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Neuroscience

Langfristige Verhaltens Verfolgung von Frei Schwimmen Schwach elektrische Fische

doi: 10.3791/50962 Published: March 6, 2014

Summary

Wir beschreiben eine Reihe von Techniken für die Untersuchung spontane Verhalten frei schwimmend schwach-elektrischen Fischen über einen längeren Zeitraum durch synchrones Messen der elektrischen Organ Ausstoßzeitpunkt des Tieres, Körper Position und Stellung sowohl genau und zuverlässig in einem speziell konstruierten Aquariumbehälter in einem sensorischen Isolationskammer.

Abstract

Langfristige Verhaltens Tracking kann erfassen und zu quantifizieren, natürlichen tierischen Verhaltensweisen, auch die selten auftreten. Verhaltensweisen wie Exploration und sozialen Interaktionen können am besten durch die Beobachtung hemmungslos, frei lebenden Tier untersucht werden. Schwach elektrische Fische (WEF) Display leicht beobachtbar Sondierungs-und Sozialverhalten durch Aussenden elektrische Orgel Entladung (EOD). Hier beschreiben wir drei effektiven Techniken synchron messen die EOD, Körperposition und Haltung eines frei schwimm WEF für einen längeren Zeitraum. Zunächst beschreiben wir den Bau eines Versuchs Tank in einer Isolationskammer entwickelt, um externe Quellen von Sinnesreizen wie Licht, Sound und Vibration zu blockieren. Das Aquarium wurde aufgeteilt auf vier Proben aufnehmen und automatisierte Tore Fernzugriff der Tiere an die zentrale Arena steuern. Zweitens beschreiben wir eine präzise und zuverlässige Echtzeit-EOD Zeitmessverfahren von frei schwimm WEF. Signalverzerrungen durch Körperbewegungen des Tieres verursacht werden durch räumliche und zeitliche Mittelung Verarbeitungsstufen korrigiert. Drittens, beschreiben wir eine Unterwasser Nah-Infrarot-Bildgebungs Setup, um ungestörten Nachttierverhalten zu beobachten. Infrarotlicht-Impulse wurden verwendet, um die Zeitsteuerung zwischen dem Videosignal und dem physiologischen über einen langen Aufzeichnungsdauer zu synchronisieren. Unsere automatisierten Tracking-Software misst Körperposition und Körperhaltung des Tieres zuverlässig in einem aquatischen Szene. In Kombination sind diese Techniken ermöglichen langfristige Beobachtung des spontanen Verhaltens in einer zuverlässigen und präzisen Art und Weise frei schwimmen schwach-elektrischen Fischen. Wir glauben, dass unsere Methode kann ähnlich wie bei der Studie von anderen Wassertieren, die im Zusammenhang mit ihrer physiologischen Signale Sondierungs oder sozialen Verhaltensweisen angewandt werden.

Introduction

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Hintergrund. Quantitative Versuche über das Verhalten von Tieren (z. B. Zwangs Wahl, Stoßvermeidung, T-Labyrinth, etc.) Werden in der Regel verwendet, um spezifische Hypothesen zu untersuchen über sensorisch-motorischen Fähigkeiten, Lernen und Gedächtnisbildung. , Vermissen jedoch diese restriktiven Experimente viel von dem Reichtum an natürlichen Verhalten der Tiere und werden wahrscheinlich in stark vereinfachte Modelle der zugrunde liegenden neuronalen Grundlagen von Verhalten führen. Experimente unter naturalistischen Bedingungen sind daher eine wichtige Ergänzung, durch die wir näher erkunden eine Art Verhaltensrepertoire. Experimente mit frei beweglichen Tieren müssen jedoch ansprechen einzigartige technische Herausforderungen wie bewegungsinduzierte Aufnahme Artefakte. Anders als Stimulus hervorgerufene Reaktionen, spontan auftretende Erkundungsverhalten nicht vorhergesagt werden, somit Versuchspersonen müssen ständig überwacht und über einen längeren Zeitraum verfolgt werden. Spezifische Forschungsfragen can am besten durch sorgfältig ausgewählte Organismen und verfügbaren technischen Tools angesprochen werden. Zum Beispiel sind optische Aufzeichnungs-und Stimulationstechniken wie genetisch codierten Calciumsensoren 1 und 2 Optogenetik wurde erfolgreich eingesetzt, um frei beweglichen genetischen Modellorganismen 3-5. Alternativ können miniaturisierte neuronalen Telemetriesysteme erfassen und frei bewegen zu stimulieren kleine Tiere 6,7.

Elektrische Fische. WEF-Arten erzeugen elektrische Orgel Entladungen (EOD), die sie an die unmittelbare Umgebung erfassen oder über größere Entfernungen kommunizieren. Zeitlichen Muster der EOD variieren unter verschiedenen Bedingungen wie Selbst Bewegungen 8,9, Sinnesreize 10,11, 12,13 und soziale Interaktionen. Pulse-Typ-WEF Arten produzieren eine Folge von diskreten Impulsen, im Gegensatz zu Wave-Arten, die quasi-kontinuierliche Sinuswellenformen zu erzeugen. Im Allgemeinen impulsartige Spezies weisen morE EOD variable Rate im Vergleich zu den Wellentyp-Spezies und Tiere "EOD Raten Neuheit Inhalt ihrer sensorischen Umgebung 10,14 eng reflektieren. Puls-Typ-Arten können die inter-Pulsintervall (IPI) in einer einzigen Impulszyklus verkürzen sofort reagieren in ein neues Sinnesstörung (Neuheit Antwort 10,11,14). Die anhaltende elektrische Verhalten dieser Fische können durch unkontrollierte Sinnesreize von außen gestört werden, und verschiedene Arten von Reizen wie Vibration, Klang, Elektrizität und Licht sind bekannt Trigger Neuheit Antworten. Daher müssen besondere Vorkehrungen getroffen werden, um während einer Langzeitbeobachtung von frei schwimm WEF blockieren oder abschwächen externe Sinnesreize werden. Auf diese Weise können Änderungen in der EOD Rate und Bewegungsbahnen speziell auf Reize vom Experimentator dargestellt zurückzuführen.

Aquarium Tank-und Isolationskammer. Deshalb platziert mehrere Schichten von schwingungsdämpfenden Materialien under ein großes Aquarium (2,1 mx 2,1 mx 0,3 m) und umgeben den Tank mit einem isolierten Gehäuse für externe Lichtquellen, elektrisches Rauschen, Ton-und Wärmefluss blockieren. EOD Rate ist abhängig von der Umgebungstemperatur 15,16, also die Wassertemperatur wurde dicht an einem tropischen Bereich (25 ± 1 ° C) für die südamerikanischen Arten WEF geregelt. Wir konstruierten einen großen und flachen (10 cm Wassertiefe) Tank zu Sondierungs räumliche Verhalten der WEF vor allem in zwei Dimensionen (Abbildung 1A) eingeschränkt beobachten. Der Tank wurde in eine zentrale Arena räumliche Verhalten zu beobachten, und vier Ecken Fächer unterteilt ist, um einzelne Fische einzeln aufzunehmen (Fig. 1B). Jedes Abteil wurde wasserdicht gebaut, um eine elektrische Kommunikation zwischen Individuen zu verhindern. Zugang der Tiere zu der zentralen Bühne wurde von außen durch vier motorisierten Gates gesteuert. Die Tore wurden zwischen den Abteilen platziert, und sie wurde als wasserdicht verschlossenvon Nylon-Flügelmuttern. Keine Metallteile wurden verwendet, Unterwasser seit WEF reagieren empfindlich auf Metalle.

