Summary
我々は、自由に同期して、感覚の内部に特別に設計された水槽の両方で正確かつ確実に、動物の電気器官吐出タイミング、上体位置姿勢を測定することにより、長時間にわたって弱電気魚の水泳の自発的挙動を研究するための技術のセットを記述隔離室。
Abstract
長期の行動追跡は、発生頻度の少ないものを含めて天然の動物行動を捕捉し、定量化することができます。このような探査と社会的相互作用のような行動は最高の気ままな、自由に行動する動物を観察することによって調べることができる。弱い電気魚（WEF）ディスプレイ、電気オルガン放電（EOD）を放出することによって容易に観察探索および社会的行動。ここでは、同期EOD、身体位置、および長期間自由遊泳WEFの姿勢を測定するために3つの有効な技術を記載している。まず、光、音、振動などの感覚刺激の外部ソースをブロックするように設計された隔離室の内部に実験槽の構成を記載している。水槽は、4つの試験片を収容するために区画され、自動化されたゲートは、遠隔中央アリーナに対する動物のアクセスを制御した。第二に、我々は自由にWEF水泳より正確で信頼性のあるリアルタイムのEODタイミング測定方法を説明。動物の身体の動きに起因する信号歪みは、空間的および時間的平均化処理ステージで補正される。第三に、我々は非摂動夜行性動物の行動を観察する水中近赤外イメージングのセットアップについて説明します。赤外光パルスは、長い記録時間にわたってビデオ及び生理学的信号間のタイミングを同期するために使用した。私達の自動化されたトラッキングソフトウェアは、水生シーンで確実に動物の身体の位置や姿勢を計測する。組み合わせて、これらの技術は、自由に確実かつ正確な方法で、弱電気魚の水泳の自発行動の長期的な観察を可能にする。我々は我々の方法は、同様に探索や社会的行動との生理学的信号を関連付けることにより、他の水生動物の研究に適用することができると信じています。
Introduction
背景 。動物の行動に関する定量的実験（ 例えば強制選択、ショック回避、T-迷路などが ）一般的に感覚運動技能、学習と記憶形成に関する特定の仮説を調査するために利用される。しかし、これらの制限の実験は、天然の動物の行動の豊かさの多くを欠場し、行動の基礎となる神経基盤の単純化モデルとなる可能性が高い。より自然な条件の下での実験は、それゆえ我々は、より完全に種の行動レパートリーを探ることのできる重要な補完である。自由に動く動物を含む実験は、しかし、このような動きによって誘発される記録の成果物として、それぞれの技術的な課題に対処する必要があります。刺激誘発反応とは異なり、自然発生探索行動を予測することはできません。このように実験対象は常に監視され、長期間にわたって追跡されなければならない。具体的な研究課題では、CANベスト厳選された生物および利用可能な技術的なツールによって対処する。例えば、そのような遺伝的にコードカルシウムセンサーとして光記録及び刺激技術1および2の光遺伝学正常に自由に遺伝モデル生物の3-5を移動させるために適用されてきた。代わりに、小型化された神経遠隔計測システムは、記録することができますし、小動物の6,7の移動を自由に刺激する。
電気魚 。 WEFの種は、彼らの身近に感知するために以上の長距離での通信を可能にする、電気オルガン放電（EODs）を生成します。 EODsの時間的なパターンは、自己の運動8,9、感覚刺激10,11、および社会的相互作用12,13等の異なる条件で異なります。連続的な擬似正弦波形を生成するための波型の種とは対照的に、パルス型WEF種は、離散的なパルス列を生成する。一般に、パルス型種展示MORE変数EOD率が波型種と比較し、そして動物のEOD率は密接に彼らの感覚周囲10,14の新規性の内容を反映している。パルス型の種はすぐに新たな感覚摂動（新規性応答10,11,14）への対応の単一パルス周期内でパルス間間隔（IPI）を短縮することができます。これらの魚の継続的な電気挙動は、外部からの制御不能な感覚刺激によって乱さすることができ、かつ、振動、音、電気、光などの刺激の異なる種類のトリガーノベルティ応答を知られている。そのため、特別な措置は、自由遊泳WEFの長期観察中に外部感覚刺激をブロックしたり、減衰させるように注意する必要があります。このように、EOD速度及び移動軌跡の変化は、具体的に実験者によって提示された刺激に起因し得る。
水槽と隔離室。そこで振動吸収材料の複数の層を置いたU大水槽（2.1 MX 2.1 MX 0.3メートル）NDER、光、電気的ノイズ、音と熱流束の外部ソースをブロックするために絶縁された筐体でタンクを囲んだ。 EOD率は、このように水温がしっかり南米WEFの種のために熱帯の範囲（25±1℃）に調節した、周囲の温度15,16によって異なります。私たちは、主に2次元（ 図1A）に制限されたWEFの空間探索行動を観察するために大きな浅い（10cmの水深）タンクを構築した。タンクは、空間的挙動を観察するために、中央の場に分配し、四隅の区画は、別々に、個々の魚（ 図1B）を収容する。各区画は、個人間の電気通信を防ぐために、防水建てられました。中央アリーナ動物のアクセスは4電動ゲートで外部からコントロールした。ゲートは、区画間に配置され、ロックされたときには、水密になったナイロンウィングナットで。 WEFは、金属に敏感に反応するので、全く金属部分は水中では使用されなかった。
EOD記録 。 EODsは17,18（Mormyrids中）単一または（Gymnotiforms中）の複数の空間的に分布電気器官の活性化によってステレオタイプのようにして生成される。髄ペースメーカーは、今度は前脳19から軸索投射を受ける間脳prepacemaker核、などの高次脳領域から直接、神経の入力を受け取るため、EOD率の一時的な変調は、より高いレベルの神経活動を明らかにすることができます。しかし、EOD時期は慎重に生波形記録から抽出され、動物の運動誘発性の歪みによってバイアスされていないする必要があります。 WEFによって生成される電界はダイポールとして近似することができるため、記録電極におけるEODパルス振幅は、動物、電極8,20間の相対距離と方向に依存する。動物の自己MOVEMエントは、このような動きは、異なる電極でのEODの振幅が（6月ら 8の図2（b）参照 ）は、揮発性の方法で経時的に変化させ、動物と電極との間の相対的なジオメトリを変更してください。電子オルガンの異なるセットからの相対的な寄与は、テール曲げて導入されたボディの長さと地元の曲率に沿ってそれらの位置に依存しているため、さらに、自己の運動もまた、記録されたEOD波形の形状を変更。 