Summary
Se describe un conjunto de técnicas para el estudio de la conducta espontánea de nadar libremente peces débilmente eléctrica durante un período prolongado de tiempo, de forma sincrónica medir el tiempo de descarga de órgano eléctrico del animal, la posición del cuerpo y la postura tanto de forma precisa y fiable en un tanque del acuario especialmente diseñado dentro de un sensorial cámara de aislamiento.
Abstract
Seguimiento del comportamiento a largo plazo puede capturar y cuantificar las conductas animales naturales, incluyendo las que ocurren con poca frecuencia. Conductas tales como la exploración y las interacciones sociales pueden ser mejor estudiados mediante la observación, los animales comportarse libremente sin restricciones. Peces eléctricos débilmente (WEF) de visualización exploratoria fácilmente observables y el comportamiento social mediante la emisión de descarga órgano eléctrico (EOD). A continuación, describimos tres técnicas eficaces para medir de forma sincrónica los Tedax, la posición del cuerpo y la postura de un WEF nadan libremente durante un período prolongado de tiempo. En primer lugar, se describe la construcción de un tanque experimental en el interior de una cámara de aislamiento diseñado para bloquear las fuentes externas de estímulos sensoriales como la luz, el sonido y la vibración. El acuario se dividió para dar cabida a cuatro especímenes de ensayo, y barreras automáticas controlar remotamente el acceso de los animales a la arena central. En segundo lugar, se describe un método preciso y fiable en tiempo real de medición de tiempo del EOD de nadar libremente WEF. Distorsiones de la señal causadas por los movimientos del cuerpo del animal se corrigen por promediado espacial y etapas de procesamiento temporal. En tercer lugar, se describe una configuración de imagen en el infrarrojo cercano bajo el agua para observar comportamientos de los animales nocturnos no perturbadas. Pulsos de luz de infrarrojos se utilizan para sincronizar la temporización entre el vídeo y la señal fisiológica a través de una duración de la grabación de largo. Nuestro software de seguimiento automatizado mide la posición del cuerpo del animal y la postura de forma fiable en una escena acuática. En combinación, estas técnicas permiten la observación a largo plazo de la conducta espontánea de nadar libremente peces débilmente eléctrica de una manera fiable y precisa. Creemos que nuestro método se puede aplicar de manera similar al estudio de otros animales acuáticos, relacionando sus señales fisiológicas con comportamientos exploratorios o sociales.
Introduction
Antecedentes. Experimentos cuantitativos sobre el comportamiento animal (por ejemplo, elección forzada, evitación de shock, laberinto en T, etc.) Se utilizan normalmente para investigar las hipótesis específicas relativas a las habilidades sensoriales y motoras, el aprendizaje y la formación de la memoria. Sin embargo, estos experimentos restrictivas se pierda gran parte de la riqueza del comportamiento natural de los animales, y es probable que resulte en modelos simplistas de la base neural subyacente de comportamiento. Los experimentos en condiciones más naturales son, por tanto, un complemento importante por el cual podemos explorar más a fondo el repertorio conductual especies. Los experimentos con animales se mueven libremente deben, sin embargo, frente a los desafíos técnicos únicos, tales como artefactos de grabación inducidas por movimiento. A diferencia de las respuestas de estímulo evocado, que se producen de manera espontánea el comportamiento exploratorio no se pueden predecir, por lo que los sujetos experimentales tienen que ser controlados y seguidos durante un período prolongado de tiempo constante. Las preguntas específicas de investigación can ser mejor abordados por organismos cuidadosamente seleccionados y las herramientas técnicas disponibles. Por ejemplo, las técnicas de registro y estimulación ópticos tales como sensores de calcio genéticamente codificados en 1 y 2 optogenética se han aplicado con éxito para moverse libremente organismos modelos genéticos 3-5. Por otra parte, los sistemas de telemetría neuronales miniaturizados pueden grabar y estimular que se mueve libremente animales pequeños 6,7.
Peces Electric. Especies WEF generan descargas eléctricas de órganos (EODs), que les permiten percibir su entorno inmediato o para comunicarse a grandes distancias. Los patrones temporales de EODs varían bajo diferentes condiciones tales como auto-movimientos 8,9, estímulos sensoriales 10,11, 12,13 y las interacciones sociales. Especies WEF de tipo Pulso producen un tren de pulsos discretos, en lugar de especies de tipo de onda a la que generan formas de onda cuasi sinusoidal continua. En general, de tipo pulso exhiben especies more Tasa EOD variables en comparación con las especies de tipo de onda, y las tasas de eliminación de artefactos explosivos de los animales refleja de cerca el contenido de la novedad de su entorno sensorial 10,14. Especies de tipo de pulso pueden reducir de inmediato el intervalo entre pulsos (IPI) en un solo ciclo de pulso en responder a una perturbación sensorial novela (respuesta novedad 10,11,14). El comportamiento eléctrico continuo de estos peces puede ser perturbado por los estímulos sensoriales no controladas procedentes de fuentes externas, y diferentes tipos de estímulos tales como la vibración, el sonido, la electricidad y la luz son conocidas las respuestas de la novedad de activación. Por lo tanto, se deben tomar precauciones especiales para impedir o atenuar los estímulos sensoriales externos durante una observación a largo plazo de nado libre WEF. De esta manera, los cambios en la tasa de EOD y trayectorias de movimiento pueden ser atribuidos específicamente a los estímulos presentados por el experimentador.
Tanque de acuario y cámara de aislamiento. Por lo tanto, colocamos varias capas de materiales de absorción de vibraciones under un tanque del acuario grande (2,1 mx 2,1 mx 0,3 m), y rodearon el tanque con un recinto aislado para bloquear las fuentes externas de luz, ruido eléctrico, el sonido y el flujo de calor. Tasa de EOD depende de la temperatura que rodea 15,16, por lo tanto la temperatura del agua fue estrechamente regulada en un intervalo de tropical (25 ± 1 ° C) para las especies de Sur América WEF. Construimos un (10 cm de profundidad de agua) tanque grande y poco profunda para observar conductas exploratorias espaciales del WEF restringidas principalmente en dos dimensiones (Figura 1A). El tanque se repartió en una pista central para observar comportamientos espaciales, y cuatro compartimentos de esquina para albergar por separado cada pez (Figura 1B). Cada compartimiento estanco fue construida para impedir la comunicación eléctrica entre los individuos. Acceso Animals 'a la arena central estaba controlada desde el exterior por cuatro compuertas motorizadas. Las puertas se colocaron entre los compartimentos, y se convirtieron hermético cuando está bloqueadopor nylon alas nueces. No hay partes metálicas se utilizaron bajo el agua desde WEF reaccionan sensiblemente a los metales.