EOD Aufnahme. EOD in einer stereotypen Art und Weise durch die Aktivierung der einzelnen (in Mormyrids) oder mehrere räumlich verteilte elektrische Organe (in Gymnotiforms) 17,18 erzeugt. Zeitliche Modulationen in der EOD Rate geordneten neuronalen Aktivitäten zu offenbaren, da die Markschrittmacher erhält direkten neuronalen Eingänge von höheren Hirnregionen wie dem Zwischenhirn prepacemaker Kern, die wiederum erhält axonalen Projektionen aus dem Vorderhirn 19. Jedoch muss der EOD Zeit sorgfältig aus einem rohen Wellenaufnahme extrahiert werden und nicht durch die Bewegung induzierte Verzerrungen des Tieres vorgespannt ist. Das elektrische Feld durch eine WEF erzeugt als Dipol angenähert werden, so EOD Impulsamplituden an Aufzeichnungselektroden von den relativen Abstände und Orientierungen zwischen dem Tier und den Elektroden 8,20. Tierselbst movemEltern verändern die relative Geometrie zwischen dem Tier und den Elektroden, wodurch Bewegungen bewirken, dass die EOD-Amplituden bei verschiedenen Elektroden mit der Zeit in einer flüchtigen Weise zu variieren (siehe Abbildung 2B im Juni et al. 8). Außerdem Eigenbewegungen auch die Form der aufgezeichneten Wellenformen EOD ändern, denn relativen Beiträge von anderen Satz von der elektrischen Organe hängen von ihren Standorten entlang der Körperlänge und ihre lokalen Krümmungen durch Schwanzbiege eingeführt. Die Bewegungs-induzierten Verzerrungen in den EOD Amplituden und Formen können zu ungenauen und unzuverlässigen EOD Zeitmessungen führen. Wir überwanden diese Probleme durch die Mittelung mehrerer räumlich EOD Wellenformen an verschiedenen Orten aufgenommen und durch Zugabe einer Hülle Extraktionsfilter genau bestimmen die EOD Timing von einer frei schwimm WEF. Darüber hinaus misst unsere Technik auch EOD Amplituden, die anzeigen, ob ein Tier ruht oder aktiv bewegt, basierend auf der Änderung des EODAmplituden über die Zeit (siehe Abb. 2E und 2F). Wir nahmen differentiell verstärkten Signale von den Aufzeichnungselektrodenpaare auf Gleichtaktrauschen zu reduzieren. Da die EOD-Impulse werden in unregelmäßigen Zeitabständen erzeugt, das EOD Ereigniszeit-Serie haben eine variable Abtastrate. Der EOD Zeitreihen auf einen konstanten Abtastrate durch Interpolation, wenn durch eine analytische Werkzeug der Wahl erforderlich umgewandelt werden.

Video-Aufnahme. Obwohl EOD Aufnahme kann eine Brutto-Bewegungsaktivität eines Tieres zu überwachen, ermöglicht Videoaufzeichnung direkte Messungen der Körperposition und Haltung eines Tieres. Nah-Infrarot (NIR)-Beleuchtung (λ = 800 ~ 900 nm) erlaubt ungestörten visuelle Beobachtung von frei schwimmenden Fischen 21,22, da WEFs sind am aktivsten in der Finsternis und ihre Augen sind nicht empfindlich auf NIR-Spektrum 23,24. Die meisten digitalen Bildsensoren (zB CMOS-oder CCD) kann mit der NIR-Spektrum erfassen wavelength Bereich zwischen 800 bis 900 nm, nach dem Entfernen eines Infrarot-(IR)-Sperrfilter 25. Einige High-End-Consumer-Webcams bieten High-Definition-, weite Betrachtungswinkel und eine gute Low-Light-Empfindlichkeit, die eine Bildqualität vergleichbar oder überlegen professionelle IR-Kameras an viel höhere Kosten produzieren kann. Darüber hinaus werden bestimmte Verbraucher-Grade-Webcams mit Recording-Software, die eine längere Aufnahmedauer ermöglicht durch Komprimieren Video ohne Qualitätsverlust gebündelt. Die meisten Profi-Kameras bieten die Zeitsynchronisation TTL Impulsausgänge oder TTL Triggerimpulseingänge 26 für die Ausrichtung des Timing zwischen dem Video mit den digitalisierten Signale, aber diese Funktion ist in der Regel in Consumer-Webcams fehlt. Jedoch kann die Zeitsteuerung zwischen einer Videoaufzeichnung und einem Signal-Digitalisierer genau durch gleichzeitige Erfassung einer periodisch blinkenden IR-LED mit der Kamera und dem Digitalisierer Signal abgestimmt werden. Die Anfangs-und die endgültige IR Impulszeit kann verwendet werden, eines zwei Zeitkalibrierungsmarkierungen zur Umwandlung der Video-Frame-Nummern an die Signal Digitalisierer Zeiteinheit und umgekehrt.

Lighting & Hintergrund. Bildaufnahme durch Wasser kann technisch anspruchs aufgrund von Lichtreflexionen auf der Wasseroberfläche sein. Die Wasseroberfläche kann als Spiegel fungieren, um eine visuelle Szene über Wasser, und obskuren visuellen Merkmale Unterwasser reflektieren, und so muss die Szene über Wasser gesichts gemacht, um visuelle Störungen zu verhindern. Um das ganze Bild Aquarium, braucht eine Kamera direkt über dem Wasser platziert werden, und sollte sie hinter der Decke über einem kleinen Sichtloch versteckt, um seine Spiegelung auf der Wasseroberfläche zu verhindern. Darüber hinaus kann die Wasseroberfläche starrt und ungleichmäßige Beleuchtung zu produzieren, wenn Lichtquellen werden falsch projiziert. Indirekte Beleuchtung kann eine gleichmäßige Helligkeit über das gesamte Aquarium mit dem Ziel, die Lichtquellen in Richtung Decke zu erreichen, so dass die Decke und die umgebenden walls kann reflektieren und diffundieren die Lichtstrahlen vor dem Erreichen der Wasseroberfläche. Wählen Sie einen IR-Strahler, die eine spektrale Empfindlichkeit der Kamera (z. B. 850 nm Peak-Wellenlänge) entspricht. Elektrisches Rauschen von den Lichtquellen kann durch LED-Leuchten und Anordnen der DC-Stromversorgung außerhalb des Faradayschen Käfigs zu minimieren. Legen Sie einen weißen Hintergrund unter dem Tank, da Kontrast zu Fisch in einem weißen Hintergrund in der NIR-Wellenlängen. Ebenso stellt die Verwendung von matten weißen Farbe auf den Innenflächen der Isolationskammer gleichmäßige und helle Hintergrundbeleuchtung.

Video-Tracking. Nach einer Video-Aufnahme, kann eine automatische Bild Tracking-Algorithmus Körperpositionen und Körperhaltungen der Tiere über die Zeit zu messen. Das Video-Tracking kann automatisch von beiden ready-to-use-Software (Viewpoint oder Ethovision) oder vom Benutzer programmierbare Software (OpenCV oder MATLAB Die Image Processing Toolbox) durchgeführt werden. Als ersten Schritt der Bildverfolgung,ein gültiger Spurbereich muss, indem eine geometrische Form, um den Bereich außerhalb auszuschließen (Maskierungsoperation) definiert werden. Weiter muss Bild eines Tieres aus dem Hintergrund durch Subtrahieren eines Hintergrundbildes aus einem Bild, die das Tier isoliert werden. Das subtrahierte Bild wird in ein binäres Format durch Anlegen einer Intensitätsschwelle, so dass der Schwerpunkt und die Orientierungsachse von binären morphologischen Operationen berechnet werden, umgewandelt. In Gymnotiforms 27-29 und 30-32 Mormyrids, ist die Elektrorezeptordichte die höchste in der Nähe der Kopfbereich, somit die Kopfposition in jedem Moment gibt einen Ort der höchsten Sinnesschärfe. Die Kopf-und Schwanz Standorten können automatisch durch die Anwendung der Bilddrehung und Begrenzungs-Box-Operationen bestimmt werden. Die Kopf-und Schwanzenden könnten voneinander manuell in den ersten Rahmen, der ihnen, und durch die Verfolgung der Positionen von den Vergleich von zwei aufeinanderfolgenden Rahmen zu unterscheiden.

