Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

לטווח ארוך התנהגות מעקב של Freely בריכה בחולשת דגים חשמליים

Published: March 6, 2014 doi: 10.3791/50962
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 2,3
1Department of Physics, University of Ottawa, 2Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Ottawa, 3Centre for Neural Dynamics, University of Ottawa

Summary

אנו מתארים קבוצה של טכניקות ללימוד התנהגות ספונטנית של שוחה בחופשיות דגי חשמל חלש על פני תקופה ארוכה של זמן, על ידי באופן סינכרוני מדידת העיתוי של החיה פריקת אורגן חשמלי, תנוחת גוף ואת היציבה הן מדויקת ואמין באקווריום שתוכנן במיוחד בתוך חושי חדר בידוד.

Abstract

מעקב התנהגותי לטווח ארוך יכול לתפוס ולכמת התנהגות בעלי חיים טבעית, כוללים אלה המתרחשים לעתים רחוקות. התנהגויות כגון חיפוש ואינטראקציות חברתיות ניתן ללמוד הכי טובות על ידי צפייה בבעלי חיים חסרי מעצורים, מתנהגים בחופשיות. תצוגת דגים חשמליים חלוש (WEF) גישוש לצפות בקלות ובהתנהגויות חברתיות על ידי פליטת פריקת אורגן חשמלית (EOD). כאן, אנו מתארים שלוש טכניקות יעילות למדידה באופן סינכרוני EOD, תנוחת גוף, והיציבה של WEF שחייה חופשית לתקופה ממושכת של זמן. ראשית, אנו מתארים את הבנייה של טנק ניסיוני בתוך תא בידוד שנועד לחסום מקורות חיצוניים של גירויים חושיים כגון אור, צליל ורטט. האקווריום היה מחולק לארבע להכיל דגימות בדיקה, ושערים אוטומטיים מרחוק לשלוט בגישתם של בעלי החיים לזירה המרכזית. שנית, אנו מתארים שיטת מדידת עיתוי EOD זמן אמת מדויקת ואמינה מחי WEF חופשיות. עיוותי אות שנגרמו על ידי תנועות גופו של בעל החיים מתוקנים על ידי מיצוע במרחב ובשלבי עיבוד זמניים. שלישית, אנו מתארים התקנת הדמיה קרובה אינפרא אדום מתחת למים כדי לבחון התנהגויות של בעלי חיים ליליות בשלוות נפש. הבזקי אור אינפרא אדום שימשו כדי לסנכרן את התזמון בין הווידאו והאותות הפיסיולוגיים על משך הקלטה ארוך. תוכנת המעקב האוטומטית שלנו מודדת תנוחת גופו של בעל החיים ויציבה באופן אמין בזירה הימית. בשילוב, טכניקות אלה מאפשרות תצפית ארוכת טווח של התנהגות ספונטנית של שוחה בחופשיות דגי חשמל חלש באופן אמין ומדויק. אנו מאמינים כי השיטה שלנו יכולה להיות מיושמת באופן דומה לחקר בעלי חיים ימיים אחרים על ידי הנוגעים אותות הפיסיולוגיים שלהם עם התנהגויות גישוש או חברתיות.

Introduction

רקע. ניסויים כמותיים על התנהגות בעלי חיים (לדוגמא: בחירה כפויה, הימנעות הלם, T-מבוך, וכו '.) מנוצלים בדרך כלל כדי לחקור השערות ספציפיות לגבי כישורים חושיים מוטוריים, למידה ויצירת זיכרון. עם זאת, ניסויים המגבילים אלה לפספס הרבה מהעושר של התנהגות טבעית של בעלי חיים והם עשויים לגרום למודלים הפשטניים של הבסיס העצבי הבסיסי של התנהגות. ניסויים בתנאים נטורליסטי יותר ולכן השלמה חשובה שבאמצעותו אנו יכולים לחקור באופן מלא יותר את רפרטואר התנהגותי מין. ניסויים מעורבים בעלי חיים לנוע בחופשיות חייבים, עם זאת, להתמודד עם אתגרים טכניים ייחודיים כגון חפצי הקלטה מושרה תנועה. בניגוד לתגובות עורר גירוי, התנהגות גישוש מתרחש באופן ספונטני לא ניתן לחזות, ולכן נבדקים בניסוי צריך להיות במעקב כל הזמן ולעקוב אחריו לאורך תקופה ארוכה של זמן. שאלות מחקר ספציפיות can לטפל הטוב ביותר על ידי אורגניזמים שנבחרו בקפידה וכלים טכניים זמינים. לדוגמא, טכניקות הקלטה וגירוי אופטיות כגון חיישנים גנטיים מקודדים סידן 1 וoptogenetics 2 יושמו בהצלחה ללנוע בחופשיות אורגניזמים מודל גנטי 3-5. לחלופין, מערכות טלמטריה עצביות מיניאטורי יכולות להקליט ולעורר באופן חופשי לנוע חיות קטנות 6,7.

דגים חשמליים. מיני WEF ליצור פריקות חשמליות איבר (EODs), המאפשרים להם לחוש את סביבתם המיידית או כדי לתקשר על פני מרחקים גדולים יותר. דפוסים זמניים של EODs להשתנות בתנאים שונים כגון תנועות עצמי 8,9, גירויים חושיים 10,11, ואינטראקציות חברתיות 12,13. מיני WEF דופק מהסוג לייצר רכבת של פולסים דיסקרטיים, בניגוד מינים לנופף מסוג שבו ליצור צורות גל למחצה סינוסי רציף. באופן כללי, מור תערוכת מיני דופק מסוגדואר שיעור EOD משתנה בהשוואה למיני גל מהסוג; ושיעורי EOD חיות משקפים באופן הדוק תוכן חידוש של הסביבה החושית שלהם 10,14. מיני דופק מהסוג יכולים לקצר באופן מיידי המרווח בין הדופק (IPI) בתוך מעגל דופק יחיד במגיבים להפרעות רומן חושיות (תגובת חידוש 10,11,14). ההתנהגות החשמלית המתמשכת של דגים אלה יכול להיות מוטרד על ידי גירויים חושיים מבוקרים ממקורות חיצוניים, וסוגים שונים של גירויים כגון רעידות, קול, חשמל, ואור ידועים תגובות חידוש הדק. לכן, יש לנקוט באמצעי זהירות מיוחדת כדי לחסום או להחליש גירויים חושיים חיצוניים במהלך תצפית ארוך טווח של WEF שחייה חופשית. בדרך זו, שינויים בשער סוף היום ומסלולי תנועה ניתן לייחס באופן ספציפי לגירויים שהוצגו על ידי הנסיין.

טנק אקווריום וחדר בידוד. לכן אנו ממוקמים במספר שכבות של חומרי רטט קליטת under אקווריום גדול באקווריום (2.1 MX 2.1 MX 0.3 מ '), והקיף את המכל במתחם מבודד לחסום מקורות חיצוניים של אור, רעש חשמלי, קול ושטף חום. שיעור EOD תלוי בטמפרטורת סביבת 15,16, ובכך טמפרטורת המים הייתה מוסדר היטב במגוון טרופי (C ° 25 ± 1) למיני הדרום WEF האמריקאי. אנחנו בניתי טנק גדול ורדוד (10 סנטימטר עומק מים) כדי לבחון התנהגויות גישוש המרחבי של WEF המוגבל בעיקר בשני ממדים (איור 1 א). הטנק היה מחולק לזירה מרכזית להתבונן התנהגויות מרחבית, וארבעה תאי פינה לבית דגים בודדים (איור 1 ב ') בנפרד. כל תא נבנה אטום למים כדי למנוע תקשורת חשמלית בין יחידים. גישתם של בעלי חיים לזירה המרכזית הייתה בשליטה מבחוץ על ידי ארבעה שערים ממונעים. השערים הוצבו בין התאים, והם הפכו אטומות למים כאשר נעוליםעל ידי אגף אגוזי ניילון. ללא חלקי מתכת שימשו מתחת למים מאז WEF מגיב ברגישות למתכות.