Grabación EOD. EODs se generan de una manera estereotipada por la activación de un solo (en Mormyrids) o múltiples órganos eléctricos distribuidos espacialmente (en Gymnotiforms) 17,18. Modulaciones temporales en la tasa del EOD pueden revelar las actividades neuronales de nivel superior, ya que el marcapasos medular recibe entradas neuronales directos de las regiones superiores del cerebro, tales como el núcleo prepacemaker diencefálico, que a su vez recibe las proyecciones axonales de la cerebro anterior 19. Sin embargo, el momento del EOD debe ser cuidadosamente extraída de una grabación de forma de onda en bruto y no sesgada por las distorsiones inducidas por movimiento del animal. El campo eléctrico generado por una FEM se puede aproximar como un dipolo, por lo EOD amplitudes de pulso en electrodos de registro dependen de las distancias y orientaciones relativas entre el animal y los electrodos de 8,20. Auto-movem del Animalpadres cambian la geometría relativa entre el animal y los electrodos, por lo tanto los movimientos causan las amplitudes EOD en diferentes electrodos para varían con el tiempo de una manera volátil (véase la Figura 2B en Junio et al. 8). Por otra parte, auto-movimientos también cambian la forma de onda EOD grabadas, porque las contribuciones relativas de diferentes conjunto de los órganos eléctricos dependen de sus ubicaciones a lo largo de la longitud del cuerpo y sus curvaturas locales introducida por la flexión de la cola. Las distorsiones inducidas por movimiento en las amplitudes y formas EOD pueden conducir a mediciones de tiempo EOD imprecisas y no fiables. Hemos superado estos problemas espacialmente promediando múltiples formas de onda de desactivación de artefactos explosivos registrados en distintos lugares, y añadiendo un filtro de extracción de sobres para determinar con precisión el momento del EOD de una FEM de nado libre. Además, nuestra técnica también mide las amplitudes de desactivación de artefactos explosivos, que indican si un animal está en reposo o moviéndose activamente basándose en el cambio de la EODamplitudes en el tiempo (véanse las figuras 2E y 2F). Se registraron señales diferencialmente amplificados a partir de los pares de electrodos de grabación para reducir el ruido de modo común. Dado que los pulsos de desactivación de artefactos explosivos se generan a intervalos de tiempo irregulares, el evento de series de tiempo EOD tiene una frecuencia de muestreo variable. El tiempo-serie del EOD se puede convertir a una velocidad de muestreo constante por interpolación si es requerido por una herramienta analítica de elección.
La grabación de vídeo. Aunque la grabación EOD puede supervisar una actividad de movimiento bruto de un animal, la grabación de vídeo permite la medición directa de la posición del cuerpo de un animal y la postura. Infrarrojo cercano (NIR) Iluminación (λ = 800 ~ 900 nm) permite imperturbable observación visual de nadar libremente peces 21,22, ya WEFs son más activos en la oscuridad y sus ojos no son sensibles al espectro NIR 23,24. La mayoría de los sensores de imagen digital (por ejemplo, CMOS o CCD) pueden capturar el espectro NIR con la wavelength rango entre 800-900 nm, después de la eliminación de un puerto de infrarrojos (IR) de filtro de bloqueo 25. Ciertas webcams de nivel de consumidor de gama alta ofrecen alta definición, ángulo de visión amplio y una buena sensibilidad con poca luz, lo que puede producir una calidad de imagen comparable a, o superior a cámaras de infrarrojos de calidad profesional disponible a costos mucho mayores. Además, ciertos webcams de nivel de consumidor se incluyen con el software de grabación que permite un tiempo de grabación prolongado al comprimir vídeo sin pérdida de calidad. La mayoría de cámaras de nivel profesional ofrecen sincronización TTL salidas de impulsos de tiempo o entradas de pulsos TTL de disparo 26 para alinear la sincronización entre el vídeo con las señales digitalizadas, pero esta característica es generalmente ausente en webcams de nivel de consumidor. Sin embargo, la temporización entre una grabación de vídeo y un digitalizador de señal se puede emparejar con precisión mediante la captura simultáneamente un IR LED parpadea periódicamente con la cámara y el digitalizador de señal. El momento inicial y la final del pulso IR se puede utilizar unas de dos marcadores de calibración de tiempo para convertir los números de fotogramas de vídeo a la unidad de tiempo digitalizador de señal y viceversa.
Iluminación y fondo. Imagen capturar a través del agua puede ser un desafío técnico debido a reflejos de luz en la superficie del agua. La superficie del agua puede actuar como un espejo para reflejar una escena visual por encima del agua, y las características visuales oscuros bajo el agua, por lo que la escena fuera del agua debe dictarse sin rasgos para evitar la interferencia visual. Con el fin de imagen todo el acuario, una cámara tiene que ser colocado directamente sobre el agua, y que debe estar oculto detrás del techo sobre un orificio de visualización pequeño para evitar su reflexión sobre la superficie del agua. Por otra parte, la superficie del agua puede producir miradas y la iluminación no uniforme si las fuentes de luz se proyectan de forma incorrecta. La iluminación indirecta puede lograr una iluminación uniforme sobre toda el acuario por objetivo las fuentes de luz hacia el techo, de tal manera que el techo y el Wal rodeals pueden reflejar y difundir los rayos de luz antes de llegar a la superficie del agua. Elija un iluminador de infrarrojos que coincide con una respuesta espectral de la cámara (por ejemplo, 850 nm de longitud de onda de pico). Ruido eléctrico de las fuentes de luz puede ser minimizado mediante el uso de luces LED y la colocación de sus fuentes de alimentación de corriente continua fuera de la jaula de Faraday. Coloque un fondo blanco debajo del tanque, ya que los peces contrasta bien en un fondo blanco en longitudes de onda NIR. Del mismo modo, el uso del color blanco mate en las superficies interiores de la cámara de aislamiento proporciona uniforme y brillante iluminación de fondo.
Seguimiento de vídeo. Después de una grabación de vídeo, un algoritmo de seguimiento automatizado de imágenes puede medir posiciones y posturas del cuerpo del animal con el tiempo. El seguimiento de vídeo se puede realizar de forma automática, ya sea software listo para usar (Viewpoint o Ethovision), o software programable por el usuario (OpenCV o MATLAB caja de herramientas de procesamiento de imagen). Como el primer paso de seguimiento de imagen,un área de seguimiento válido tiene que ser definido por dibujar una forma geométrica para excluir la zona exterior (enmascarar la operación). A continuación, la imagen de un animal tiene que ser aislado del fondo restando una imagen de fondo de una imagen que contiene el animal. La imagen de la resta se convierte a un formato binario mediante la aplicación de un umbral de intensidad, de manera que el centroide y el eje de orientación se pueden calcular a partir de las operaciones morfológicas binarias. En Gymnotiforms 27-29 y 30-32 Mormyrids, la densidad electroreceptor es la más alta cerca de la región de la cabeza, por lo que la posición de la cabeza en cualquier momento indica una ubicación de la más alta agudeza sensorial. Los lugares de la cabeza y de la cola se pueden determinar de forma automática mediante la aplicación de las operaciones de rotación de imagen y de cuadro de límite. Los extremos de cabeza y cola se pueden distinguir uno del otro definiendo manualmente en el primer fotograma, y por hacer el seguimiento de sus ubicaciones de la comparación de dos tramas sucesivas.