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Protocol

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Dieses Verfahren entspricht den Anforderungen der Universität von Ottawa Animal Care Committee. Kein Interessenkonflikt erklärt. Bitte beachten Sie die Tabelle der Materialien und Reagenzien für die Marken und Modelle der Geräte und unten aufgeführten Materialien. Benutzerdefinierte schriftliche Spike2 und MATLAB-Skripten und Beispieldaten werden in der Supplemental-Datei bereitgestellt.

1. Aquarium Tank und Isolation Chamber-Setup

  1. Anti-v ibration Boden. Konstruieren Sie ein Anti-Vibrations-Oberfläche (2,1 mx 2,1 m) durch Stapeln von Gummi-Pads, akustische Styropor-, Meeres-Sperrholzplatte, und Polyurethan-Schaumstoff-Pads von unten nach oben (Abbildung 1A). Legen Sie vier Holzständer (5 cm x 10 cm) auf der Sperrholzplatte, um die Kanten des Aquarium zu unterstützen.
  2. Bodenheizung. Legen Sie eine elektrisch abgeschirmte Heizelement über thermisch abgestuft Schaumstoffpolsterung (siehe Abbildung 1D unten). Decken Sie das Heizelement mit einem Metalllic Netz für elektrische Abschirmung.
  3. Räumliche Tank. Konstruieren Sie eine breite und flache Aquarium (1,8 mx 1,8 mx 30 cm) mit 1,3 cm dicken Glasplatten, L-förmige Aluminiumrahmen und Aquarium-Silikon (siehe Abbildung 1A) gemildert. Decken Sie die Unterseite des Tanks mit einem großen Bogen weißem Hintergrund zu hohe Abbildungs ​​Kontrast zu schaffen (siehe Protokoll Nr. 3).
  4. Teilen Sie das Aquarium in eine zentrale Arena (1,5 m Durchmesser) und vier Eck-Fächern (siehe Abbildung 1B) durch die Installation Wände (22,5 cm hoch) von Acrylplatten (matt weiß, 0,64 cm dick) hergestellt.
    1. Biegen vier Acrylplatten (22,5 cm x 102,7 cm) durch Anwendung von Wärme zu vier gebogenen Wandabschnitte zu erstellen, und befestigen Sie sie mit Silikon abdichten, um die zentrale Arena von den vier Eck-Fächer zu trennen, um den Tankboden. Lassen Sie 20 cm Abstand zwischen den Kurvenabschnitten für die Gate-Installation.
    2. Separate Nachbar Eckfächer durch die Installation von vier Doppelwände with 15 cm Lücken, die zusätzliche elektrische Isolierung und Orte für Unterwassersensoren wie ein Hydrophon bieten.
  5. Montieren Sie vier motorisierte Tore, und installieren Sie sie zwischen den Fächern Ecke und der zentralen Arena.
    1. Zubauen vier Türrahmen, wie in Fig. 1C gezeigt. Neues sechs Bohrungen (0,64 cm tief) an jedem Türrahmen einzubetten Nylon Hutmuttern (0,64 cm Durchmesser Gewinde) und sichern Sie diese mit Epoxidharz.
    2. Cut vier Türverkleidungen aus Acryl-und Kautschukbahnen und Erstellen sechs Bohrungen (0,64 cm Durchmesser) auf Acryl-und Gummiplatten für die Verriegelung. Schließen Sie sich der Acryl-und Gummiplatten mit Silikon Abdichten.
    3. Installieren Acryl-Scharniere, die Türverkleidungen mit den Türrahmen anzuschließen.
    4. Berg Schwenkarme Servomotoren auf, und installieren Sie sie auf der Oberseite der Türrahmen (siehe Abbildung 1C). Machen Schleifen mit Kabelbindern um die Schwenkarme an den Türverkleidungen verbinden.
    5. Positionieren Sie die Gate-Baugruppen auf der gaps zwischen den gekrümmten Wandabschnitte erstellt, und befestigen Sie sie mit Silikon Abdichten.
    6. Verbinden Sie alle Servomotoren an eine Servosteuerung, und schließen Sie es an eine Stromquelle und einem Computer über eine aktive USB-Verlängerungskabel. Testen Sie die Tore mit dem Servo-Controller mitgelieferte Steuersoftware.
    7. Nachdem das Silikon aushärtet, überprüfen Sie die Dichtheit durch Sperren alle Tore mit Nylon-Schrauben und füllt ein Fach nach dem anderen.
  6. Isolationskammer. Konstruieren Sie eine Isolationskammer, um das Aquarium umgeben und blockieren externen Quellen von Licht, Klang und elektrischen Störungen (siehe Abbildung 1D).
    1. Machen Sie drei Wandplatten (2 mx 2 mx 5 cm) und vier Türverkleidungen (1,9 mx 0,95 mx 5 cm). Für jedes Panel, kommen Aluminium-Formteile (5 cm x 2,5 cm), um einen rechteckigen Rahmen zu schaffen, und nieten eine weiße Kunststoff-Wellplatte auf der Aluminiumrahmen. Füllen akustische Fiberglas Batts in den Panels, und schließen mit einem schwarzen Kunststoffwellplatte.
    2. Legen Sie drei Wandplatten auf dem Anti-Vibrations-Stock, und installieren Stangenscharniere, die vier Türverkleidungen auf den Wandplatten anzuschließen.
    3. Umgeben die Isolationskammer mit Aluminium-Gitter und Boden greift auf allen Seiten einen Faradayschen Käfig zu schaffen.
  7. Feuchteregelung. Installieren Sie eine geräuscharme Abluftventilator (1F oben), um überschüssige Feuchtigkeit Aufbau von Heizung entfernen. Setzen Sie den Abluftventilator mindestens 2 m entfernt von der Aufnahme-Website, und installieren Sie einen Luftkanal zwischen der Isolationskammer und der Abgasventilator.
  8. Routinemäßig überwachen und die Bedingungen des Tankwassers und Tiere halten.
    1. Mit konstanter Wasserbedingungen bei 10 cm Tiefe, 100 uS / cm Leitfähigkeit und pH 7,0 durch Zugabe von Wasser oder Salz-Stammlösung (siehe Knudsen 33 für das Rezept). In eine Tüte Korallenbruch, wenn der pH-Wert unter 6,5.
    2. Installieren vertikale Aquarienfilter, die aus flachen Wasser zur Reinigung bedienen und kannBelüftungszwecken (1F unten). Trennen Sie die Filter und nehmen Sie sie aus dem zentralen Arena während der Aufnahme-Sessions.
    3. Mehlwürmer liefern Live auf dem Boden des Behälters durch Anbringen sie auf Saugnäpfe mit Gummibändern. Vermeiden frei schwebenden Beute wie blackworms unkontrollierte Fütterung von streunenden Beute während der Aufnahme zu vermeiden.