הקלטת EOD. EODs נוצרים באופן סטריאוטיפי על ידי הפעלה של יחיד (בMormyrids) או איברים חשמליים מופצים מרחבית מרובות (בGymnotiforms) 17,18. מודולציות זמניות בשיעור EOD יכולה לחשוף את פעילות עצבית ברמה גבוהה יותר, שכן קוצב לב מהדולרי מקבלת תשומות עצביות ישירות מאזורי המוח גבוהים יותר כמו גרעין prepacemaker diencephalic, אשר בתורו מקבל תחזיות axonal מהמוח הקדמי 19. עם זאת, עיתוי EOD חייב להיות מופק בקפידה מתוך הקלטת צורת גל גלם ואינו מוטה על ידי עיוותים הנגרמת התנועה של בעלי החיים. השדה החשמלי שנוצר על ידי WEF יכול להיות מקורב כמו דיפול, ולכן אמפליטודות דופק EOD באלקטרודות הקלטה תלויה במרחקים יחסי והאוריינטציות בין בעלי החיים ואלקטרודות 8,20. movem העצמי של בעלי החייםמציג לשנות את הגיאומטריה היחסית בין בעלי החיים ואלקטרודות, ובכך לגרום לתנועות אמפליטודות EOD באלקטרודות שונות כדי להשתנות לאורך הזמן באופן תנודתי (ראה איור 2 ביוני et al. 8). יתר על כן, תנועות עצמית גם לשנות את הצורה של גל EOD נרשם, כי תרומה היחסית מסט של האיברים חשמליים שונה תלויות על מיקומיהם לאורך הגוף והעקמומיות המקומית שלהם הוצגו על ידי כיפוף זנב. העיוותים הנגרמות התנועה באמפליטודות EOD וצורות יכולות להוביל למדידות עיתוי EOD לא מדויקות ולא אמינות. התגברנו על בעיות אלה על ידי מרחבית ממוצע גל EOD מרובה נרשם במקומות שונים, ועל ידי הוספת מסנן חילוץ מעטפה לקבוע באופן מדויק את עיתוי EOD מWEF שחייה חופשית. בנוסף, הטכניקה שלנו מודדת גם את אמפליטודות EOD, שתציין אם חיה נחה או פעיל מרגשת המבוססת על השינוי של EODאמפליטודות לאורך זמן (ראה 2E דמויות ו2F). הקלטנו אותות מוגבר באופן דיפרנציאלי מזוגות האלקטרודה הקלטה כדי להפחית את הרעש נפוץ במצב. מאז פולסים EOD נוצרים במרווחי זמן סדירים, יש זמן סדרת אירוע EOD קצב דגימה משתנה. זמן סדרת EOD ניתן להמיר לקצב דגימה קבוע על ידי ביון אם נדרש על ידי כלי האנליטי של בחירה.

הקלטת וידאו. למרות שהקלטת EOD יכולה לפקח על פעילות תנועת ברוטו של בעלי חיים, הקלטת וידאו מאפשרת מדידה ישירה של תנוחת גופו של בעל חיים ואת היציבה. תאורת אינפרא אדום קרוב (NIR) (λ = 800 ~ 900 ננומטר) מאפשרת תצפית ויזואלית מוטרדת של שחייה בחופשיות דגים 21,22, מאז WEFs הם פעילים ביותר בחושך ועיניהם אינן רגישות לספקטרום ניר 23,24. רוב חיישני הדמיה הדיגיטליים (לדוגמא ה-CMOS או CCD) יכולים ללכוד קשת ניר עם wavelengtטווח שעות שבין 800-900 ננומטר, לאחר הסרת אינפרא אדום (IR) חוסם את המסנן 25. מצלמות רשת כיתה הצרכן-high-end מסוימת מציעות בהבחנה גבוהה, זווית צפייה רחבה ורגישות נמוכה לאור טוב, אשר יכול לייצר איכות תמונה דומה, או עדיפה על רמה מקצועית מצלמות IR זמינות בעלויות הרבה יותר גדולות. בנוסף, מצלמות רשת כיתה צרכן מסוימות יחד עם תוכנת הקלטה המאפשרת משך הקלטה ארוך על ידי דחיסת וידאו ללא אובדן איכות. רוב המצלמות ברמה מקצועית מציעות תפוקות זמן סנכרון TTL דופק או תשומות דופק TTL הדק 26 ליישור התזמון בין הווידאו עם האותות הדיגיטליים, אבל תכונה זו היא בדרך כלל חסרה במצלמות כיתה צרכן. עם זאת, העיתוי בין הקלטת וידאו וdigitizer אות ניתן להתאים באופן מדויק על ידי במקביל לכידת IR מעת לעת מהבהבת LED עם המצלמה וdigitizer האות. עיתוי דופק IR הראשוני והסופי יכול לשמששני סמני כיול זמן להמרת מספרי מסגרת וידאו ליחידת זמן digitizer האות ולהיפך.

תאורה ורקע. התמונה לכידת באמצעות מים יכולה להיות מאתגרת מבחינה טכנית בשל השתקפויות אור על פני המים. פני המים יכולים לשמש כראי לשקף סצנה ויזואלית מעל מים, ותכונות חזותיות מעורפלות מתחת למים, ולכן הסצנה מעל המים חייבת להיות שניתנו ייחוד כדי למנוע הפרעה חזותית. כדי תמונה השלם אקווריום, מצלמה צריכה להיות ממוקמת ישירות מעל המים, וזה צריך להיות מוסתר מאחורי התקרה מעל חור צפייה קטן כדי למנוע ההשתקפות שלה על פני המים. יתר על כן, על פני המים יכולים לייצר מבטים ותאורה לא אחידה אם מקורות אור מוקרנים באופן שגוי. תאורה עקיפה יכולה להשיג בהירות אחידה על פני כל אקווריום על ידי מכוון מקורות האור לכיוון התקרה, כך שהתקרה וול מסביבls יכול לשקף ולפזר את קרני האור לפני שהגיע פני המים. בחר הפנס IR התואם את תגובה הספקטרלית של המצלמה (למשל שיא גל ננומטר 850). רעש חשמלי ממקורות האור ניתן למזער באמצעות נורות LED והצבת ספקי כוח DC שלהם מחוץ לכלוב פאראדיי. הנח רקע לבן מתחת לטנק, שכן בניגוד דגים היטב ברקע לבן באורכי גל ניר. באופן דומה, שימוש בצבע לבן דהוי על המשטחים הפנימיים של תא הבידוד מספק תאורת רקע אחידה ובהירה.

מעקב וידאו. לאחר הקלטת וידאו, אלגוריתם מעקב תמונה אוטומטי יכול למדוד תנוחות גופו של בעל החיים ותנוחות לאורך זמן. מעקב הווידאו יכול להתבצע באופן אוטומטי או על ידי תוכנה מוכנה לשימוש (נקודת מבט או Ethovision), או תוכנה למשתמש הניתן לתכנות (OpenCV או ארגז כלים של עיבוד תמונת MATLAB). כצעד הראשון של מעקב תמונה,שטח חוקי למעקב צריך להיות מוגדר על ידי ציור צורה גיאומטרית שלא לכלול את האזור שמחוץ (מיסוך פעולה). בשלב הבא, התמונה של בעל חיים צריכה להיות מבודדת מהרקע על ידי הפחתת תמונת רקע מתמונה המכילה את בעלי החיים. תמונת מופחתים מומרת לפורמט בינארי על ידי יישום סף עוצמה, כזה שcentroid וציר הנטייה ניתן לחשב מפעולות מורפולוגיות בינארי. בGymnotiforms 27-29 וMormyrids 30-32, צפיפות electroreceptor היא הגבוה ביותר בסמוך לאזור הראש, ולכן מיקום הראש בכל רגע מצביע על מיקומו של חדות החושים הגבוהות ביותר. מקומות הראש והזנב ניתן לקבוע באופן אוטומטי על ידי יישום פעולות סיבוב תמונה ותוחם-box. קצות הראש והזנב יכולים להבחין בין זה לזה על ידי הגדרה ידנית שלהם בפריים הראשון, ועל ידי שמירה על המסלול של המקומות שלהם מהשוואה בין שתי מסגרות רצופות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הליך זה עומד בדרישות של אוניברסיטת ועדת טיפול בבעלי חיים אוטווה. אין ניגוד האינטרסים מוצהר. נא עיין בטבלה של חומרים וריאגנטים לגורם והדגמים של הציוד וחומרים המפורטים להלן. סקריפטים מותאמים אישית שנכתבו Spike2 וMATLAB, ונתונים לדוגמה מסופקים בקובץ משלימה.