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Protocol
Este procedimiento cumple con los requisitos de la Universidad de Comité de Cuidado de Animales de Ottawa. Ningún conflicto de interés se declara. Por favor, consulte la Tabla de Materiales y Reactivos para las marcas y modelos de los equipos y materiales que figuran a continuación. Escritos Custom Spike2 y MATLAB scripts y datos de ejemplo se proporcionan en el archivo suplementario.
1. El tanque del acuario y de la Cámara de aislamiento Configuración
- Anti-v piso ibration. Construir una superficie anti-vibración (2,1 mx 2,1 m) apilando los cojines de goma espuma de poliestireno, acústico, el panel de madera contrachapada marina, y los cojines de espuma de poliuretano de la parte inferior a la parte superior (Figura 1A). Coloque cuatro postes de madera (5 cm x 10 cm) en el panel de madera contrachapada para apoyar a los bordes del tanque del acuario.
- Calentador de piso. Coloque un elemento de calentamiento eléctrico blindado sobre un relleno de espuma térmicamente clasificado (ver figura inferior 1D). Cubrir el elemento de calentamiento con un metallic malla de blindaje eléctrico.
- Tanque espacial. Construir un tanque del acuario de ancho y poco profundo (1,8 mx 1,8 mx 30 cm), utilizando 1,3 cm paneles de vidrio, marco de aluminio en forma de L y silicona acuario grado (véase la Figura 1A) de espesor templado. Cubrir la parte inferior del tanque con una gran hoja de fondo blanco para proporcionar un alto contraste de formación de imágenes (véase el Protocolo 3).
- Divida el tanque del acuario en una arena central (1,5 m de diámetro) y cuatro compartimentos de esquina (véase la Figura 1B) por paredes instalando (22,5 cm de altura) hechas de hojas de acrílico (mate blanco, 0,64 cm de grosor).
- Curva cuatro hojas de acrílico (22,5 cm x 102,7 cm), mediante la aplicación de calor para crear cuatro secciones de pared curvadas, y las incluirá en el fondo del tanque utilizando masilla de silicona para separar la arena central de los cuatro compartimentos de esquina. Deje 20 cm de espacio entre las secciones curvas para la instalación de la puerta.
- Separe compartimentos de esquina vecina mediante la instalación de cuatro paredes dobles with 15 cm lagunas, que proporcionan aislamiento eléctrico adicional y lugares para sensores submarinos como un hidrófono.
- Montar cuatro puertas motorizadas, y los instala entre los compartimentos de esquina y el escenario central.
- Montar cuatro marcos de puertas como se muestra en la Figura 1C. Crear seis pozos (0,64 cm de profundidad) en cada marco de puerta, insertar tuercas ciegas nylon (hilo de diámetro 0,64 cm) y fijarlos con epoxi.
- Cortar cuatro paneles de las puertas de acrílico y láminas de caucho, y crear seis agujeros (0,64 cm de diámetro) en el acrílico y paneles de goma para el mecanismo de bloqueo. Únete al acrílico y paneles de goma utilizando masilla de silicona.
- Instale bisagras de acrílico para unir los paneles de las puertas con los marcos de las puertas.
- Monte balanceando los brazos en servomotores, e instalarlas en la parte superior de los marcos de las puertas (ver Figura 1 C). Hacer bucles con bridas para unir los brazos oscilantes de los paneles de las puertas.
- Coloque los conjuntos de puerta en la gaps creado entre las secciones de pared curvados, y asegurarlos mediante masilla de silicona.
- Conecte todos los servomotores a un controlador servo, y conectarlo a una fuente de alimentación y un ordenador mediante un cable de extensión USB activo. Pruebe las puertas utilizando el software de control suministrado con el controlador del servo.
- Después de que la silicona se endurece, compruebe la estanqueidad al bloquear todas las puertas con tornillos de nylon y relleno de un compartimiento a la vez.
- Cámara de aislamiento. Construir una cámara de aislamiento para rodear el acuario y bloquear las fuentes externas de luz, sonido y ruido eléctrico (vea la Figura 1D).
- Haga tres paneles de pared (2 mx 2 mx 5 cm) y cuatro paneles de las puertas (1,9 mx 0,95 mx 5 cm). Para cada grupo, se unen las molduras de aluminio (5 cm x 2,5 cm) para crear un marco rectangular, y remachar un panel blanco de plástico corrugado en el marco de aluminio. Rellene guatas de fibra de vidrio acústico de los paneles, y cerca de un panel de plástico corrugado negro.
- Instale tres paneles de pared en el piso anti-vibración, e instalar bisagras de piano para unirse a los cuatro paneles de las puertas en los paneles de las paredes.
- Rodean la cámara de aislamiento con mallas de aluminio, y la tierra de mallas en todos los lados para crear una jaula de Faraday.
- Control de humedad. Instale un extractor de aire de bajo ruido (Figura 1F superior) para eliminar el exceso de humedad acumulación de calor. Coloque el extractor de aire de al menos 2 m de distancia del lugar de grabación, e instalar un conducto de aire entre la cámara de aislamiento y el extractor de aire.
- Rutinariamente supervisar y mantener las condiciones de agua del tanque y animales.
- Mantener las condiciones de agua constante a 10 cm de profundidad, 100 S / cm de conductividad y pH 7,0 mediante la adición de agua o solución salina de valores (consulte Knudsen 33 para la receta). Añadir una bolsa de coral triturado si el pH cae por debajo de 6,5.
- Instale filtros del acuario verticales que pueden operar desde aguas poco profundas para la limpieza yfines de aireación (Figura 1F) de fondo. Desconecte los filtros y los llevan fuera de la arena central durante las sesiones de grabación.
- Entregar gusanos viven en el fondo del tanque uniéndolos en ventosas con elásticos. Evite presas flotantes como blackworms para evitar la alimentación controlada de presas perdidas durante la grabación.
2. Seguimiento del EOD
- Instalación de electrodos. Ensamble ocho electrodos de grafito, y el espacio por igual en la pared curva de la pista central.
- Obtener la elaboración de ofertas (15 cm de longitud; Marte Carbon 2 mm Tipo de HB) y afeitarse el revestimiento externo de los cables.
- Cortar ocho segmentos de 10 cm de cable coaxial (RG-174), envolver el núcleo del cable alrededor de un extremo de las barras de grafito, y aplicar calor tubo retráctil sobre ellos para la conexión eléctrica fuerte y estable. Conecte los conectores jack BNC en los extremos opuestos (Figura 2A izquierda). </ Li>
- Coloque los electrodos en la pared con cinta adhesiva, y se aplican tiras delgadas de cinta adhesiva en las superficies de los electrodos para protegerlo de la silicona. Aplique sellador de silicona para mantener de forma permanente los electrodos, y quitar toda la cinta antes de que se endurezca silicona (Figura 2A derecha).
- Construir ocho conjuntos de cables mediante la medición de la distancia desde cada electrodo a la unidad de amplificador, y corte de cables coaxiales (RG-54) en longitudes. Adjuntar conectores BNC en ambos extremos de los cables.
