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Neuroscience

À long terme de suivi comportemental de librement piscine faiblement poisson électrique

Published: March 6, 2014 doi: 10.3791/50962
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 2,3
1Department of Physics, University of Ottawa, 2Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Ottawa, 3Centre for Neural Dynamics, University of Ottawa

Summary

Nous décrivons un ensemble de techniques pour étudier le comportement spontané de nager librement poissons faiblement électriques sur une période de temps prolongée, en mesurant de manière synchrone électrique organe décharge le calendrier, la position du corps et la posture de l'animal à la fois précise et fiable dans un aquarium spécialement conçu dans un sensorielle chambre d'isolement.

Abstract

Suivi du comportement à long terme peut capturer et quantifier les comportements animaux naturels, y compris ceux qui se produisent rarement. Comportements tels que l'exploration et interactions sociales peuvent être mieux étudiées en observant effrénée, des animaux se comportent librement. Poissons faiblement électriques (WEF) affichage exploratoire facilement observables et les comportements sociaux par décharge à émission d'organe électrique (EOD). Ici, nous décrivons trois techniques efficaces pour mesurer de manière synchrone l'EOD, la position du corps et la posture d'un WEF nage libre pour une période de temps prolongée. Tout d'abord, nous décrivons la construction d'un réservoir expérimental à l'intérieur d'une chambre d'isolement conçu pour bloquer les sources externes de stimuli sensoriels tels que la lumière, le son, et les vibrations. L'aquarium a été partagé pour accueillir quatre éprouvettes, et des portes automatiques de contrôler à distance l'accès des animaux à l'arène centrale. Deuxièmement, nous décrivons une méthode de mesure de distribution de NEM en temps réel précis et fiable de la natation librement WEF. distorsions de signal provoquées par les mouvements du corps de l'animal sont corrigées par calcul de la moyenne spatiale et d'étapes de traitement temporel. Troisièmement, nous décrivons une installation d'imagerie dans le proche infrarouge sous l'eau pour observer les comportements des animaux nocturnes perturbés. Des impulsions de lumière infrarouge ont été utilisés pour synchroniser la synchronisation entre la vidéo et le signal physiologique sur une durée d'enregistrement de temps. Notre logiciel de suivi automatisé mesure corps la position et la posture de l'animal de manière fiable dans une scène aquatique. En combinaison, ces techniques permettent l'observation à long terme de comportement spontané de nager librement poissons faiblement électriques de manière fiable et précise. Nous croyons que notre méthode peut être appliquée de manière similaire à l'étude d'autres animaux aquatiques en rapportant leurs signaux physiologiques des comportements exploratoires ou sociaux.

Introduction

Contexte. Expériences quantitatives sur le comportement animal (choix forcé, choc évitement, labyrinthe en T, etc.) Sont généralement utilisés pour enquêter sur des hypothèses spécifiques concernant les compétences sensori-motrices, l'apprentissage et la formation de la mémoire. Toutefois, ces expériences restrictives manquez beaucoup de la richesse du comportement animal naturel et sont susceptibles d'entraîner des modèles simplistes de la base neurale sous-jacente du comportement. Expériences dans des conditions plus naturalistes sont donc un complément important par lequel nous pouvons explorer plus à fond un répertoire comportemental de l'espèce. Expériences impliquant des animaux se déplaçant librement doivent, toutefois, de relever les défis techniques uniques tels que des artefacts d'enregistrement induite mouvement. Contrairement réponses de relance évoqués, survenant spontanément un comportement exploratoire ne peut pas être prédit, donc sujets expérimentaux doivent être constamment surveillés et suivis sur une période de temps prolongée. Questions de recherche spécifiques can être mieux traitée par les organismes soigneusement sélectionnés et des outils techniques disponibles. Par exemple, les techniques d'enregistrement et de stimulation optiques tels que des capteurs de calcium génétiquement codés et une optogenetics 2 ont été appliqués avec succès à des organismes modèles génétiques déplacer librement 3-5. Alternativement, les systèmes de télémesure de neurones miniaturisés peuvent enregistrer et stimuler déplacer librement petits animaux 6,7.

Poissons électriques. WEF espèces produisent des décharges électriques d'organes (de DOE), qui leur permettent de sentir leur environnement immédiat ou de communiquer sur de grandes distances. Les tendances temporelles de DOE varient dans des conditions différentes telles que l'auto-mouvements, 8,9 stimuli sensoriels 10,11 et 12,13 interactions sociales. WEF espèces de type à impulsions produisent un train d'impulsions discrètes, par opposition espèces de type à onde qui génèrent des formes d'onde quasi-sinusoïdale continue. En général, de type impulsion exposition des espèces more taux d'EOD variables par rapport à l'espèce type d'onde, et les taux de NEM des animaux reflètent fidèlement le contenu de nouveauté de leur environnement sensorielles 10,14. espèces de type Pulse peuvent immédiatement réduire l'intervalle entre les impulsions (IPI) dans un cycle d'impulsion unique dans répondent à une perturbation sensorielle roman (réponse nouveauté 10,11,14). Le comportement électrique continue de ces poissons peut être perturbée par des stimuli sensoriels non contrôlés provenant de sources externes, et différents types de stimuli tels que les vibrations, le son, l'électricité et la lumière sont les réponses de nouveauté de déclenchement connu. Par conséquent, des précautions particulières doivent être prises pour empêcher ou atténuer les stimuli sensoriels externes lors d'une observation à long terme de la nage libre WEF. De cette façon, les changements de taux d'EOD et trajectoires de mouvement peuvent être spécifiquement attribués à des stimuli présentés par l'expérimentateur.

Réservoir d'aquarium et de la chambre d'isolement. Nous avons donc passé plusieurs couches de matériaux absorbant les vibrations under un grand aquarium (2,1 mx 2,1 mx 0,3 m), et le réservoir entouré d'une enceinte isolée de bloquer les sources de lumière externes, le bruit électrique, le son et le flux de chaleur. EOD taux dépend de la température ambiante 15,16, donc la température de l'eau a été strictement réglementée dans une plage tropicale (25 ± 1 ° C) pour les espèces d'Amérique du Sud WEF. Nous avons construit un grand et profond réservoir (10 cm de profondeur) à observer des comportements exploratoires spatiales de WEF essentiellement restreintes à deux dimensions (figure 1A). Le réservoir a été divisée en une arène centrale à observer des comportements spatiaux, et quatre compartiments de coin pour loger séparément chaque poisson (figure 1B). Chaque compartiment étanche à l'eau a été construit pour empêcher la communication électrique entre les individus. L'accès des animaux à l'arène centrale a été contrôlée de l'extérieur par quatre portes motorisées. Les portes ont été placées entre les compartiments, et ils sont devenus étanche lorsqu'il est verrouillépar nylon ailes noix. Pas de pièces métalliques ont été utilisés sous l'eau depuis WEF réagir avec sensibilité aux métaux.