1. התקנת אקווריום טנק ובידוד קאמרי

  1. Anti-v רצפת ibration. לבנות משטח נגד רעידות (2.1 MX 2.1 מ ') על ידי ערמת רפידות גומי, קלקר אקוסטית, לוח דיקט ימי, וכריות קצף פוליאוריטן מהתחתית לחלק העליון (איור 1 א). הנח ארבעה חתיכים מעץ (5 ס"מ X 10 סנטימטר) בלוח הדיקט כדי לתמוך בקצוות של אקווריום.
  2. דוד מקיר לקיר. הנח גוף חימום חשמלי מוגן על ריפוד קצף מדורג תרמית (ראה למטה 1D איור). מכסה את גוף החימום עם מתכתLic רשת למיגון חשמלי.
  3. טנק מרחבית. לבנות טנק רחב ורדוד אקווריום (1.8 MX 1.8 MX 30 סנטימטר) באמצעות 1.3 ס"מ עובי מזג לוחות זכוכית, מסגרת אלומיניום בצורת L וסיליקון כיתה אקווריום (ראה איור 1 א). מכסה את החלק התחתון של הטנק עם גיליון גדול של רקע לבן כדי לספק ניגוד הדמיה גבוה (ראה פרוטוקול 3).
  4. מחלקים את מיכל האקווריום לזירה מרכזית (1.5 מ 'קוטר) וארבעה תאי פינה (ראה איור 1) על ידי קירות התקנה (22.5 סנטימטר) עשויים יריעות אקריליק (מט לבנים, 0.64 ס"מ עובי).
    1. בנד ארבעה גיליונות אקריליק (22.5 סנטימטר x 102.7 סנטימטר) על ידי הפעלת חום כדי ליצור ארבעה חלקי קיר מעוגלים, ולצרף אותם לתחתית המכל באמצעות קולק סיליקון להפריד את הזירה המרכזית מארבעה תאי הפינה. השאר 20 חלל סנטימטר בין החלקים המעוגלים להתקנת השער.
    2. תאים שכנים פינה נפרדת על ידי התקנת wi ארבעה קירות כפוליםפערי ה 15 סנטימטר, המספקים בידוד נוסף חשמל ומקומות עבור חיישנים מתחת למים כגון hydrophone.
  5. להרכיב ארבעה שערים ממונעים, ולהתקין אותם בין תאי הפינה והזירה המרכזית.
    1. להרכיב ארבע מסגרות דלתות כפי שמוצג באיור 1 ג. צור שש בארות (0.64 סנטימטר עמוק) על כל מסגרת דלת, להטביע אגוזי בלוט ניילון (חוט קוטר 0.64 סנטימטר) ולאבטח אותם עם אפוקסי.
    2. חותכים ארבעה לוחות דלת מאקריליק ויריעות גומי, וליצור שישה חורים (0.64 ס"מ קוטר) באקריליק ולוחות גומי למנגנון הנעילה. הצטרפות אקריליק ולוחות גומי אטימה באמצעות סיליקון.
    3. התקן אקריליק צירים להצטרף ללוחות הדלת עם מסגרות הדלת.
    4. ההר מתנדנד נשק על סרוו, ולהתקין אותם בחלק העליון של מסגרות הדלתות (ראה תרשים 1C). הפוך לולאות עם קשרי כבל לקשור את הידיים מתנדנדות ללוחות הדלת.
    5. מקם את מכלולי השער בgaps שנוצר בין קטעי קירות המעוגלים, ולאבטח אותם באמצעות אטימה סיליקון.
    6. לחבר את כל servomotors לבקר סרוו, ולחבר אותו למקור חשמל ומחשב באמצעות כבל מאריך USB פעיל. בדוק את השערים באמצעות תוכנות שליטה מסופקות עם בקר סרוו.
    7. לאחר סיליקון מתקשה, לבדוק watertightness ידי נעילת כל השערים עם ברגי ניילון וממלא תא אחד בכל פעם.
  6. חדר בידוד. לבנות תא בידוד להקיף את האקווריום ולחסום מקורות חיצוניים של אור, קול ורעש חשמלי (ראה איור 1D).
    1. לעשות שלושה לוחות קיר (2 MX 2 MX 5 ס"מ) וארבעה פנלי דלת (1.9 MX 0.95 MX 5 ס"מ). לכל לוח, להצטרף פיתוחים אלומיניום (5 ס"מ X 2.5 סנטימטר) כדי ליצור מסגרת מלבנית, ומסמר פנל פלסטיק גלי לבן במסגרת האלומיניום. מלא אטס אקוסטית פיברגלס בפנלים, וקרוב עם פנל פלסטיק גלי שחור.
    2. התקינו את שלושה לוחות קיר על הרצפה נגד הרעידות, ולהתקין פסנתר הצירים להצטרף לארבעת לוחות הדלת על לוחות הקיר.
    3. מקיף את תא הבידוד עם meshes אלומיניום, והקרקע משתלבת בכל הצדדים כדי ליצור כלוב פאראדיי.
  7. בקרת לחות. התקנת מאוורר בעל רעש נמוך פליטה (למעלה איור 1F) כדי להסיר לחות הצטברות עודפת מחימום. הנח את מאוורר הפליטה לפחות 2 מ 'ממקום ההקלטה, ולהתקין את צינור אוויר בין תא הבידוד והמאוורר.
  8. באופן שיגרתי לפקח ולשמור על התנאים של המים במכל ובעלי חיים.
    1. לשמור על תנאי מים קבועים ב10 סנטימטר עומק, 100 μS / מוליכות סנטימטר וpH 7.0 על ידי הוספת מים או פתרון מניות מלח (עיין קנודסן 33 למתכון). להוסיף שקית של אלמוגים כתושים אם ה-pH יורדת מתחת 6.5.
    2. להתקין מסנני אקווריום אנכיים אשר יכול לפעול ממים רדודים לניקוי ומטרות מתאווררות (תחתון 1F איור). נתק את המסננים ולקחת אותם אל מחוץ לזירה המרכזית במהלך פגישות הקלטה.
    3. לספק תולעי קמח בשידור חיים בתחתית המכל על ידי הצמדת אותם על כוסות יניקה עם גומיות. הימנע פושט חופשי צף כגון blackworms כדי למנוע האכלה בלתי מבוקרת של פושט תועה במהלך הקלטה.

2. סוף יום מעקב

  1. התקנת האלקטרודות. להרכיב שמונה אלקטרודות גרפיט, ושטחם באופן שווה על הקיר המעוגל של הזירה המרכזית.
    1. השג ציור מוביל (15 סנטימטר אורך; סוג מ"מ פחמן 2 מאדים HB) ולגלח את הציפוי החיצוני של מוביל.
    2. חותכים שמונה 10 מגזרי סנטימטר של כבל קואקסיאלי (RG-174), לעטוף את ליבת הכבל סביב קצה אחד של מוטות גרפיט, ולהחיל את כיווץ בחום צינורות עליהם לחיבור חשמלי חזק ויציב. צרף מחברים לשקע BNC בקצוות המנוגדים (משמאל איור 2 א). </ Li>
    3. מקם את האלקטרודות על הקיר על ידי ההדבקה, ולהחיל רצועות דקות של קלטת מסוך על משטחי אלקטרודה כדי להגן מסיליקון. החל אטימה סיליקון כדי להחזיק באופן קבוע את האלקטרודות, ולהסיר את כל הקלטת לפני מתקשה סיליקון (איור 2A מימין).
  2. לבנות שמונה מכלולי כבל על ידי מדידת המרחק מכל אלקטרודה ליחידת המגבר, וחיתוך כבלים קואקסיאליים (RG-54) באורכים. צרף מחברים תקע BNC בשני הקצוות של הכבלים.
  3. השתמש באסיפות כבל חוט כל אלקטרודות ליחידת המגבר. באופן דיפרנציאלי להגביר ידי זיווג שתי 90 ° אלקטרודות אוריינטציה (ראה איור 2), וקרקע כל חוטי המיגון קואקסיאליים ידי חיבורם לכלוב פאראדיי.
  4. קבע את רווח המגבר מתחת לגבול הרוויה אות, ולהחיל מסנן להקה עובר (200 קילוהרץ Hz-5) כדי להסיר רעש. ספרה ארבעה זוגות האלקטרודה הקלטה ב40 KS / sec.
  5. באינטרנטעיבוד אותות. ההוראות נכתבו עבור תוכנת Spike2, והגדרות הפרמטר מותאמות לsp Gymnotus. (ראה איור 2 ג לסיכום).
    1. הוספת DC להסיר תהליך (τ = 0.1 שניות) לכל ערוצי ההקלטה.
    2. הוספת תהליך לתקן לכל ערוצי ההקלטות.
    3. ליצור ערוץ וירטואלי על ידי סיכום כל ארבעת ערוצי ההקלטה.
    4. לחלץ מעטפת unimodal לכל דופק EOD ידי הוספת RMS (שורש ממוצע ריבוע, תהליך) (τ = 0.25 אלפיות שני) לערוץ הווירטואלי, ליצירת שיא אחד בכל מחזור EOD לקבוע את עיתוי הדופק באופן חד משמעי.
    5. ליצור ערוץ realmark מהערוץ הווירטואלי ולהקליט את הזמן וערכים של אמפליטודות השיא, לאחר הגדרת סף מתאים כדי ללכוד את כל wi פולסים EODגם בלי חסר דופק, תוך הימנעות חיוביות שגוי.
    6. לפקח על קצב EOD המיידי בזמן אמת על ידי קביעת אפשרות תצוגת ערוץ של ערוץ realmark למצב תדירות מיידי.
    7. לפקח על תנועת הדגים בזמן אמת על ידי לשכפל את ערוץ realmark, ולהגדיר את אפשרות התצוגה למצב צורת גל.
    8. לכמת את רמת פעילות מRMS של המדרון משרעת EOD על ידי יצירת ערוץ וירטואלי מערוץ realmark (תקופת דגימה 0.01 שניות), ולהוסיף מדרון (τ = 0.25 אלפיות שני) וRMS (τ = 0.5 אלפיות שני) תהליכים.
    9. לייצא את ערוץ realmark בתוכנת Spike2 לפורמט MATLAB.