- Utilice los montajes de cable para conectar todos los electrodos a la unidad de amplificador. Amplificar diferencialmente por el emparejamiento de dos 90 ° electrodos orientados (vea la Figura 2B), y la tierra todos los cables coaxiales de blindaje mediante la conexión a la jaula de Faraday.
- Establecer la ganancia del amplificador por debajo del límite de saturación de la señal, y aplicar un filtro de paso de banda (200 Hz-5 kHz) para eliminar el ruido. Digitalizar los cuatro pares de electrodos de grabación a 40 kS / s.
- Onlineprocesamiento de la señal. Las instrucciones están escritas para el software Spike2, y los ajustes de los parámetros están optimizados para Gymnotus sp. (Ver Figura 2 C para el resumen).
- Añadir un DC quitar proceso (τ = 0,1 segundos) para todos los canales de grabación.
- Añade un proceso de rectificar a todos los canales de grabaciones.
- Crear un canal virtual mediante la suma de los cuatro canales de grabación.
- Extrae un sobre unimodal por pulso EOD añadiendo un RMS (root-mean-cuadrado,
) Proceso (τ = 0,25 mseg) para el canal virtual, para generar un solo pico por ciclo del EOD para determinar sin ambigüedad la temporización de los impulsos. - Crear un canal RealMark desde el canal virtual y registrar el tiempo y los valores de las amplitudes de pico, después de fijar un umbral adecuado para capturar todo del EOD pulsos wisn perder el pulso, mientras evita falsos positivos.
- Monitorear la tasa EOD instantánea en tiempo real mediante el establecimiento de la opción de visualización de canal del canal RealMark a un modo de frecuencia instantánea.
- Monitorear el movimiento de los peces en tiempo real mediante la duplicación de la canal RealMark y establezca la opción de pantalla a un modo de forma de onda.
- Cuantificar el nivel de actividad de la RMS de la pendiente de amplitud EOD mediante la creación de un canal virtual desde el canal RealMark (periodo de muestreo 0,01 seg), y añadir la pendiente (τ = 0,25 ms) y RMS (τ = 0,5 ms) procesos.
- Exportar el canal RealMark en el software de Spike2 al formato MATLAB.
) Proceso (τ = 0,25 mseg) para el canal virtual, para generar un solo pico por ciclo del EOD para determinar sin ambigüedad la temporización de los impulsos. 3. Seguimiento de vídeo sincronizada
- Crear un fondo de escena.
- Ocultar cualquier objeto que arroja un reflejo en la superficie del agua, cubriendo con película mate encimera blanco.
- Instale un blanco matePanel de plástico corrugado de 15 cm por debajo del techo para ocultar la cámara y la salida de aire.
- Imprimir patrones de cuadrícula en una hoja grande de papel blanco para la calibración de una cámara y ponerla debajo del tanque para proporcionar un fondo de alto contraste.
- Instale las fuentes de luz.
- Obtener luces del IR LED y, quite ventiladores incorporados para reducir el ruido. Conducir el LED con una fuente de alimentación de corriente regulada DC colocado fuera de la jaula de Faraday.
- Instale luces del IR para la imagen en la oscuridad, y las luces blancas del LED para la conducción de un ciclo de luz diurna en los peces del ensayo LED. Directos todas las fuentes de luz hacia el techo para lograr la iluminación indirecta y uniforme (Figura 3A).
- Regular el ciclo de luz diurna mediante el accionamiento del blanco LED luces con un interruptor de control de tiempo (por ejemplo, 12 horas on/12 hr off).
- Instale una cámara directamente encima del acuario.
- Obtenga una cámara NIR y minúsculas, o quitar un bloqueo filte IRR rompiendo una fina lámina de vidrio teñido en la parte posterior del conjunto de lentes. Asegúrese de que el ángulo de visión es lo suficientemente amplia como para la imagen de todo el escenario central.
- Haz un pequeño agujero de visión en el centro del panel de techo, y coloque la cámara directamente encima del agujero.
- Instale un guardia anillo blanco alrededor de la lente, si las fuentes de luz generan resplandores.
- Realice una grabación de vídeo sincronizado.
- Deposite un LED IR en una de las cuatro esquinas del tanque para generar pulsos de sincronización de tiempo (1 ms de duración, período de 10 segundos). Añadir un resistor limitador de carga (1 kW) en serie, y conducir el LED IR de un puerto de salida digital del hardware digitalizador.
- Use el software de grabación de video incluido con la cámara, si está disponible. Seleccione la calidad de grabación más alta (por ejemplo, la compresión sin pérdida) y los más altos resoluciones soportadas.
- Inicie la grabación de vídeo inmediatamente antes de iniciar la grabación del EOD, y detener la grabación de vídeo inmemente después de la grabación del EOD.
- Después de la grabación, convertir los números de cuadro de imagen a la unidad de tiempo digitalizador por interpolación lineal entre el primero y los últimos impulsos de luz capturados por el digitalizador de señal y la grabación de vídeo.
- Seguimiento automatizado de imágenes
Las instrucciones están escritas para la caja de herramientas de procesamiento de imágenes MATLAB, y hacer uso de sus funciones. Una secuencia de comandos de MATLAB encargo se ofrece con esta presentación para el seguimiento automatizado de imágenes.- Importar vídeo. Importar un archivo de grabación de vídeo directamente en el espacio de trabajo de MATLAB usando "Videoreader. Leer" la función.
- Crear una imagen de fondo compuesto por la combinación de dos cuadros de imagen. Reemplazar la región de imagen ocupada por un animal con una imagen no ocupada de la misma región de otro marco (véase la Figura 3B).
- Especifique un área de imagen para realizar un seguimiento mediante la elaboración de una máscara circular alrededor de la pista central para excluir la unarea exterior (Figura 3B inferior), y multiplicar por una constante (r int) para establecer un umbral mínimo para la diferencia de intensidad. Por ejemplo, establecer rint = 0.85 suprimirá las fluctuaciones de intensidad de 15% = (1 - r int) por debajo del fondo.
- Sustracción de imagen. Restar un cuadro de imagen (= IM k) de la imagen de fondo (= IM 0) para obtener la imagen de diferencia (= ΔIM k). Utilice entero sin signo de precisión numérica para almacenar los valores de intensidad de imagen como enteros no negativos.
- Segmento de la imagen de diferencia mediante la aplicación de un umbral de intensidad determinada a partir de la función de graythresh. Limpie la imagen binaria utilizando la función bwmorph y seleccione la mancha más grande que corresponde a un animal después de calcular todas las áreas de blob utilizando la función regionprops.
- Determinar el centroide y un importante orientaciónxis de la mancha más grande mediante la aplicación de la función regionprops, y rotar la imagen para alinear el eje mayor con el eje x. Divida la imagen para las partes de la cabeza y de la cola en el centroide (parte superior Figura 3D).
- Determinar el eje mayor de la parte de cabeza, y girar toda la imagen para alinear con el eje x (Figura 3D parte inferior izquierda). Montar delimitadores cajas alrededor de la cabeza y las partes traseras paralelas a sus ejes principales el uso de la función regionprops.