EOD振幅と形状の動きによって誘発される歪みは不正確で信頼できないのEODタイミング測定につながることができます。我々は、空間的に異なる位置に記録された複数のEOD波形を平均化することにより、かつ正確に自由遊泳WEFからEODタイミングを決定するために、エンベロープ抽出フィルタを追加することによってこれらの問題を克服した。加えて、我々の技術は、動物がEODの変化に基づいて、静止または能動的に移動しているかどうかを示すEOD振幅を測定する時間の経過とともに振幅（ 図2Eと2Fを参照してください）。我々は、コモンモードノイズを低減するために、記録電極対から差動増幅された信号を記録した。 EODパルスが不規則な時間間隔で生成されるため、EODイベントの時系列は、可変サンプリングレートを有する。選択肢の解析ツールによって必要な場合EOD時系列は、補間によって一定のサンプリングレートに変換することができる。
ビデオ録画 。 EOD記録は動物の総運動の活動を監視することもできますが、録画は、動物の体の位置と姿勢の直接測定を可能にします。近赤外（NIR）照明（λ= 800〜900 nm）のWEFsは暗闇の中で最も活発であり、その目はNIRスペクトル23,24に敏感ではないので、自由に魚21,22水泳の非摂動目視観察を可能にします。ほとんどのデジタル画像センサ（ 例えば CMOSまたはCCD）がwavelengtとNIRスペクトルをキャプチャすることができますフィルタ25をブロックする赤外線（IR）を除去した後800〜900 nmのHレンジ、。特定のハイエンド消費者向けのウェブカメラは、高精細、広視野角や画質に匹敵する、またはプロ級の赤外線カメラよりも優れて利用できる、はるかに大きなコストを生成することができ、良好な低照度感度を提供しています。また、一部の消費者向けのウェブカメラは、品質上の損失でビデオを圧縮することによって拡張された録画時間を許可する記録ソフトウェアにバンドルされています。ほとんどのプロ級のカメラは、デジタル化された信号と映像とのタイミングを合わせるために26時間の同期TTLパルス出力またはトリガTTLパルス入力を提供していますが、この機能は、消費者向けのウェブカメラで一般に存在しない。しかしながら、映像記録信号デジタイザとの間のタイミングを正確に同時に、カメラと信号デジタイザーで周期的に点滅IR LEDを撮像して一致させることができる。最初と最後のIRパルスタイミングを使用することができるs信号デジタイザ時間単位及びその逆に映像フレーム番号を変換するための2つのタイム較正マーカー。
照明＆背景 。水を介して、撮影は、水の表面での光の反射により、技術的に挑戦することができます。水面、水中、水上ビジュアルシーン、そして曖昧な視覚的特徴を反映するために、ミラーとして機能することができ、したがって水上記のシーンは、視覚的な干渉を防止するために特徴のないレンダリングしなければならない。画像の順序全体水槽では、カメラは水の上に直接配置される必要がある、そしてそれは、水面上での反射を防ぐために小さな視野穴の上の天井の後ろに隠されるべきである。光源が誤って投影される場合には更に、水の表面がグレア及び不均一な照明を生成することができる。間接照明は、天井に向かって光源を目指したことで全体の水槽の上に均一な輝度を達成することができますように、天井と周囲のWALlsが水面に達する前に、光線を反射して拡散することができる。カメラ（ 例えば 850 nmのピーク波長）のスペクトル応答と一致する赤外線照明器を選択してください。光源からの電気的ノイズは、LEDライトを使用し、ファラデーケージの外でDC電源装置を配置することによって最小限に抑えることができる。魚は近赤外波長で白色の背景によく対比さ以来、タンクの下に白い背景を配置します。同様に、隔離室の内面上に白色マットの使用は、均一で明るい背景照明を供給する。
ビデオトラッキング 。録画した後、自動画像追跡アルゴリズムは、経時的に、動物の身体の位置及び姿勢を計測することができる。ビデオトラッキングを自動的にのいずれか、すぐに使用できるソフトウェア（視点又はEthovision）、またはユーザープログラム可能なソフトウェア（またはOpenCVのMATLAB 画像処理ツール ）によって行うことができる。画像追跡の最初のステップとして、有効なトラッキングエリアは、（動作マスキング）の外側の領域を除外するために幾何学的形状を描くことによって定義される必要がある。次に、動物のイメージは、動物を含む画像から背景画像を差し引くことにより、バックグラウンドから単離する必要がある。差分画像は、重心と配向軸がバイナリモルフォロジー演算から計算することができるように、強度閾値を適用してバイナリ形式に変換される。 Gymnotiforms 27〜29と30〜32 Mormyridsでは、電子受容密度は、頭部領域の近くに最高であるため、任意の瞬間にヘッド位置が最も高く、感覚の鋭敏さの位置を示しています。頭部および尾部の位置が自動的に画像回転と境界ボックスの操作を適用することによって決定することができる。頭部および尾部端部は手動で最初のフレームで、二つの連続するフレームを比較から、それらの位置を追跡することによってそれらを定義することにより、互いに区別することができる。
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Protocol
この手順では、大学オタワの動物管理委員会の要件を満たしています。利害の競合が宣言されていない。下記の機器や材料のメーカーとモデルのための材料および試薬の表を参照してください。カスタム書かSpike2とMATLABスクリプト、およびサンプル·データは、補足ファイルで提供されています。
1。水槽と隔離室のセットアップ
- 抗 V リブレーションの床 。下から上（ 図1A）にゴムパッド、音響発泡スチロール、船舶用合板パネル、ポリウレタンフォームパッドを積層して防振面（2.1 MX 2.1メートル）を構築。水槽の縁をサポートするために、合板パネルの4木製スタッド（5センチメートル×10センチ）横たわっていた。
- 床暖房 。 （ 図1Dの下部を参照）を熱傾斜フォームパッドの上に電気的にシールドされた発熱体を築く。金属を加熱素子を覆う電気シールド用LICメッシュ。