3. מעקב וידאו מסונכרן

  1. ליצור סצנת רקע.
    1. הסתר כל אובייקט שמטיל השתקפות על פני המים על ידי כיסוי עם סרט השיש לבן מט.
    2. התקן לבן מטפנל פלסטיק גלי 15 סנטימטר מתחת לתקרה כדי להסתיר את המצלמה ואת פתח האוורור.
    3. הדפסת דפוסי רשת על גיליון גדול של נייר לבן לכיול מצלמה, ולהניח אותה מתחת לטנק כדי לספק רקע עם ניגודיות גבוהה.
  2. התקן את מקורות אור.
    1. השג IR נורות LED ו, להסיר אוהדים מובנים כדי להפחית את הרעש. כונן את LED עם אספקת חשמל מוסדר זרם DC ממוקמת מחוץ לכלוב פאראדיי.
    2. התקנת IR נורות LED עבור הדמיה בחושך, ואורות LED לבנים לנהיגת מחזור אור יומי בדגי הבדיקה. ישירים כל מקורות האור לכיוון התקרה כדי להשיג תאורה עקיפה ואחידה (איור 3 א).
    3. להסדיר את מחזור האור היומי על ידי נסיעה הלבנה נורות LED עם מתג בשליטת טיימר (למשל hr את on/12 שעות 12).
  3. התקן מצלמה ישירות מעל האקווריום.
    1. השג מצלמה ניר רגישה, או להסיר חסימת filte IRr על ידי שבירת שכבה דקה של זכוכית כהה בחלק האחורי של ההרכבה העדשות. ודא זווית הצפייה רחבה מספיק לתמונה כולה בזירה המרכזית.
    2. לעשות חור צפייה קטן באמצע פנל התקרה, ולמקם את המצלמה ישירות מעל החור.
    3. התקן את שומר טבעת לבן סביב העדשה אם מקורות האור לייצר מבטים.
  4. הפוך הקלטת וידאו מסונכרן זמן.
    1. המקום IR LED באחת מארבע פינות הטנק לייצר פולסים סינכרון זמן (משך 1 אלפיות שני, 10 תקופה שניות). הוספת הנגד הגבלת עומס (1 kΩ) בסדרה, ולנסוע IR LED מיציאת פלט דיגיטלית של חומרת digitizer.
    2. השתמש בתוכנת הקלטת וידאו יחד עם המצלמה, אם זמין. בחר בהקלטה באיכות הגבוהה ביותר (לדוגמא, הדחיסה ללא אובדן נתונים) והרזולוציות הגבוהות ביותר הנתמכות.
    3. התחל הקלטת הווידאו באופן מיידי לפני שמתחיל את ההקלטה סוף היום, ולהפסיק imme הקלטת וידאוdiately לאחר הקלטת EOD.
    4. לאחר ההקלטה, להמיר את מספרי מסגרת תמונה ליחידת זמן digitizer ידי ביון באופן ליניארי בין הראשון והבזקי האור האחרונים שנתפסו על ידי digitizer האות והקלטת וידאו.
  5. מעקב תמונה אוטומטי
    ההוראות נכתבו עבור ארגז הכלים עיבוד תמונת MATLAB, ולעשות שימוש בפונקציות שלה. תסריט MATLAB המותאם אישית מסופק עם הגשה זו למעקב תמונה אוטומטית.
    1. יבוא וידאו. יבוא קובץ הקלטת וידאו ישירות לסביבת העבודה של MATLAB באמצעות "Videoreader. לקרוא" פונקציה.
    2. ליצור תמונת רקע מרוכבים על ידי שילוב של שתי מסגרות תמונה. החלף את תמונת האזור שנכבש על ידי חיה עם דימוי ריק של אותו האזור ממסגרת אחרת (ראה איור 3 ב).
    3. ציין אזור תמונה כדי לעקוב אחר על ידי ציור מסכה מעגלית סביב הזירה המרכזית שלא לכלולריאה מחוץ (תחתון איור 3 ב), ולהכפיל בקבוע (int r) לקבוע סף מינימאלי להבדל בעוצמה. לדוגמא, הגדרת הדפס = 0.85 ימנעו את התנודות בעוצמה 15% = (1 - r int) מתחת לרקע.
    4. חיסור תמונה. לחסר מסגרת תמונה (= k IM) מתמונת הרקע (= IM 0) כדי לקבל את תמונת ההבדל (= k ΔIM). השתמש שלם חתום דיוק מספרי כדי לאחסן את ערכי עצמת תמונה כשלמים שאינם שליליים.
    5. מגזר תמונת ההבדל על ידי יישום סף עוצמה שנקבע מפונקצית graythresh. נקה את התמונה בינארית באמצעות פונקצית bwmorph, ובחר את הבועה הגדולה ביותר המקביל לבעלי חיים לאחר חישוב כל תחומי הבועה באמצעות פונקצית regionprops.
    6. לקבוע את centroid ונטייה גדולהXIS של הבועה הגדולה ביותר על ידי הפעלת פונקצית regionprops, ולסובב את התמונה כדי ליישר את הציר המרכזי עם ציר ה-x. מחלקים את התמונה לחלקי הראש והזנב בcentroid (למעלה איור 3D).
    7. לקבוע את הציר המרכזי של חלק הראש, ולסובב את התמונה כולה כדי להתיישר עם ציר ה-x (איור 3D למטה משמאל). תתאים תוחמת תיבות סביב הראש וחלקי זנב במקביל לצירים המרכזיים שלהם באמצעות פונקצית regionprops.
    8. קבע את y-הקואורדינטות החציוני של הבועה בשמאל, המרכז וקצוות אנכיים משמאל לתיבות התוחמות (נקודות ירוקות בתחתית איור 3D), ולהקצות אותם לחמש נקודות תכונה (ראש קצה, באמצע ראש, באמצע גוף , אמצע זנב, זנב קצה).
    9. לעבד מסגרות רצופות לאחר חיתוך מסגרת תמונה ממורכזת בcentroid של בעלי החיים נקבעים מהמסגרת הקודמת שלה.
    10. באופן ידני להקצות את הנטייה הראש לפריים הראשון, ולהשתמש betwe הדוט מוצרen וקטורי הכיוון משתי מסגרות רצופות כדי לקבוע באופן אוטומטי את כיוון הראש. בדוק את התוצאה, ולהפוך באופן ידני את כיוון הראש, אם הוקצה באופן שגוי.
  6. עלילה מסלול של בעלי חיים על ידי הצטרפות לראש הטיפים, ולהחליק באמצעות חציון ומסננים ממוצע (n = 3) אם יש לו מראה מתוח. להרכיב את המסלול עם תמונת רקע, ולשרבב קווי אמצע דגים באמצעות חמש נקודות תכונה (ראה 2E איור).
  7. לחשב את השיעור סוף היום הממוצע בכל פעם ללכוד תמונה על ידי resampling השיעור המיידי EOD (קצב דגימת הרץ 100) וממוצע (חלון זמן 0.0625 שניות). העלילה המסלול בפסאודו צבעים שנקבעו מEOD שיעור התאמת הזמן, ולהרכיב עם תמונת רקע (ראה איור 2F).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תוצאות מעקב EOD

גל EOD נרשם מזוגות אלקטרודה שונים מגוון באמפליטודות וצורות כצפוי מתפקידים הייחודיים שלהם ואורינטציות (למעלה איור 2C). השימוש בזוגות אלקטרודה מרובים הבטיחו קבלת אות חזקה בכל העמדות אפשריות והאוריינטציות של WEF בתוך הטנק. צורת גל המעטפה (תחתון איור 2C, סימן ירוק) תמיד הכיל שיא אחד בכל מחזור EOD, ששימש כסמן אמין לזמן דווקא קביעת המרווחים בין הדופק וקצב EOD המיידי (= IPI -1). פסגות EOD הרצופות הצטרפו ואינטרפולציה ליניארי במרווחי זמן קבוע (למעלה איור 2 ד, סימן שחור), ושיעור EOD המיידי היה אינטרפולציה דומה במרווחי זמן קבועים (למטה איור 2 ד, סימן ורוד). הליך הדגימה החוזר קבועה במשרה מאפשר סינכרון הזמן להיותtween את מסלול תנועה ואת האות סוף היום, ומאפשר למנף ממספר גדול יותר של כלים אנליטיים לנתונים בזמן סדרה נדגמו כל הזמן. אמפליטודות EOD נרשמה באלקטרודות חיצוניות נשארה קבועה בזמן שבעל חיים היה במנוחה (העליון 2E איור), אבל זה משתנה לאורך זמן ואילו בעלי החיים עברו עקב שינוי מיקום דיפול וכיוון (למעלה איור 2F). לפיכך, תנועת הדגים אפשר להסיק מהתבוננות בשינוי של אמפליטודות סוף היום לאורך זמן. שיעור EOD הבסיסי נותר נמוך ואילו דגים היו במנוחה (תחתון 2E איור), אך שיעור EOD הפך גבוה באופן משמעותי בזמן שהדגים שחו באופן פעיל (למעלה איור 2F). התצפית שלנו היא בקנה אחד עם המתאם החיובי בין שיעור EOD ותנועת הדגים דיווחו 8,9,34,35 כמו בעבר.