- Determinar la mediana de coordenadas y de la burbuja en la izquierda, el centro y los bordes verticales de la derecha de los cuadros delimitadores (puntos verdes en la parte inferior figura 3D), y asignarlos a cinco puntos de la entidad (la cabeza de punta, a mitad de la cabeza, a medio cuerpo , a mediados de la cola, punta de la cola).
- Procesar imágenes sucesivas después de recortar un cuadro de imagen centrada en baricentro del animal determina a partir de su marco anterior.
- Asigne manualmente la orientación de la cabeza para el primer fotograma, y utilizar un betwe punto-productoen los vectores de orientación de dos fotogramas sucesivos para determinar automáticamente la orientación de la cabeza. Inspeccione el resultado, y dar la vuelta manualmente la orientación de la cabeza si se ha asignado incorrectamente.
- Trazar una trayectoria animales al unirse a la cabeza-tips y suavizar utilizando la mediana y los filtros de promedio (n = 3) si tiene una apariencia nerviosa. Superponer la trayectoria una imagen de fondo, e interpolar las líneas medias de peces usando los cinco puntos de la entidad (véase la Figura 2E).
- Calcular la tasa de EOD promedio en cada imagen el tiempo de captura por remuestreo la tasa EOD instantáneo (frecuencia de muestreo de 100 Hz) y un promedio de (ventana de tiempo 0.0625 segundos). Trazar la trayectoria en pseudo-colores determinados a partir de la tasa de EOD vez emparejados, y superponer una imagen de fondo (ver Figura 2F) con.
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Representative Results
Seguimiento de los resultados del EOD
Las formas de onda EOD grabadas de diferentes pares de electrodos varían en amplitud y las formas como se esperaba de sus posiciones únicas y orientaciones (Figura 2C arriba). El uso de múltiples pares de electrodos garantiza fuerte recepción de la señal en todas las posiciones posibles y las orientaciones de FEM dentro del tanque. La forma de onda envolvente (Figura 2C parte inferior, verde rastro) siempre contenía un solo pico por ciclo del EOD, que sirvió como un marcador de tiempo fiable para determinar con precisión los intervalos entre pulsos y la tasa del EOD instantánea (IPI = -1). Los picos EOD sucesivas se unieron y interpolan linealmente a intervalos de tiempo constantes (mejores Figura 2D, traza negro), y la tasa de EOD instantánea se interpolan de manera similar a intervalos de tiempo constantes (inferior Figura 2D, trazas de color rosa). El procedimiento de remuestreo en tiempo constante facilita la sincronización de tiempo seatre la trayectoria de movimiento y la señal EOD, y permite aprovechar de un mayor número de herramientas de análisis de datos de series temporales constantemente muestreados. Las amplitudes EOD registrados en los electrodos externos se mantuvo constante, mientras que un animal estaba en reposo (Figura 2E parte superior), pero variaron con el tiempo mientras que el animal se movía debido al cambio de ubicación y la orientación de dipolo (Figura 2F parte superior). Así, el movimiento de los peces puede deducirse de la observación de la variación de amplitudes EOD con el tiempo. La tasa de referencia del EOD se mantuvo baja mientras que el pescado estaba en reposo (figura inferior 2E), pero la tasa de EOD se convirtió significativamente mayor, mientras que los peces nadando activamente (Figura 2F superior). Nuestra observación es consistente con la correlación positiva entre la tasa de EOD y el movimiento de los peces como se informó anteriormente 8,9,34,35.
Seguimiento de los resultados de Video
Trayectoria y líneas medias del animal se muestran en la figura 3E Ure con los primeros y últimos cuadros de imagen superpuesta. El curso temporal de los cambios postura fue capturado mientras que el pescado fue abruptamente convirtiendo durante dos segundos, y las líneas medias de pescado se trazan cada 200 ms. La línea media de pescado ha iniciado correctamente en la punta de la cabeza y termina en la punta de la cola de pescado. Las imágenes de peces estrechamente acordadas con las líneas medias de orugas de forma automática a pesar de las sombras emitidos por el animal. Figura 3F ilustra la tasa variable en el tiempo promedio del EOD (τ = 0,0625 seg) en el color, que se superpone con la trayectoria coincidentes en el tiempo de la cabeza del pescado -tip. Durante la duración de inflexión 2 seg, la tasa media del EOD alcanzó su pico mientras el animal estaba en el medio de la fase de giro, y la tasa disminuyó hacia el final del giro. Este resultado representativo ilustra que nuestro método puede ser aplicado con éxito para estudiar la relación entre los movimientos de auto-guiados y la modulación de la frecuencia del EOD durante la natación libre.
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Figura 1. Configuración de acuario tanque y cámara de aislamiento. A) La cámara experimental consta de un piso anti-vibración, tanque de acuario, y una cámara de aislamiento. B) El tanque de acuario se divide en el ámbito central para llevar a cabo experimentos, y cuatro compartimentos de esquina para el individuo vivienda peces. Cada compartimiento estanco fue construida para impedir la comunicación eléctrica entre los animales. C) La puerta motorizada se ilustra en múltiples ángulos de perspectiva. La puerta se vuelve hermético cuando está bloqueado por seis tuercas de mariposa que comprimen la junta de goma (la hoja de color marrón claro). Una vez desbloqueado, la puerta puede ser operado a distancia por el servomotor en la parte superior. D) La cámara de aislamiento fue montado por unir tres Wtodos los paneles y cuatro paneles de las puertas, que dan acceso al tanque del acuario a partir de dos lados. El panel inferior muestra los rieles de madera para soportar los bordes del tanque, y la colocación del calentador piso. Una capa de malla de aluminio cubre el calentador para proteger su ruido eléctrico. E) Las paredes y los paneles de las puertas de la cámara de aislamiento se construye a partir de marcos de aluminio para el soporte estructural (3). Las superficies interiores de la cámara están cubiertas por paneles de plástico blanco (5) para reflejar las fuentes de luz internas, y los exteriores están cubiertas por paneles de plástico negro (2) para bloquear las fuentes de luz externas. Una malla de aluminio (1) cubre las paredes exteriores para bloquear el ruido eléctrico externo. El muro está lleno de bloques de fibra de fibra de vidrio acústico (4) F) La foto superior muestra la configuración de la ventilación de aire para eliminar el exceso de humedad generada por el calentamiento;. Y la foto de abajo muestra la configuración de filtrado de agua para la limpieza, la difusión y la aireación del agua del tanque entre experimentalsesiones. Haz click aquí para ver la imagen más grande .