2. EOD-Tracking

  1. Elektroden-Installation. Zubauen acht Graphitelektroden und Raum sie gleichmäßig auf der gekrümmten Wand der zentralen Bereich.
    1. Erhalten Zeichnung Leitungen (15 cm in der Länge; Mars Carbon 2 mm Typ HB) und rasieren Sie die äußere Beschichtung der Leitungen.
    2. Schneiden Sie acht 10 cm Segmente Koaxialkabel (RG-174), wickeln Sie das Kabel Kern, um ein Ende der Graphitstäbe, und wenden Sie Schrumpfschlauch über sie für starke und stabile elektrische Verbindung. Bringen BNC-Buchse Anschlüsse auf den gegenüberliegenden Enden (2A links). </ Li>
    3. Positionieren Sie die Elektroden auf der Wand durch Abkleben und gelten dünne Streifen Klebeband auf den Elektrodenoberflächen aus Silikon schützen. Bewerben Silikondichtmasse, die Elektroden dauerhaft zu halten, und entfernen Sie alle Band vor den Silikon härtet (2A rechts).
  2. Aufbau acht Kabelanordnungen durch Messen des Abstands von jeder Elektrode zu der Verstärkereinheit, und Schneid Koaxialkabel (RG-54) in der Länge. Bringen BNC-Steckverbinder an beiden Enden der Kabel.
  3. Verwenden Sie die Kabelbaugruppen, alle Elektroden an der Verstärkereinheit zu verdrahten. Verstärken differentiell durch Paarung zwei 90 ° ausgerichtet Elektroden (siehe Abbildung 2B), und Boden alle Koaxialabschirmhülse Drähte, indem sie mit dem Faradayschen Käfig.
  4. Stellen Sie die Verstärkung des Verstärkers unter der Signalsättigungsgrenze, und Anwendung eines Bandpassfilters (200 Hz-5 kHz), um Rauschen zu entfernen. Digitalisieren Sie die vier Aufzeichnungselektrodenpaaren bei 40 kS / sec.
  5. OnlineSignalverarbeitung. Die Hinweise sind für die Spike2 Software geschrieben und die Parametereinstellungen für Gymnotus sp optimiert. (Siehe Abbildung 2C für Zusammenfassung).
    1. Schreibe einen DC entfernen Prozess (τ = 0,1 s) auf alle Aufzeichnungskanäle.
    2. Fügen Sie einen Rectify Prozess für alle Aufnahmen Kanäle.
    3. Erstellen Sie einen virtuellen Kanal, der durch Addition aller vier Aufzeichnungskanäle.
    4. Extrahieren Sie eine unimodale Umschlag pro EOD Impuls, der durch das Hinzufügen von ein RMS (root-mean-squared, ) Verfahren (τ = 0,25 ms), um den virtuellen Kanal, zur Erzeugung eines einzelnen Peaks pro EOD Zyklus eindeutig bestimmen die Impulszeit.
    5. Erstellen Sie ein Realmark-Kanal von den virtuellen Kanal und notieren Sie die Zeit und die Werte der Spitzenamplituden, nach Setzung einer angemessenen Schwelle, alle EOD Impulse wi erfassenThout fehlt ein Impuls, und vermeidet Fehlalarme.
    6. Überwachung der momentanen EOD Rate in Echtzeit, indem Sie die Option des Realmark-Kanal Kanalanzeige einer momentanen Frequenzmodus.
    7. Überwachen Sie den Fisch Bewegung in Echtzeit durch Duplizieren der Realmark-Kanal, und stellen Sie die Anzeigeoption auf eine Wellenform-Modus.
    8. Quantifizieren Sie eine Aktivität aus den RMS des EOD Amplitudensteigung durch die Schaffung einer virtuellen Kanal aus der Realmark-Kanal (0,01 Sekunden Messzeit) und fügen Steigung (τ = 0,25 ms) und RMS (τ = 0,5 ms) Prozesse.
    9. Exportieren Sie die Realmark-Kanal im Spike2 Software auf die MATLAB-Format.

3. Synchronisierte Video-Tracking

  1. Erstellen Sie eine Hintergrundszene.
    1. Ausblenden jedes Objekt, das eine Reflexion auf der Wasseroberfläche durch Abdecken mit Folie matt weiß Arbeitsplatte wirft.
    2. Installieren Sie eine matte whiteWellkunststoffplatte 15 cm unterhalb der Decke, die Kamera und die Entlüftungs verstecken.
    3. Drucken Gittermuster auf einem großen weißen Blatt Papier zur Kalibrierung einer Kamera, und legen Sie sie unter dem Tank, um ein kontrast Hintergrund zu liefern.
  2. Installieren Lichtquellen.
    1. Erhalten IR-LED-Leuchten und Entfernen eingebauten Lüfter um Lärm zu reduzieren. Fahren Sie die LED mit einem Strom-geregelte Gleichstromversorgung außerhalb des Faraday-Käfig gesetzt.
    2. Installieren IR-LED-Leuchten für die Bildgebung in der Finsternis, und weiße LED-Leuchten für den Antrieb eines Tageslichtzyklus in der Test Fisch. Direkt alle Lichtquellen in Richtung Decke auf indirekte und gleichmäßige Ausleuchtung (3A) zu erreichen.
    3. Regulieren Sie die Tageslichtzyklus durch den Antrieb des weißen LED-Leuchten mit einem Timer-gesteuerten Schalter (z. B. 12 h on/12 h aus).
  3. Installieren Sie eine Kamera direkt über dem Aquarium.
    1. Besorgen Sie sich einen NIR-empfindlichen Kamera, oder entfernen Sie einen IR-Sperr filter durch Aufbrechen einer dünnen Folie aus getöntem Glas auf der Rückseite der Linsenanordnung. Stellen Sie sicher, weit genug, um das ganze Bild zentralen Arena der Betrachtungswinkel ist.
    2. Machen Sie ein kleines Sichtloch in der Mitte der Deckenplatte und legen Sie die Kamera direkt über das Loch.
    3. Installieren Sie einen weißen Schutzring um das Objektiv, wenn die Lichtquellen erzeugen starrt.
  4. Machen Sie eine zeitsynchrone Videoaufzeichnung.
    1. ViaMichelin für eine IR-LED an einer der vier Ecken Tank zu Zeit Synchronisationsimpulse (1 ms Dauer, 10 sec Zeitraum) zu erzeugen. Hinzufügen eines Lastbegrenzungswiderstand (1 k) in Serie, und treiben die IR-LED von einem Digital-Ausgang des Digitalisierers Hardware.
    2. Verwenden Sie Video-Recording-Software mit der Kamera, wenn verfügbar gebündelt. Wählen Sie die höchste Aufnahmequalität (zB die verlustfreie Kompression) und die höchsten Auflösungen unterstützt.
    3. Starten Sie das Video-Aufzeichnung unmittelbar vor Beginn des EOD-Aufnahme, und stoppen Sie die Videoaufnahme Immeunmittelbar nach dem EOD-Aufnahme.
    4. Nach der Aufzeichnung, wandeln die Bildnummern am Digitizer Zeiteinheit durch lineare Interpolation zwischen der ersten und der letzten von der Signal Digitizer und der Videoaufzeichnung erfasst Lichtimpulse.
  5. Automatisierte Bildverfolgungs
    Die Hinweise sind für die Bildverarbeitung MATLAB Toolbox geschrieben, und nutzen Sie seine Funktionen. Eine benutzerdefinierte MATLAB-Skript wird mit dieser Vorlage für die automatisierte Bildverfolgungs Verfügung gestellt.
    1. Importieren Sie Video. Importieren Sie eine Video-Aufnahme-Datei direkt auf der MATLAB-Arbeitsbereich mit "Videoreader. Gelesen"-Funktion.
    2. Erstellen Sie ein zusammengesetztes Bild Hintergrund durch Kombination von zwei Einzelbildern. Ersetzen der Bildbereich von einem Tier mit einem unbesetzten Bild der gleichen Region von einem anderen Rahmen (siehe Fig. 3B) besetzt.
    3. Geben Sie einen Bildbereich zu, indem eine kreisförmige Maske um die zentrale Arena, die ein auszuschließen verfolgenrea außen (3B unten), und vermehren sich durch einen konstanten (r int), um eine Mindestschwelle für Intensitätsdifferenz eingestellt. Sie beispielsweise rucken = 0,85 wird die Intensitätsschwankungen zu unterdrücken = 15% - unter dem Hintergrund (1 r int).
    4. Bild Subtraktion. Subtrahieren Sie einen Bildrahmen (= IM k) von dem Hintergrundbild (= IM-0), um den Differenzbild (= ΔIM k) zu erhalten. Verwenden unsigned integer numerische Genauigkeit, um die Bildintensitätswerte als nicht-negativen ganzen Zahlen zu speichern.
    5. Segment das Differenzbild durch Anlegen einer Intensitätsschwelle von der graythresh Funktion bestimmt. Reinigen Sie das Bild mit dem binären bwmorph Funktion, und wählen Sie die größte Blob entsprechend eines Tieres nach Berechnung aller Blob Gebieten mit der Funktion regionprops.
    6. Bestimmen Sie den Schwerpunkt und Hauptorientierung einxis der größte Klecks durch Anwenden der regionprops Funktion und dreht das Bild, um die Hauptachse mit der x-Achse auszurichten. Teilen Sie das Bild, um Kopf-und Heckteile im Schwerpunkt (3D oben).
    7. Bestimmen Sie die Hauptachse des Kopfteils, und drehen Sie das gesamte Bild mit der x-Achse (Abbildung 3D unten links) auszurichten. Fit Begrenzungsboxen rund um die Kopf-und Schwanzteile parallel zu ihren Hauptachsen mit der regionprops Funktion.
    8. Bestimmen Sie die mittlere y-Koordinaten des Blobs an der linken, mittleren und rechten vertikalen Kanten der Begrenzungsrahmen (grüne Punkte in 3D unten), und weisen Sie sie fünf Spielpunkte (Kopf-Spitze, mid-Kopf, Körpermitte , Mid-Schwanz, Schwanzspitze).
    9. Prozess aufeinanderfolgenden Rahmen nach Bild beschneiden Rahmen an Schwerpunkt des Tieres aus seiner vorherigen Rahmen bestimmt zentriert.
    10. Die Kopforientierung manuell zuweisen für das erste Bild, und verwenden Sie einen Punkt-Produkt zwiscen der Orientierungsvektoren aus zwei aufeinanderfolgenden Frames automatisch die Kopforientierung. Überprüfen Sie das Ergebnis, und die Kopforientierung manuell drehen, wenn sie falsch zugeordnet.
  6. Zeichnen Sie ein Tier und Weise, indem die Kopf-Tipps und glatt mit Median-und Durchschnitts Filter (n = 3), wenn sie einen nervösen Auftritt hat. Überlagern die Flugbahn mit einem Hintergrundbild und interpolieren Fisch Mittellinien mit den fünf Merkmalspunkte (siehe Abbildung 2E).
  7. Berechnen Sie die durchschnittliche EOD Rate an jedem Bildaufnahmezeit durch Resampling der momentanen EOD Rate (100 Hz Abtastrate) und Mittelung (0,0625 Sek. Zeitfenster). Zeichnen Sie die Flugbahn in Pseudo-Farben aus der Zeit abgestimmt EOD Rate bestimmt und überlagert mit einem Hintergrundbild (siehe Abbildung 2F).