Enregistrement EOD. DOE sont générés de manière stéréotypée par activation de simple (dans Mormyrids) ou plusieurs organes électriques répartis dans l'espace (dans Gymnotiforms) 17,18. Modulations temporelles de la fréquence EOD peuvent révéler activités neuronales plus haut niveau, depuis le stimulateur médullaire reçoit des entrées de neurones directs des régions supérieures du cerveau comme le noyau de prepacemaker diencéphaliques, qui à son tour reçoit des projections axonales du cerveau antérieur 19. Toutefois, le moment EOD doit être extrait avec précaution d'un enregistrement de forme d'onde brute et non biaisée par les distorsions induites par le mouvement-de l'animal. Le champ électrique généré par une FEM peut être approximée comme un dipôle, ainsi NEM impulsions amplitudes à des électrodes d'enregistrement sont fonction des distances et des orientations relatives entre l'animal et les électrodes de 8,20. Auto-mouvem de l'animalents modifient la géométrie relative entre l'animal et les électrodes, ce qui provoquent des mouvements dans des amplitudes de NEM différentes électrodes pour faire varier au cours du temps d'une manière volatile (voir la figure 2B en juin et al. 8). De plus, des auto-mouvements modifient également la forme de formes d'onde enregistrées NEM, parce que les contributions relatives de jeu différent des organes électriques dépendent de leurs emplacements le long de la longueur du corps et leurs courbures locales introduites par pliage queue. Les distorsions dans les amplitudes et les formes EOD induite mouvement-peuvent conduire à des mesures imprécises et non fiables synchronisation NEM. Nous avons surmonté ces problèmes en faisant la moyenne spatiale des signaux multiples NEM recensés sur différents sites, et en ajoutant un filtre d'extraction de l'enveloppe de déterminer avec précision le moment EOD d'un WEF nage libre. En outre, notre technique mesure également les amplitudes EOD, qui indiquent si un animal est au repos ou en mouvement activement sur la base du changement de l'EODamplitudes plus de temps (voir les figures 2E et 2F). Nous avons enregistré des signaux amplifiés différentielle des paires d'électrodes d'enregistrement pour réduire le bruit de mode commun. Depuis les impulsions EOD sont générées à des intervalles de temps irréguliers, le cas des séries chronologiques EOD ont un taux d'échantillonnage variable. La série temporelle EOD peut être converti en un taux d'échantillonnage constant par interpolation si nécessaire par un outil d'analyse de choix.

l'enregistrement de la vidéo. Bien que l'enregistrement EOD peut surveiller une activité de transport de brut d'un animal, l'enregistrement vidéo permet des mesures directes de corps la position et la posture de l'animal. Proche infrarouge (NIR) éclairage (λ = 800 ~ 900 nm) permet l'observation visuelle imperturbable de nager librement poissons 21,22, depuis WEFs sont les plus actifs dans l'obscurité et les yeux ne sont pas sensibles au spectre NIR 23,24. La plupart des capteurs d'imagerie numérique (par exemple CMOS ou CCD) peuvent capturer spectre NIR avec le wavelength comprise entre 800-900 nm, après la suppression d'un infrarouge (IR) filtre de blocage 25. Certains consommation de qualité webcams haut de gamme offrent haute définition, large angle de vision et une bonne sensibilité en faible luminosité, ce qui peut produire une qualité d'image comparable ou supérieure aux caméras infrarouges de qualité professionnelle disponibles à coûts beaucoup plus élevés. En outre, certains consommation de qualité webcams sont livrées avec un logiciel d'enregistrement qui permet une durée d'enregistrement prolongée par la compression vidéo sans perte de qualité. La plupart des appareils de qualité professionnelle offrent synchronisation TTL sorties d'impulsions de temps ou entrées d'impulsions de déclenchement TTL 26 pour aligner la synchronisation entre la vidéo avec les signaux numérisés, mais cette fonction est généralement absent dans consommation de qualité webcams. Toutefois, la synchronisation entre un enregistrement vidéo et un convertisseur analogique-numérique du signal peut être adaptée avec précision en capturant simultanément une LED IR clignoter périodiquement avec la caméra et le convertisseur analogique-numérique du signal. La synchronisation initiale et finale impulsion IR peut être utilisé uns deux marqueurs de calibrage de temps pour convertir le nombre de trames vidéo à l'unité de temps signal de convertisseur analogique-numérique et inversement.

Éclairage et arrière-plan. Capture d'image dans l'eau peut être techniquement difficile en raison de réflexions de la lumière à la surface de l'eau. La surface de l'eau peut agir comme un miroir pour refléter une scène visuelle au-dessus de l'eau et des fonctionnalités visuelles obscurs sous-marine; ainsi la scène ci-dessus de l'eau doit être rendue sans relief pour prévenir toute interférence visuelle. Afin d'image de l'ensemble de l'aquarium, une caméra doit être placé au dessus de l'eau, et il doit être caché derrière le plafond au-dessus d'un petit trou d'observation pour éviter sa réflexion sur la surface de l'eau. En outre, la surface de l'eau peut produire des éclats et éclairage non uniforme si les sources lumineuses sont projetées de manière incorrecte. Éclairage indirect peut obtenir une luminosité uniforme sur toute aquarium en visant les sources de lumière vers le plafond, de telle sorte que le plafond et le wal environnantels peuvent réfléchir et diffuser les rayons de lumière avant d'atteindre la surface de l'eau. Choisir un illuminateur infrarouge qui correspond à une réponse spectrale de l'appareil (par exemple 850 nm longueur d'onde maximale). Le bruit électrique provenant des sources de lumière peut être minimisé en utilisant des lumières LED et de placer leurs alimentations en courant continu à l'extérieur de la cage de Faraday. Placez un fond blanc sous le réservoir, car les poissons contraste bien dans un fond blanc à des longueurs d'onde NIR. De même, l'utilisation de mat de couleur blanche sur les surfaces intérieures de la chambre d'isolation fournit uniforme et brillant éclairage de fond.

suivi de la vidéo. Après un enregistrement vidéo, un algorithme de suivi automatique des images peut mesurer les positions et les postures du corps de l'animal au fil du temps. Le suivi de la vidéo peut être effectuée automatiquement par le logiciel soit prêt à l'emploi (Point de vue ou Ethovision), ou un logiciel programmable par l'utilisateur (OpenCV ou MATLAB Traitement de l'image boîte à outils). En tant que première étape de poursuite d'image,une zone de suivi valide doit être défini par le dessin d'une forme géométrique d'exclure la zone à l'extérieur (opération de masquage). Ensuite, l'image d'un animal doit être isolé à partir de l'arrière-plan en soustrayant une image de fond à partir d'une image contenant l'animal. L'image soustraite est converti en un format binaire en appliquant un seuil d'intensité, de telle sorte que le centre de gravité et l'axe d'orientation peuvent être calculées à partir des opérations morphologiques binaires. Dans Gymnotiforms 27-29 et 30-32 Mormyrids, la densité de électrorécepteur est la plus haute à proximité de la région de la tête; ainsi la position de la tête à tout moment, indique un emplacement de la plus haute acuité sensorielle. Les emplacements de tête et de queue peuvent être automatiquement déterminées en appliquant les opérations de rotation d'image et sélection-box. Les extrémités de tête et de queue peuvent être distingués les uns des autres en les définissant manuellement dans la première image, et en gardant la trace de leurs emplacements de la comparaison de deux trames successives.