Figura 2. Configuración de la grabación EOD y resultados representativos. A) El panel de la izquierda muestra el conjunto de electrodos que consiste en un delgado electrodo de grafito, un segmento corto de cable coaxial, y una Jack BNC. El panel derecho muestra las instrucciones de fijación de electrodos. La cinta adhesiva se utiliza para posicionar temporalmente el conjunto de electrodos, y calafateo de silicona se aplica para mantener de forma permanente el electrodo. B) El diagrama de cableado. Dos electrodos 90 ° orientado están emparejados, diferencialmente amplificada y filtrada. Cuatro canales de grabación se digitalizaron fuera del Faraday cedad. C) Ilustración de las etapas de procesamiento de señal EOD. Los principales vestigios muestran formas de onda de primas de cuatro pares de electrodos, que se rectifican y se suman para producir la traza barra gris. Sobres unimodales se extraen de la forma de onda de color gris con el "Root-Mean-Square" (RMS) filtro (trazo verde). Las amplitudes de desactivación de artefactos explosivos y los IPI se determinan a partir de los picos de la envolvente. D) Las variables en el tiempo EOD amplitudes (arriba) y la tasa de EOD instantánea (abajo) se muestran en una escala de tiempo mayor que C). Las amplitudes de desactivación de artefactos explosivos y la tasa instantánea (IPI = -1) son interpolados a intervalos de tiempo regulares uniendo los picos de la envolvente (trazas negras). E) Igual D), pero representan en una escala de tiempo más largo, mientras que el pescado estaba en reposo. F) Igual que E) mientras que el pescado estaba nadando activamente. Haz clic aquí para ver la imagen más grande .
Figura 3. Configuración del seguimiento de vídeo y los resultados representativos. A) La configuración de iluminación y la cámara se ilustra. El infrarrojo (IR) y fuentes de luz visible están unidos en las paredes y señaló hacia el techo, de manera que la superficie del techo refleja y difunde la luz para proyectar una iluminación uniforme en todo el tanque. La cámara está oculta por encima del panel de techo para evitar la reflexión sobre la superficie del agua. Un LED de IR está situado en una de las cuatro esquinas del tanque para generar pulsos de sincronización de tiempo. B) Generación de una imagen de fondo compuesta se ilustra. Dos cuadros de imagen (imágenes en la parte superior) se combinan para formar la imagen de fondo de material compuesto (parte inferior izquierda) mediante la sustitución de la región que contiene el animal (por lotapa cuadrado rojo) con la región sin que el animal (discontinua cuadrado rojo). Zona exterior de la pista central se enmascara en negro (parte inferior derecha). C) aislar el contorno de pescado. Un cuadro de la imagen (arriba a la izquierda) se resta de la imagen de fondo (arriba a la derecha) para producir la imagen de diferencia (abajo a la izquierda), y se convierte en la imagen binaria (parte inferior derecha) mediante la aplicación de un umbral de intensidad. D) Las mediciones de la posición del cuerpo y la postura se ilustran. La imagen binaria del animal (BLOB) se hizo girar para alinear su eje mayor con el eje x (parte superior derecha), y centrado en su centroide. La mancha fue separado de la cabeza las piezas (rojo) y la cola (azul), y cada parte se hizo girar por separado para determinar su cuadro delimitador. La nota estaba orientado a fotograma del animal de referencia (inferior izquierda), y cinco puntos de función (de cabecera, a mitad de la cabeza, a medio cuerpo, a mediados de la cola, la cola-end) se determinaron a partir de los puntos medios de la caja de contorno bordes. E) Time-lapse imedad de las líneas medias de pescado representó cada 200 ms. Los primeros y últimos fotogramas de imágenes se superponen durante la 2 seg de duración de inflexión. F) La tasa promedio EOD está representado en pseudo-color y superpone con la trayectoria de la cabeza de pescado. Las mismas imágenes se utilizan como en E). Haga clic aquí para ver la imagen más grande .
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Discussion
Importancia de nuestras técnicas. En resumen, se describió por primera vez la construcción de un gran tanque de acuario y una cámara de aislamiento para observar comportamientos exploratorios espontáneas producidas por WEF. A continuación, se demostró la técnica de registrar y hacer un seguimiento de la tasa de EOD y los estados de movimiento de los peces sin restricciones en tiempo real, utilizando múltiples pares de electrodos. Finalmente, describimos la técnica de infrarrojos de grabación de vídeo a través del agua en un momento de forma sincronizada, y el algoritmo de seguimiento de imágenes para medir la posición del cuerpo y la postura. Como preparación experimental, FEM ofrece una ventaja importante para la investigación de comportamientos-sensoriales guiada activos mediante la demostración de tasa EOD fácilmente cuantificable, que es igual a la tasa de muestreo electrosensorial activo. La combinación de estas técnicas puede permitir preciso y fiable observación a largo plazo 8 de comportamientos espontáneos de desenfrenada WEF. Por otra parte, la mayoría de nuestra configuración se puede construir from amplia disponibilidad de materiales de construcción y componentes electrónicos fáciles de obtener. Las técnicas descritas aquí se han desarrollado y probado para cumplir con nuestros requerimientos experimentales de los últimos años. Por lo tanto, se recomienda estas técnicas para futuros estudios de los comportamientos exploratorios espontáneas de nado libre WEF.
Cámara de aislamiento. La cámara de aislamiento proporciona condiciones experimentales bien controlados por el bloqueo de las fuentes externas de luz, la vibración, el sonido y el ruido eléctrico con diferentes grados de efectividad. El rendimiento de bloqueo de luz se puso a prueba mediante la colocación de una cámara motorizada en el interior de la cámara de aislamiento oscuro, y no hay fugas de luz externa se observó desde la cámara después de explorar todos los lugares se usa el control alejado de la cacerola. La superficie de amortiguación de vibraciones instalado bajo la atenuación tanque provisto contra vibraciones externas canalizados desde el suelo, y de apilamiento de múltiples capas de caucho y de espuma era eficaz para bloquear máseventos de vibraciones externas. Sin embargo, los acontecimientos de vibraciones intermitentes como cierre de la puerta ruidosamente en localidades cercanas hicieron desencadenar respuestas de la novedad en raras ocasiones. Aunque una mesa de aire anti-vibración podría ofrecer un rendimiento de aislamiento superior de vibraciones de fondo, sería prohibitivamente caro para comprar una mesa de aire lo suficientemente grande para nuestro acuario. Por lo tanto, hemos puesto un submarino hidrófono para detectar y excluir eventos cuando grandes vibraciones externas provocaron respuestas de la novedad. Para minimizar aún más la influencia del ruido fuera del laboratorio, se llevaron a cabo los experimentos durante las horas de menor actividad (después de 18:00). Del mismo modo, el ruido acústico en el aire externo se atenuó a través de las paredes de la cámara de aislamiento de fibra de vidrio llenas de bloques de fibra de aislamiento. Aunque no cuantificar objetivamente el rendimiento de la atenuación del sonido, la mayor parte del sonido de fondo en un entorno de laboratorio no provocó las respuestas de la novedad. En raras ocasiones, un sonido fuerte y repentino del gatillo fueraed una respuesta novedad, pero tal acontecimiento fue detectado por la grabación del hidrófono, y rara vez se produjo durante las horas de menor actividad. El tanque del acuario proporcionado área suficientemente grande para nuestros animales para nadar y explorar libremente. El tamaño del tanque fue elegido en proporción a la longitud de las especies que usamos (hasta 30 cm), pero el tamaño del tanque se puede escalar hacia abajo si se utilizaran animales más pequeños. Elegimos Gymnotus sp. entre las diferentes especies del tipo de impulsos para su grande tamaño del cráneo para facilitar los registros electrofisiológicos durante el nado libre 36. La calidad de la grabación eléctrica puede mejorar el uso de más costosos mallas de cobre, y blindar el ventilador de escape utilizado para el control de la humedad.