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Representative Results

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EOD Tracking-Ergebnisse

Die aufgezeichneten EOD Wellenformen aus verschiedenen Elektrodenpaare variiert in Amplituden und Formen, wie sie von ihren einzigartigen Positionen und Orientierungen (2C oben) erwartet. Die Verwendung von mehreren Elektrodenpaaren sichergestellt starken Signalempfang an allen möglichen Positionen und Orientierungen des WEF innerhalb des Tanks. Der Umschlag Wellenform (2C Boden, grüne Kurve) immer einen einzigen Peak pro EOD-Zyklus, der als zuverlässige Zeitmarkierung für die genaue Bestimmung der Zwischenimpulsintervalle und die momentane EOD Rate (IPI = -1) serviert enthalten. Die aufeinanderfolgenden EOD Peaks wurden zusammengefügt und linear interpoliert in konstanten Zeitabständen (2D-Top, schwarze Kurve) und die momentane EOD Rate wurde in ähnlicher Weise in konstanten Zeitabständen (2D Boden, rosa Kurve) interpoliert. Der ständige Zeit Resampling Verfahren erleichtert die Zeitsynchronisation seinschen der Bewegungsbahn und der EOD-Signal, und ermöglicht es, aus einer größeren Anzahl von Analysewerkzeugen für ständig abgetastete Zeitreihendaten zu nutzen. Die EOD Amplituden an externen Elektroden aufgezeichnet konstant blieb, während ein Tier in Ruhe war (Fig. 2E oben), aber über die Zeit variiert, während sich das Tier bewegt, durch den Wechsel Dipol Position und Ausrichtung (Fig. 2F oben). Somit könnte die Bewegung der Fische aus der Beobachtung der Änderung des EOD Amplituden über die Zeit abgeleitet werden. Die Baseline-EOD Quote blieb niedrig, während Fisch war in Ruhe (2E unten), aber die EOD Rate wurde deutlich höher, während der Fisch schwamm aktiv (2F oben). Unsere Beobachtung ist konsistent mit der positiven Korrelation zwischen dem EOD Rate und der Bewegung der Fische, wie zuvor berichtet 8,9,34,35.

Video Tracking-Ergebnisse

Flugbahn und Mittellinien des Tieres sind in Fig. Abbildung 3E mit dem ersten und letzten Einzelbilder überlagert. Der Zeitverlauf der Lageänderung wurde gefangen genommen, während Fisch wurde abrupt drehen für zwei Sekunden, und die Fische werden Mittellinien alle 200 ms aufgetragen. Der Fisch Mittellinie richtig an der Kopfspitze begonnen und an der Schwanzspitze der Fische beendet. Die Fische Bilder trotz der Schatten durch das Tier gegossen mit den automatisch verfolgt Mittellinien eng vereinbart. 3F zeigt die zeitlich variierenden durchschnittlichen EOD Rate (τ = 0,0625 sec) in der Farbe, die mit der Zeit abgestimmte Flugbahn des Kopfes Fisches überlagert ist -Spitze. Während der 2 Sekunden Wendezeit, die durchschnittliche EOD Rate ihren Höhepunkt erreicht, während das Tier in die Mitte der Drehphase war, und die Rate verringert zu dem Ende der Wende. Diese repräsentative Ergebnis zeigt, dass unsere Methode erfolgreich angewendet, um die Beziehung zwischen Selbst-geführte Bewegungen und der EOD Rate Modulation während Freischwimmen zu studieren.

t "fo: keep-together.within-page =" always "> Figur 1
Fig. 1 ist. Aquarium Tank-und Isolationskammer-Setup. A) Die Experimentierkammer besteht aus einem Anti-Vibrations-Etage, Aquarium und eine Isolationskammer. B) Das Aquarium wurde in die zentrale Arena für laufende Experimente und vier Eck-Fächer für Gehäuse einzelnen geteilt Fisch. Jedes Fach wurde gebaut, um wasserdichte elektrische Kommunikation zwischen Tieren. C) Die motorisierte Tor ist an mehreren Winkeln Perspektive dargestellt verhindern. Das Tor wird wasserdicht, wenn sie von sechs Flügelmuttern, die die Gummidichtung (die hellbraune Blatt) komprimieren gesperrt. Einmal freigeschaltet, kann das Tor aus der Ferne durch den Servomotor auf der Oberseite bedient werden. D) Die Isolationskammer wurde durch den Beitritt von drei w montiertAlle Platten und vier Türflügel, die den Zugang zu dem Aquariumbehälter von zwei Seiten bereitzustellen. Die Bodenplatte zeigt die Holzschienen für die Unterstützung der Tank Kanten und die Bodenheizung Platzierung. Eine Schicht aus Aluminiumnetz umfasst die Heizung, um ihre elektrische Rauschen. Abzuschirmen E) Die Wände und Türverkleidungen aus der Isolationskammer wurden aus Aluminium-Rahmen für strukturelle Unterstützung gebaut (3). Die Innenflächen der Kammer sind durch weiße Kunststoffplatten (5) abgedeckt, um interne Lichtquellen reflektieren, und der Außenbereich sind durch schwarze Kunststoffplatten abgedeckt (2) auf externe Lichtquellen zu blockieren. Ein Aluminium-Netz (1) deckt die Außenwände mit externen elektrischen Lärm blockieren. . Die Wand wird mit Akustikglasfaservliese (4) F) Das Foto oben zeigt die Belüftung Setup zum Entfernen von überschüssiger Feuchtigkeit aus Heizung erzeugt gefüllt, und das Foto unten zeigt die Wasserfiltration Setup für die Reinigung, diffundiert und Belüften des Tankwassers zwischen experimentellSitzungen. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