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Protocol

Cette procédure est conforme aux exigences de l'Université Comité de protection des animaux d'Ottawa. Aucun conflit d'intérêts est déclaré. S'il vous plaît se référer à la table des matières et des réactifs pour les marques et modèles de l'équipement et des matériaux énumérés ci-dessous. Personnalisé écrites Spike2 et MATLAB son, un échantillon de données sont fournies dans le fichier supplémentaire.

Une. Configuration Tank Aquarium et isolement Chambre

  1. Anti-v-de-chaussée de libration. Construire une surface anti-vibration (2,1 mx 2,1 m) en empilant des coussinets en caoutchouc, mousse de polystyrène acoustique, panneau de contreplaqué marine, et des tapis de mousse de polyuréthane à partir du bas vers le haut (figure 1A). Disposez quatre poteaux en bois (5 cm x 10 cm) sur le panneau de contreplaqué pour soutenir les bords de l'aquarium.
  2. chauffage au sol. Posez un élément chauffant blindé électriquement sur ​​thermiquement classés rembourrage en mousse (voir figure 1D bas). Couvrir l'élément chauffant avec un métallic mesh pour le blindage électrique.
  3. Réservoir spatiale. Construire un aquarium large et peu profonde (1,8 mx 1,8 mx 30 cm) à l'aide de 1,3 cm d'épaisseur des panneaux de verre trempé, cadre en aluminium en forme de L et silicone aquarium de qualité (voir la figure 1A). Couvrir la face inférieure de la cuve avec une grande feuille de fond blanc de fournir un contraste élevé d'imagerie (voir Protocole 3).
  4. Diviser le réservoir d'aquarium dans une arène centrale (1,5 m de diamètre) et quatre compartiments de coin (voir la figure 1B) par des parois de l'installation (22,5 cm de hauteur) en feuilles d'acrylique (mat blanc, 0,64 cm d'épaisseur).
    1. Bend quatre feuilles acryliques (22,5 cm x 102,7 cm) par application de chaleur pour créer quatre sections de murs courbes, et les attacher au fond de la cuve à l'aide calfeutrage en silicone pour séparer la scène centrale des quatre compartiments de coin. Laissez 20 cm d'espace entre les sections incurvées pour l'installation de la porte.
    2. Séparez les compartiments de coin voisine en installant quatre murs doubles wie 15 cm lacunes, qui fournissent l'isolement et lieux électrique supplémentaire pour les capteurs sous-marins comme un hydrophone.
  5. Assemblez quatre portails motorisés, et les installer entre les compartiments de coin et la scène centrale.
    1. Assembler quatre cadres de porte comme le montre la figure 1C. Créer six puits (0,64 cm de profondeur) sur chaque cadre de porte, incorporer écrous borgnes de nylon (fil de 0,64 cm de diamètre) et les fixer avec de l'époxy.
    2. Couper quatre panneaux de porte en acrylique et feuilles de caoutchouc, et de créer six trous (0,64 cm de diamètre) sur l'acrylique et les panneaux en caoutchouc pour le mécanisme de verrouillage. Joignez-vous à l'acrylique et les panneaux de caoutchouc à l'aide de pâte silicone.
    3. Installez acrylique charnières à rejoindre les panneaux de porte avec les cadres de porte.
    4. Mont bras oscillants sur servomoteurs, et les installer sur le dessus des cadres de porte (voir figure 1C). Faire des boucles avec des colliers pour relier les bras oscillants pour les panneaux de porte.
    5. Placez les ensembles de porte sur la gaps créée entre les sections de murs courbes, et fixez-les à l'aide de pâte silicone.
    6. Connecter tous les servomoteurs à un contrôleur de servo, et le connecter à une source d'alimentation et un ordinateur via un câble d'extension USB actif. Tester les grilles de commande en utilisant un logiciel fourni avec le contrôleur d'asservissement.
    7. Après le silicone durcit, vérifier l'étanchéité en verrouillant toutes les portes avec des vis en nylon et en remplissant un compartiment à la fois.
  6. chambre d'isolement. Construire une chambre d'isolement pour entourer l'aquarium et de bloquer les sources externes de lumière, le son et le bruit électrique (voir figure 1D).
    1. Faire trois panneaux muraux (2 mx 2 mx 5 cm) et quatre panneaux de porte (1,9 mx 0,95 mx 5 cm). Pour chaque panneau, rejoindre moulures d'aluminium (5 cm x 2,5 cm) pour créer un cadre rectangulaire et riveter un panneau de plastique ondulé blanc sur le cadre en aluminium. Remplissez nattes de fibre de verre dans les panneaux acoustiques, et à proximité d'un panneau de plastique ondulé noir.
    2. Installer trois panneaux muraux sur le plancher anti-vibration, et installer les charnières à piano de joindre les quatre panneaux de portes sur les panneaux muraux.
    3. Entourer la chambre d'isolation avec des mailles en aluminium, et la masse en prise de tous les côtés pour créer une cage de Faraday.
  7. Contrôle de l'humidité. Installez un ventilateur d'extraction à faible bruit (figure 1F haut) afin d'éliminer l'excès d'humidité accumulation de chauffage. Placer le ventilateur d'extraction d'au moins 2 m à une distance à partir du site d'enregistrement, et d'installer un conduit d'air entre la chambre d'isolement et le ventilateur d'extraction.
  8. Surveiller régulièrement et maintenir les conditions de l'eau du réservoir et des animaux.
    1. Maintenir des conditions d'eau constants à 10 cm de profondeur, à 100 uS / cm conductivité et pH 7,0 par addition d'eau ou d'une solution de sel d'actions (voir Knudsen 33 pour la recette). Ajouter un sac de corail écrasé si le pH chute en dessous de 6,5.
    2. Installer des filtres d'aquarium verticales qui peuvent fonctionner à partir de l'eau peu profonde pour le nettoyage etfins d'aération (1F de fond de la figure). Débranchez les filtres et les sortir de l'arène centrale pendant les sessions d'enregistrement.
    3. Livrer les vers de farine vivants sur le fond de la cuve en les attachant sur ventouses avec des élastiques. Évitez proies flottantes telles que blackworms pour empêcher l'alimentation incontrôlée des proies errants pendant l'enregistrement.