- 空間的なタンク 。 （ 図1Aを参照）1.3センチメートルに厚い強化ガラスパネル、L字型のアルミフレームと水族館·グレードのシリコーンを使用して広く浅い水槽（1.8 MX 1.8 MX 30センチメートル）を構築。高い結像コントラスト（プロトコル3を参照）を提供するために、白地の大きなシートでタンクの下面を覆う。
- アクリルシート（0.64センチメートル厚いマットホワイト、）で作られた（22.5センチ）の壁を設置することにより（ 図1（b）参照 ）、中央·アリーナ（1.5メートル直径）に水槽を分割し、4隅の区画。
- 4湾曲した壁部を作成し、4コーナー区画から中央アリーナを分離するために、シリコンコーキングを使用してタンク底部に取り付けますに熱を加えることにより、曲げ4アクリルシート（22.5センチ×102.7センチメートル）。ゲートのインストールのために湾曲した部分の間に20センチのスペースを残す。
- 4重壁のWIをインストールして別々の隣接コーナーコンパートメントこのようなハイドロフォンなど水中のセンサーのための余分な電気的絶縁や場所を提供する第15cmのギャップ。
- 4電動ゲートを組み立てて、コーナーのコンパートメントと中央のアリーナの間にそれらをインストールしてください。
- 図1Cに示すように、4つのドアフレームを組み立てる。各ドア枠に6ウェル（0.64センチメートル深い）を作成し、ナイロンドングリナット（0.64センチメートル直径スレッド）を埋め込むとエポキシで固定します。
- アクリルゴムシートから4ドアパネルをカットし、ロック機構のためのアクリルゴムパネルに6つの穴（0.64g直径1cm）を作成します。シリコンコーキングを使用して、アクリル系、ゴムのパネルに参加します。
- アクリルをインストールすると、ドアフレームにドアパネルに参加するヒンジ。
- マウントされます（ 図1C参照 ）サーボモータに腕を振って、ドアフレームの上に取り付けます。ドアパネルにスイングアームをリンクするためにケーブルタイでのループを作る。
- GA上にゲートアセンブリを配置するpsの湾曲した壁部との間に作成され、シリコーンコーキングを使用してそれらを固定する。
- サーボコントローラにすべてのサーボモータを接続し、アクティブなUSB延長ケーブルを介して電源とコンピュータに接続します。サーボコントローラに供給された制御ソフトウェアを使用してゲートをテストする。
- シリコーンは硬化した後、ナイロンネジですべてのゲートをロックし、一度に1室を充填することにより水密性を確認してください。
- 隔離室 。 （ 図1D参照 ）水槽を囲み、光、音、電気的ノイズの外部ソースをブロックする隔離室を構築します。
- 3壁パネル（2 MX 2 MX 5cm）にし、4ドア·パネル（1.9 MX 0.95 MX 5センチ）を作る。各パネルには、矩形の枠を作成するために、アルミ成形品（5センチメートル×2.5 cm）の参加とアルミフレームの白い波形プラスチックパネルをリベット。パネル内の音響グラスファイバーバットを記入し、黒波形プラスチックパネルとの緊密な。
- 防振床に3壁パネルをインストールし、インストールしてピアノは壁パネルに4ドア·パネルに参加するヒンジ。
- アルミメッシュとの隔離室を囲むと、グランドはファラデーケージを作成するためにすべての側面に噛み合っている。
- 湿度制御 。加熱から過剰な湿気の蓄積を除去するために、低騒音、排気ファン（ 図1Fの一番上）をインストールします。少なくとも2メートル離れて記録サイトからの排気ファンを配置し、隔離室と排気ファンとの間に空気ダクトを取り付けます。
- 日常監視し、水槽の水と動物の状態を維持する。
- 10cmの深さ、100μS/ cmの導電率と水又は塩原液（レシピクヌーセン33を参照）加えてpHを7.0で一定に水の条件を維持する。 pHが6.5以下になると粉砕した珊瑚の袋を追加します。
- クリーニングのために浅瀬で動作することができ、垂直水槽のフィルタをインストールする通気目的（ 図1Fの下）。フィルターを外し、記録セッション中に、中央のアリーナの外にそれらを取る。
- ゴムひもで吸盤上に取り付けることにより、タンクの底にライブミルワームを提供します。録音中に浮遊プレイの制御不能な送を防止するために、このようなblackwormsなどのフリーフローティング餌を避けてください。
2。 EODの追跡
- 電極の取り付け 。 8黒鉛電極を組み立てて、同じように中央のアリーナの湾曲した壁のスペースにそれらを。
- さ（長さ15センチメートル、火星カーボン2ミリメートルタイプHB）のリード線を描く取得し、リードの外部コーティングを剃り落とす。
- 同軸ケーブル（RG-174）の8 10cmのセグメントをカットしたグラファイト棒の一方の端の周りにケーブルコアをラップし、熱収縮に強く、安定した電気的接続のためにそれらの上にチューブを適用します。両端（左図2A）のBNCジャックコネクタを接続します。</李>
- テーピングで壁に電極を配置し、シリコーンから保護するために、電極表面上にマスキングテープの薄いストリップを適用します。永久に電極を保持し、シリコーンが硬化（ 図2A右）の前に、すべてのテープを削除するには、シリコンコーキングを適用します。
- アンプ部に各電極からの距離を測定し、長さで同軸ケーブル（RG-54）を切断することにより8ケーブルアセンブリをビルドします。ケーブルの両端にBNCプラグコネクタを取り付けます。
- アンプユニットに全ての電極を配線するケーブルアセンブリを使用してください。差動で2 90°指向の電極を組み合わせることで増幅する（ 図2B参照 ）、ファラデーケージにそれらを接続することにより、すべての同軸シールド線を接地してください。
- 信号飽和限界以下のアンプゲインを設定し、ノイズを除去するバンドパスフィルタ（200Hzの-5 kHz）を適用する。 40 KS /秒で4つの記録電極対をデジタル化。
- オンライン信号処理。命令は、Spike2ソフトウエアのために書かれており、パラメータ設定がGymnotus種のために最適化される。 （概要について図2Cを参照してください）。
- 追加DCが全ての記録チャンネルにプロセス（τ= 0.1秒）を取り外します 。
- すべての録音チャンネルにRECTIFYプロセスを追加。
- すべての4つの録音チャンネルを合計することによって、仮想チャネルを作成します。
- は、RMS（二乗平均平方根を追加することで、EODパルスあたりの単峰エンベロープを抽出