תוצאות מעקב וידאו

מסלולו של בעל החיים וקווי האמצע מוצגים באיור 3E יור עם מסגרות התמונה הראשונות ואחרונים על גבי זו. הזמן במהלך שינוי התנוחה היה נתפס בעת שהדג היה בפתאומיות פונה לשתי שניות, וקווי אמצע הדגים הם זממו כל 200 אלפית שניים. קו האמצע הדגים התחיל בצורה נכונה בראש עצה והסתיים בזנב הקצה של דגים. תמונות הדגים הסכימו בשיתוף פעולה הדוק עם קווי אמצע המעקב באופן אוטומטי למרות הצללים casted על ידי בעלי החיים. איור 3F ממחיש את השיעור המשתנה עם הזמן הממוצע EOD (τ = 0.0625 שניות) בצבע, אשר גבי עם מסלולו של ראשו של הדג בהתאמה הזמן עצה. במהלך תקופת מפנה 2 שניות, שיעור EOD הממוצע הגיע לשיאה בעוד החיה הייתה באמצע שלב הפיכת, ושיעור ירד לקראת סוף המפנה. תוצאת נציג זה ממחישה כי השיטה שלנו יכולה להיות מיושמת בהצלחה ללמוד את הקשר בין תנועות עצמית מודרכת ואפנון שיעור EOD במהלך שחייה חופשית.

t "עבור: לשמור-together.within-page =" תמיד "> איור 1
איור 1. התקנת מיכל ותא הבידוד באקווריום.) תא הניסוי מורכב מרצפה נגד רעידות, אקווריום, וחדר בידוד. B) אקווריום היה מחולק לזירה המרכזית לביצוע ניסויים, וארבעה תאי פינה לאדם דיור דגים. כל תא נבנה אטום למים כדי למנוע תקשורת חשמלית בין בעלי החיים. C) השער הממונע מודגם בזוויות ראייה מרובות. השער הופך להיות אטום למים כאשר ננעלו על ידי שישה אגוזי כנף שלדחוס את אטם הגומי (גיליון החום הבהיר). ברגע שלא נעול, השער יכול להיות מופעל מרחוק על ידי מנוע סרוו בחלק העליון. ד ') קאמרי הבידוד הורכב על ידי הצטרפות שלושה wכל הפנלים וארבעת לוחות דלת, המספקים גישה לאקווריום משני צדדים. הפנל התחתון ממחיש את המסילות מעץ לתמיכה בקצות הטנק, ואת מיקום דוד רצפה. שכבה של רשת אלומיניום מכסה את דוד כדי להגן על הרעש החשמלי שלה. ה) הקירות ולוחות דלת של חדר הבידוד נבנו ממסגרות אלומיניום לתמיכה מבנית (3). המשטחים הפנימיים של התא מכוסים על ידי לוחות פלסטיק לבנים (5) על מנת לשקף מקורות אור פנימיים, והחיצוניות מכוסות על ידי לוחות פלסטיק שחורים (2) כדי לחסום את מקורות אור חיצוניים. רשת אלומיניום (1) מכסה את הקירות החיצוניים כדי לחסום את הרעש חשמלי חיצוני. הקיר מתמלא באטס פיברגלס אקוסטי (4) F) התמונה למעלה מראה את התקנת אוורור אוויר להסרת לחות עודפת שנוצרה מחימום;. והתמונה התחתונה מראה את התקנת סינון מים לניקוי, לשדר, ומאוורר את המים במכל בין ניסיונימפגשים. לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 2
איור 2. הגדרת הקלטת EOD ותוצאות מייצגות.) הלוח השמאלי ממחיש את ההרכבה אלקטרודה בהיקף של האלקטרודה דקה גרפיט, קטע קצר של כבלים קואקסיאליים, וג'ק BNC. הפנל הימני מדגים הוראות מצורפים האלקטרודה. סרטי הדבקה משמש עמדת ההרכבה האלקטרודה באופן זמני, ואטים סיליקון יושם להחזיק את האלקטרודה. B) תרשים החיווט באופן קבוע. אלקטרודות שני 90 ° אורינטציה לזווג אותו, באופן דיפרנציאלי מוגבר ומסונן. ארבעה ערוצי הקלטה היו דיגיטציה מחוץ לג פאראדייאילוסטרציה גיל. C) משלבי עיבוד אותות EOD. העקבות העליונים מראות צורות גל גלם מארבעה זוגות אלקטרודות, אשר תוקנו וסיכם כדי לייצר את העקבות האפורות להלן. מעטפות unimodal מופקות מצורת הגל האפורה באמצעות "השורש-Mean-Square" מסנן (RMS) (זכר ירוק). אמפליטודות EOD וIPIs נקבעות מפסגות המעטפה. ד) אמפליטודות המשתנה עם הזמן EOD (למעלה) והמחיר המיידי EOD (התחתון) מוצגות על ציר זמן ארוך יותר מאשר C). אמפליטודות EOD והשיעור המיידי (= IPI -1) הם אינטרפולציה במרווחי זמן קבועים על ידי הצטרפות פסגות המעטפה (עקבות שחורות). ה) זהה D) אבל זממו על ציר זמן ארוך יותר ואילו דגים היו במנוחה. F) אותו דבר כמו ה ') בזמן שדגים שוחה באופן פעיל. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 3
איור 3. הגדרת מעקב וידאו ותוצאות מייצגות.) תוכנית ההתקנה של התאורה והמצלמה באה לידי ביטוי. אינפרא אדום (IR) ומקורות אור נראים מחוברים על הקירות והצביעו לכיוון התקרה, כך שמשטח התקרה משקף ומפזר את האור למקרין תאורה אחידה על פני כל הטנק. המצלמה נסתרת מעל פנל התקרה כדי למנוע השתקפות על פני המים. LED IR ממוקם באחד מארבע פינות הטנק לייצר פולסים סינכרון זמן. ב ') יצירת תמונת רקע מרוכבים מאויר. שתי מסגרות תמונה (תמונות למעלה) הן משולבות כדי ליצור תמונה המורכבת רקע (משמאל למטה) על ידי החלפת האזור הכולל את בעלי החיים (ולכןריבוע אדום מכסה) עם האזור ללא בעלי החיים (מקווקו ריבוע אדום). אזור שמחוץ לזירה המרכזית הוא רעול פנים בשחור (מימין למטה). C) בידוד המתווה הדגים. מסגרת תמונה (למעלה משמאל) יורדת מתמונת הרקע (למעלה מימין) כדי לייצר את תמונת ההבדל (למטה משמאל), והוסבה לתמונה בינארי (מימין למטה) על ידי יישום סף עוצמה. ד) מדידות של תנוחת הגוף ותנוחה מומחשות. התמונה בינארית של החיה (הבועה) הייתה מסובבת ליישר הציר המרכזי שלה עם ציר ה-x (למעלה מימין), והתרכזה בcentroid. הבועה הופרדה לראש (אדום) וזנב (כחול) חלקים, וכל חלק היה מסובב בנפרד לקביעה התוחמת-התיבה שלו. הבועה הייתה מכוונת למסגרת של החיה של התייחסות (משמאל למטה), וחמש נקודות תכונה (ראש בסוף, באמצע ראש, באמצע גוף, באמצע זנב, זנב סוף) נקבעו מנקודתי האמצע של תוחמת-box קצוות.) im זמן לשגות Eגיל קווי אמצע הדגים זמם כל 200 אלפית שני. מסגרות התמונה הראשונות ואחרונות על גבי זו במהלך תקופת מפנה 2 שניות. F) שיעור EOD הממוצע מיוצג בפסאודו צבע וגבי עם מסלולו של ראש הדג. אותו תמונות משמשות כבE). לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

משמעות של הטכניקות שלנו. לסיכום, אנו תיארו לראשונה את הבנייה של טנק אקווריום גדול וחדר בידוד כדי לבחון התנהגויות גישוש ספונטניות המיוצרים על ידי WEF. בשלב בא, שהדגמנו את הטכניקה של רישום ומעקב אחר שיעור EOD ומדינות תנועה מדג חסר מעצורים בזמן אמת באמצעות אלקטרודה זוגות מרובים. לבסוף, אנו תיארתי את טכניקת אינפרא אדום הקלטת וידאו דרך מים באופן מסונכרן בזמן, ואת אלגוריתם מעקב תמונה על מנת למדוד את תנוחת גוף ואת היציבה. כהכנה ניסיונית, WEF מציע יתרון חשוב לחקר התנהגויות מודרכים חושיות פעילה על ידי הוכחת שיעור EOD לכימות, אשר שווה לקצב דגימת electrosensory הפעיל. שילוב של טכניקות אלה יכול לאפשר התבוננות מדויקת ואמינה לטווח הארוך של התנהגויות ספונטניות 8 מWEF בלתי מרוסן. יתרה מזאת, הרוב המכריע של ההתקנה שלנו ניתן לבנות frאום זמין לציבור רחב חומרי בנייה ורכיבים אלקטרוניים השגה בקלות. הטכניקות המתוארות כאן פותחו ונבדקו בהתאם לדרישות הניסוי שלנו בשנים האחרונות. לכן, אנו ממליצים בטכניקות אלה למחקרים עתידיים של התנהגויות גישוש ספונטניות מWEF שחייה חופשית.