2. Suivi EOD

  1. l'installation des électrodes. Assembler huit électrodes de graphite et un espace entre eux aussi sur la paroi courbe de la scène centrale.
    1. Obtenir dessin pistes (15 cm de longueur; Mars carbone 2 mm type HB) et raser le revêtement extérieur des pistes.
    2. Couper huit 10 cm segments de câble coaxial (RG-174), envelopper l'âme du câble autour d'une extrémité des barres de graphite, et appliquer gaine thermorétractable sur eux pour la connexion électrique solide et stable. Fixez BNC connecteurs jack sur les extrémités opposées (figure 2A de gauche). </ Li>
    3. Placer les électrodes sur le mur par du ruban adhésif, et d'appliquer de fines bandes de ruban de masquage sur la surface des électrodes à l'abri de silicone. Appliquer un joint silicone de tenir en permanence les électrodes, et enlever le ruban adhésif avant le durcissement du silicone (Figure 2A droite).
  2. Construire huit ensembles de câbles en mesurant la distance entre chaque électrode de l'unité d'amplification, et la coupe des câbles coaxiaux (RG-54) dans des longueurs. Attacher des connecteurs BNC sur les deux extrémités des câbles.
  3. Utilisez les assemblages de câbles à raccorder toutes les électrodes à l'amplificateur. Amplifier de façon différentielle en jumelant deux électrodes orientées à 90 ° (voir figure 2B), et la terre tous les fils de blindage coaxiaux en les reliant à la cage de Faraday.
  4. Régler le gain de l'amplificateur au-dessous de la limite de saturation de signal, et à appliquer un filtre passe-bande (200 Hz-5 kHz) pour supprimer le bruit. Numériser les quatre paires d'électrodes d'enregistrement à 40 kS / s.
  5. En lignele traitement du signal. Les instructions sont écrites pour le logiciel Spike2, et les paramètres sont optimisés pour Gymnotus sp. (Voir la figure 2C pour le résumé).
    1. Ajouter un DC supprimer processus (τ = 0,1 sec) pour tous les canaux d'enregistrement.
    2. Ajouter un processus rectifier pour tous les canaux de enregistrements.
    3. Créer un canal virtuel en additionnant les quatre canaux d'enregistrement.
    4. Extrait d'une enveloppe unimodale par EOD impulsion en ajoutant RMS (root-mean-squared, ) Procédé (τ = 0,25 ms) pour le canal virtuel, destiné à générer un pic unique par cycle de NEM pour déterminer sans ambiguïté l'impulsion de synchronisation.
    5. Créer un canal de RealMark du canal virtuel et enregistrer le temps et les valeurs des amplitudes de pointe, après la fixation d'un seuil approprié pour capturer tous EOD impulsions wiThoout manque une impulsion, tout en évitant les faux positifs.
    6. Surveiller le taux d'EOD instantanée en temps réel en activant l'option d'affichage de canal du canal de RealMark à un mode de fréquence instantanée.
    7. Surveiller le mouvement du poisson en temps réel par la duplication du canal de RealMark, et réglez l'option d'affichage pour un mode de forme d'onde.
    8. Quantifier un niveau d'activité des RMS de l'amplitude pente EOD par la création d'un canal virtuel du canal de RealMark (période d'échantillonnage de 0,01 s), et ajouter pente (τ = 0,25 ms) et RMS (τ = 0,5 ms) processus.
    9. Exporter le canal de RealMark dans le logiciel Spike2 au format MATLAB.

3. Suivi de la vidéo synchronisée

  1. Créer une scène de fond.
    1. Masquer tout objet qui jette une réflexion sur la surface de l'eau en couvrant avec film mat de comptoir blanc.
    2. Installer un blanc matPanneau en plastique ondulé 15 cm au-dessous du plafond pour cacher la caméra et la mise à l'air.
    3. Imprimer des motifs de grille sur une grande feuille de papier blanc pour l'étalonnage d'un appareil photo, et le poser sous le réservoir pour fournir un fond à contraste élevé.
  2. Installez les sources de lumière.
    1. Obtenir des lumières LED IR et, retirez ventilateurs intégrés pour réduire le bruit. Conduisez la LED avec une alimentation en courant continu à courant régulé placé à l'extérieur de la cage de Faraday.
    2. Installer des lumières pour l'imagerie dans l'obscurité, et des lumières blanches LED pour la conduite d'un cycle de lumière diurne dans les poissons d'essai LED IR. Direct toutes les sources lumineuses vers le plafond de réaliser un éclairage indirect et uniforme (figure 3A).
    3. Réguler le cycle de la lumière diurne en entraînant le blanc des lumières LED avec une minuterie contrôlée (par exemple 12 heures on/12 h off).
  3. Installer une caméra au dessus de l'aquarium.
    1. Obtenir une caméra NIR sensible, ou supprimer un blocage filte IRr par la rupture d'une fine feuille de verre teinté à l'arrière de l'ensemble de l'objectif. Assurez-vous que l'angle de vision est assez large à l'image de l'ensemble du domaine central.
    2. Faites un petit trou d'observation dans le milieu du panneau de plafond, et placer la caméra directement au-dessus du trou.
    3. Installez un anneau de garde blanc autour de l'objectif si les sources de lumière génèrent éclats.
  4. Faire un enregistrement vidéo synchronisée.
    1. Passer une LED IR à l'un des quatre coins de réservoir pour générer des impulsions de synchronisation de temps (1 d'une durée de ms, 10 sec de la période). Ajouter une résistance de limitation de charge (1 kohm) en série, et conduire la LED IR à partir d'un port de sortie numérique du matériel de numérisation.
    2. Utilisez le logiciel d'enregistrement vidéo fourni avec l'appareil photo, si disponible. Sélectionnez la meilleure qualité d'enregistrement (par exemple de compression sans perte) et les plus hautes résolutions prises en charge.
    3. Lancer l'enregistrement vidéo juste avant de commencer l'enregistrement EOD, et arrêter le immédiate d'enregistrement vidéoimmédiatement après l'enregistrement EOD.
    4. Après l'enregistrement, convertir les numéros de trames d'image à l'unité de temps du convertisseur analogique-numérique en interpolant linéairement entre la première et la dernière des impulsions lumineuses captées par le convertisseur analogique-numérique du signal et de l'enregistrement vidéo.
  5. Suivi automatisé des images
    Les instructions sont écrites pour le MATLAB de traitement de l'image boîte à outils, et de faire usage de ses fonctions. Un script MATLAB personnalisé est fourni avec cet argument pour automatisé de suivi de l'image.
    1. Importer de la vidéo. Importation d'un fichier d'enregistrement vidéo directement à l'espace de travail MATLAB en utilisant "Videoreader. Lu" la fonction.
    2. Créer une image de fond composite en combinant deux trames d'image. Remplacer la région de l'image occupée par un animal avec une image non occupée de la même région d'une autre trame (voir la figure 3B).
    3. Spécifiez une région de l'image à suivre en traçant un masque circulaire autour de l'arène centrale d'exclure l'unrea l'extérieur (figure 3B bas), et multiplier par une constante (r int) de fixer un seuil minimum de la différence d'intensité. Par exemple, la mise en rimer = 0,85 supprimera les fluctuations d'intensité de 15% = (1 - r int) en dessous du fond.
    4. soustraction de l'image. Soustraire une trame d'image (IM = k) de l'image de fond (= IM 0) pour obtenir l'image de différence (= ΔIM k). Utilisation entier non signé de la précision numérique pour stocker les valeurs d'intensité d'image comme des entiers non négatifs.
    5. Segmenter l'image de différence en appliquant un seuil d'intensité déterminée à partir de la fonction de graythresh. Nettoyez l'image binaire en utilisant la fonction de bwmorph, et ​​choisir le plus grand blob correspondant à un animal après avoir calculé tous les domaines de blob en utilisant la fonction regionprops.
    6. Déterminer le centre de gravité et une orientation majeurexis du plus grand blob en appliquant la fonction de regionprops, et faire pivoter l'image à aligner l'axe majeur de l'axe des x. Diviser l'image de la tête et de la queue parties au centre de gravité (figure 3D haut).
    7. Déterminer le grand axe de la partie de tête, et faire tourner l'ensemble de l'image pour l'aligner sur l'axe des x (figure 3D en bas à gauche). Monter la limite boîtes autour de la tête et des parties de la queue parallèles à leurs axes principaux en utilisant la fonction regionprops.
    8. Déterminer les coordonnées y médianes du blob à gauche, au centre et les bords verticaux à droite des boîtes englobantes (points verts dans le fond figure 3D), et les affecter à cinq points caractéristiques (tête-pointe, mi-tête, à mi-corps , mi-queue, bout de la queue).
    9. Traiter les trames successives après rognage d'une trame d'image centrée au centre de gravité de l'animal déterminée à partir de son image précédente.
    10. Attribuer manuellement l'orientation de la tête de la première image, et utiliser un betwe produit scalaireen les vecteurs d'orientation de deux trames successives pour déterminer automatiquement l'orientation de la tête. Inspectez le résultat, et retourner manuellement l'orientation de la tête si mal attribué.
  6. Tracer une trajectoire animal en se joignant à la tête-conseils, et lisser à l'aide médiane et filtres moyennes (n = 3) si elle a un aspect nerveux. Superposer la trajectoire avec une image de fond, et interpoler médianes de poissons en utilisant les cinq points caractéristiques (voir figure 2E).
  7. Calculer le taux d'EOD moyenne à chaque moment de la capture d'image par rééchantillonnage le taux d'EOD instantanée (100 de fréquence d'échantillonnage Hz) et moyenne (fenêtre de temps 0,0625 sec). Tracer la trajectoire en pseudo-couleurs déterminées à partir du taux EOD apparié dans le temps, et superposer à une image d'arrière-plan (voir la figure 2F).