明確パルスタイミングを決定するために、EODサイクルごとに単一のピークを生成するための仮想チャネル）の処理（τ= 0.25ミリ秒）。 - 仮想チャネルからrealmarkチャンネルを作成し、すべてのEODパルスWIをキャプチャするために、適切なしきい値を設定した後、時間とピーク振幅の値を記録パルス欠落thout、誤検知を回避しながら。
- 瞬時周波数モードにrealmarkチャンネルのチャンネル表示オプションを設定することで、リアルタイムで瞬時EOD率を監視します。
- realmarkチャンネルを複製することによって、リアルタイムでの魚の動きを監視し、 波形モードへの表示オプションを設定します。
- realmarkチャネル （0.01秒のサンプリング周期）から仮想チャネルを作成することにより、EOD振幅の傾きのRMSから活動レベルを定量化し、スロープ（τ= 0.25ミリ秒）とRMS（τ= 0.5秒）プロセスを追加。
- MATLABの形式にSpike2ソフトウェアでrealmarkチャンネルをエクスポートします。
明確パルスタイミングを決定するために、EODサイクルごとに単一のピークを生成するための仮想チャネル）の処理（τ= 0.25ミリ秒）。 3。同期されたビデオトラッキング
- 背景シーンを作成します。
- マットホワイトカウンターフィルムで覆うことにより、水面に反射をキャストし、任意のオブジェクトを非表示にします。
- 白いマットをインストールカメラと通気孔を非表示にするには、15センチメートル天井の下波形プラスチックパネル。
- カメラのキャリブレーションのための白い大きな紙に印刷グリッドパターン、コントラストの高いバックグラウンドを提供するために、タンクの下に置きます。
- 光源を取り付けます。
- 入手したIR LEDが点灯して、ノイズを低減するために、組み込みのファンを取り外します。ファラデーケージの外に配置され、電流直流安定化電源でLEDを駆動。
- IRは、暗闇の中でイメージング用ライト、およびテストの魚に日周光サイクルを駆動する白色LEDライトをLEDにインストールします。間接的で均一な照明（ 図3A）を達成するために、天井に向けて直接的全ての光源。
- 白を駆動することにより、日周光周期を調節するタイマー制御スイッチ（HRオフon/12 例えば 12時間）とLEDが点灯します。
- 直接水族館の上にカメラを設置。
- NIRに敏感なカメラを取得、またはIRブロッキングfilteを削除レンズ組立体の後方に着色ガラスの薄いシートを壊すことによってrを視野角は、画像全体の中央アリーナに十分な幅であることを確認してください。
- 天井パネルの中央にある小さな視聴穴を開け、穴の真上にカメラを置きます。
- 光源はグレアを生成する場合、レンズの周りに白い輪ガードを取り付けます。
- 時間同期録画を行います。
- 時刻同期パルス（1ミリ秒の持続時間、10秒周期）を生成するために4つのタンクのコーナーの一つにIR LEDを配置する。直列に負荷制限抵抗（1kΩの）を追加し、デジタイザハードウェアのデジタル出力ポートからIR LEDを駆動します。
- 利用可能な場合は、カメラにバンドルされているビデオ録画ソフトウェアを使用してください。最高記録品質（ 例えば可逆圧縮）およびサポートされている最高の解像度を選択します。
- EODの記録を開始する直前に録画を開始し、録画直ちにを停止EOD記録後直ちに。
- 記録後、直線的に第一及び信号デジタイザとビデオ記録によって捕捉最後の光パルスの間を補間することによって、デジタイザ時間単位に画像フレーム番号に変換する。
- 自動画像追尾
命令は、MATLABの画像処理ツールボックスのために書かれており、その機能を利用している。カスタムMATLABスクリプトは、自動化された画像トラッキングについては、この提出が設けられている。- ビデオをインポートします 。使用して、MATLABワークスペースに直接録画ファイルをインポート」Videoreaderを 。 読む 」機能を。
- 2つの画像フレームを合成して合成背景画像を作成する。別のフレームからの同じ領域の空き画像（ 図3（b）参照 ）を用いて動物が占有する画像領域を交 換してください。
- αを除外するために、中央競技場の周りに円形マスクを描画することで追跡するために画像領域を指定するREAの外側（ 図3Bの下）、および強度差の最小しきい値を設定する定数（R int型 ）を掛けます。背景以下の- （R INTは 1）例えば、RINT設定 = 0.85は強度変動15パーセント=を抑制します。
- 画像減算 。差分画像（=ΔIMk）を得るために、背景画像（IM = 0）から、画像フレーム（IM = k）を減算する。負でない整数として画像強度値を記憶する符号なし整数の数値精度を使用する。
- graythresh関数から決定された強度閾値を適用することにより、セグメントの差分画像を。 bwmorph機能を使用してバイナリ画像をきれいにし、regionprops機能を使用して、すべてのBLOB領域を計算した後、動物に対応する最大のBLOBを選択します。
- 重心と主要な方向Aを決定regionprops関数を適用し、x軸と長軸を整列させるために画像を回転することによって最大のブロブのXIS。重心（ 図3Dの上）での頭と尾の部分に画像を分割する。
- ヘッド部の長軸を決定し、X軸（ 図3D左下）と整合する画像全体を回転させます。頭と尾の部分の周りにフィットバウンディング·ボックスはregionprops機能を利用して長軸に平行である。
- 左、中央、バウンディングボックスの右側の垂直エッジ（ 図3Dの底に緑の点）でのブロブの中央値はy座標を決定し、そして5の特徴点（ヘッドチップ、半ば頭、中央体に割り当てる、半ば尾、尾の先端）。
- その前のフレームから決定され、動物の重心を中心とした画像フレームをクロップした後、連続したフレームを処理します。
- 手動で最初のフレームのためのヘッドの向きを割り当て、ドット積betweを使用二つの連続フレームからの配向ベクトルエン自動的に頭の向きを決定する。その結果を検査し、不正に割り当てられた場合は、手動でヘッドの向きを反転させます。
- それは神経質な外観を持っている場合、ヘッドチップを接合することにより、動物の軌跡をプロットし、中央値と平均値フィルタを用いて平滑化する（n = 3）であった。背景画像との軌跡を重ね、5つの特徴点（ 図2Eを参照）を使用して、魚の中線を補間する。
- 瞬時EODレート（100 Hzのサンプリングレート）と平均（0.0625秒の時間窓）をリサンプリングすることにより、各撮像時の平均EOD率を計算する。時間を一致させたEOD率から求めた擬似色で軌跡をプロットした（ 図2F参照 ）背景画像に重ね合わせる。