Figur 2
2. EOD Aufnahme-Setup und repräsentative Ergebnisse. A) Die linke Abbildung zeigt die Elektrodenanordnung, bestehend aus einer dünnen Graphitelektrode, einem kurzen Segment der Koaxialkabel und BNC Jack. Das rechte Bild zeigt Elektrodenbefestigungs Anweisungen. Abdeckband wird verwendet, um vorübergehend die Elektroden-Anordnung zu positionieren, und Silikondichtmasse angewendet wurde, um die Elektrode. B) Das Schaltbild dauerhaft halten. Zwei 90 °-orientierten Elektroden gepaart, differentiell verstärkt und gefiltert. Vier Aufzeichnungskanäle wurden außerhalb des Faraday-c digitalisiertAlter. C) Illustration der EOD Signalverarbeitungsschritte. Die Top-Spuren zeigen, roh Wellenformen von vier Elektroden-Paare, die behoben werden und summiert, um die graue Kurve unten zu produzieren. Unimodal Umschläge sind von der grauen Wellenform mit dem "Root-Mean-Square" (RMS)-Filter (grüne Kurve) extrahiert. Die EOD-Amplituden und IPIs werden von den Umschlag Spitzen. D) Die zeitvariablen EOD Amplituden (oben) und die momentane EOD Rate (unten) auf einer längeren Zeitskala als C dargestellt) bestimmt. Die EOD-Amplituden und die momentane Geschwindigkeit (IPI = -1) werden in regelmäßigen Zeitabständen durch Verbinden der Umschlag Spitzen (schwarz Spuren) interpoliert. E) wie D), aber aufgetragen auf einer längeren Zeitskala, während Fisch war in Ruhe. F) Gleich wie E), während Fisch war aktiv schwimmen. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

Fig. 3
3. Video-Tracking-Einrichtung und repräsentative Ergebnisse. A) Die Beleuchtung und Kamera-Setup dargestellt. Die Infrarot-(IR) und sichtbaren Lichtquellen an den Wänden befestigt und zeigte auf der Decke, so dass die Deckenoberfläche reflektiert und streut das Licht zum Projizieren gleichmäßige Ausleuchtung über die gesamte Tank. Die Kamera ist über der Deckenverkleidung versteckt, um Reflexion auf der Wasseroberfläche zu verhindern. Eine IR-LED ist an einer der vier Ecken positioniert Tank Zeitsynchronisationsimpulse zu erzeugen. B) Erzeugen eines zusammengesetzten Hintergrundbildes veranschaulicht. Zwei Vollbilder (Bilder oben) kombiniert, um die zusammengesetzten Hintergrundbildes (unten links) durch Ersetzen der Bereich, der das Tier (so bildenDeckel rotes Quadrat) mit der Region ohne die Tier (gestrichelte rote Quadrat). Bereich außerhalb des zentralen Arena wird in schwarz (rechts unten). C) Isolierung der Fisch-Kontur maskiert. Ein Bildrahmen (oben links) von dem Hintergrundbild subtrahiert (oben rechts), um das Differenzbild zu erzeugen (unten links), und in das binäre Bild (unten rechts) durch Anlegen einer Schwellenintensität. D) Messung der Körperlage und Haltung dargestellt. Das binäre Bild des Tieres (blob) wurde gedreht, um seine Hauptachse mit der x-Achse (rechts oben) ausgerichtet und an seinem Flächenschwerpunkt zentriert. Der Blob wurde auf den Kopf (rot) und Schwanz (blau) Teile getrennt, und jeder Teil wurde separat zur Bestimmung seiner Begrenzungsrahmens gedreht. Der Blob wurde, um den Rahmen des Tieres von Referenz (unten links), und fünf Spielpunkte (Head-End-, Mid-Kopf, Körpermitte, Mitte Schwanz, Schwanz-Ende) ausgerichtet wurden aus den Mittelpunkten der Begrenzungsrahmens bestimmt Kanten. E) im ZeitrafferAlter der Fische Mittellinien aufgetragen alle 200 msec. Die ersten und letzten Einzelbilder werden während der 2 Sekunden Wendezeit. F) Die durchschnittliche EOD Rate wird in Falschfarben dargestellt und mit der Flugbahn des Fischkopf überlagert überlagert. Die gleichen Bilder wie in E) eingesetzt. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

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Discussion

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Bedeutung unserer Techniken. Zusammenfassend zuerst beschrieben wir den Bau eines großen Aquarium und eine Isolationskammer zu spontanen Erkundungsverhalten von WEF hergestellt beobachten. Weiter haben wir gezeigt, die Technik der Aufnahme und die Verfolgung der EOD Rate und die Bewegungszustände von Fisch ungebremst in Echtzeit über mehrere Elektrodenpaare. Schließlich haben wir beschrieben, die Infrarot-Videoaufzeichnungsverfahren durch Wasser in einem zeitsynchron und das Bildverfolgungsalgorithmus, um die Körperposition und Körperhaltung messen. Als Versuchsvorbereitung, bietet WEF einen wichtigen Vorteil für die Untersuchung von aktiven Sinnesgeführten Verhaltensweisen durch den Nachweis leicht quantifizierbare EOD Rate, die auf die aktive elektrosensorischen Abtastrate entspricht. Die Kombination dieser Techniken können präzise und zuverlässige langfristige Beobachtung des spontanen Verhaltens 8 von ungebremst WEF zu ermöglichen. Darüber hinaus kann die Mehrheit unserer Einrichtung aufgebaut werden from weit verbreitet Baumaterialien und elektronischen Komponenten leicht erhältlich. Die hier beschriebenen Techniken wurden entwickelt und getestet, um unsere experimentellen Anforderungen in den letzten Jahren zu erfüllen. Wir empfehlen daher, diese Techniken für zukünftige Studien der spontanen Erkundungsverhalten von frei schwimm WEF.

Isolationskammer. Die Isolationskammer bietet gut kontrollierten experimentellen Bedingungen durch die Blockierung externer Lichtquellen, Vibration, Sound und elektrische Störungen mit unterschiedlichem Grad der Effektivität. Die Lichtsperr Leistung wurde durch Platzieren eines motorisierten Kamera in der dunklen Isolationskammer getestet und keine externe Lichtverlust wurde von der Kamera nach dem Scannen alle Standorte mit Remote-Pan-Regler beobachtet. Die Schwingungsdämpfungsoberfläche unter dem Tank vorgesehen Dämpfung gegen äußere Vibrationen von dem Boden geleitet und Stapeln von mehreren Gummischichten und Schaum installiert war zum Blockieren effektivsteexterne Vibrationen Veranstaltungen. Allerdings intermittierenden Vibrationen Ereignisse wie laute Türschließ an benachbarten Standorten, tat auslösen Neuheit Reaktionen in seltenen Fällen. Obwohl ein Anti-Vibrations-Lufttisch könnte überlegen Isolierung Leistung von Hintergrundschwingungen liefern, wäre es zu teuer sein, kaufen ein Lufttisch groß genug für unser Aquarium. Daher legten wir ein Hydrophon unter Wasser zu erkennen und auszuschließen, wenn große Ereignisse externen Vibrationen ausgelöst Neuheit Antworten. Zur weiteren Minimierung des Einflusses von Rauschen außerhalb des Labors wurden unsere Experimente außerhalb der Spitzenzeiten (nach 6 Uhr) durchgeführt. Ähnlich wurde externe Luftschallgeräusche über die Isolationskammer Wände mit Glasfaservliese Isolierung gefüllt gedämpft. Obwohl wir nicht objektiv zu quantifizieren, die Schalldämpfungsleistung, die meisten der Hintergrund-Sound in einer Laborumgebung nicht lösen die Neuheit Antworten. In seltenen Fällen kann eine plötzliche laute Geräusche von außen Triggered ein Novum Antwort, aber ein solches Ereignis wurde von der Hydrophon-Aufzeichnung festgestellt, und sie außerhalb der Spitzenzeiten nur selten aufgetreten. Das Aquarium Tank ausreichend große Fläche für unsere Tiere frei zu schwimmen und zu erkunden. Die Behältergröße wurde im Verhältnis zu der Länge der Arten, die wir verwendet (bis 30 cm) gewählt wird, aber die Behältergröße kann verkleinert werden, wenn kleinere Tiere eingesetzt. Wir haben uns für Gymnotus sp. zwischen verschiedenen impulsartige Spezies für ihre großen Schädelgröße auf elektrophysiologischen Ableitungen bei frei schwimm 36 zu erleichtern. Die elektrische Aufnahmequalität kann von der Verwendung teurer Kupfernetze und Abschirmung der Abluftventilator für die Feuchtesteuerung verwendet zu verbessern.