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Representative Results

Les résultats du suivi EOD

Les formes d'onde enregistrées EOD de différentes paires d'électrodes modifiées en amplitudes et de formes comme prévu à partir de leurs positions uniques et orientations (figure 2C haut). L'utilisation de plusieurs paires d'électrodes assure la réception du signal fort à toutes les positions et orientations des WEF possibles dans le réservoir. La forme d'onde d'enveloppe (figure 2C bas, trace verte) contient toujours un pic unique par cycle EOD, qui a servi de marqueur de temps fiable pour déterminer précisément les intervalles entre les impulsions et le taux d'EOD instantanée (IPI = -1). Les pics de NEM successives ont été rejoints et interpolées linéairement à des intervalles de temps constants (figure 2D de haut, trace noire), et le taux d'EOD instantanée a été similaire interpolées à des intervalles de temps constants (de fond figure 2D, oligo-rose). La procédure de ré-échantillonnage à temps constant facilite la synchronisation de l'heure soitentre la trajectoire de mouvement et le signal EOD, et permet de tirer parti d'un plus grand nombre d'outils d'analyse des données de séries chronologiques constamment échantillonnés. Les amplitudes EOD enregistrées au niveau des électrodes externes sont restés constants pendant un animal était au repos (figure 2E dessus), mais il varie au fil du temps alors que l'animal déplacé à cause de changement de l'emplacement et l'orientation dipolaire (figure 2F haut). Ainsi, le mouvement du poisson pourrait être déduit de l'observation du changement d'amplitudes EOD au fil du temps. Le taux d'EOD de base est restée faible tandis que le poisson était au repos (figure 2E bas), mais le taux d'EOD est devenu nettement plus élevé alors que le poisson nage active (figure 2F haut). Notre observation est cohérente avec la corrélation positive entre le taux EOD et le déplacement des poissons comme indiqué précédemment 8,9,34,35.

les résultats du suivi de la vidéo

La trajectoire et médianes de l'animal sont présentés sur la figure ure 3E avec les première et dernière trames d'image superposée. L'évolution temporelle de changement de posture a été capturé tandis que le poisson a été brusquement tourne pendant deux secondes, et les lignes médianes de poissons sont tracées toutes les 200 ms. La ligne médiane du poisson correctement démarré à la tête pointe et terminé à l'extrémité de la queue de poisson. Les images de poissons près convenus avec les lignes médianes suivi automatiquement malgré les ombres moulées par l'animal. Figure 3F illustre le taux de variation temporelle moyenne EOD (τ = 0,0625 sec) en couleur, qui se superpose avec la trajectoire de temps assortie de la tête de poisson pointe. Au cours de la durée de rotation de deux secondes, le taux de NEM moyenne a atteint son apogée pendant que l'animal était au milieu de la phase de rotation, et la vitesse a diminué à la fin de la rotation. Ce résultat illustre représentant que notre méthode peut être appliquée avec succès pour étudier la relation entre les mouvements d'auto-guidée et la modulation du taux EOD pendant la nage libre.

t "fo: keep-together.within page =" always "> Figure 1
Figure 1. Installation de réservoir et la chambre d'isolement Aquarium. A) La chambre expérimentale se compose d'un plancher anti-vibration, aquarium, et une chambre d'isolement. B) L'aquarium a été divisée dans l'arène centrale pour mener des expériences, et de quatre compartiments de coin pour l'habitat individuel poissons. Chaque compartiment étanche à l'eau a été construit pour empêcher la communication électrique entre les animaux. C) Le portail motorisé est illustrée à plusieurs angles de perspective. La porte est étanche à l'eau lorsqu'il est verrouillé par six écrous à oreilles qui compriment le joint en caoutchouc (la feuille brun clair). Une fois déverrouillé, le portail peut être actionné à distance par le servo-moteur sur la partie supérieure. D) La chambre d'isolement a été assemblé en reliant trois wtous les panneaux et quatre panneaux de porte, qui donnent accès à la cuve d'aquarium par deux côtés. Le panneau du bas montre les rails en bois pour soutenir les bords de réservoir, et le placement sol chauffant. Une couche de maille d'aluminium recouvre le dispositif de chauffage pour protéger son bruit électrique. E) Les murs et les panneaux de porte de la chambre d'isolement ont été construits à partir de cadres en aluminium pour un support structural (3). Les surfaces intérieures de la chambre sont recouvertes par des panneaux en plastique blanc (5) pour tenir compte de sources de lumière intérieures, et les extérieurs sont recouverts par des panneaux en plastique noir (2) pour bloquer des sources de lumière externes. Une maille d'aluminium (1) couvre les murs extérieurs pour bloquer le bruit électrique externe. Le mur est rempli de matelas en fibre de verre acoustique (4) F) La photo du haut montre la configuration de ventilation d'air pour éliminer l'excès d'humidité générée par le chauffage;. Et la photo du bas montre la configuration de la filtration de l'eau pour le nettoyage, la diffusion et l'aération du réservoir d'eau entre expérimentalséances. Cliquez ici pour agrandir l'image .

