware | Cambridge Electronic Design, UK | Power MKII 1401 | |
| Signal digitizer software | Cambridge Electronic Design, UK | Spike 2. ver 7 | |
| Visual Tracking Setup | |||
| White LED light | IKEA, Sweden | DIODER 201.194.18 | www.ikea.com |
| Infrared LED light (850 nm) | Scene Electronics, China | S8100-60-B/C-IR | Remove built-in fan |
| USB webcam | Logitech Inc., CA, USA | C910 | Remove Infrared blocking filter |
| Motorized camera | Logitech Inc., CA, USA | Quickcam Orbit | Remove Infrared blocking filter |
| Video recording software | Logitech Inc., CA, USA | Logitech Quickcam Software | Download from www.logitech.com |
| MATLAB | Mathworks, MA, USA | 2012a | Image processing toolbox |
References
- Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat. Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Adamantidis, A. R., Zhang, F., Aravanis, A. M., Deisseroth, K., De Lecea, L. Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons. Nature. 450 (7168), 420-424 (2007).
- Naumann, E. A., Kampff, A. R., Prober, D. A., Schier, A. F., Engert, F. Monitoring neural activity with bioluminescence during natural behavior. Nat. Neurosci. 13 (4), 513-520 (2010).
- Leifer, A. M., Fang-Yen, C., Gershow, M., Alkema, M. J., Samuel, A. D. Optogenetic manipulation of neural activity in freely moving Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 8 (2), 147-152 (2011).
- Mavoori, J., Millard, B., Longnion, J., Daniel, T., Diorio, C. A miniature implantable computer for functional electrical stimulation and recording of neuromuscular activity. In IEEE international workshop on biomedical circuits and systems (BioCAS) 2004; Session: Functional Electrical Stimulators and Related Sensing Techniques. , (2004).
- Harrison, R. R., Fotowat, H., Chan, R., Kier, R. J., Olberg, R., Leonardo, A., Gabbiani, F. Wireless neural/EMG telemetry systems for small freely moving animals. IEEE TBioCAS. 5 (2), 103-111 (2011).
- Jun, J. J., Longtin, A., Maler, L. Precision measurement of electric organ discharge timing from freely moving weakly electric fish. J. Neurophys. 107 (7), 1996-2007 (2012).
- Forlim, C. G., Pinto, R. D. Noninvasive Realistic Stimulation/Recording of Freely Swimming Weakly Electric Fish: Movement Detection and Discharge Entropy to Infer Fish Behavior. , (2012).
- Caputi, A. A., Aguilera, P. A., Castelló, M. E. Probability and amplitude of novelty responses as a function of the change in contrast of the reafferent image in G. carapo. J. Exp. Biol. 206 (6), 999-1010 (2003).
- Pluta, S. R., Kawasaki, M. Multisensory enhancement of electromotor responses to a single moving object. J. Exp. Biol. 211 (18), 2919-2930 (2008).
- Heiligenberg, W. Electrolocation and jamming avoidance in a Hypopygus (Rhamphichthyidae, Gymnotoidei), an electric fish with pulse-type discharges. J. Comp. Phys. A. 91 (3), 223-240 (1974).
- Capurro, A., Malta, C. P. Noise autocorrelation and jamming avoidance performance in pulse type electric fish. Bull. Math. Biol. 66 (4), 885-905 (2004).
- Post, N., von der Emde, G. The "novelty response" in an electric fish: response properties and habituation. Phys. Behav. 68 (1), 115-128 (1999).
- Toerring, M. J., Serrier, J. Influence of water temperature on the electric organ discharge (EOD) of the weakly electric fish Marcusenius cyprinoides (Mormyridae). J. Exp. Biol. 74 (1), 133-150 (1978).
- Ardanaz, J. L., Silva, A., Macadar, O. Temperature sensitivity of the electric organ discharge waveform in Gymnotus carapo. J. Comp. Phys. A. 187 (11), 853-864 (2001).
- Rodríguez-Cattaneo, A., Pereira, A. C., Aguilera, P. A., Crampton, W. G., Caputi, A. A. Species-specific diversity of a fixed motor pattern: the electric organ discharge of Gymnotus. PLoS One. 3 (5), (2008).
- Bennett, M. V. L. Fish physiology. Hoar, W. S., Randall, D. J. , Academic Press. NY. 493-574 (1971).
- Wong, C. J. Afferent and efferent connections of the diencephalic prepacemaker nucleus in the weakly electric fish, Eigenmannia virescens: interactions between the electromotor system and the neuroendocrine axis. J. Comp. Neurol. 383 (1), 18-41 (1997).
- Jun, J. J., Longtin, A., Maler, L. Real-time localization of moving dipole sources for tracking multiple free-swimming weakly electric fish. PLoS One. 8 (6), (2013).
- Rasnow, B., Assad, C., Hartmann, M. J., Bower, J. M. Applications of multimedia computers and video mixing to neuroethology. J. Neuro. Methods. 76 (1), 83-91 (1997).
- MacIver, M. A., Nelson, M. E. Body modeling and model-based tracking for neuroethology. J. Neuro. Methods. 95 (2), 133-143 (2000).