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Representative Results
EODの追跡結果
彼らのユニークな位置と方向（ 図2Cの上部）から予想されるように異なった電極対から記録されたEOD波形は振幅と形状に変化した。複数の電極対の使用は、タンク内のWEFのすべての可能な位置および向きで強い信号の受信を確実にした。エンベロープ波形（ 図2C下 、緑のトレース）は常に正確（= IPI -1）パルス間の間隔と瞬時EOD率を決定するための信頼できる時刻のマーカーを務めEODサイクルごとに単一のピークを含んでいた。連続したEODピークが参加し、線形補間を一定の時間間隔（ 図2Dトップ 、黒のトレース）で、瞬時EOD率も同様に一定の時間間隔（ 図2D底 、ピンクの線）で補間されたされた。一定時間のリサンプリング手順は、時間同期が容易であること運動軌道とEOD信号をトゥイーンし、常にサンプリングされた時系列データのための分析ツールより多くから活用することができます。動物が残ります（ 図2Eトップ ）であったが、動物は双極子の位置と向き（ 図2Fの一番上）を変えに移動しながら、それが時間の経過とともに変化させながら、外部電極で記録されたEOD振幅は一定であった。このように、魚の動きが時間の経過とともに、EOD振幅の変化を観察することから推測することができた。魚が残ります（ 図2E下 ）であったベースラインのEOD率が低いままであるが、魚は積極的に（ 図2Fトップ ）泳いでいる間EOD率が有意に高くなった。以前8,9,34,35を報告したように我々の観察は、EOD率と魚の動きとの間に正の相関関係と一致している。
ビデオ追跡結果
動物の軌道と中線を図に示されている最初と最後の画像フレームとのURE 3eが重畳。魚が急に2秒間回転させ、魚の中線が200msec毎にプロットされている間の姿勢変化の時間経過が捕獲された。魚の正中線が正しくヘッド先端で開始され、魚の尾の先端で終了。密接に動物がキャスト影のにもかかわらず、自動的に追跡中線と合意した魚のイメージが。 図3Fは、魚の頭の時間を一致させた軌跡が重畳されている色は、時間変化の平均EOD率を（τ= 0.0625秒）を示しチップ。動物が回転位相の途中であった期間を回す2秒の間に、平均EOD率がピークに達し、料金は回転の終わりに向かって減少した。この代表的な結果は、我々のメソッドが正常に自由遊泳中のセルフガイドの動きやEOD率変調の間の関係を研究するために適用することができることを示している。
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図1。水族館タンクと隔離室のセットアップ。A）の実験室は、防振フローリング、水槽、及び隔離室。B）水族館の水槽は、ハウジングの個々のために実験し、4隅の区画を実行するための中心的な競技場に分かれていたで構成されています魚。各区画は、動物間の電気通信を防止する水密造られた。C）電動ゲートは、複数のパースペクティブ角度で示されている。ゴムパッキン（薄茶色のシート）を圧縮6ウィングナットでロックされた時にゲートが水密になる。一旦アンロック、ゲートがリモート上にサーボモータにより動作させることができる。D）分離チャンバは、3ワットを接合して組み立てた両側から水槽へのアクセスを提供し、すべてのパネルと4ドアパネル、。下のパネルは、タンクエッジを支持するための木製レールと床暖房の配置を示す図である。アルミニウムメッシュの層はその電気ノイズを遮蔽するヒータを覆っている。E）分離チャンバの壁及び扉パネルは、構造支持体（3）のためのアルミニウムフレームから構築した。チャンバの内部表面は、（5）内部の光源を反射するように白色プラスチックパネルによって覆われ、外観は外部光源を遮断するために黒いプラスチックパネル（2）によって覆われている。アルミメッシュは、（1）外部の電気的ノイズを遮断するために外壁を覆う。そして下の写真は、洗浄用の水のろ過のセットアップを示して拡散し、間に水槽の水を曝気;。壁が一番上の写真は、発熱から発生する余剰湿気を取り除くための換気のセットアップを示しています）（4）F音響グラスファイバーバットで満たされている実験的セッション。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
図2。 EOD記録の設定と代表的な結果であって、a）左側のパネルは、薄いグラファイト電極、同軸ケーブルの短いセグメント、およびBNCジャックからなる電極アセンブリを示している。右側のパネルには、電極取り付け手順を示しています。マスキングテープを一時的に電極組立体を位置決めするために使用され、シリコーンコーキングが永久電極を保持するために適用した。B）配線図。二つの90°指向電極は差動増幅させ、濾過、対になっている。 4つの記録チャネルはファラデーcの外でデジタル化したEOD信号処理ステップの時代。C）イラスト。上部トレースは、整流され、以下に灰色トレースを生成するために合計される4つの電極対からの生波形を示している。単峰エンベロープは、「 二乗平均平方根 」（RMS）フィルター（緑のトレース）を使用して、灰色の波形から抽出される。 EODの振幅およびIPIを包絡線のピーク。D）時間変化する振幅EOD（上）と、瞬時EOD率（下部）はCよりも長い時間スケールで示されている）から決定される。 EOD振幅と瞬時レート（= IPIは-1）エンベロープピーク（黒のトレース）を接合することで、一定の時間間隔で補間されます。E）の Dと同じ）が、魚が休息。 女であったより長い時間スケールでプロット）魚が活発に泳いでいた間）Eと同じ。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