Figure 2
Figure 2. Configuration de l'enregistrement EOD et des résultats représentatifs. A) Le panneau de gauche montre l'ensemble d'électrode constitué d'une fine électrode en graphite, un court segment de câble coaxial, et un Jack BNC. Le panneau de droite montre les instructions de fixation d'électrodes. Le ruban de masquage est utilisé pour positionner temporairement l'ensemble d'électrodes, et le calfeutrage de silicone a été appliqué pour tenir en permanence l'électrode. B) Le schéma de câblage. Deux électrodes 90 ° orientés sont jumelés, différentiel amplifié et filtré. Quatre canaux d'enregistrement ont été numérisées à l'extérieur de la Faraday câge. C) Illustration des NEM étapes de traitement du signal. Les meilleurs traces montrent des formes d'onde premières de quatre électrodes paires, qui sont corrigées et additionnés pour produire la trace gris ci-dessous. Enveloppes unimodaux sont extraites de la forme d'onde de gris en utilisant le "Root-Mean-Square" (RMS) filtre (trace verte). Les amplitudes NEM et les APIs sont déterminées à partir des pics d'enveloppe. D) Les variables dans le temps EOD amplitudes (en haut) et le taux d'EOD instantanée (en bas) sont présentées sur une échelle de temps plus longue que C). Les amplitudes NEM et le taux instantané (= IPI -1) sont interpolées à des intervalles de temps réguliers en joignant les sommets de l'enveloppe (traces noires). E) Comme D) mais reportés sur une échelle de temps plus longue tandis que le poisson était au repos. F) Identique à E) tandis que le poisson nageait activement. Cliquez ici pour agrandir l'image .

Figure 3
Figure 3. configuration du suivi de la vidéo et des résultats représentatifs. A) La configuration de l'éclairage et de la caméra est illustré. L'infrarouge (IR) et les sources de lumière visible sont fixés sur les parois et pointés vers le plafond, de telle sorte que la surface du plafond réfléchit et diffuse la lumière pour projeter un éclairage uniforme sur tout le réservoir. L'appareil photo est caché au-dessus de la plaque de plafond pour empêcher la réflexion sur la surface de l'eau. Une DEL infrarouge est positionné à l'un des quatre coins de réservoir pour générer des impulsions de synchronisation de temps. B) Génération d'une image d'arrière-plan composite est illustrée. Deux cadres d'image (images) sur le dessus sont combinées pour former l'image d'arrière-plan composite (en bas à gauche) par le remplacement de la région contenant l'animal (de sortecouvercle carré rouge) avec la région sans que l'animal (en pointillé carré rouge). Zone à l'extérieur de l'arène centrale est masqué en noir (en bas à droite). C) Isoler le contour du poisson. Un cadre d'image (en haut à gauche) est soustraite de l'image d'arrière-plan (en haut à droite) afin de produire l'image de différence (en bas à gauche), et converti à l'image binaire (en bas à droite) par application d'un seuil d'intensité. D) Les mesures de la position du corps et la posture sont illustrés. L'image binaire de l'animal (blob) a été tourné pour aligner son axe avec l'axe des x (en haut à droite), et centré sur son centre de gravité. Le blob a été séparé de la tête (rouge) et la queue (bleu) parties, et chaque partie a été tourné séparément pour déterminer son cadre de sélection. Le blob a été orienté à la trame de l'animal de référence (en bas à gauche), et cinq points caractéristiques (tête-end, mi-tête, à mi-corps, mi-queue, queue de gamme) ont été déterminées à partir des milieux de la boîte de sélection bords. E) Time-lapse imâge des médianes de poissons tracé toutes les 200 ms. Les premières et dernières images d'images sont superposées au cours de la durée de rotation de 2 sec. F) Le taux d'EOD moyenne est représentée en pseudo-couleur et superposée avec la trajectoire de la tête du poisson. Les mêmes images sont utilisées que dans E). Cliquez ici pour agrandir l'image .

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Discussion

L'importance de nos techniques. En résumé, nous avons d'abord décrit la construction d'un grand aquarium et une chambre d'isolement à observer des comportements exploratoires spontanées produites par le WEF. Ensuite, nous avons démontré la technique de l'enregistrement et le suivi du taux EOD et les états de mouvement des poissons effrénée en temps réel en utilisant plusieurs paires d'électrodes. Enfin, nous avons décrit la technique infrarouge d'enregistrement vidéo par le biais de l'eau d'une manière synchronisée dans le temps, et l'algorithme de suivi d'image pour mesurer la position et la posture du corps. Comme une préparation expérimentale, WEF offre un avantage important pour l'enquête comportements sensoriels guidée actifs en démontrant taux d'EOD facilement quantifiables, ce qui équivaut au taux d'échantillonnage électrosensoriel active. La combinaison de ces techniques peut permettre l'observation à long terme précis et fiable des comportements spontanés 8 de effrénée WEF. En outre, la majorité de notre configuration peut être construit from largement disponibles matériaux de construction et des composants électroniques faciles à obtenir. Les techniques décrites ici ont été développés et testés pour répondre à nos besoins expérimentaux au cours des dernières années. Par conséquent, nous vous recommandons de ces techniques pour de futures études de comportements exploratoires spontanées de nage libre WEF.

chambre d'isolement. La chambre d'isolement offre des conditions expérimentales bien contrôlées par le blocage des sources extérieures de lumière, les vibrations, le son et le bruit électrique avec des degrés variables d'efficacité. Les performances de blocage de lumière a été testée en plaçant un appareil motorisé à l'intérieur de la chambre d'isolement foncé, et aucune fuite de lumière externe a été observée à partir de l'appareil après le balayage en utilisant tous les endroits de contrôle à distance de la cuvette. La surface d'amortissement de vibrations installé sous la cuve munie d'atténuation des vibrations externes acheminés à partir du plancher, et l'empilage de plusieurs couches de caoutchouc et de la mousse était la plus efficace pour bloquerles événements externes de vibration. Cependant, les événements de vibrations intermittentes telles que la fermeture de la porte fort à des endroits proches ont fait déclencher des réponses de nouveauté dans de rares occasions. Bien que d'une table de air anti-vibration pourrait offrir des performances d'isolation supérieure des vibrations de fond, il serait trop coûteux d'acheter une table de air assez grand pour notre aquarium. Par conséquent, nous avons placé un sous-marin d'hydrophones pour détecter et exclure des événements lorsque de grandes vibrations externes déclenchés réponses nouveauté. Pour réduire davantage l'influence du bruit à l'extérieur du laboratoire, nos expériences ont été menées pendant les heures creuses (après 18 heures). De même, le bruit acoustique dans l'air extérieur a été atténuée par l'intermédiaire des parois de la chambre d'isolation en fibre de verre remplies de matelas isolant. Même si nous n'avons pas de quantifier objectivement les performances d'atténuation acoustique, plus de bruit de fond dans un environnement de laboratoire n'ont pas déclencher les réponses nouveauté. En de rares occasions, un bruit fort et soudain de la détente à l'extérieured une réponse de nouveauté, mais un tel événement a été détecté par l'enregistrement d'hydrophones, et ils sont rarement survenus durant les heures creuses. L'aquarium a fourni suffisamment grand pour nos animaux de nager librement et explorer. La taille du réservoir a été choisi en fonction de la durée des espèces, nous avons utilisé (jusqu'à 30 cm), mais la taille du réservoir peut être réduite si les petits animaux ont été utilisés. Nous avons choisi Gymnotus sp. entre les différentes espèces de type pulsé pour leur grande taille du crâne pour faciliter les enregistrements électrophysiologiques pendant nage libre 36. La qualité de l'enregistrement électrique peut améliorer d'utiliser des maillages de cuivre les plus coûteux, et protégeant le ventilateur d'extraction utilisée pour le contrôle de l'humidité.