- Douglas, R. H., Hawryshyn, C. W. Behavioral studies of fish vision: an analysis of visual capabilities. In The Visual System of Fish. Douglas, R., Djamgoz, M. , Chapman & Hall. London. 373-418 (1990).
- Ciali, S., Gordon, J., Moller, P. Spectral sensitivity of the weakly discharging electric fish Gnathonemus petersi using its electric organ discharges as the response measure. J. Fish Biol. 50 (5), 1074-1087 (1997).
- Ratledge, D. An Introduction to Webcam Imaging. Digital Astrophotography: The State of the Art. , 31-44 (2005).
- Hofmann, V., Sanguinetti-Scheck, J. I., Gómez-Sena, L., Engelmann, J. From static electric images to electric flow: Towards dynamic perceptual cues in active electroreception. J. Phys. Paris. 107, 95-106 (2013).
- Castelló, M. E., Aguilera, P. A., Trujillo-Cenóz, O., Caputi, A. A. Electroreception in Gymnotus carapo: pre-receptor processing and the distribution of electroreceptor types. J. Exp. Biol. 203 (21), 3279-3287 (2000).
- Caputi, A. A., Castelló, M. E., Aguilera, P., Trujillo-Cenóz, O. Electrolocation and electrocommunication in pulse gymnotids: signal carriers, pre-receptor mechanisms and the electrosensory mosaic. J. Phys. 96 (5), 493-505 (2002).
- Pusch, R., et al. Active sensing in a mormyrid fish: electric images and peripheral modifications of the signal carrier. J. Exp. Biol. 211 (6), 921-934 (2008).
- Harder, W. Die beziehungen zwischen elektrorezeptoren, elektrischem organ, seitenlinienorganen und nervensystem bei den Mormyridae (Teleostei, Pisces). Z. Vgl. Physiol. 59 (3), 272-318 (1968).
- Bacelo, J., Engelmann, J., Hollmann, M., Gvonder Emde,, Grant, K. Functional foveae in an electrosensory system. J. Comp. Neurol. 511 (3), 342-359 (2008).
- Hollmann, M., Engelmann, J., Von Der Emde, G. Distribution, density and morphology of electroreceptor organs in mormyrid weakly electric fish: anatomical investigations of a receptor mosaic. J. Zool. 276 (2), 1469-7998 (2008).
- Knudsen, E. I. Spatial aspects of electric fields generated by weakly electric fish. J. Comp. Phys. 99 (2), 103-118 (1975).
- Kramer, B. Spontaneous discharge rhythms and social signalling in the weakly electric fish Pollimyrus isidori (Cuvier et Valenciennes) (Mormyridae, Teleostei). Behav. Ecol. Sociobiol. 4 (1), 66-74 (1978).
- Stoddard, P. K., Markham, M. R., Salazar, V. L., Allee, S. Circadian rhythms in electric waveform structure and rate in the electric fish Brachyhypopomus pinnicaudatus. Physiol. Behav. 90 (1), 11-20 (2007).
- Canfield, J. G. Methods for chronic neural recording in the telencephalon of freely behaving fish. J. Neurosci. Methods. 133 (1-2), 127-134 (2004).
- Chen, L., House, J. L., Krahe, R., Nelson, M. E. Modeling signal and background components of electrosensory scenes. J. Comp. Physiol. A. 191 (4), 331-345 (2005).
- Emran, F., Rihel, J., Dowling, J. E. A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities. J. Vis. Exp. (20), (2008).
- Windsor, S. P., Tan, D., Montgomery, J. C. Swimming kinematics and hydrodynamic imaging in the blind Mexican cave fish (Astyanax fasciatus). J. Exp. Biol. 211 (18), 2950-2959 (2008).
- Shapiro, L. G., Stockman, G. C. Computer vision. , Prentice Hall. Upper Saddle River, NJ. 367-368 (2001).
- Hedrick, T. L. Software techniques for two- and three-dimensional kinematic measurements of biological and biomimetic systems. Bioinsp. Biomim. 3 (3), 034001 (2001).
- Babineau, D., Lewis, J. E., Longtin, A. Spatial acuity and prey detection in weakly electric fish. PLoS Comp. Biol. 3 (3), (2007).
- Sanguinetti-Scheck, J. I., Pedraja, E. F., Cilleruelo, E., Migliaro, A., Aguilera, P., Caputi, A. A., Budelli, R. Fish geometry and electric organ discharge determine functional organization of the electrosensory epithelium. PLoS One. 6 (11), (2011).
- Castello, M. E., Caputi, A., Trujillo‐Cenóz, O. Structural and functional aspects of the fast electrosensory pathway in the electrosensory lateral line lobe of the pulse fish Gymnotus carapo. J. Comp. Neurol. 401 (4), 549-563 (1998).
- Canfield, J. G., Mizumori, S. J. Y. Methods for chronic neural recording in the telencephalon of freely behaving fish. J. Neurosci. Methods. 133 (1), 127-134 (2004).
- Pereira, A. C., Centurión, V., Caputi, A. A. Contextual effects of small environments on the electric images of objects and their brain evoked responses in weakly electric fish. J. Exp. Biol. 208 (5), 961-972 (2005).