図3。ビデオトラッキングの設定と代表的な結果であって、a）照明や カメラの設定が示されている。赤外線（IR）及び可視光源は、天井面に反射し、タンク全体にわたって均一な照明を投影するための光を拡散するように、壁に取り付けられ、天井に向かって尖っている。カメラは水の表面での反射を防ぐために、天井パネルの上方に隠されている。 IR LEDは、時刻同期パルスを発生するために4つのタンクのコーナーの一つに位置している。B）複合背景画像の生成が示されている。 2つの画像フレーム（上の画像）を、動物を含む領域を置換する（そのようにして合成背景画像（左下）を形成するために結合される動物（破線の赤の広場）のない領域と蓋赤い四角）。魚の輪郭を分離する中央競技場の外側の領域を黒でマスクされている（右下）。C）。画像フレームの体位の（左上）、差分画像（左下）を生成する（右上）背景画像から減算され、強度閾値を適用することにより二値画像（右下）に変換される。D）測定姿勢が示されている。動物（ブロブ）の二値画像は、x軸（右上）と、その長軸を位置合わせするために回転し、その重心を中心とした。ブロブは、ヘッド（赤）とテール（青）の部分に分離し、各部分を別々に、そのバウンディングボックスを決定するために回転させた。 BLOBは、動物の基準のフレーム（左下）、および5の特徴点（ヘッドエンド、ミッド頭、中央体、半ばテール、テールエンド）を向いたが、境界ボックスの中間点から決定したエッジ。E）タイムラプスIM魚の中線の時代ごとに200ミリ秒をプロットした。最初と最後の画像フレームが持続期間を旋回2秒の間に重畳される。F）平均EOD率は擬似カラーで表現し、魚の頭の軌跡が重畳される。同じ画像は、Eのように使用されている）。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
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Discussion
私たちの技術の重要性。要約すると、我々は最初の大水槽の建設やWEFによって生成自発的探索行動を観察する隔離室を説明した。次に、複数の電極対を用いてリアルタイムでEOD速度および無拘束魚からの移動状態を記録および追跡する技術を実証した。最後に、我々は、時間同期の方法で水を介して赤外線ビデオ記録技術、および上体位置姿勢を測定する画像追跡アルゴリズムを記載した。実験準備として、WEFは、アクティブな電気感覚のサンプリングレートに等しく容易に定量EOD率を示すことにより、アクティブな感覚誘導行動を調査するための重要な利点を提供しています。これらの技術の組み合わせは、拘束されていないWEFからの自然な行動の正確で信頼性の高い長期的な観察8を有効にすることができます。さらに、我々のセットアップの大部分は、FRを構築することができますOM建材や容易に入手、電子部品に広く利用できる。ここに記載された技術が開発され、近年、我々の実験の要件を満たすようにテストされている。したがって、我々は自由遊泳WEFからの自然探索行動の今後の研究のためにこれらの技術をお勧めします。
隔離室 。隔離室は、様々な程度の有効性の光、振動、音、電気ノイズの外部ソースを遮断することによって十分に制御された実験条件を提供する。遮光性能が暗い隔離室の内部に電動カメラを配置することにより試験し、外部光の漏れは、リモートパンコントロールを使用してすべての場所をスキャンした後、カメラから観察されなかった。外部の床から運ば振動し、複数のゴム発泡体層の積層に対してタンク提供減衰の下にインストール振動減衰表面が大部分を遮断するための効果的であった外部振動イベント。しかし、このような近隣の場所で大声でドア閉などの断続的な振動事象はまれで新規性の応答を誘発するでした。防振エアテーブルが背景振動から、優れたアイソレーション性能を提供できますが、それは私たちの水槽のための十分な大きさのエアテーブルを購入する法外に高価である。したがって、我々は大きな外部振動が新規性の応答を引き起こしたイベントを検出し、除外するハイドロフォン水中に置いた。さらに、実験室の外のノイズの影響を最小化するために、我々の実験は、（6時以降）オフピーク時に実施された。同様に、外部の空気中の音響ノイズは、グラスファイバーバット断熱材で満たされた隔離室の壁を経由して減衰した。我々は客観的に音の減衰性能を定量化しなかったが、ラボ環境での背景音のほとんどは新規性の応答をトリガしませんでした。外部のトリガからまれに、突然の大きな音ED新規性応答、しかし、このようなイベントは、ハイドロフォン記録により検出され、それらはめったにオフピーク時間帯に発生しなかった。水槽は、我々の動物が自由に泳ぎ、探索するための十分な大きさの領域を提供した。タンクの大きさは、我々が（最大30 cm）の使用される種の長さに比例して選ばれた、より小さな動物を使用した場合にタンクのサイズが縮小することができる。我々はGymnotus SP を選択しました。自由遊泳36時の電気生理学的記録を容易にするために、それらの大きな頭蓋骨のサイズの異なるパルス型種間。電気的な記録品質をより高価な銅メッシュを使用して、湿度制御に用いる排気ファンを遮蔽するより向上させることができる。
EOD測定技術 。我々のマルチチャネルEOD記録技術は、自由に泳ぐ魚をより正確で信頼性の高いEODタイミング測定を可能にした。私たちの技術を使用して、自由にWEF水泳によって生成されたすべてのEODパルスが罪を欠落または追加することなく、検出された6時間の長時間録音の間、GLEパルス（ ら 8 6月中の図12を参照）。 EOD記録対策のみならず、EOD率だけでなく、外部電極で記録されたEODのピーク振幅を変化させてから活動レベル。記録されたEOD振幅は、従って、動物の動きがEOD振幅（ 図2F）の変化を誘導し、動物及び記録電極との間の相対的な幾何学的形状によって決定される。活動レベルは、移動ウィンドウ（0.5秒）以内にEOD振幅の傾きの変動（実効値）から計算した。この方法を用いて、ビデオ記録は、長い期間にわたって活性レベルを測定するために必要とされない、単独EOD記録が十分であってもよい。代わりにビデオ記録を使用する、WEFの上体位置姿勢は、電極の位置、タンクの形状、及び電流ダイポールの理論モデルに基づいて、単独でEOD記録から推測することができる。同じようなrecordiを使用してngのセットアップ、ジュンら 20は、既知の電流ダイポールの位置で予測された信号強度を含むルックアップテーブルのエントリを有する複数の記録電極対で測定された信号強度を比較して物体の存在下で複数のWEFsを追跡するためのリアルタイムの電気追跡手法を提案した。電気追跡方法は、動物は、多くの場合、ビューから、またはトラッキング、複数の動物の間に閉塞しましょ視覚的に雑然とした環境で改善された追跡の信頼性を提供しています。 WEFの自然の生息地は、電気トラッキング方法が視覚追跡よりも簡単セットアップ要件に、より信頼性の高い追跡を提供できるような水生植物や根などの多くの視覚的な障害物が含まれています。原則として、本手法は、フィルタの時定数を変更した後の波型WEF種に直接適用される。 EOD波形は波型の種でほぼ正弦波であるため、整流ステップは、EODサイクルごとに二つのモードを紹介します。