Technique de mesure EOD. Notre technique enregistrement EOD multicanal autorisée mesure EOD synchronisation précise et fiables natation librement poissons. Grâce à notre technique, toutes les impulsions générées par NEM nager librement WEF ont été détectées sans manquer ou en ajoutant un péchégle impulsion pour une longue durée d'enregistrement de six heures (voir la figure 12 à Jun et al. 8). Les mesures d'enregistrement NEM, non seulement le taux EOD, mais aussi le niveau de la durée de l'activité variant EOD amplitudes maximales enregistrées au niveau des électrodes externes. Les amplitudes enregistrées de NEM sont déterminées par la géométrie relative entre l'animal et les électrodes d'enregistrement, ainsi les mouvements des animaux induisent des changements dans l'amplitude de NEM (Figure 2F). Le niveau d'activité a été calculée à partir de la variabilité (RMS) de l'amplitude pente EOD dans une fenêtre mobile (0,5 sec). En utilisant cette méthode, l'enregistrement vidéo ne serait pas nécessaire pour mesurer le niveau d'activité sur une longue période de temps, et le seul enregistrement EOD peut être suffire. Au lieu d'utiliser un enregistrement vidéo, la position et la posture du corps du WEF peuvent être déduites à partir de la seule EOD enregistrement sur la base des emplacements des électrodes, la géométrie d'un réservoir, et un modèle théorique d'un dipôle de courant. L'utilisation d'un recordi similaireconfiguration ng, Jun et al. 20 ont proposé une méthode de suivi électrique en temps réel pour le suivi de plusieurs WEFs en présence d'un objet, qui compare les intensités de signal mesurées à plusieurs paires d'électrodes d'enregistrement avec des entrées de table de consultation contenant des intensités de signaux prévus au connues emplacements de dipôle de courant. La méthode de suivi électrique offre une meilleure fiabilité de suivi dans un environnement visuellement encombré où les animaux souvent empêchés de se voir, ou pendant le suivi de plusieurs animaux. Habitats naturalistes de WEF contiennent de nombreux obstacles visuels tels que les plantes aquatiques et les racines, où la méthode de suivi électrique pourrait fournir un suivi plus fiable avec les exigences d'installation plus simples que le suivi visuel. En principe, notre méthode est directement applicable à l'espèce WEF type de vague après la modification des constantes de temps de filtre. L'étape de rectification introduira deux modes par cycle EOD, depuis la forme d'onde EOD est approximativement sinusoïdale en espèces de type onde. Dans ce cas,, Le taux de EOD instantanée peut être déterminée en sautant tous les autres marqueurs de temps EOD d'ignorer la phase de EOD négative. WEF peut détecter les électrodes d'enregistrement quand ils nagent à proximité ainsi nous éviter l'utilisation de grandes ou électrodes métalliques qui peuvent être détectées de plus loin 37, et à la place utilisée minces électrodes de graphite (de 2 mm de diamètre). Plus minces câbles coaxiaux (RG-174) ont été utilisés avec les ensembles d'électrodes pour la flexibilité, mais plus épais câbles coaxiaux (RG-54) ont été utilisés pour le câblage sur de longues distances pour blindage électrique supérieure. Plus longue durée d'enregistrement EOD peut être réalisé en réduisant le taux d'échantillonnage, mais à une résolution temporelle inférieure comme un compromis. La moyenne et la variabilité du taux EOD varie entre les espèces, ainsi la fenêtre de temps de lissage du taux d'EOD instantanée doit être ajustée de manière appropriée. Une fenêtre de temps plus courte est recommandée pour les espèces ayant une moyenne plus courte et plus petite dans la variabilité APIs (par exemple Gymnotiforms), et un plus long temps de window est recommandé pour les espèces ayant plus moyenne et une plus grande variabilité dans l'IPI (par exemple Mormyrids).

L'éclairage et l'installation de la caméra. Les enregistrements vidéo fournissent des observations quantitatives et qualitatives de comportement, et ici nous avons décrit les procédures pour la mise en place, l'enregistrement et le traitement des données d'image. installation d'éclairage joue un rôle important dans la production d'images de haute qualité, et l'angle de projection de lumière est un facteur important pour l'imagerie des animaux sous-marins. Dans des conditions d'éclairage non optimales, la surface de l'eau peut former des regards et des réflexions qui peuvent interférer avec le suivi d'image notamment lorsque les animaux génèrent des ondes de surface. Les problèmes d'éblouissement et de réflexion peuvent être éliminés par des sources de lumière faisant saillie à partir du fond d'un réservoir. Pour un petit réservoir, des tableaux de LED peuvent être placés directement sous le réservoir et brillent à travers un panneau de diffuseur pour générer uniforme intensité de la lumière 38. De même, pour un plus grand réservoir, une source de lumière cun être placé en dessous du réservoir, et l'intensité de lumière uniforme peut être obtenue en permettant à une distance suffisante pour que la lumière diffuse 39. Dans notre configuration, nous étions obligés de projeter la lumière au-dessus du réservoir en raison de contraintes d'espace, la stabilité structurelle, et la mise en place du dispositif de chauffage sous le réservoir. Nous avons évité les problèmes d'éblouissement et de réflexion en utilisant un éclairage indirect, telles que les sources lumineuses ont été projetées vers le plafond. En rendant la partie supérieure de la chambre de blanc uniforme et mat, pas de reflets étaient visibles sur la surface de l'eau. À l'image de l'ensemble de la sphère centrale, un objectif grand angle peut être monté sur l'appareil, mais certaines lentilles (lentilles fish-eye) peuvent provoquer une distorsion en barillet importante. La distorsion en barillet peut être corrigée en utilisant une feuille de grille de calibrage sous le réservoir pour mesurer les coordonnées de pixels des emplacements de grille vus au centre de la cuve. Conjointement avec les emplacements de grille correspondantes en centimètres, une matrice de transformation peut être calculée à correct la distorsion en barillet 40. Nous vous recommandons caméras à haute résolution si une taille d'animal est beaucoup plus petite que la taille du réservoir, de sorte que nombre suffisant de pixels peut être obtenu à partir de l'animal pour mesurer correctement sa posture.