Técnica de medición del EOD. Nuestra técnica de grabación EOD multicanal permite la medición de tiempo EOD precisa y fiable de nadar libremente pescado. El uso de nuestra técnica, todos los impulsos de desactivación de artefactos explosivos generados por nadar libremente WEF se detectaron sin perderse o la adición de un pecadopulso gle para un máximo de seis horas de duración larga grabación (vea la Figura 12 en junio et al. 8). Las medidas de grabación EOD no sólo la tasa de EOD, sino también el nivel de actividad de la variable en el tiempo amplitudes de pico EOD registrados en los electrodos externos. Las amplitudes EOD grabados están determinadas por la geometría relativa entre un animal y los electrodos de registro, por lo tanto los movimientos de animales inducen cambios en las amplitudes EOD (Figura 2F). El nivel de actividad se calcula a partir de la variabilidad (RMS) de la pendiente de amplitud del EOD dentro de una ventana en movimiento (0,5 seg). Usando este método, la grabación de vídeo no se requeriría para medir el nivel de actividad durante un largo período de tiempo, y la grabación del EOD sola puede ser suficiente. En lugar de utilizar una grabación de vídeo, la posición del cuerpo y la postura de FEM se pueden inferir a partir de la grabación del EOD solo sobre la base de las ubicaciones de electrodos, la geometría de un tanque, y un modelo teórico de un dipolo de corriente. El uso de un recordi similaresconfiguración ng, Jun et al. 20 propusieron un método de seguimiento eléctrica en tiempo real para el seguimiento de múltiples WEFs en presencia de un objeto, que se compara la intensidad de la señal medida en múltiples pares de electrodos de grabación con entradas de la tabla de búsqueda que contienen intensidades de señal predichas en lugares dipolo actuales conocidos. El método de seguimiento eléctrica ofrece una mayor fiabilidad de seguimiento en un entorno visualmente desordenado donde los animales a menudo quedan obstruidos de la vista, o durante el seguimiento de varios animales. Hábitats naturalistas del WEF contienen muchos obstáculos visuales, tales como las plantas acuáticas y las raíces, donde el método de seguimiento eléctrica podría proporcionar un seguimiento más fiable con los requisitos de configuración más simples que el seguimiento visual. En principio, nuestro método es directamente aplicable a la especie del FEM de tipo de onda después de cambiar las constantes de tiempo de filtro. El paso de la rectificación introducirá dos modos por ciclo EOD, ya que la forma de onda del EOD es aproximadamente sinusoidal en las especies de tipo de onda. En este caso, La tasa de EOD instantánea se puede determinar saltarse todos los otros marcadores de tiempo EOD ignorar la fase EOD negativa. WEF puede detectar los electrodos de registro cuando nadan en las inmediaciones, por lo que hemos evitado el uso de grandes o metálicos electrodos que pueden ser detectados desde más lejos de 37 años, y en su lugar se utiliza electrodos de grafito fino (2 mm de diámetro). Cables coaxiales más delgada (RG-174) se utilizaron con los conjuntos de electrodos para la flexibilidad, pero cables coaxiales más gruesas (RG-54) fueron utilizados para el cableado en distancias extendidas para el blindaje eléctrico superior. Mayor duración de la grabación del EOD se puede lograr mediante la reducción de la frecuencia de muestreo, pero con una resolución temporal inferior como un trade-off. La media y la variabilidad de la tasa de EOD varía entre las especies, por lo que la ventana de tiempo para suavizar la tasa EOD instantánea necesitan ser ajustadas adecuadamente. Se recomienda una ventana de tiempo más corto para las especies que tienen media más corta y menor variabilidad en la IPI (por ejemplo Gymnotiforms), y un tiempo más largo windoSe recomienda w para las especies que tienen media más larga y una mayor variabilidad en el IPI (por ejemplo Mormyrids).
Iluminación y configuración de la cámara. Las grabaciones de vídeo proporcionan observaciones conductuales cuantitativos y cualitativos, y aquí estamos describieron las modalidades de constitución, registro y procesamiento de los datos de la imagen. Configuración La iluminación juega un papel importante en la producción de imágenes de alta calidad, y el ángulo de proyección de la luz es un factor importante para obtener imágenes de los animales bajo el agua. Bajo condiciones de iluminación subóptimas, la superficie del agua puede formar miradas y reflexiones, que pueden interferir con la imagen de seguimiento especialmente cuando los animales generan ondas de superficie. Los problemas de deslumbramiento y de reflexión pueden ser eliminados mediante la proyección de fuentes de luz de la parte inferior de un tanque. Para un pequeño tanque, matrices de LED se pueden colocar directamente debajo del tanque y brillan a través de un panel difusor para generar la intensidad de luz uniforme 38. Del mismo modo para un tanque más grande, una fuente de luz cun ser colocados debajo del tanque, y la intensidad de luz uniforme se puede lograr al permitir una distancia suficiente para que la luz difusa 39. En nuestra configuración, nos vimos obligados a proyectar la luz de arriba del tanque debido a las limitaciones de espacio, la estabilidad estructural y la colocación del calentador debajo del tanque. Evitamos los problemas de deslumbramiento y reflexión mediante el uso de la iluminación indirecta, de tal forma que las fuentes de luz se proyectaron hacia el techo. Al hacer la parte superior de la cámara de blanco liso y mate, sin reflejos eran visibles en la superficie del agua. Para la imagen de todo el escenario central, una lente de gran angular puede ser montado en la cámara, pero algunas lentes (lente de ojo de pez) pueden causar la distorsión de barril significativo. La distorsión de barril puede ser corregida mediante el uso de una hoja de cuadrícula de calibración debajo del tanque para medir las coordenadas de píxeles de las ubicaciones de rejilla vistos en el centro del tanque. Junto con las ubicaciones correspondientes de la cuadrícula en centímetros, una matriz de transformación puede ser calculado para correcta la distorsión de barril 40. Recomendamos cámaras de alta resolución si un tamaño de animal es mucho más pequeño que el tamaño del tanque, de manera que un número suficiente de píxeles se puede obtener a partir del animal para medir correctamente su postura del cuerpo.