この場合瞬時EOD率が負のEOD相を無視し、他のすべてのEOD時間マーカーをスキップすることにより決定することができる。それらは近くに泳ぐときWEFは、記録電極を検出することができ、したがって、我々は遠く37から感知され、代わりに薄いグラファイト電極（直径2mm）を使用することができる大規模または金属電極を使用して回避する。シンナー同軸ケーブル（RG-174）は、柔軟性のための電極アセンブリで使用された、しかし、厚い同軸ケーブル（RG-54）は、優れた電気的シールドのための拡張された長距離配線に使用された。 EOD長い記録期間は、サンプリングレートを低下させることによって達成されたが、トレードオフとして低級時間分解能にすることができる。 EOD率の平均および変動性は、種間で変化し、従って瞬時EODレートを平滑化するための時間窓を適切に調整する必要がある。短い時間ウィンドウが短い平均とIPIを（ 例えば Gymnotiforms）が小さく変動し、より長い時間WINDOを有する種をお勧めしますWはIPIを（ 例えば Mormyrids）に長く、平均より高い可変性を有する種をお勧めします。
照明や カメラの設定 。ビデオ記録は、定量的および定性的な行動観察を提供し、ここでは、設定した記録、及び画像データを処理するための手順を説明した。照明設定は、高品質の画像を生成するのに重要な役割を果たしており、投光角度が水中動物を画像化するための重要な因子である。準最適な照明条件の下で、水面は、動物が表面波を生成するときに、特に画像トラッキングと干渉する可能性がグレア及び反射を形成することができる。グレア及び反射の問題は、タンクの底部から光源を投影することにより除去することができる。小タンクについては、LEDのアレイは、タンクの真下に配置することができ、均一な光強度38を生成するために、拡散板を通って光る。同様に、より大きなタンク、光源cのタンクの下方に配置され、均一な光強度が39を拡散する光に対して十分な距離を可能にすることによって達成することができる。私たちのセットアップでは、我々はスペースの制約、構造安定性、タンクの下のヒーター配置にはタンクの上から光を投影することを余儀なくされた。私たちは、光源が天井に向けて投射されたように、間接照明を使用することによってグレアや反射の問題を回避した。チャンバー特徴のないとマットホワイトの上部をレンダリングすることによって、全く反射が水面上見られなかった。イメージに全体の中央競技場、広角レンズをカメラに取り付けることができますが、一部のレンズ（魚眼レンズ）が重要な樽型の歪曲収差が発生することがあります。樽型の歪曲収差は、タンク中央に見たグリッド位置の画素座標を測定するために、タンクの下に較正グリッドシートを用いて補正することができる。一緒センチメートル単位で対応するグリッド位置と、変換行列を共に計算することができる樽型の歪曲収差40を修正してください。十分な数のピクセルが正しく、その身体の姿勢を測定するために動物から得ることができるように、動物の大きさは、タンクの大きさよりもはるかに小さい場合、我々は、高解像度カメラをお勧めします。
画像追跡および時刻同期 。ここで説明した画像追跡アルゴリズムを迅速に身体の位置および姿勢を測定するための関心領域（ROI）の動作を利用する。 ROI動作は、処理対象の画像サイズを縮小し、前フレームからの動物の位置の近くトラッキング範囲を制約する。我々は、画像の回転や境界ボックスの操作の代わりに、時には明確に定義された単一の正中線を生成するために失敗した通常の画像スケルトン化操作を使用して、上体姿勢（正中線）で抽出した。参照の動物のフレームは自己中心的な行動分析が可能にヘッドバウンディングボックスの中央に位置していた。画像trackiにおける誤差の主な原因ngの広角端での投影光学効果によるものであった。理想的には、動物の垂直運動は2次元位置測定に影響を及ぼすべきではない、しかし、遠く離れた中央の撮影軸から、垂直方向の寸法の大部分は、カメラに投影される。水面での屈折は、我々のイメージングセットアップ（カメラの高さ= 1.8メートル、水深= 10センチ、タンク半径= 75センチ）28％光学投影効果を低減し、最悪の位置誤差は、円形で±1.4 cmであったフェンス。 EODとビデオ記録の間のタイミングは、ビデオ及び信号デジタイザクロック、異なる記録起動時間の間の時間のずれを考慮するために、赤外線LEDのパルスを用いて同期した。ビデオおよびEOD記録間の時間同期における予想される不確実性は、フレームキャプチャ区間に比例し、例えば、毎秒15フレーム（fps）のフレームキャプチャレートは、±33ミリ秒のタイムアラインメント不確実になります。ティムの程度電子精度が遅く移動する魚を追跡するために十分であるが、高速度カメラは、動物を移動させるより高速追跡するために必要とされてもよい。センサの露光時間がフレームレートに反比例するので、我々は、増加したフレームレートを有する明るい光強度をお勧めします。
今後の課題 。複数WEFs間の社会的相互作用は、そのEOD信号と体の位置を追跡することによって研究することができ、追跡システムが正常に同じ個体の位置がEODを関連付ける必要があります。 6月らによって記載双極子位置特定方法によれば、20を用いて同様のセットアップ、複数の電極で受信し、それらのEOD信号によって推測動物の位置は、正確に異なる個体からEODパルスを識別するための視覚追跡出力に一致させることができる。複数の動物の画像追跡は、ROI動作を使用して、一度に一つの個体を行うことができる。 ROIは、最初に、個々の周りに定義することができます追跡され、ROIが更新された身体の位置を毎フレームごとに再配置されます。それはROIのoutside表示されたら、他の魚は、画像追跡、分析から除外され、内部があらわれた場合、他の魚のイメージが自動的にそのイメージは、ROIの境界を触れたかどうかをチェックすることによって除去することができる。場合によっては、2匹の動物が互いに接触し、それらの画像がマージと、もしそうであれば、マスクは、手動で他の魚のイメージを分離するために引くことができる。もう一つの興味深い今後の課題は、獲物捕獲22または社会的相互作用の間に複雑な動きシーケンスを明らかにするために3次元ビデオ追跡している。マッキーバーら 22は、3次元人体モデルを再構築するための上部と側面から長方形の水槽を表示するには、2台のカメラを使用していました。