חדר בידוד. תא הבידוד מספק תנאי ניסוי מבוקרים היטב על ידי חסימת מקורות חיצוניים של אור, רטט, צליל ורעש חשמלי בדרגות שונות של יעילות. ביצועי חסימת האור נבדקו על ידי הצבת מצלמה ממונעת הפנימי של חדר הבידוד החשוך, ואין זליגת אור חיצונית נצפתה מהמצלמה לאחר סריקת כל המיקומים באמצעות שליטה מרחוק במחבת. משטח רטט דעיכת המותקן מתחת להנחתת הטנק סיפק נגד תנודות חיצוניות מתועלות מהרצפה, וערימה של שכבות גומי וקצף רבות היה יעיל ביותר לחסימהאירועי רטט חיצוניים. עם זאת, אירועי רעידות לסירוגין כגון סגירת דלת בקול רם במקומות סמוכים עשו לעורר תגובות חידוש במקרים נדירים. אמנם שולחן אוויר נגד רעידות יכול לספק ביצועי בידוד מעולים מתנודות רקע, זה יהיה יקר מדי לרכישת שולחן אוויר גדול מספיק למכל האקווריום שלנו. לכן, אנחנו ממוקמים מתחת למים hydrophone לזהות ולהוציא אירועים כאשר תנודות חיצוניות גדולות גררו תגובות חידוש. כדי למזער עוד יותר את ההשפעה של רעש מחוץ למעבדה, הניסויים שלנו נערכו בשעות מחוץ לשעתי שיא (אחרי 6 בערב). בדומה לכך, רעש אקוסטי הנישאים באוויר חיצוני נחלש באמצעות תא בידוד הקירות מלאים בבידוד באטס פיברגלס. למרות שאנחנו לא אובייקטיבי לכמת את ביצועי הנחתה קול, רוב צלילי הרקע בסביבת מעבדה לא יפעילו את תגובות חידוש. במקרים נדירים, צליל חזק ופתאומי מההדק בחוץed תגובת חידוש, אבל אירוע כזה זוהה על ידי הקלטת hydrophone, והם התרחשו לעתים נדירות בשעות שפל. אקווריום בתנאי שטח גדול מספיק עבור בעלי החיים שלנו כדי לשחות בחופשיות ולחקור. גודל המכל נבחר באופן יחסי לאורכו של מין היינו (עד 30 סנטימטר), אבל גודל המכל וניתן לשנותם למטה אם בעלי חיים קטנים יותר היו בשימוש. בחרנו sp Gymnotus. בין מיני דופק מסוג שונים לגודל הגולגולת הגדול שלהם כדי להקל על קלטות אלקטרו במהלך חייה חופשית 36. איכות ההקלטה החשמלית עשויה לשפר משימוש משתלב נחושת יקרה יותר, ומיגון מאוורר הפליטה המשמש לבקרת הלחות.

טכניקת מדידת EOD. טכניקת הקלטת EOD רב ערוצית שלנו מותר מדידת עיתוי EOD מדויקת ואמינה מדגים שוחים בחופשיות. באמצעות הטכניקה שלנו, כל קטניות EOD שנוצרו על ידי שחייה WEF חופשיות אותרו ללא חסר או הוספת חטאדופק GLE למשך הקלטה הארוכה של שש שעות (ראה איור 12 ביוני et al. 8). אמצעי ההקלטה EOD לא רק את שיעור EOD, אלא גם את רמת הפעילות מרגע משתנה אמפליטודות שיא EOD נרשמה באלקטרודות חיצוניות. אמפליטודות EOD נרשמה נקבעות על ידי הגיאומטריה היחסית בין בעלי חיים ואלקטרודות ההקלטה, ובכך לגרום לשינויי תנועות של בעלי חיים באמפליטודות EOD (איור 2F). רמת הפעילות חושבה מההשתנות (RMS) של המדרון משרעת EOD בתוך חלון הזזת (0.5 שניות). באמצעות שיטה זו, הקלטת וידאו לא היית נדרשת למדידת רמת הפעילות על פני תקופת זמן ארוך, והקלטת EOD לבד עשויה להיות מספיק. במקום להשתמש בהקלטת וידאו, תנוחת הגוף ואת היציבה של WEF ניתן להסיק מרישום EOD לבד מבוססים על מיקומי אלקטרודות, הגיאומטריה של טנק, ומודל תיאורטי של דיפול הנוכחי. שימוש recordi דומההתקנת ng, Jun et al. 20 מוצעים שיטת מעקב חשמלי בזמן אמת לצורך מעקב WEFs מרובה בנוכחותו של אובייקט, אשר משווה עוצמות אות נמדדת בזוגות האלקטרודה הקלטה מרובים עם ערכי טבלת בדיקה המכילים עוצמות אות חזו במקומות דיפול הנוכחיים ידועים. שיטת המעקב החשמלית מציעה אמינות מעקב משופרת בסביבה חזותית מבולגנת שבו בעלי חיים לעתים קרובות לקבל חסומים מתצוגה או בבעלי חיים רבים מעקב. בתי הגידול נטורליסטי של WEF מכילים הרבה מכשולים חזותיים כגון צמחים ושורשים מימיים, שבו שיטת המעקב החשמלית יכולה לספק מעקב אמין יותר עם דרישות התקנה פשוטות יותר מאשר מעקב ויזואלי. בעיקרון, השיטה שלנו היא ישימה ישירות מיני WEF גל מהסוג לאחר שינוי קבועי זמן סינון. צעד התיקון יציג שני מצבים בכל מחזור סוף היום, שכן צורת גל EOD הוא כ סינוסי במין גל מהסוג. כאן, שיעור EOD המיידי יכול להיקבע על ידי דילוג כל סמנים אחרים זמן EOD להתעלם שלב EOD השלילי. WEF יכול לזהות אלקטרודות הקלטה כאשר הם שוחים בקרבת מקום, ולכן נמנענו משימוש באלקטרודות גדולות או מתכתיות שניתן חשה ממקום מרוחק יותר 37, ובמקום זאת השתמש באלקטרודות דקות גרפיט (קוטר 2 מ"מ). כבלים קואקסיאליים דקים יותר (RG-174) שימשו עם מכלולי אלקטרודה לגמישות, אבל כבלים קואקסיאליים עבים (RG-54) שימשו לחיווט על פני מרחקים ארוכים למיגון חשמלי מעולה. משך הקלטה ארוך יותר EOD יכול להיות מושגת על ידי הורדת קצב הדגימה, אבל ברזולוציה הטמפורלית נמוכה יותר כמו trade-off. הממוצע וההשתנות של השיעור סוף היום משתנים בין מינים, ובכך חלון הזמן להחלקת שיעור EOD המיידי צריך להיות מותאם כראוי. חלון זמן קצר יותר מומלץ למינים יש ממוצע קצר יותר ולהבדלים קטנים יותר בIPIs (למשל Gymnotiforms), וwindo זמן ארוך יותרw מומלץ למין שיש אומר יותר והשתנות גבוהה יותר בIPIs (למשל Mormyrids).

תאורה והתקנת מצלמה. הקלטות וידאו מספקות תצפיות התנהגותיות כמותיים ואיכותיות, והנה אנחנו תיארו את ההליכים להקמה, הקלטה, ועיבוד נתוני תמונה. התקנת תאורה משחקת תפקיד חשוב בהפקת תמונות באיכות גבוהה, ואת זווית הקרנת האור היא גורם חשוב להדמית בעלי חיים מתחת למים. בתנאי תאורה לא טובים, פני המים יכולים להיווצר מבטים והשתקפויות, מה שיכול להפריע למעקב התמונה במיוחד כאשר חיות ליצור גלים על פני שטח. ניתן למנוע בעיות הסנוור והשתקפות על ידי הקרנת מקורות אור מהחלק התחתון של טנק. לטנק קטן, מערכים של LED יכולים להיות ממוקמים ישירות מתחת לטנק ולזרוח דרך פנל מפזר לייצר עוצמת אור אחידה 38. בדומה לטנק גדול יותר, ג מקור אורלהיות ממוקם מתחת לטנק, ועוצמת אור אחידה יכולה להיות מושגת על ידי מתן אפשרות למרחק מספיק לאור לנטרל 39. בהתקנה שלנו, נאלצנו להקרין את האור מלמעלה הטנק בשל אילוצי מקום, יציבות מבנית, ואת מיקום התנור מתחת לטנק. אנו נמנע בעיות הסנוור והשתקפות באמצעות תאורה עקיפה, כך שמקורות האור שמוקרנים לכיוון התקרה. על ידי מתן החלק העליון של החדר הלבן חסר ייחוד ומאט, לא השתקפויות נראו על פני המים. לתמונה כולה הזירה המרכזית, עדשה רחבה זווית יכולה להיות מותקנת על המצלמה, אבל כמה עדשות (עדשת עין דג) עלולה לגרום לעיוות חבית משמעותית. עיוות החבית ניתן לתקן על ידי שימוש בגיליון רשת כיול מתחת לטנק כדי למדוד את קואורדינטות פיקסל של מיקומי הרשת שנצפו במרכז הטנק. יחד עם מיקומי רשת המקביל בסנטימטרים, מטריצת הפיכה ניתן לחשב לשתףrrect עיוות חבית 40. אנו ממליצים מצלמות ברזולוציה גבוהות, אם גודל של בעלי חיים קטן בהרבה מגודל המכל, כך ניתן לקבל כי מספר המספיק של פיקסלים מבעלי החיים כדי למדוד את תנוחת גופו בצורה נכונה.