le suivi de l'image et de synchronisation d'horloge. L'algorithme de suivi d'image décrite ici fait usage de l'opération région d'intérêt (ROI) pour mesurer rapidement la position du corps et la posture. L'opération de retour sur investissement réduit la taille de l'image à traiter, et limite la gamme de suivi près de l'emplacement des animaux de la trame précédente. Nous avons extrait la posture du corps (médiane) en utilisant la rotation de l'image et des opérations englobant-box à la place de l'opération image squelettisation d'habitude, qui, parfois, n'a pas réussi à produire une ligne médiane unique bien définie. Le cadre de référence de l'animal était situé au milieu de la boîte englobante tête, ce qui permet l'analyse du comportement égocentrique. La principale source d'erreur dans l'image tracking est due à l'effet de projection optique à grand angle. Idéalement, les mouvements verticaux des animaux ne devraient pas affecter la mesure de position 2D, mais le plus loin de l'axe central de l'imagerie, la plus grande partie de la dimension verticale est projetée à la caméra. La réfraction à la surface de l'eau réduit l'effet optique de projection de 28% dans notre configuration d'imagerie (hauteur de la caméra = 1,8 m, profondeur de l'eau = 10 cm, rayon de réservoir = 75 cm), et la pire erreur de position était ± 1,4 cm à la circulaire clôture. La synchronisation entre l'EOD et des enregistrements vidéo ont été synchronisées en utilisant des impulsions infrarouges de LED pour tenir compte de la dérive de temps entre la vidéo et les horloges de numériseur de signaux, et différents moments enregistrement de démarrage. L'incertitude attendue dans la synchronisation entre la vidéo et enregistrements EOD est proportionnelle à l'intervalle de capture d'image, par exemple, 15 images par seconde taux de capture (ips) se traduira dans le temps alignement incertitude de ± 33 msec. Tel degré de time précision est suffisante pour le suivi des poissons plus lent mouvement, mais une caméra à haute vitesse peut être nécessaire pour le suivi rapide des animaux en mouvement. Nous recommandons lumineux d'intensité lumineuse avec une fréquence d'image accrue, puisque le temps d'exposition du capteur est inversement proportionnelle à la fréquence de trame.

Les travaux futurs. Les interactions sociales entre plusieurs WEFs peuvent être étudiés par le suivi de leurs signaux NEM et les lieux du corps, et le système de suivi doivent correctement associer l'EOD avec l'emplacement de la même personne. Selon le procédé dipôle de localisation décrite par Jun et al. 20 une configuration similaire en utilisant les emplacements d'origine animale inférées par leurs signaux de NEM reçues à électrodes multiples peut être adaptée à la sortie de suivi visuel pour identifier correctement les impulsions de NEM à partir de différents individus. suivi de l'image de plusieurs animaux peut être effectuée une seule personne à la fois en utilisant l'opération de ROI. Un retour sur investissement peut être d'abord défini autour d'un individu àêtre suivi, et le retour sur investissement sera repositionné à chaque trame avec une position de corps de mise à jour. Les autres poissons seront exclus de l'analyse de suivi d'image quand il apparaît à l'extérieur de la ROI, et si apparu à l'intérieur, l'image de l'autre les poissons peuvent être automatiquement supprimés en vérifiant si son image touche la limite de ROI. Parfois, deux animaux en contact les uns des autres et leurs images se confondent, et si oui, un masque peut être tirée manuellement pour séparer l'image de l'autre poisson. Un autre travail futur intéressant est le suivi vidéo en trois dimensions de révéler des séquences de mouvements complexes lors de la capture des proies 22 ou les interactions sociales. MacIver et al. Utilisé 22 deux caméras pour afficher une cuve d'aquarium rectangulaire de la partie supérieure et le côté destiné à reconstituer un modèle de corps à trois dimensions. Cependant, cette approche ne fonctionnerait pas dans notre cas, car il ya des murs de cloisonnement qui bloquent des vues de côté et l'aquarium a beaucoup plus de largeur que la profondeur. Au lieu de cela, il serait plus applicablecâble à installer plusieurs caméras sur le plafond au point de vue différent angles similaire à la configuration utilisée par Hedrick 41. Pour plus de précision, l'effet de réfraction introduit par l'eau et l'angle de caméra oblique devrait être corrigé par l'étalonnage des images en trois dimensions. Notre méthode de suivi visuel pourrait être appliqué à étudier le flux d'image électrique sur la surface du corps de poisson lorsque le poisson nage 42,43 proximité d'un objet. Comme étudié par Hofmann et al. 26, il serait intéressant d'étudier le flux électrique d'image de l'objet lors de la nage libre en fonction de la distance de l'objet, la forme, la taille et la matière. En fin de compte, nos méthodes combinées avec des enregistrements de neurones de nager librement poissons 44-46 peuvent révéler de nouvelles idées par des observations de l'évolution de l'activité neuronale et taux EOD tandis que le poisson s'engage dans l'exploration de l'objet ou les interactions sociales.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Ce travail a été généreusement soutenu par le Conseil de recherches en génie du Canada (CRSNG) en sciences naturelles et les Instituts canadiens de recherche en santé du Canada (IRSC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aquarium Construction
Electrically shielded floor heater ThermoSoft Corp., IL, USA ThermoTile www.thermosoft.com
Tempered glass panel generic 0.5 in thick, used for the aquarium construction
Aquarium grade silicone generic  
Acrylic sheet generic 0.25 in thick, matte white
Natural rubber sheet generic 0.25 in thick
Servomotor HTECHRCD Inc., Korea HS-325HB, 180deg rotation www.servocity.com
Servomotor arm mount HITECHRCD Inc., Korea 56362 Large Spline www.servocity.com
Servomotor controller (6 channels) Sparkfun ROB-09664 Micro Maestro 6-channel USB Servo Controller
Active USB extension cable C2G 38990 12 m USB 2.0 A Male to A Female 4-Port Active Extension Cable
Exhaust fan Nutone ILFK120 www.homedepot.com
Vertical aquarium filter Tetra, Germany Whisper Internal Power Filter - 40i  
Crushed coral Used to increase the pH of the tank water
EOD Recording Setup
Graphite Electrodes Staedtler, Germany Mars Carbon 2-mm type HB Shave the outer coating
Physiological Amplifier/Filter Intronix, Canada 2015F  
Coaxial Cable generic RG174 For electrodes assembly
Coaxial Cable generic RG54 For wiring use
BNC jack connector for RG-174 Amphenol Connex 112160 For electrodes assembly
BNC plug connector for RG-54 Amphenol Connex 112116 For wiring use
Signal digitizer hardware Cambridge Electronic Design, UK Power MKII 1401  
Signal digitizer software Cambridge Electronic Design, UK Spike 2. ver 7  
Visual Tracking Setup
White LED light IKEA, Sweden DIODER 201.194.18 www.ikea.com
Infrared LED light (850 nm) Scene Electronics, China S8100-60-B/C-IR Remove built-in fan
USB webcam Logitech Inc., CA, USA C910 Remove Infrared blocking filter
Motorized camera Logitech Inc., CA, USA Quickcam Orbit Remove Infrared blocking filter
Video recording software Logitech Inc., CA, USA Logitech Quickcam Software Download from www.logitech.com
MATLAB Mathworks, MA, USA 2012a Image processing toolbox

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Jun, J. J., Longtin, A., Maler, L.… More

Jun, J. J., Longtin, A., Maler, L. Long-term Behavioral Tracking of Freely Swimming Weakly Electric Fish. J. Vis. Exp. (85), e50962, doi:10.3791/50962 (2014).

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