De seguimiento de imagen y la sincronización de tiempo. El algoritmo de seguimiento de imagen descrito aquí hace uso de la operación de región de interés (ROI) para medir rápidamente la posición del cuerpo y la postura. La operación de retorno de la inversión reduce el tamaño de la imagen a procesar, y limita el rango de seguimiento de cerca de la localización de los animales de la trama anterior. Se extrajo la postura del cuerpo (línea media) mediante el uso de la rotación de la imagen y operaciones de cuadro de límite en lugar de la operación imagen esqueletización habitual, que a veces no logró producir una línea media única bien definida. Marco del animal de referencia se encuentra en el medio del cuadro delimitador cabeza, lo que permite el análisis del comportamiento egocéntrico. La principal fuente de error en la Tracki imagenng era debido al efecto óptico de proyección en un ángulo amplio. Idealmente, los movimientos verticales de los animales no deben afectar a la medición de posición 2D, pero cuanto más lejos de los ejes centrales de formación de imágenes, la mayor parte de la dimensión vertical se proyecta a la cámara. La refracción en la superficie del agua reduce el efecto óptico de proyección en un 28% en nuestra configuración de imagen (cámara en altura = 1,8 m, la profundidad del agua = 10 cm, el radio del tanque = 75 cm), y el peor error de posición fue de ± 1.4 cm en la circular valla. La temporización entre el EOD y grabaciones de vídeo se sincroniza utilizando pulsos de LED infrarrojos para tener en cuenta la deriva de tiempo entre el vídeo y los relojes del digitalizador de señal, y diferentes tiempos de inicio de grabación. La incertidumbre esperado en la sincronización de tiempo entre el vídeo y las grabaciones EOD es proporcional al intervalo de captura de imágenes, por ejemplo, 15 fotogramas por segundo tasa de captura (fps) marco dará lugar a la incertidumbre de alineación de tiempo de ± 33 mseg. Tal grado de time precisión es adecuada para el seguimiento de los peces en movimiento más lento, pero una cámara de alta velocidad puede ser necesaria para el seguimiento de los animales en movimiento más rápido. Recomendamos brillante intensidad de la luz con un aumento de la velocidad de fotogramas, ya que el tiempo de exposición del sensor es inversamente proporcional a la velocidad de fotogramas.
El trabajo futuro. Las interacciones sociales entre múltiples WEFs pueden ser estudiados mediante el seguimiento de sus señales de desactivación de artefactos explosivos y los lugares del cuerpo, y el sistema de seguimiento deben asociar correctamente el EOD con la ubicación de la misma persona. De acuerdo con el método de localización del dipolo descrito por Jun et al. 20 una configuración similar usando, los lugares de origen animal inferidas por sus señales de desactivación de artefactos explosivos recibidos en múltiples electrodos pueden ser emparejados a la salida de rastreo visual para la correcta identificación de los pulsos de desactivación de artefactos explosivos de diferentes individuos. Seguimiento de imagen de varios animales se puede realizar una sola persona a la vez con la operación retorno de la inversión. Un retorno de la inversión puede ser inicialmente definido en torno a un individuo ase registra y el retorno de la inversión se volverá a colocar en cada cuadro con la posición del cuerpo actualizada. Los otros peces se excluyeron del análisis de seguimiento de imagen cuando aparece fuera del retorno de la inversión, y si apareció en el interior, la imagen de los otros peces se pueden eliminar de forma automática mediante la comprobación de su imagen llega al límite de retorno de la inversión. A veces, dos animales en contacto entre sí y sus imágenes se fusionan, y si es así, una máscara se pueden extraer manualmente para separar la imagen de los otros peces. Otro interesante trabajo futuro es el seguimiento de vídeo en tres dimensiones para mostrar las secuencias de movimiento complejas durante la captura de la presa 22 o las interacciones sociales. MacIver et al. 22 utiliza dos cámaras para ver un tanque de acuario rectangular de la parte superior y el lado para la reconstrucción de un modelo de cuerpo tridimensional. Sin embargo, este enfoque no funciona en nuestro caso, ya que hay paredes divisorias que bloquean vistas laterales y el acuario tiene mucho mayor anchura que profundidad. En lugar de ello, sería más aplicablecable para instalar varias cámaras en el techo a diferentes ángulos de perspectiva similar a la configuración utilizada por Hedrick 41. Para mayor precisión, el efecto de refracción introducida por el agua y el ángulo de la cámara oblicua tendría que ser corregido por la calibración de imágenes en tres dimensiones. Nuestro método de seguimiento visual se podría aplicar para estudiar el flujo de imagen eléctrica en la superficie del cuerpo de los peces 42,43 pez nada cuando un objeto cercano. Como estudiado por Hofmann et al. 26, sería interesante investigar el flujo de imagen eléctrica del objeto durante el nado libre en función de la distancia del objeto, forma, tamaño y material. En última instancia, nuestros métodos combinados con grabaciones neuronales de nadar libremente peces 44-46 pueden revelar nuevos conocimientos por las observaciones de los cambios en la actividad de los nervios y la tasa EOD mientras que el pescado se dedica a la exploración de los objetos o de las interacciones sociales.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo contó con el generoso apoyo de las Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de Canadá (NSERC) y los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aquarium Construction | |||
| Electrically shielded floor heater | ThermoSoft Corp., IL, USA | ThermoTile | www.thermosoft.com |
| Tempered glass panel | generic | 0.5 in thick, used for the aquarium construction | |
| Aquarium grade silicone | generic | ||
| Acrylic sheet | generic | 0.25 in thick, matte white | |
| Natural rubber sheet | generic | 0.25 in thick | |
| Servomotor | HTECHRCD Inc., Korea | HS-325HB, 180deg rotation | www.servocity.com |
| Servomotor arm mount | HITECHRCD Inc., Korea | 56362 Large Spline | www.servocity.com |
| Servomotor controller (6 channels) | Sparkfun | ROB-09664 | Micro Maestro 6-channel USB Servo Controller |
| Active USB extension cable | C2G | 38990 | 12 m USB 2.0 A Male to A Female 4-Port Active Extension Cable |
| Exhaust fan | Nutone | ILFK120 | www.homedepot.com |
| Vertical aquarium filter | Tetra, Germany | Whisper Internal Power Filter - 40i | |
| Crushed coral | Used to increase the pH of the tank water | ||
| EOD Recording Setup | |||
| Graphite Electrodes | Staedtler, Germany | Mars Carbon 2-mm type HB | Shave the outer coating |
| Physiological Amplifier/Filter | Intronix, Canada | 2015F | |
| Coaxial Cable | generic | RG174 | For electrodes assembly |
| Coaxial Cable | generic | RG54 | For wiring use |
| BNC jack connector for RG-174 | Amphenol Connex | 112160 | For electrodes assembly |
| BNC plug connector for RG-54 | Amphenol Connex | 112116 | For wiring use |
| Signal digitizer hardware | Cambridge Electronic Design, UK | Power MKII 1401 | |
| Signal digitizer software | Cambridge Electronic Design, UK | Spike 2. ver 7 | |
| Visual Tracking Setup | |||
| White LED light | IKEA, Sweden | DIODER 201.194.18 | www.ikea.com |
| Infrared LED light (850 nm) | Scene Electronics, China | S8100-60-B/C-IR | Remove built-in fan |
| USB webcam | Logitech Inc., CA, USA | C910 | Remove Infrared blocking filter |
| Motorized camera | Logitech Inc., CA, USA | Quickcam Orbit | Remove Infrared blocking filter |
| Video recording software | Logitech Inc., CA, USA | Logitech Quickcam Software | Download from www.logitech.com |
| MATLAB | Mathworks, MA, USA | 2012a | Image processing toolbox |
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