EOD-Messtechnik. Unsere Multi-Channel-EOD Aufnahmetechnik erlaubt eine genaue und zuverlässige Zeitmessung von EOD frei schwimmen Fische. Mit unserer Technik wurden alle EOD Impulse durch frei schwimmen WEF erzeugt ohne fehlende oder das Hinzufügen einer Sünde erkanntgle Impuls für einen Sechs-Stunden-lange Aufnahmedauer (siehe Abbildung 12 im Juni et al. 8). Die EOD Aufnahme Maßnahmen nicht nur die EOD Rate, sondern auch das Aktivitätsniveau aus der Zeit variierenden EOD Spitzenamplituden bei externen Elektroden aufgezeichnet. Die aufgezeichneten EOD Amplituden werden durch die relative Geometrie zwischen einem Tier und den Aufzeichnungselektroden bestimmt, so Tierbewegungen induzieren Veränderungen in den EOD Amplituden (2F). Das Aktivitätsniveau wurde aus der Variabilität (RMS) des EOD Amplitudensteigung in einem gleitenden Fenster (0,5 sec) berechnet. Mit dieser Methode würden Videoaufnahmen nicht zur Messung der Aktivität über einen langen Zeitraum benötigt werden, und die EOD Aufnahme allein kann ausreichen werden. Anstelle der Verwendung einer Video-Aufzeichnung, kann die Körperposition und-haltung des WEF vom EOD Aufzeichnungs allein abgeleitet werden, basierend auf den Elektroden Orten die Geometrie des Tanks, und ein theoretisches Modell eines Strom-Dipols. Verwendung eines ähnlichen recording Setup Juni et al. vorgeschlagenen 20 ein Echtzeit-Tracking-Verfahren elektrischen zur Verfolgung mehrerer WEFs in Anwesenheit eines Objekts, die gemessenen Signalintensitäten an verschiedenen Aufnahmeelektrodenpaare mit Lookup-Tabelle Einträge, die vorhergesagte Signalintensitäten bei bekannten Stromdipol Standorten vergleicht. Die elektrische Tracking-Verfahren bietet eine verbesserte Tracking-Zuverlässigkeit in einem Umfeld, in dem visuell überladen Tiere bekommen oft aus dem Blick, oder während der Verfolgung mehrerer Tiere behindert. WEF naturalistischen Lebensräume enthalten viele visuelle Hindernisse wie Wasserpflanzen und Wurzeln, wo die elektrische Tracking-Verfahren könnte zuverlässiges Tracking mit einfacher Setup-Anforderungen als visuelle Verfolgung bieten. Im Prinzip ist unsere Methode direkt auf den WEF-Arten Wellentyp nach dem Ändern Filterzeitkonstanten. Die Gleichschritt werden zwei Modi pro EOD Zyklus einzuführen, da die EOD-Wellenform in der Wellentyp-Spezies annähernd sinusförmig. In diesem FallKann die momentane EOD Rate durch Überspringen alle anderen EOD Zeitmarken, um die negativen EOD Phase ignorieren bestimmt werden. WEF können die Aufzeichnungselektroden erkennen, wenn sie in der Nähe schwimmen, damit wir mit großen oder metallische Elektroden, die von weiter weg 37 erfasst werden kann vermieden und stattdessen verwendet dünne Graphitelektroden (2 mm Durchmesser). Dünner Koaxialkabel (RG-174) mit den Elektroden-Einheiten für Flexibilität verwendet, aber dicker Koaxialkabel (RG-54) wurden für die Verdrahtung über längere Distanzen zu überlegene elektrische Abschirmung verwendet. Längere EOD Aufnahmedauer kann durch Absenken der Abtastrate erreicht werden, aber mit einer geringeren zeitlichen Auflösung als Trade-off. Der Mittelwert und die Variabilität des EOD Rate variiert zwischen Spezies, wodurch das Zeitfenster für die Glättung des momentanen EOD Rate muss entsprechend angepasst werden. Für Arten mit kürzeren mittlere und kleinere Variabilität in der IPIs (zB Gymnotiforms) und eine längere Zeit windo ist eine kürzere Zeitfenster empfohlenw ist für die Spezies mit mehr mittlere und höhere Variabilität in der IPIs (zB Mormyrids) empfohlen.

Licht-und Kamera-Setup. Video-Aufnahmen liefern quantitative und qualitative Verhaltensbeobachtungen und hier beschrieben wir die Verfahren für die Einrichtung, Aufnahme und Verarbeitung der Bilddaten. Licht-Setup spielt eine wichtige Rolle in der Herstellung von qualitativ hochwertigen Bildern, und das Licht Projektionswinkel ein wichtiger Faktor für die Abbildung Unterwasser-Tiere ist. Unter nicht optimalen Lichtbedingungen kann die Wasseroberfläche starrt und Reflexionen, die mit der Bildverfolgungs besonders stören können, wenn Tiere zu erzeugen Oberflächenwellen zu bilden. Die Blend-und Reflexionsprobleme können durch Projizieren von Lichtquellen aus dem Boden eines Tanks beseitigt werden. Für einen kleinen Tank, der LED-Arrays kann direkt unter dem Tank platziert werden und glänzen durch eine Diffusorplatte, um eine gleichmäßige Lichtstärke 38 zu generieren. In ähnlicher Weise für einen größeren Behälter, eine Lichtquelle cein unterhalb des Behälters angeordnet werden und eine gleichmäßige Lichtintensität, indem sie ausreichend Abstand für Licht zu diffundieren 39 erreicht werden. In unserem Setup, waren wir gezwungen, das Licht über dem Tank aus Platzgründen, strukturelle Stabilität, und die Platzierung der Heizung unter dem Tank zu projizieren. Wir vermeiden die Blendung und Reflexion Probleme, die durch die indirekte Beleuchtung, so dass die Lichtquellen wurden gegen die Decke projiziert. Indem der obere Teil der Kammer gesichts und matt weiß, waren keine Reflexionen auf der Wasseroberfläche sichtbar. Um das Bild der ganze zentrale Arena, ein Weitwinkel-Objektiv auf der Kamera montiert werden, aber einige Linsen (Fischauge) kann zu erheblichen tonnenförmige Verzeichnung. Die Tonnenverzerrung kann unter Verwendung einer Kalibrierungsgitterbahn unterhalb des Behälters, um die Pixel-Koordinaten der Gitterplätze im Behälterzentrum betrachtet Messung korrigiert werden. Zusammen mit den entsprechenden Gitterstellen in Zentimetern kann eine Transformationsmatrix berechnet werden, um zusammenRRECT die tonnenförmige Verzeichnung 40. Wir empfehlen hochauflösende Kameras, ob ein Tier viel kleiner ist als die Speichergröße, so dass eine ausreichende Anzahl von Pixeln aus dem Tier erhalten, seine Körperhaltung korrekt zu messen.