מעקב תמונה וסינכרון הזמן. אלגוריתם מעקב התמונה המתואר כאן עושה שימוש בפעולה באזור של עניין (ROI) כדי למדוד את תנוחת גוף ואת היציבה במהירות. מבצע ההחזר על ההשקעה מקטין את גודל התמונה שיש מעובד, ומגביל את טווח המעקב ליד המיקום של בעלי החיים מהמסגרת הקודמת. אנו חולצו תנוחת הגוף (קו האמצע) באמצעות סיבוב התמונה ופעולות תוחמת תיבה במקום פעולת skeletonization הדימוי המקובלת, שלעתים לא הצליחה לייצר קו האמצע יחיד ומוגדר היטב. המסגרת של החיה של התייחסות הייתה ממוקמת באמצע התוחם תיבת הראש, המאפשרת ניתוח התנהגות אגוצנטרי. המקור העיקרי של שגיאה בtracki התמונהng היה בשל השפעת ההקרנה האופטית בזווית רחבה. באופן אידיאלי, התנועות אנכיות של בעל החיים לא אמורים להשפיע על מדידת מצב 2D, אבל רחוק מהציר ההדמיה המרכזי, החלק גדול יותר של הממד האנכי צפוי למצלמה. השבירה על פני המים הפחיתה את השפעת ההקרנה האופטית על ידי 28% בהתקנת ההדמיה שלנו (גובה מצלמה = 1.8 מ ', עומק מים = 10 סנטימטר, רדיוס טנק = 75 סנטימטר), ושגיאת המיקום הגרועה ביותר היה ± 1.4 סנטימטר בחוזר גדר. העיתוי בין EOD והקלטות וידאו היו מסונכרן באמצעות פולסים LED אינפרא אדום כדי להסביר את היסחפות הזמן בין הווידאו ושעוני digitizer אות, וזמני אתחול הקלטה שונים. חוסר הוודאות הצפויה בזמן הסנכרון בין הווידאו והקלטות EOD הוא פרופורציונלית למרווח המסגרת ללכוד, למשל, 15 מסגרות לשניית שיעור לכידת מסגרת (fps) יגרמו לחוסר ודאות יישור הזמן של ± 33 אלפיות שניים. מידה כזו של timדיוק דואר הוא נאות למעקב איטי יותר דגים מרגשים, אבל מצלמה במהירות גבוהה עשויה להידרש למעקב מהיר יותר נע בעלי חיים. אנו ממליצים עוצמת אור בהירה עם מסגרת שיעור מוגבר, שכן את זמן חשיפת החיישן הוא ביחס הפוך לקצב הפריימים.

עבודה בעתיד. אינטראקציות חברתיות בין WEFs המרובים יכולות להיחקר על ידי מעקב אחר האותות סוף היום שלהם ומקומות בגוף, ומערכת המעקב חייבת בצורה נכונה לשייך את EOD עם מיקומו של אותו האדם. על פי שיטת לוקליזציה דיפול שתוארה על ידי יוני et al. 20 התקנה דומה משתמשת, במקומות החיות להסיק על ידי אותות EOD קיבלו באלקטרודות מרובות יכול להיות מתאים לפלט המעקב החזותי לאיתור נכון של קטניות סוף היום מאנשים שונים. מעקב תמונה של בעלי חיים רבים ניתן לבצע אדם אחד בכל פעם, באמצעות פעולת החזר על ההשקעה. החזר על השקעה יכולה להיות בתחילה הוגדרה סביב פרטלהיות במעקב, ואת ההחזר על ההשקעה יהיה מיקומו בכל מסגרת עם תנוחת גוף מעודכנת. הדגים האחרים לא ייכללו מניתוח מעקב אחר התמונה כאשר הוא מופיע מחוץ להחזר על ההשקעה, ואם הופיעו בפנים, התמונה של הדגים האחרים ניתן להסיר באופן אוטומטי על ידי בדיקה האם התמונה שלה נוגעת בגבול ההחזר על ההשקעה. לפעמים, שני בעלי חיים ליצור קשר עם אחד את השני והתמונות שלהם להתמזג, ואם כן, מסכה ניתן להסיק באופן ידני כדי להפריד בין התמונה של הדגים האחרים. עוד עבודה בעתיד מעניינת היא מעקב וידאו תלת ממדים כדי לחשוף רצפי תנועה מורכבים במהלך לכידת טרף 22 או אינטראקציות חברתיות. MacIver et al. 22 השתמשו בשתי מצלמות כדי להציג טנק אקווריום מלבני מהחלק העליון והן בצד לשחזור מודל תלת ממדי של גוף. עם זאת, גישה זו לא הייתה עובדת במקרה שלנו, שכן יש קירות מחיצות שחוסמים דעות בצד ויש לו את האקווריום רוחב גדול בהרבה מעומק. במקום זאת, זה יהיה יותר appliכבל להתקנת מצלמות מרובות על התקרה במבט שונה זוויות דומה להתקנה בשימוש על ידי הדריק 41. לדיוק רב יותר, האפקט השבירה הוצג על ידי המים וזווית המצלמה האלכסונית היית צריך להיות מתוקן על ידי כיול תמונות בשלושה ממדים. שיטת המעקב החזותית שלנו יכולה להיות מיושמת על ללמוד את זרימת תמונה החשמלית על פני גופו של דג 42,43 כאשר דג שוחה קרוב לאובייקט. כפי שנחקר על ידי הופמן ואח'. 26, זה יהיה מעניין לחקור את זרימת התמונה החשמלית של האובייקט במהלך חייה חופשית בהתאם למרחק אובייקט, צורה, גודל, וחומר. סופו של דבר, את השיטות שלנו בשילוב עם הקלטות עצביות מדגים שוחים בחופשיות 44-46 עשויות לחשוף תובנות חדשות על ידי תצפיות על שינויים בפעילות עצבית ושיעור EOD אילו הדגים עוסק בחקר אובייקט או אינטראקציות חברתיות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

יש המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה בנדיבות על ידי למדעי הטבע והנדסת מועצת מחקר של קנדה (NSERC) והמכון הקנדי לבריאות מחקר (CIHR).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aquarium Construction
Electrically shielded floor heater ThermoSoft Corp., IL, USA ThermoTile www.thermosoft.com
Tempered glass panel generic 0.5 in thick, used for the aquarium construction
Aquarium grade silicone generic  
Acrylic sheet generic 0.25 in thick, matte white
Natural rubber sheet generic 0.25 in thick
Servomotor HTECHRCD Inc., Korea HS-325HB, 180deg rotation www.servocity.com
Servomotor arm mount HITECHRCD Inc., Korea 56362 Large Spline www.servocity.com
Servomotor controller (6 channels) Sparkfun ROB-09664 Micro Maestro 6-channel USB Servo Controller
Active USB extension cable C2G 38990 12 m USB 2.0 A Male to A Female 4-Port Active Extension Cable
Exhaust fan Nutone ILFK120 www.homedepot.com
Vertical aquarium filter Tetra, Germany Whisper Internal Power Filter - 40i  
Crushed coral Used to increase the pH of the tank water
EOD Recording Setup
Graphite Electrodes Staedtler, Germany Mars Carbon 2-mm type HB Shave the outer coating
Physiological Amplifier/Filter Intronix, Canada 2015F  
Coaxial Cable generic RG174 For electrodes assembly
Coaxial Cable generic RG54 For wiring use
BNC jack connector for RG-174 Amphenol Connex 112160 For electrodes assembly
BNC plug connector for RG-54 Amphenol Connex 112116 For wiring use
Signal digitizer hardware Cambridge Electronic Design, UK Power MKII 1401  
Signal digitizer software Cambridge Electronic Design, UK Spike 2. ver 7  
Visual Tracking Setup
White LED light IKEA, Sweden DIODER 201.194.18 www.ikea.com
Infrared LED light (850 nm) Scene Electronics, China S8100-60-B/C-IR Remove built-in fan
USB webcam Logitech Inc., CA, USA C910 Remove Infrared blocking filter
Motorized camera Logitech Inc., CA, USA Quickcam Orbit Remove Infrared blocking filter
Video recording software Logitech Inc., CA, USA Logitech Quickcam Software Download from www.logitech.com
MATLAB Mathworks, MA, USA 2012a Image processing toolbox