サイドビューをブロックし、水族館の深さよりもはるかに大きな幅を有し、仕切る壁があるのでしかし、このアプローチは、我々の場合では動作しません。その代わりに、よりアプリであろう別の視点で天井に複数のカメラをインストールするためのケーブルがヘドリック41によって使用されるセットアップに似て角度。より高い精度のために、水及び斜めカメラアングルによって導入屈折効果は、三次元画像を較正することによって補正されなければならない。私たちの視覚的な追跡方法は、魚が近くのオブジェクトを泳ぐとき、魚の体表面42,43上の電気的な画像の流れを研究するために適用することができた。ホフマンら 26によって研究されるように、被写体距離、形状、大きさ、材料に応じて自由遊泳中にオブジェクトの画像の電気の流れを調べることは興味深いであろう。魚は、オブジェクト探査や社会的相互作用に従事しながら、最終的には、自由に魚44〜46を泳いでからの神経の録音と組み合わせた私たちの方法は、神経活動の変化やEOD率の観測によって新たな洞察を明らかにすることができる。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
この作品は、寛大に自然科学とカナダの工学研究評議会（NSERC）と健康の研究（CIHR）のカナダの協会によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aquarium Construction | |||
| Electrically shielded floor heater | ThermoSoft Corp., IL, USA | ThermoTile | www.thermosoft.com |
| Tempered glass panel | generic | 0.5 in thick, used for the aquarium construction | |
| Aquarium grade silicone | generic | ||
| Acrylic sheet | generic | 0.25 in thick, matte white | |
| Natural rubber sheet | generic | 0.25 in thick | |
| Servomotor | HTECHRCD Inc., Korea | HS-325HB, 180deg rotation | www.servocity.com |
| Servomotor arm mount | HITECHRCD Inc., Korea | 56362 Large Spline | www.servocity.com |
| Servomotor controller (6 channels) | Sparkfun | ROB-09664 | Micro Maestro 6-channel USB Servo Controller |
| Active USB extension cable | C2G | 38990 | 12 m USB 2.0 A Male to A Female 4-Port Active Extension Cable |
| Exhaust fan | Nutone | ILFK120 | www.homedepot.com |
| Vertical aquarium filter | Tetra, Germany | Whisper Internal Power Filter - 40i | |
| Crushed coral | Used to increase the pH of the tank water | ||
| EOD Recording Setup | |||
| Graphite Electrodes | Staedtler, Germany | Mars Carbon 2-mm type HB | Shave the outer coating |
| Physiological Amplifier/Filter | Intronix, Canada | 2015F | |
| Coaxial Cable | generic | RG174 | For electrodes assembly |
| Coaxial Cable | generic | RG54 | For wiring use |
| BNC jack connector for RG-174 | Amphenol Connex | 112160 | For electrodes assembly |
| BNC plug connector for RG-54 | Amphenol Connex | 112116 | For wiring use |
| Signal digitizer hardware | Cambridge Electronic Design, UK | Power MKII 1401 | |
| Signal digitizer software | Cambridge Electronic Design, UK | Spike 2. ver 7 | |
| Visual Tracking Setup | |||
| White LED light | IKEA, Sweden | DIODER 201.194.18 | www.ikea.com |
| Infrared LED light (850 nm) | Scene Electronics, China | S8100-60-B/C-IR | Remove built-in fan |
| USB webcam | Logitech Inc., CA, USA | C910 | Remove Infrared blocking filter |
| Motorized camera | Logitech Inc., CA, USA | Quickcam Orbit | Remove Infrared blocking filter |
| Video recording software | Logitech Inc., CA, USA | Logitech Quickcam Software | Download from www.logitech.com |
| MATLAB | Mathworks, MA, USA | 2012a | Image processing toolbox |
References
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