Bild Verfolgung und Zeitsynchronisation. Die hier beschriebene Bild Tracking-Algorithmus nutzt die Region-of-Interest (ROI)-Operation, um den Körper Position und Haltung schnell zu messen. Die ROI-Betrieb reduziert die Bildgröße zu verarbeiten sind, und beschränkt die Tracking-Bereich in der Nähe des Tier Standort aus dem vorherigen Frame. Wir extrahierten die Körperhaltung (Mittellinie) unter Verwendung der Bilddrehung und Begrenzungsrahmens Operationen statt der üblichen Bild Skelettierung Operation, die manchmal versäumt, eine gut definierte Einzelmittellinie zu produzieren. Referenzrahmen des Tieres wurde in der Mitte des Kopfes Begrenzungs-Box, die egozentrische Verhaltensanalyse ermöglicht entfernt. Die Hauptfehlerquelle in der Bild Tracking war aufgrund des optischen Projektionseffekt in einem breiten Winkel. Idealerweise sollten die vertikalen Bewegungen des Tieres nicht auf die 2D-Positionsmessung, sondern die weiter von der zentralen Achse weg Bildgebung wird der größere Teil der vertikalen Abmessung der Kamera projiziert. Die Brechung an der Wasseroberfläche reduziert die optische Projektionseffekt um 28% in unsere Imaging-Setup (Kamerahöhe = 1,8 m, Wassertiefe = 10 cm, Tankradius = 75 cm), und das Schlimmste war, Positionsfehler ± 1,4 cm an der Kreis Zaun. Das Timing zwischen der EOD-und Videoaufnahmen wurden unter Verwendung von Infrarot-LED-Impulse für die Zeitabweichung zwischen dem Videosignal und den Digitalisierer Uhren und verschiedenen Aufzeichnungsstartzeiten entfallen synchronisiert. Die erwartete Unsicherheit in der Zeitsynchronisierung zwischen dem Video-und EOD-Aufnahmen ist proportional zu der Frame Capture-Intervall, beispielsweise 15 Bilder pro Sekunde (fps) Frame Capture Rate wird in der Zeit Ausrichtung Unsicherheit von ± 33 ms führen. Solche Studien von time Genauigkeit ist ausreichend für die Verfolgung von sich langsamer bewegenden Fisch, aber eine Hochgeschwindigkeitskamera kann zur Verfolgung schneller bewegende Tiere erforderlich. Wir empfehlen heller Lichtintensität mit einer erhöhten Bildfrequenz, da der Sensor Belichtungszeit ist umgekehrt proportional zu der Framerate.

Zukünftige Arbeiten. Sozialen Interaktionen zwischen mehreren WEFs kann durch Verfolgen der EOD-Signale und Körperregionen untersucht werden, und das Spursystem korrekt verbinden den EOD mit der Position des gleichen Individuums. Nach der von 20 mit einem ähnlichen Aufbau Juni et al. Beschriebenen Dipol-Lokalisierungsverfahren, die Tier Stellen durch ihre EOD Signale hergeleitet an mehreren Elektroden empfangen werden, um die visuelle Verfolgung Ausgang der korrekten Identifizierung der EOD Impulse von verschiedenen Personen angepaßt werden. Bild Verfolgung mehrerer Tiere können einem Individuum zu einem Zeitpunkt durchgeführt werden unter Verwendung des ROI-Betrieb. Ein ROI kann zunächst um einen einzelnen festgelegt werden,verfolgt werden, und die ROI wird bei jedem Rahmen mit einem aktualisierten Körperposition positioniert werden. Die anderen Fische werden von der Bild Tracking-Analyse ausgeschlossen werden, wenn es außerhalb der ROI erscheint, und wenn innerhalb erschien, kann das Bild des anderen Fisches automatisch durch Überprüfung, ob das Image der ROI Grenze berührt, entfernt werden. Manchmal, wenden beiden Tiere sich gegenseitig und ihre Bilder verschmelzen, und wenn dem so ist, kann eine Maske manuell gezogen werden, um das Bild des anderen Fisches zu trennen. Eine weitere interessante zukünftige Arbeit ist die dreidimensionale Video-Tracking, um komplizierte Bewegungsabläufe beim Beutefang 22 oder sozialen Interaktionen aufzudecken. MacIver et al. 22 verwendet zwei Kameras, eine rechteckige Aquarium von oben und von der Seite zur Rekonstruktion eines dreidimensionalen Körpers Modell anzuzeigen. Allerdings würde dieser Ansatz nicht in unserem Fall arbeiten, da gibt es Trennwände, die Seitenansichten und das Aquarium hat viel größere Breite als Tiefe zu blockieren. Stattdessen würde es mehr Anwendungen seinKabel, um mehrere Kameras an der Decke an anderen Perspektive zu installieren Winkel ähnlich dem Setup von Hedrick 41 verwendet. Für eine höhere Genauigkeit würde die Brechungswirkung durch das Wasser und der schrägen Winkel eingeführt Kamera muss durch Kalibrieren Bilder in drei Dimensionen korrigiert werden. Unsere visuelle Tracking-Verfahren angewandt werden könnte, um die elektrische Bildfluss auf Fische Körperoberfläche 42,43 studieren, wenn ein Objekt Fisch schwimmt in der Nähe. Wie von Hofmann et al. 26. studiert, wäre es interessant zu elektrischen Bildfluss des Objekts während der frei schwimm abhängig von der Objektentfernung, Form, Größe und Material zu untersuchen. Letztlich kann unsere Methoden kombiniert mit neuronalen Aufnahmen von frei schwimmenden Fischen 44-46 neue Erkenntnisse durch Beobachtungen der Veränderungen der neuronalen Aktivität und EOD Rate zeigen, während der Fisch in der Explorations-oder Objekt sozialen Interaktionen eingreift.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von der Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) und den Canadian Institutes of Health Research (CIHR) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aquarium Construction
Electrically shielded floor heater ThermoSoft Corp., IL, USA ThermoTile www.thermosoft.com
Tempered glass panel generic 0.5 in thick, used for the aquarium construction
Aquarium grade silicone generic  
Acrylic sheet generic 0.25 in thick, matte white
Natural rubber sheet generic 0.25 in thick
Servomotor HTECHRCD Inc., Korea HS-325HB, 180deg rotation www.servocity.com
Servomotor arm mount HITECHRCD Inc., Korea 56362 Large Spline www.servocity.com
Servomotor controller (6 channels) Sparkfun ROB-09664 Micro Maestro 6-channel USB Servo Controller
Active USB extension cable C2G 38990 12 m USB 2.0 A Male to A Female 4-Port Active Extension Cable
Exhaust fan Nutone ILFK120 www.homedepot.com
Vertical aquarium filter Tetra, Germany Whisper Internal Power Filter - 40i  
Crushed coral Used to increase the pH of the tank water
EOD Recording Setup
Graphite Electrodes Staedtler, Germany Mars Carbon 2-mm type HB Shave the outer coating
Physiological Amplifier/Filter Intronix, Canada 2015F  
Coaxial Cable generic RG174 For electrodes assembly
Coaxial Cable generic RG54 For wiring use
BNC jack connector for RG-174 Amphenol Connex 112160 For electrodes assembly
BNC plug connector for RG-54 Amphenol Connex 112116 For wiring use
Signal digitizer hardware Cambridge Electronic Design, UK Power MKII 1401  
Signal digitizer software Cambridge Electronic Design, UK Spike 2. ver 7  
Visual Tracking Setup
White LED light IKEA, Sweden DIODER 201.194.18 www.ikea.com
Infrared LED light (850 nm) Scene Electronics, China S8100-60-B/C-IR Remove built-in fan
USB webcam Logitech Inc., CA, USA C910 Remove Infrared blocking filter
Motorized camera Logitech Inc., CA, USA Quickcam Orbit Remove Infrared blocking filter
Video recording software Logitech Inc., CA, USA Logitech Quickcam Software Download from www.logitech.com
MATLAB Mathworks, MA, USA 2012a Image processing toolbox

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Langfristige Verhaltens Verfolgung von Frei Schwimmen Schwach elektrische Fische
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Jun, J. J., Longtin, A., Maler, L. Long-term Behavioral Tracking of Freely Swimming Weakly Electric Fish. J. Vis. Exp. (85), e50962, doi:10.3791/50962 (2014).More

Jun, J. J., Longtin, A., Maler, L. Long-term Behavioral Tracking of Freely Swimming Weakly Electric Fish. J. Vis. Exp. (85), e50962, doi:10.3791/50962 (2014).

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