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).
  2. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat. Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  3. Adamantidis, A. R., Zhang, F., Aravanis, A. M., Deisseroth, K., De Lecea, L. Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons. Nature. 450 (7168), 420-424 (2007).
  4. Naumann, E. A., Kampff, A. R., Prober, D. A., Schier, A. F., Engert, F. Monitoring neural activity with bioluminescence during natural behavior. Nat. Neurosci. 13 (4), 513-520 (2010).
  5. Leifer, A. M., Fang-Yen, C., Gershow, M., Alkema, M. J., Samuel, A. D. Optogenetic manipulation of neural activity in freely moving Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 8 (2), 147-152 (2011).
  6. Mavoori, J., Millard, B., Longnion, J., Daniel, T., Diorio, C. A miniature implantable computer for functional electrical stimulation and recording of neuromuscular activity. In IEEE international workshop on biomedical circuits and systems (BioCAS) 2004; Session: Functional Electrical Stimulators and Related Sensing Techniques. , (2004).
  7. Harrison, R. R., Fotowat, H., Chan, R., Kier, R. J., Olberg, R., Leonardo, A., Gabbiani, F. Wireless neural/EMG telemetry systems for small freely moving animals. IEEE TBioCAS. 5 (2), 103-111 (2011).
  8. Jun, J. J., Longtin, A., Maler, L. Precision measurement of electric organ discharge timing from freely moving weakly electric fish. J. Neurophys. 107 (7), 1996-2007 (2012).
  9. Forlim, C. G., Pinto, R. D. Noninvasive Realistic Stimulation/Recording of Freely Swimming Weakly Electric Fish: Movement Detection and Discharge Entropy to Infer Fish Behavior. , (2012).
  10. Caputi, A. A., Aguilera, P. A., Castelló, M. E. Probability and amplitude of novelty responses as a function of the change in contrast of the reafferent image in G. carapo. J. Exp. Biol. 206 (6), 999-1010 (2003).
  11. Pluta, S. R., Kawasaki, M. Multisensory enhancement of electromotor responses to a single moving object. J. Exp. Biol. 211 (18), 2919-2930 (2008).
  12. Heiligenberg, W. Electrolocation and jamming avoidance in a Hypopygus (Rhamphichthyidae, Gymnotoidei), an electric fish with pulse-type discharges. J. Comp. Phys. A. 91 (3), 223-240 (1974).
  13. Capurro, A., Malta, C. P. Noise autocorrelation and jamming avoidance performance in pulse type electric fish. Bull. Math. Biol. 66 (4), 885-905 (2004).
  14. Post, N., von der Emde, G. The "novelty response" in an electric fish: response properties and habituation. Phys. Behav. 68 (1), 115-128 (1999).
  15. Toerring, M. J., Serrier, J. Influence of water temperature on the electric organ discharge (EOD) of the weakly electric fish Marcusenius cyprinoides (Mormyridae). J. Exp. Biol. 74 (1), 133-150 (1978).
  16. Ardanaz, J. L., Silva, A., Macadar, O. Temperature sensitivity of the electric organ discharge waveform in Gymnotus carapo. J. Comp. Phys. A. 187 (11), 853-864 (2001).
  17. Rodríguez-Cattaneo, A., Pereira, A. C., Aguilera, P. A., Crampton, W. G., Caputi, A. A. Species-specific diversity of a fixed motor pattern: the electric organ discharge of Gymnotus. PLoS One. 3 (5), (2008).
  18. Bennett, M. V. L. Fish physiology. Hoar, W. S., Randall, D. J. , Academic Press. NY. 493-574 (1971).
  19. Wong, C. J. Afferent and efferent connections of the diencephalic prepacemaker nucleus in the weakly electric fish, Eigenmannia virescens: interactions between the electromotor system and the neuroendocrine axis. J. Comp. Neurol. 383 (1), 18-41 (1997).
  20. Jun, J. J., Longtin, A., Maler, L. Real-time localization of moving dipole sources for tracking multiple free-swimming weakly electric fish. PLoS One. 8 (6), (2013).
  21. Rasnow, B., Assad, C., Hartmann, M. J., Bower, J. M. Applications of multimedia computers and video mixing to neuroethology. J. Neuro. Methods. 76 (1), 83-91 (1997).
  22. MacIver, M. A., Nelson, M. E. Body modeling and model-based tracking for neuroethology. J. Neuro. Methods. 95 (2), 133-143 (2000).
  23. Douglas, R. H., Hawryshyn, C. W. Behavioral studies of fish vision: an analysis of visual capabilities. In The Visual System of Fish. Douglas, R., Djamgoz, M. , Chapman & Hall. London. 373-418 (1990).
  24. Ciali, S., Gordon, J., Moller, P. Spectral sensitivity of the weakly discharging electric fish Gnathonemus petersi using its electric organ discharges as the response measure. J. Fish Biol. 50 (5), 1074-1087 (1997).
  25. Ratledge, D. An Introduction to Webcam Imaging. Digital Astrophotography: The State of the Art. , 31-44 (2005).
  26. Hofmann, V., Sanguinetti-Scheck, J. I., Gómez-Sena, L., Engelmann, J. From static electric images to electric flow: Towards dynamic perceptual cues in active electroreception. J. Phys. Paris. 107, 95-106 (2013).
  27. Castelló, M. E., Aguilera, P. A., Trujillo-Cenóz, O., Caputi, A. A. Electroreception in Gymnotus carapo: pre-receptor processing and the distribution of electroreceptor types. J. Exp. Biol. 203 (21), 3279-3287 (2000).
  28. Caputi, A. A., Castelló, M. E., Aguilera, P., Trujillo-Cenóz, O. Electrolocation and electrocommunication in pulse gymnotids: signal carriers, pre-receptor mechanisms and the electrosensory mosaic. J. Phys. 96 (5), 493-505 (2002).
  29. Pusch, R., et al. Active sensing in a mormyrid fish: electric images and peripheral modifications of the signal carrier. J. Exp. Biol. 211 (6), 921-934 (2008).
  30. Harder, W. Die beziehungen zwischen elektrorezeptoren, elektrischem organ, seitenlinienorganen und nervensystem bei den Mormyridae (Teleostei, Pisces). Z. Vgl. Physiol. 59 (3), 272-318 (1968).
  31. Bacelo, J., Engelmann, J., Hollmann, M., Gvonder Emde,, Grant, K. Functional foveae in an electrosensory system. J. Comp. Neurol. 511 (3), 342-359 (2008).
  32. Hollmann, M., Engelmann, J., Von Der Emde, G. Distribution, density and morphology of electroreceptor organs in mormyrid weakly electric fish: anatomical investigations of a receptor mosaic. J. Zool. 276 (2), 1469-7998 (2008).
  33. Knudsen, E. I. Spatial aspects of electric fields generated by weakly electric fish. J. Comp. Phys. 99 (2), 103-118 (1975).
  34. Kramer, B. Spontaneous discharge rhythms and social signalling in the weakly electric fish Pollimyrus isidori (Cuvier et Valenciennes) (Mormyridae, Teleostei). Behav. Ecol. Sociobiol. 4 (1), 66-74 (1978).
  35. Stoddard, P. K., Markham, M. R., Salazar, V. L., Allee, S. Circadian rhythms in electric waveform structure and rate in the electric fish Brachyhypopomus pinnicaudatus. Physiol. Behav. 90 (1), 11-20 (2007).
  36. Canfield, J. G. Methods for chronic neural recording in the telencephalon of freely behaving fish. J. Neurosci. Methods. 133 (1-2), 127-134 (2004).
  37. Chen, L., House, J. L., Krahe, R., Nelson, M. E. Modeling signal and background components of electrosensory scenes. J. Comp. Physiol. A. 191 (4), 331-345 (2005).
  38. Emran, F., Rihel, J., Dowling, J. E. A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities. J. Vis. Exp. (20), (2008).
  39. Windsor, S. P., Tan, D., Montgomery, J. C. Swimming kinematics and hydrodynamic imaging in the blind Mexican cave fish (Astyanax fasciatus). J. Exp. Biol. 211 (18), 2950-2959 (2008).
  40. Shapiro, L. G., Stockman, G. C. Computer vision. , Prentice Hall. Upper Saddle River, NJ. 367-368 (2001).
  41. Hedrick, T. L. Software techniques for two- and three-dimensional kinematic measurements of biological and biomimetic systems. Bioinsp. Biomim. 3 (3), 034001 (2001).
  42. Babineau, D., Lewis, J. E., Longtin, A. Spatial acuity and prey detection in weakly electric fish. PLoS Comp. Biol. 3 (3), (2007).
  43. Sanguinetti-Scheck, J. I., Pedraja, E. F., Cilleruelo, E., Migliaro, A., Aguilera, P., Caputi, A. A., Budelli, R. Fish geometry and electric organ discharge determine functional organization of the electrosensory epithelium. PLoS One. 6 (11), (2011).
  44. Castello, M. E., Caputi, A., Trujillo‐Cenóz, O. Structural and functional aspects of the fast electrosensory pathway in the electrosensory lateral line lobe of the pulse fish Gymnotus carapo. J. Comp. Neurol. 401 (4), 549-563 (1998).
  45. Canfield, J. G., Mizumori, S. J. Y. Methods for chronic neural recording in the telencephalon of freely behaving fish. J. Neurosci. Methods. 133 (1), 127-134 (2004).
  46. Pereira, A. C., Centurión, V., Caputi, A. A. Contextual effects of small environments on the electric images of objects and their brain evoked responses in weakly electric fish. J. Exp. Biol. 208 (5), 961-972 (2005).

Tags

Neuroscience גיליון 85 מעקב בעלי חיים דגי חשמל חלשים פריקת אורגן חשמלית הדמיה אינפרא אדום מתחת למים מעקב אחר תמונה אוטומטית תא בידוד חושי התנהגות גישוש
לטווח ארוך התנהגות מעקב של Freely בריכה בחולשת דגים חשמליים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jun, J. J., Longtin, A., Maler, L.… More

Jun, J. J., Longtin, A., Maler, L. Long-term Behavioral Tracking of Freely Swimming Weakly Electric Fish. J. Vis. Exp. (85), e50962, doi:10.3791/50962 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter