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Neuroscience

자유롭게 수영 약하게 전기 생선의 장기 행동 추적

doi: 10.3791/50962 Published: March 6, 2014

Summary

우리는 자유롭게 기적 감각 내부 특별히 설계된 수조의 모두 정확하고 안정적​​으로 동물의 전기 기관 방전 타이밍, 상체 위치 자세를 측정함으로써, 장기간에 걸쳐 약하게 전기 물고기 수영의 자발적 행동을 연구하기위한 기술의 집합을 설명 격리 실.

Abstract

장기 행동 추적이 자주 발생하는 등의 천연 동물의 동작을 캡처하고 수치화 할 수 있습니다. 이러한 탐사 및 사회적 상호 작용 등의 행동은 가장 억제되지 않은, 자유롭게 행동하는 동물을 관찰하여 공부하실 수 있습니다. 약한 전기 물고기 (WEF) 디스플레이 전자 오르간 방전 (EOD)을 방출하여 쉽게 관찰 탐구와 사회적 행동. 여기서는 동기 EOD, 상체 위치 및 시간의 장기간 동안 자유 수영 WEF의 자세를 측정하는 세 효과적인 기술을 설명한다. 첫째, 우리는 빛, 소리, 진동과 같은 감각 자극의 외부 소스를 차단하도록 설계 분리 챔버의 내부 실험 탱크의 구성을 설명한다. 수족관은 네 개의 시험편을 수용하기 위해 분할 및 자동 게이트 원격으로 중앙 무대에 동물의 접근을 통제했다. 둘째, 우리는 자유롭게 WEF 수영에서 정확하고 안정적​​인 리얼 타임 EOD 타이밍 측정 방법을 설명. 동물의 신체의 움직임에 의한 신호 왜곡은 공간 및 시간 평균 처리 단계에 의해 수정된다. 셋째, 우리는 교란 야행성 동물의 행동을 관찰 할 수있는 수중 근적외선 영상 설정에 대해 설명합니다. 적외선 광 펄스는 긴 기간 동안 녹화 영상 및 생체 신호 간의 타이밍을 동기화하기 위해 사용되었다. 자동화 된 추적 소프트웨어 수생 씬 안정적 동물의 상체 위치 자세를 측정한다. 조합에서는 이러한 기술을 자유롭게 안정적이고 정확한 방식으로 약하게 전기 물고기 수영의 자발적 행동의 장기 관찰을 가능하게합니다. 우리는 우리의 방법이 유사하게 탐색 또는 사회적 행동과 생리 신호를 관련하여 다른 수생 동물의 연구에 적용 할 수 있다고 믿는다.

Introduction

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배경입니다. 동물의 행동에 대한 정량 실험 (예를 들어 강제로 선택, 충격 방지, T-미로 등은.) 일반적으로, 감각 - 운동 능력에 관한 학습과 기억 형성 특정 가설을 조사하기 위해 사용된다. 그러나 이러한 제한적인 실험은 자연의 동물 행동의 풍요 로움을 많이 그리워하고 행동의 기본이되는 신경 기초의 과도하게 단순화 된 모델을 초래할 가능성이있다. 자연주의 조건에서 실험 그러므로 우리가 더욱 완벽 종의 행동 레퍼토리를 탐구 할 수있는 중요한 보완. 자유롭게 이동하는 동물을 포함하는 실험은, 그러나, 이러한 운동에 의한 기록 유물 등의 고유 한 기술적 과제를 해결해야합니다. 자극 유발 된 반응과는 달리, 저절로 발생하는 탐색 동작은 예측 될 수 없으며, 따라서 피험자는 끊임없이 모니터링하고 장기간에 걸쳐 추적한다. 특정 연구 질문은 캘리포니아N 가장 엄선 된 생물 및 사용 가능한 기술 도구에 의해 해결 될 수있다. 예를 들어, 유전자 인코딩 칼슘 센서 1 optogenetics 2와 같은 광 기록 및 자극 기술이 성공적으로 자유롭게 유전자 모델 생물 3-5를 이동하기 위해 적용되었습니다. 또한, 소형화 신경 원격 측정 시스템은 기록 할 수 및 작은 동물에게 6,7를 이동 자유롭게 자극한다.

전기 물고기. 세계 경제 포럼 (WEF)의 종은 그들의 즉각적인 환경을 감지하거나 더 먼 거리를 통해 통신 할 수 있도록 전자 오르간 방전 (EODs)를 생성합니다. EODs의 시간적 패턴은 자기 운동 8,9, 감각 자극 10, 11, 12, 13 및 사회적 상호 작용 등 다양한 조건에 따라 다릅니다. 연속 준 사인 파형을 생성하는 웨이브 형태의 종을 반대 펄스 형 WEF 종, 개별 펄스의 열차를 생산하고 있습니다. 일반적으로, 펄스 형 종 전시 MORE 변수 EOD 속도는 웨이브 형 종에 비해, 그리고 동물의 EOD 요금은 밀접하게 자신의 감각 주변 10,14의 새로운 내용을 반영합니다. 펄스 형 종은 바로 새로운 감각의 섭동 (새로운 응답 10,11,14)에 응답으로 단일 펄스주기 내 펄스 간 간격 (IPI)을 단축 할 수 있습니다. 이 물고기의 지속적인 전기 동작은 외부 소스에서 제어되지 않는 감각 자극에 의​​해 교란 될 수 있고, 진동, 소리, 전기, 빛 등의 자극의 종류는 트리거 참신 응답 알려져있다. 따라서 특별한주의는 자유 수영 세계 경제 포럼 (WEF)의 장기 관찰하는 동안 외부 감각 자극을 차단하거나 약화주의해야합니다. 이러한 방식으로, EOD 속도와 이동 궤적의 변화는 특별히 실험자 제시 자극에 기인 할 수있다.

수족관 탱크와 분리 실. 따라서 우리는 진동 흡수 재료의 여러 레이어를 배치 U개 nder 큰 수족관 탱크 (2.1 MX 2.1 MX 0.3 m), 그리고 빛, 전기 노이즈, 소리와 열 플럭스의 외부 소스를 차단하는 절연 케이스와 탱크를 포위. EOD 속도는 주위 온도 (15, 16)에 따라, 따라서 물 온도는 단단히 남미 WEF 종의 열대 범위 (25 ± 1 ℃)로 조정했다. 우리는 주로 두 가지 차원 (그림 1A)에 제한 WEF의 공간 답사의 행동을 관찰하기 위해 크고 얕은 (10cm 수심) 탱크를 건설했다. 탱크는 별도로 개별 물고기 (그림 1B)를 수용 할 수있는 중앙 공간 행동을 관찰하는 분야, 4 개의 코너 구획으로 분할했다. 각 구획은 개인 간의 전기 통신을 방지하기 위해 방수 지어졌다. 중앙 무대에 동물의 접근은 네 개의 모터 게이트에 의해 외부에서 제어되었다. 게이트는 구획 사이에 배치하고, 고정 할 때 수밀 된되었습니다나일론 윙 너트로. 세계 경제 포럼 (WEF)은 금속에 민감하게 반응하기 때문에 어떤 금속 부품은 수중 사용되지 않았다.

EOD 기록. EODs은 (Mormyrids에서) 하나의 활성화 또는 17, 18 (Gymnotiforms에서) 여러 공간적으로 분산 된 전기 기관에 박힌 방식으로 생성된다. 수질 페이스 메이커는 다시 전뇌 19에서 축삭 돌기를받는 diencephalic prepacemaker의 핵으로 높은 뇌 영역에서 직접 신경 입력을 수신하기 때문에 EOD 속도의 시간적 변조는 높은 수준의 신경 활동을 공개 할 수 있습니다. 그러나, EOD 타이밍은 신중 원시 파형 기록에서 추출하여 동물의 이동에 의한 왜곡에 의해 바이어스되지해야합니다. WEF에 의해 생성 된 전계는 다이폴로서 근사화 될 수 있으며, 따라서, 기록 전극의 EOD 펄스 진폭은 동물 및 8,20 전극 사이의 상대 거리 및 방향에 의존한다. 동물의 자기 movem엔트 따라서 운동이 다른 전극의 EOD의 진폭 (6 월 등. 8도 2b 참조) 휘발성 방식으로 시간이 지남에 따라 달라질 수, 동물과 전극 사이의 상대 형상을 변경합니다. 전기 기관의 다른 세트에서 상대적 기여도가 꼬리 굽힘에 의해 도입 된 몸 길이와 그 지역의 굴곡을 따라 자신의 위치에 달려 있기 때문에 또한, 자기의 움직임도 기록 EOD 파형의 모양을 변경합니다. EOD의 진폭과 모양의 운동에 의한 왜곡이 정확하고 신뢰할 수없는 EOD 타이밍 측정을 초래할 수 있습니다. 우리는 공간적으로 상이한 위치에 기록 체류 EOD 파형을 평균화함으로써 이러한 문제를 극복하고, 정확하게 자유 수영 WEF에서 EOD 타이밍을 결정하는 포락선 추출 필터를 추가하여. 또한, 우리의 기술은 동물이 EOD의 변화에​​ 따라 휴식 또는 적극적으로 이동할지 여부를 나타내는 EOD의 진폭을 측정한다시간이 지남에 따라 진폭 (그림 2E와 2F 참조). 우리는 공통 모드 노이즈를 저감하기 위해, 기록 전극 쌍에서 차동 증폭 된 신호를 기록했다. EOD 펄스가 불규칙한 시간 간격으로 생성되기 때문에, EOD 이벤트 시계열는 가변 샘플링 레이트가있다. 선택의 분석 도구를 사용하여 필요한 경우 EOD 시간 시리즈는 보간에 의해 일정한 샘플링 레이트로 변환 할 수 있습니다.

비디오 녹화. EOD 녹화 동물의 총 운동 활동을 모니터링 할 수 있지만, 비디오 기록은 동물의 몸 위치 자세의 직접적인 측정을 허용한다. 근적외선 (NIR) 조명 (λ = 800 ~ 900 nm의)는 WEFs 어둠 속에서 가장 활성화되고 그들의 눈 NIR 스펙트럼 (23, 24)에 민감하지 않기 때문에 자유롭게, 생선 (21, 22) 수영의 교란 육안 관찰을 허용합니다. 대부분의 디지털 이미징 센서 (예를 들면 CMOS 또는 CCD)는 wavelengt과 NIR 스펙트럼을 캡처 할필터 (25)를 차단하는 적외선 (IR)를 제거한 후 800 ~ 900 나노 미터 사이의 시간 범위. 일부 하이 엔드 소비자 급 웹캠을 사용할 수 전문가 수준의 IR 카메라에 훨씬 더 큰 비용 화질을 비교, 또는 뛰어난 생산할 수있는 고화질, 넓은 시야각과 좋은 낮은 조명 감도를 제공합니다. 또한, 특정 소비자 급 웹캠이없는 품질의 손실없이 비디오를 압축하여 확장 된 녹화 시간을 허용 기록 소프트웨어와 함께 번들로 제공됩니다. 대부분의 전문가 수준의 카메라는 디지털 신호와 비디오 사이의 타이밍을 정렬하기위한 26 시간 동기화 TTL 펄스 출력 또는 트리거 TTL 펄스 입력을 제공하지만,이 기능은 소비자 급 웹캠에 일반적으로 존재합니다. 그러나, 비디오 녹화 및 디지타이저 신호 간의 타이밍을 정확하게 동시에 카메라와 신호 디지타이저 LED 주기적 점멸 IR 캡처에 의해 일치 될 수있다. 초기 및 최종 IR 펄스 타이밍이 사용될 수있다반대로 신호 디지타이저 시간 단위로 비디오 프레임 번호를위한 S 변환하고이 시간 보정 표식.

조명 및 배경. 물을 통해 캡처 이미지로 인해 물 표면에서 빛의 반사에 기술적으로 어려울 수 있습니다. 물 표면 수중 물 위의 시각적 장면, 모호한 시각적 특성을 반영하는 거울의 역할을 할 수 있습니다, 따라서 물 위의 장면은 시각적 간섭을 방지하기 위해 특색 렌더링해야합니다. 이미지 순서 전체를 수족관에서 카메라를 직접 물 위에 위치해야하고, 그것은 물 표면에 자사의 반사를 방지하기 위해 작은 구멍을 통해보기 천장 뒤에 숨겨진해야합니다. 광원이 잘못 예측 된 경우 또한, 수면은 글레어 및 불균일 한 조명을 생산할 수있다. 간접 조명은, 천정을 향해 광원을 목표로함에 따라 전체 수족관 걸쳐 균일 한 휘도를 달성 할 수 있도록 천장과 주변 WALLS 반영 물 표면에 도달하기 전에 광선을 확산 할 수 있습니다. 카메라 (예를 들어, 850 nm의 피크 파장)의 스펙트럼 반응과 일치하는 IR 조명기를 선택합니다. 광원에서 전기 노이즈가 LED 조명을 사용하고 패러데이 케이지의 외부에 자신의 DC 전원 공급 장치를 배치하여 최소화 할 수있다. 물고기는 근적외선 파장에서 흰색 배경에 잘 대비하기 때문에, 탱크 아래에 흰색 배경을 놓습니다. 마찬가지로, 분리 챔버의 내부 표면에 무광택 화이트 칼라의 사용은 균일하고 밝은 배경 조명을 제공한다.

비디오 추적. 녹화 후, 자동 화상 추적 알고리즘은 시간에 동물의 몸 위치 및 자세를 측정 할 수있다. 비디오 추적이 자동으로 하나를 바로 사용할 수있는 소프트웨어 (관점 또는 모니터 Ethovision), 또는 사용자가 프로그래밍 할 수있는 소프트웨어 (OpenCV의 또는 MATLAB 이미지 처리 도구 상자)에 의해 수행 될 수있다. 화상 트랙킹의 첫 단계로,유효한 추적 영역 (작업을 마스킹) 외부 영역을 제외 기하학적 모양을 그리기에 의해 정의 될 필요가있다. 다음, 동물의 콘텐츠를 포함하는 동물 화상으로부터 배경 화상을 감산하여 배경으로부터 분리 될 필요가있다. 감산 이미지 중심 및 배향 축이 이진 형태 학적 연산에서 계산 될 수있는 강도 임계치를 적용하여 이진 포맷으로 변환된다. Gymnotiforms 27-2930-32 Mormyrids에서 electroreceptor 밀도는 헤드 영역 근처 최고이며, 따라서 임의의 순간에 헤드 위치는 높은 감각 기관의 위치를 나타낸다. 헤드와 꼬리 명소 자동 이미지 회전 및 바운딩 박스 연산을 적용함으로써 결정될 수있다. 헤드와 꼬리 단부 수동 첫번째 프레임들을 정의하고,이 연속적인 프레임을 비교에서 그 위치를 추적하는 순서에 의해 서로 구별 될 수 있었다.

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Protocol

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이 절차는 오타와의 동물 관리위원회의 대학의 요구 사항을 충족한다. 관심 없음 충돌 선언하지 않습니다. 장비 아래에 나열된 물질의 차종과 모델에 대한 재료 및 시약의 표를 참조하십시오. 사용자 정의 서면 Spike2 및 MATLAB 스크립트, 샘플 데이터는 보조 파일에 제공됩니다.

1. 수족관 탱크와 분리 실 설치

  1. 안티-V ibration 층. 바닥에서 상부 (도 1a)에 고무 패드, 탄성 발포 스티롤, 선박용 합판 패널, 및 폴리 우레탄 발포 패드를 적층하여 진동 방지 표면 (2.1 MX 2.1 m)을 구축. 수족관 탱크의 가장자리를 지원하기 위해 합판 패널에 네 개의 나무 스터드 (5cm X 10cm)를 놓습니다.
  2. 마루. (그림 1D 하단 참조) 열 등급 거품 패딩에 전기적으로 차폐 가열 요소를 놓습니다. 금속과 발열체 커버LIC 전기 차폐 메쉬.
  3. 공간 탱크. 두꺼운 유리 패널, L 모양의 알루미늄 프레임과 수족관 급 실리콘 (그림 1A 참조) 강화 1.3 cm를 사용하여 넓고 얕은 수족관 탱크 (1.8 MX 1.8 MX 30cm)를 구축합니다. (프로토콜 3 참조) 높은 촬상 콘트라스트를 제공하기 위해 흰색 배경의 큰 시트로 탱크의 밑면을 커버.
  4. (0.64 cm 두께의 흰색 매트) 아크릴 시트로 만든 (22.5 ㎝ 높이) 설치 벽으로 중앙 무대 (1.5 m 직경)과 네 개의 코너 구획 (그림 1B 참조)에 수족관 탱크를 나눈다.
    1. 네 개의 곡선 벽 부분을 만들고 4 개의 코너 구획에서 중앙 무대를 분리하는 실리콘 코킹을 사용하여 탱크 바닥에 이러한 사항을 추가하는 열을 적용하여 벤드 개의 아크릴 시트 (22.5 cm X 102.7 cm). 게이트 설치를 위해 굴곡 부분 사이에 20cm의 공간을 두십시오.
    2. 네 두 배 벽 위스콘신을 설치하여 별도의 이웃 코너 구획이러한 수중 청음기로 수중 센서에 대한 별도의 전기 절연 및 장소를 제공하는 일 15cm 간격.
  5. 네 자동화 게이트를 조립하고, 코너 구획과 중앙 무대 사이에 설치합니다.
    1. 도 1C에 도시 된 바와 같이 네 개의 도어 프레임을 조립한다. 각 도어 프레임에 6 우물 (0.64 cm 깊이)를 작성, 나일론 도토리 너트 (0.64 cm 직경 스레드)를 포함하고 에폭시로 고정합니다.
    2. 아크릴 고무 시트에서 4 도어 패널을 절단하고, 잠금 장치의 아크릴 고무 패널에 6 홀 (0.64 cm 직경)를 만듭니다. 실리콘 코킹을 사용하여 아크릴 및 고무 패널에 가입하세요.
    3. 설치 아크릴 도어 프레임과 도어 패널 가입 힌지.
    4. 마운트는 서보 모터에 팔을 스윙, (그림 1C 참조) 도어 프레임의 상단에 설치합니다. 도어 패널에 스윙 암을 연결하는 케이블 타이로 루프를 확인합니다.
    5. 조지아의 게이트 어셈블리의 위치를PS는 곡선 벽 부분 사이에 생성 및 실리콘 코킹을 사용하여 고정합니다.
    6. 서보 컨트롤러에 모든 서보 모터를 연결하고, 활성 USB 확장 케이블을 통해 전원과 컴퓨터에 연결합니다. 서보 제어기가 공급 제어 소프트웨어를 이용하여 게이트를 테스트한다.
    7. 실리콘 경화 후, 나일론 나사 모든 문을 잠그고 한 번에 하나의 구획을 작성하여 수밀성을 확인합니다.
  6. 격리 실. 수족관을 둘러싸고 (그림 1D 참조) 빛, 소리와 전기 외부 소스의 잡음을 차단하는 분리 챔버를 구축합니다.
    1. 세 벽 패널 (2 MX 2 MX 5cm)와 4 도어 패널 (1.9 MX 0.95 MX 5cm)를 확인합니다. 각 패널의 경우, 사각형 프레임을 만드는 알루미늄 몰딩 (5cm X 2.5 센티미터)에 가입하고, 알루미늄 프레임에 흰색 플라스틱 골판지 패널을 리벳을 박는 다. 음향 유리 섬유 패널에서 배트, 검은 플라스틱 골판지 패널과의 긴밀한를 입력합니다.
    2. 진동 방지 바닥에 세 개의 벽 패널을 설치하고 설치 피아노 벽 패널에있는 네 개의 도어 패널에 가입 경첩.
    3. 알루미늄 메쉬와 분리 챔버를 둘러싸고, 지상은 패러데이 케이지 (Faraday cage)를 만드는 모든 측면에 메쉬.
  7. 습도 조절. 난방에서 과잉 습도 형성을 제거하기 위해 저소음 배기 팬 (그림 1 층 탑)을 설치합니다. 적어도 2m 떨어져 기록 사이트에서 배기 팬을 배치하고, 분리 챔버 및 배기 팬 사이의 에어 덕트를 설치한다.
  8. 정기적으로 모니터링하고 수조의 물과 동물의 상태를 유지한다.
    1. 10cm 깊이, 100 μS / cm의 전도도 및 물이나 소금 원액 (제조법 크 누드 센 (33) 참조)에 추가하여 pH를 7.0로 일정하게 물 상태를 유지합니다. pH가 6.5 이하 인하의 경우 분쇄 된 산호의 가방을 추가합니다.
    2. 청소를 위해 얕은 물에서 동작 할 수 있습니다 수직 수족관 필터 설치레이팅 목적으로 (그림 1 층 바닥). 필터를 분리하고 녹음 세션 동안 중앙 무대에서 그들을 가지고.
    3. 고무줄로 흡입 컵을 부착하여 탱크의 바닥에 살아있는 밀웜을 제공합니다. 녹화 중에 부유 먹어 치우지의 제어되지 않은 먹이를 방지하기 위해 같은 blackworms 무료로 부동 먹어 치우지 않도록하십시오.

2. EOD 추적

  1. 전극의 설치. 중앙 무대의 곡선 벽에 여덟 흑연 전극과 동일하게 공간을 조립합니다.
    1. (길이 15cm, 화성 탄소 2mm 타입 HB) 리드를 그리기 입수 리드의 외부 코팅을 면도.
    2. , 동축 케이블 (RG-174)의 8 ~ 10 센티미터 세그먼트를 잘라 흑연 막대의 한쪽 끝의 주위에 케이블 코어를 감싸 적용 열수축 강력하고 안정적​​인 전기적 연결을위한 그들에 튜브를. 양단 (그림 2A 왼쪽)에 BNC 잭 커넥터를 연결합니다. </ 리>
    3. 테이핑에 의해 벽에 전극을 배치하고, 실리콘으로 보호하기 위해 전극 표면에 마스킹 테이프의 얇은 스트립을 적용합니다. 영구적으로 전극을 보유하고 실리콘이 굳어 (그림 2A 오른쪽)하기 전에 모든 테이프를 제거하기 위해 실리콘 코킹을 적용합니다.
  2. 증폭 부에 각 전극으로부터의 거리를 측정하고, 길이의 동축 케이블 (RG-54)을 절단함으로써 팔 케이블 어셈블리 빌드. 케이블의 양 끝에 BNC 플러그 커넥터를 연결합니다.
  3. 앰프 유닛에 모든 전극을 와이어 케이블 어셈블리를 사용합니다. 차동 패러데이 케이지에 연결하여 모든 동축 차폐 선 (그림 2B 참조) 2 개의 90 ° 중심 전극을 페어링하여 증폭하고, 지상.
  4. 신호 포화 한계 이하 증폭기 이득을 설정하고, 노이즈를 제거하는 대역 통과 필터 (200 Hz에서 -5 kHz에서)을 적용한다. (40) KS / 초에있는 4 개의 기록 전극 쌍을 디지털화.
  5. 온라인으로신호 처리. 지침은 Spike2 소프트웨어 용으로 작성하고 매개 변수 설정은 Gymnotus의 SP에 최적화되어 있습니다. (대한 요약도 2c 참조).
    1. 추가 DC는 모든 녹화 채널 프로세스 (τ = 0.1 초)를 제거합니다.
    2. 모든 녹화 채널을 조정한다 프로세스를 추가합니다.
    3. 네 개의 기록 채널을 합산하여 가상 채널을 만듭니다.
    4. RMS를 추가하여 EOD 펄스 당 단일 형태 봉투를 추출 (제곱 평균 제곱, 명백하게 펄스의 타이밍을 결정하기 위해 EOD 사이클 당 단일 피크를 생성하는 가상 채널에) 프로세스 (τ = 0.25 밀리 초).
    5. 가상 채널로부터 realmark 채널을 생성하고 모든 EOD 펄스 WI를 캡처하는 적절한 임계 값을 설정 한 후, 시간 및 피크 진폭의 값을 기록오 탐지를 피하면서 thout는 펄스를 누락.
    6. 순시 주파수 모드로 realmark 채널의 채널 디스플레이 옵션을 설정하여 실시간 EOD 순시 속도를 모니터한다.
    7. realmark 채널을 복제하여 실시간 물고기 이동을 모니터링하고, 파형 모드로 디스플레이 옵션을 설정.
    8. realmark 채널 (0.01 초 샘플링주기)에서 가상 채널을 만들어 EOD 진폭 경사의 RMS에서 활동 수준을 정량화하고, 경사 (τ = 0.25 밀리 초) 및 RMS (τ = 0.5 밀리 초) 프로세스를 추가합니다.
    9. MATLAB 형식으로 Spike2 소프트웨어의 realmark 채널을 보냅니다.

3. 동기화 된 비디오 추적

  1. 배경 장면을 만듭니다.
    1. 매트 화이트 싱크대 필름으로 커버하여 물 표면에 반사를 캐스트 개체를 숨 깁니다.
    2. 매트 화이트 설치카메라와 에어 벤트를 숨길 15cm 천정에서 골판지 플라스틱 패널.
    3. 카메라를 교정하기위한 흰색 큰 종이에 인쇄 격자 패턴을, 높은 콘트라스트 배경을 제공하기 위해 탱크 아래로 놓는다.
  2. 광원을 설치합니다.
    1. 확보 IR LED 빛과 소음을 줄이기 위해 내장 된 팬을 제거합니다. 패러데이 케이지의 외부에 배치 전류 조절 DC 전원으로 LED를 구동한다.
    2. IR은 어둠 속에서 이미징을위한 빛, 시험 물고기 낮의 빛을주기를 구동하는 백색 LED 조명을 LED 설치합니다. 간접와 균일 한 조명 (그림 3A)를 달성하기 위해 천장을 향해 직접 모든 광원.
    3. 화이트를 구동하여 낮의 빛을주기를 조절하는 타이머 제어 스위치 (예를 들어 12 시간의 on/12이 시간 오프)와 LED 조명.
  3. 직접 수족관 위에 카메라를 설치합니다.
    1. NIR 민감한 카메라를 얻을, 또는 IR 차단 filte를 제거렌즈 조립체의 후면에 착 유리의 얇은 시트를 끊어서 R. 시야각은 이미지 전체를 중앙 무대에 충분히 넓은 있는지 확인합니다.
    2. 천장 패널의 중간에있는 작은 시청 구멍을 확인하고 직접 구멍 위에 카메라를 배치합니다.
    3. 광원 눈총을 생성하는 경우, 렌즈 주변에 흰색 링 가드를 설치합니다.
  4. 시간 동기화 비디오 녹화를합니다.
    1. IR은 시간 동기화 펄스 (1 밀리 초 지속 시간 10 초 동안)를 생성하기 위해 4 개의 탱크 모서리 중 하나에 LED를 배치합니다. 시리즈의 부하 제한 저항 (1 kΩ의)를 추가하고, 디지타이저 하드웨어의 디지털 출력 포트에서 IR LED를 구동한다.
    2. 카메라를 사용할 수있는 경우와 함께 번들로 비디오 레코딩 소프트웨어를 사용합니다. 최고 기록 품질 (예 : 무손실 압축) 및 지원하는 가장 높은 해상도를 선택합니다.
    3. 즉시 EOD 녹화 시작 전에 녹화를 시작하고 녹화를 중지 imme거립니다 EOD 녹화 후.
    4. 녹음 후, 선형 제 신호 디지타이저 및 녹화 의해 캡쳐 최신 광 펄스 사이에 보간함으로써 디지타이저 시간 단위로 이미지 프레임 번호로 변환.
  5. 이미지 자동 추적
    지침은 MATLAB 이미지 처리 도구 상자에 대한 기록, 그 기능을 사용하게됩니다. 사용자 정의 MATLAB 스크립트가 자동으로 이미지 추적이 제출과 함께 제공됩니다.
    1. 비디오를 가져옵니다. 직접 사용하여 MATLAB 작업 공간에 녹화 파일을 가져옵니다 "Videoreader을. 읽기"기능을.
    2. 두 개의 영상 프레임을 결합하여 복합 배경 이미지를 만듭니다. 다른 프레임에서 같은 지역의 빈 이미지 (그림 (b) 참조) 동물에 의해 점유 된 이미지 영역을 교체합니다.
    3. 을 제외하는 중앙 무대 주변에 원형 마스크를 그림으로써 추적 할 이미지 영역을 지정합니다REA 외부 (그림 3B 바닥), 및 강도 차이에 대한 최소 임계 값을 설정하는 상수 (R의 INT)에 의해 곱합니다. 배경 아래 - (R의 INT 1) 예를 들어, RINT을 설정하면 0.85가 강도의 변동 15 % =가 표시되지 않습니다 =.
    4. 이미지 빼기. (= IM 0) 이미지 차이 (= ΔIM의 k)를 얻기 위해 배경 이미지에서 이미지 프레임 (= IM의 k)를 뺍니다. 음이 아닌 정수로서 이미지 세기 값을 저장하는 부호없는 정수에게 수치 정밀도를 사용한다.
    5. graythresh 함수로부터 결정 강도 임계치를 적용하여 세그먼트 차분 영상. bwmorph 기능을 이용하여 바이너리 이미지를 닦고 regionprops 함수를 사용하는 모든 블롭 영역을 계산 한 후 동물에 대응하는 큰 블롭을 선택한다.
    6. 중심 및 주요 방향을 결정regionprops 함수를 적용하고, x-축과 장축을 맞출 이미지를 회전함에 따라 큰 블롭의 XIS. 중심 (그림 3D 탑)의 머리와 꼬리 부분에 이미지를 나눈다.
    7. 헤드 부분의 장축을 결정하고, x-축 (도 3d 왼쪽 아래)에 맞도록 전체 이미지를 회전한다. 머리 주위에 경계 박스를 장착하고 꼬리 부분은 regionprops 기능을 사용하여 자신의 주요 축에 평행.
    8. 왼쪽, 중앙 및 경계 상자 (그림 3D 바닥에 녹색 점)의 오른쪽 수직 가장자리에서 덩어리의 중간 y 좌표를 결정하고, 다섯 특징점 (머리 끝, 중간 머리, 중간 몸에 할당 중간 꼬리, 꼬리 끝).
    9. 이전 프레임에서 결정되는 동물의 중심을 중심으로 이미지 프레임을 자르기 후 연속적인 프레임을 처리합니다.
    10. 수동 첫번째 프레임 헤드 방향을 지정하고, 내적의 betwe를 사용두 개의 연속 프레임에서 방향 벡터 도중 자동으로 헤드의 방향을 결정합니다. 결과를 점검하고 잘못 지정된 경우 수동으로 머리 방향을 플립.
  6. 머리 끝을 연결하여 동물의 궤도를 플롯하고, 중간, 평균 필터를 사용하여 부드럽게 (N = 3)이 흔들리는 모양이있는 경우. 배경 이미지와 궤적을 중첩하고, 오 특징점 (도 2E 참조)을 사용하여 생선 midlines 보간.
  7. EOD 순시 레이트 (100 Hz 샘플링 레이트) 및 리샘플링 (0.0625 초 시간 창)를 평균하여 각 촬상시에 EOD 평균 속도를 계산한다. 시간이 일치 EOD 속도 결정 의사 색상의 궤도를 플롯하고, 배경 이미지 (그림 2 층 참조) 중첩.

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Representative Results

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EOD 추적 결과

자신의 독특한 위치와 방향 (그림 2C 상단)에서 예상대로 다른 전극 ​​쌍에서 기록 EOD 파형은 진폭과 모양에 변화. 여러 전극 쌍의 사용은 탱크 내에서 가능한 모든 위치와 세계 경제 포럼 (WEF)의 방향에 강한 신호 수신을 보장. 봉투 파형 (그림 2C 바닥, 녹색 추적)는 항상 정확하게 (= IPI -1) 펄스 간 간격과 순간 EOD 속도를 결정하기위한 신뢰할 수있는 타임 마커로 제공 EOD 사이클 당 하나의 피크를 포함. 연속 EOD의 피크에 가입 선형 보간 일정한 시간 간격 (그림 2D 탑, 블랙 추적)에서, 그리고 순간 EOD의 환율을 유사하게 일정한 시간 간격 (그림 2D 바닥, 핑크 추적)에 삽입 된 하였다. 일정 시간의 리샘플링 절차는 시간 동기화 될 용이모션 궤도 및 EOD 신호를 트위닝, 지속적으로 샘플링 된 시계열 데이터에 대한 분석 도구의 큰 숫자에서 활용할 수 있습니다. 동물이 나머지 (그림 2E 상단)에있는 동안 외부 전극에 기록 된 EOD의 진폭은 일정하게 유지하지만, 동물이 때문에 극의 위치와 방향 (그림 2 층 맨 위) 변화로 이동하는 동안은 시간이 지남에 따라 변화. 따라서, 생선 이동은 시간이 지남에 EOD 진폭의 변화를 관찰로부터 추론 될 수있다. 물고기가 나머지 (그림 2E 아래)에있는 동안 기준 EOD 비율은 여전히 낮은 수준,하지만 물고기가 적극적으로 (그림 2 층 맨 위) 수영하는 동안 EOD 비율은 상당히 높은되었습니다. 우리의 관찰은 EOD 레이트와 같은 이전에보고 된 8,9,34,35 물고기 움직임간에 양의 상관 관계와 일치한다.

비디오 추적 결과

동물의 궤적과 midlines는 그림에 표시됩니다 첫 번째와 마지막 이미지 프레임 우레의 3E가 중첩. 물고기가 갑자기 2 초 동안 회전하는 동안 자세 변화의 시간 코스 캡처하고, 물고기 midlines마다 200 밀리 초를 꾸몄다. 물고기의 중간 선이 제대로 머리 끝에서 시작과 물고기의 꼬리 끝으로 종료되었습니다. 밀접하게 동물에 의해 주조 그림자에도 불구하고 자동으로 추적 midlines 동의 물고기의 이미지. 그림 3 층은 물고기의 머리의 시간이 일치하는 궤도와 중첩 색상이 시간에 따라 변화하는 평균 EOD 속도 (τ = 0.0625 초)을 보여줍니다 팁. 동물이 회전 위상의 중간에있는 동안 2 초 선삭 기간 동안 평균 EOD 속도는 피크에 도달하고, 속도는 선회의 단부를 향해 감소. 이 대표 결과는 우리의 방법이 성공적으로 자유 수영하는 동안 자기 주도형 운동과 EOD 속도 변조 사이의 관계를 연구에 적용 할 수 있다는 것을 보여줍니다.

T "FO : 유지 - together.within 페이지를 ="항상 "> 그림 1
그림 1. 수족관 탱크와 분리 실 설치.) 실험 챔버는 진동 방지 바닥, 수족관 탱크와 분리 실. B) 수족관 탱크가 주거 개인에 대한 실험, 4 개의 코너 구획을 실행하기위한 중앙 무대로 나뉘어 구성 물고기. 각 구획은 동물. C) 자동화 게이트가 여러 관점 각도에서 도시 간의 전기 통신을 방지하기 위해 방수 지어졌다. 고무 가스켓 (밝은 갈색 시트) 압축 여섯 날개 너트에 고정 할 때 게이트는 방수가됩니다. 일단 잠금 해제, 게이트가 원격으로 정상에 서보 모터에 의해 작동 할 수 있습니다. D) 분리 챔버는 세 승 결합에 의해 조립 된두 가지 측면에서 수족관 탱크에 대한 액세스를 제공하는 모든 패널과 4 도어 패널,. 하단 패널은 탱크의 가장자리를 지원하기위한 난간, 목재 바닥 히터의 위치를​​ 보여줍니다. 알루미늄 메쉬 층)의 전기 노이즈. E를 차폐하는 히터 커버를 분리 챔버의 벽과 도어 패널은 구조적지지 용 알루미늄 프레임으로부터 생성 하였다 (3). 챔버의 내부 표면 (5) 내부의 광원을 반영하기 위해 흰색 플라스틱 패널에 의해 덮여 있으며, 외관은 (2)의 외부 광원을 차단하는 블랙 플라스틱 패널에 의해 덮여있다. 알루미늄 메쉬 (1) 외부의 전기적 노이즈를 차단하기 위해 외부 벽을 다룹니다. . 벽은 탄성 유리 섬유 배트 (4) F) 상단 사진 가열로부터 발생 과잉 습기를 제거하기위한 공기 송풍 구성도 가득이고, 하단 사진은 확산, 사이 탱크 물 레이팅, 청소용 물 여과 셋업을 보여준다 실험세션은. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 2
그림 2. EOD 녹화 셋업 및 대표적인 결과. A) 왼쪽 패널은 얇고 흑연 전극, 동축 케이블의 짧은 세그먼트 및 BNC 잭으로 이루어진 전극 조립체를 도시한다. 오른쪽 패널의 전극 부착 명령을 보여줍니다. 마스킹 테이프는 일시적으로 전극 조립체를 위치 시키도록 사용되며, 실리콘 코킹 영구적 전극. B) 배선도를 유지하도록 적용되었다. 2 개의 90 ° 중심 전극은 차동 증폭 및 필터링, 짝됩니다. 포 녹화 채널은 패러데이 (C)의 외부에서 디지털화 된EOD 신호 처리 단계의 세. C) 그림. 맨 흔적 정류 아래 회색 추적을 생성하기 위해 합산 개의 전극 쌍, 원시 파형을 보여준다. 단봉 봉투 "제곱 평균 제곱근"(RMS) 필터 (녹색 추적)를 사용하여 회색 파형으로부터 추출된다. EOD의 진폭과 IPIS는 봉투 봉우리. D) 시간에 따라 변화하는 EOD 진폭 (위)와 순간 EOD 속도 (아래)가 C보다 더 긴 시간 규모에 표시됩니다)에서 결정된다. EOD 진폭 및 순간 속도 (= IPI는 -1) D로 E) 동일합니다. 봉투 피크 (검은 흔적)에 가입하여 일정한 시간 간격으로 보간)하지만 물고기가 휴식. F에있는 동안) 긴 시간 규모의 플롯 물고기가 적극적으로 수영하는 동안) E와 동일합니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 3
그림 3. 비디오 추적 설정 및 대표 결과.) 조명과 카메라 설정이 나와 있습니다. 적외선 (IR​​) 및 가시 광선 소스는 천 정면이 반영 탱크 전체에 걸쳐 균일 한 조명을 투사 광을 확산하도록, 벽에 부착되고 천정을 향하고있다. 카메라는 물 표면에 반사 방지 할 천장판 위에 숨겨져있다. IR LED는 시간 동기화 펄스를 생성하기 위해 4 개의 탱크 모서리 중 하나에 위치된다. B) 복합 배경 화상을 생성이 도시되어있다. 두 이미지 프레임 (위에 이미지는) 동물을 포함하는 영역을 교체 (이렇게하여 합성 배경 화상 (왼쪽 하단)을 형성하도록 조합된다동물이없는 지역과 뚜껑 빨간색 사각형) () 빨간색 사각형 점선. 중앙 무대 이외의 지역은 물고기의 윤곽을 분리 블랙 (오른쪽 아래). C)에서 마스크 처리됩니다. 이미지 프레임 (왼쪽) (오른쪽) (왼쪽 아래) 차분 영상을 생성하는 배경 화상으로부터 감산 한) 강도 임계치. D를 적용하여 이진 화상 (오른쪽 하단)으로 변환되는 상체 위치의 측정 자세가 도시되어있다. 동물 (한방울)의 이진 화상은 x-축 (오른쪽)으로 장축을 맞출 회전하고, 그 중심에 중심이되었다. 블롭은 헤드 (레드)와 꼬리 (블루) 부분으로 분리하고, 각각의 부분은 별도의 바운딩 박스를 결정하기위한 회전시켰다. BLOB는 동물의 참조 프레임 (왼쪽 아래), 5 특징점 (헤드 엔드, 중간 머리, 중간 몸, 중간 꼬리, 꼬리 끝) 지향 하였다는 경계 상자의 중간 점에서 결정되었다 가장자리. E) 시간 경과 임물고기 midlines의 나이는 모든 200 밀리 초를 꾸몄다. 첫 번째와 마지막 이미지 프레임은 2 초 회전 시간. F) 평균 EOD 속도가 의사 색 표현과 물고기 헤드의 궤도와 중첩시 중첩됩니다. 같은 이미지가) E에서와 같이 사용됩니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .

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Discussion

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우리의 기술의 중요성. 요약하면, 우리는 먼저 대형 수족관 탱크의 건설 및 세계 경제 포럼 (WEF)에 의해 생성 된 자연 탐구 행동을 관찰하는 분리 챔버를 설명했다. 다음으로, EOD 레이트 복수의 전극 쌍을 사용하여 실시간으로 무제한 물고기에서 이동 상태를 기록하고 트래킹 기술을 보여 주었다. 마지막으로, 우리는 시간 - 동기화 된 방식으로 물을 통해 적외선 비디오 녹화 기술과 상체 위치 자세를 측정하는 이미지 추적 알고리즘을 설명했다. 실험 준비로, 세계 경제 포럼 (WEF)은 활성 electrosensory 샘플링 속도에 해당합니다 쉽게 정량화 EOD 속도를 보여줌으로써 활성 감각 유도 행동을 조사하는 중요한 이점을 제공합니다. 이러한 기술의 조합은 무제한 WEF에서 자발적 행동의 정확하고 신뢰할 수있는 장기적인 관찰 8을 사용할 수 있습니다. 더욱이, 우리 셋업 대다수 FR을 구성 할 수있다톰 건축 자재 및 쉽게 얻을 전자 부품이 널리 사용. 여기에 설명 된 기술을 개발하고 최근 몇 년 동안 우리의 실험 요구 사항을 충족하기 위해 테스트되었습니다. 따라서, 우리는 자유 수영 세계 경제 포럼 (WEF)에서 자연 탐험 행동의 미래 연구에 대한 이러한 기술을 추천합니다.

격리 실. 분리 챔버는 빛, 진동, 사운드, 효과의 다양한 각도에서 전기 노이즈의 외부 소스를 차단하여 잘 통제 된 실험 조건을 제공합니다. 차광 성능은 어두운 분리 챔버의 내부 동력 카메라를 배치하여 테스트하고, 외부 광 누설 팬 원격 제어를 사용하여 모든 위치를 스캔 한 후 카메라에서 관찰되지 않았다. 외부 바닥에서 수로 진동, 여러 고무 및 발포 층의 적층에 대한 탱크 제공 감쇠에 설치 진동 감쇠 표면 대부분을 차단하는 효과가외부 진동 이벤트. 그러나, 가까운 곳에서 큰 소리로 문을 닫는 등의 간헐적 인 진동 이벤트는 드물게 새로운 반응을 유발했다. 진동 방지 에어 테이블 배경 진동으로부터 우수한 분리 성능을 제공 할 수 있지만, 우리는 수조의 충분한 공기 나타난 대형 구입 엄청나게 비쌀 것이다. 따라서, 우리는 큰 외부 진동이 참신 응답을 트리거 이벤트를 감지하고 배제하는 수중 청음기 수중을 배치. 또한 실험실 외부 노이즈의 영향을 최소화하기 위해, 우리의 실험 (오후 6시 이후) 오프 피크 시간 동안 실시 하였다. 마찬가지로, 외부 공기 소음은 유리 섬유 배트 절연 가득 격리 챔버 벽을 통해 약화되었다. 우리가 객관적으로 소리의 감쇠 성능을 정량화하지 않았지만, 실험실 환경에서 배경 소리의 대부분은 새로운 반응을 유발하지 않았다. 외부 트리거에서 드문 경우에, 갑자기 큰 소리ED 참신 응답 만이 이러한 이벤트는 수중 청음기 기록에 의해 감지, 그들은 거의 오프 피크 시간 동안 발생하지 않았다. 수족관 탱크 자유롭게 수영을 탐구하는 우리의 동물을위한 충분히 넓은 영역을 제공했다. 탱크의 크기는 우리가 (최대 30cm)를 사용 종의 길이에 비례하여 선택되었다, 그러나 작은 동물이 사용 된 경우 탱크의 크기가 축소되었을 수 있습니다. 우리는 Gymnotus 특검팀를 선택했다. 자유 수영 36시 전기 생리학 기록을 용이하게하기 위해 자신의 큰 두개골의 크기에 대해 서로 다른 펄스 형 종 중. 전기 녹화 품질은 더 비싼 구리 메쉬를 사용하고, 습도 조절을 위해 사용되는 배기 팬을 차폐부터 향상시킬 수있다.

EOD 측정 기술. 우리의 멀티 채널 EOD 기록 기술은 자유롭게 물고기 수영에서 정확하고 신뢰할 수있는 EOD 타이밍 측정을 허용. 우리의 기술을 사용하여 자유롭게 WEF 수영에 의해 생성 된 모든 EOD 펄스는 죄를 누락 또는 추가하지 않고 검출되었다여섯 시간의 긴 녹화 시간에 대한 GLE 펄스 (등. 2011/06/08 그림 12 참조). EOD 기록 대책 EOD 속도뿐만 아니라, 외부 전극을 기록 EOD 피크 진폭 시변에서 활동 레벨 아닙니다. 기록 EOD 진폭은 동물 및 기록 전극 간의 상대적인 지오메트리에 의해 결정되고, 이에 따라 동물의 움직임은 EOD 진폭 (도 2F)의 변화를 유도한다. 활동 레벨이 이동 창 내 EOD 진폭 슬​​로프의 가변성 (RMS) (0.5 초)로부터 계산 하였다. 이 방법을 사용하여, 비디오 녹화는 장시간 동안 활동 수준을 측정하기 위해 필요하지 않을 것이며, 단독 EOD 기록 충분할 수있다. 대신에 비디오 녹화를 사용하는 WEF의 상체 위치 자세가 전극의 위치에 기초하여 단독 EOD 기록에서 유추 될 수 탱크의 형상과 전류 쌍극자의 이론적 모델. 비슷한 녹음기를 사용하여NG 설치, 6 월 등. (20)는 알려진 현재의 쌍극자 위치에서 예측 된 신호 강도를 포함하는 조회 테이블 항목을 여러 기록 전극 쌍에서 측정 된 신호 강도를 비교하는 객체의 존재에 여러 WEFs을 추적하는 실시간 전기 추적 방법을 제안 하였다. 전기 추적 방법은 동물이 자주보기에서, 또는 추적 여러 동물 중에 방해받을 시각적으로 복잡 환경에서 향상된 추적 신뢰성을 제공합니다. 세계 경제 포럼 (WEF)의 자연주의적인 서식지 전기 추적 방법은 시각적 추적보다 간단 설치 요구 사항에보다 안정적인 추적을 제공 할 수있는 등의 수생 식물과 뿌리 많은 시각 장애를 포함합니다. 원칙적으로, 우리의 방법은 필터 시간 상수를 변경 한 후 웨이브 형 WEF 종에 직접적으로 적용 할 수있다. EOD 파형이 웨이브 형태의 종에서 대략 정현파이므로 정류 단계는, EOD 사이클 당 두 모드를 소개한다. 이 경우, EOD 순시 레이트는 음의 EOD 위상을 무시하는 다른 모든 EOD 시간 마커를 스킵함으로써 결정될 수있다. 그들은 부근 수영 때 WEF는 기록 전극을 검출 할 수있다, 따라서 우리는 더 멀리 (37)로부터 감지 될 수 크거나 금속 전극을 사용하여 회피하고, 대신에 얇은 흑연 전극 (2 mm 직경)을 사용했다. 얇은 동축 케이블 (RG-174)은 유연성 전극 어셈블리와 함께 사용되었습니다 만, 두꺼운 동축 케이블 (RG-54) 우수한 전기적 차폐를위한 확장 된 거리에 배선에 사용되었다. 이상 EOD 기록 기간은 샘플링 레이트를 낮춤으로써 달성하지만, 트레이드 오프로서 낮은 시간 해상도로 할 수있다. EOD 속도의 평균 및 변동성은, 종 사이에서 변화하므로 순시 EOD 레이트 스무딩위한 시간 창은 적절히 조절 될 필요가있다. 짧은 시간 창이 더 짧은 평균 작은 변화 IPIS에서 (예를 들면 Gymnotiforms), 그리고 긴 시간 진열창을 갖는 종 추천W는 IPIS (예 Mormyrids)에 이상 평균과 높은 변동성을 갖는 종을 권장합니다.

조명 및 카메라 설정. 비디오 기록은 정량적 행동 관찰을 제공하고, 여기에서 우리는 설정, 기록 및 화상 데이터를 처리하기위한 절차를 설명했다. 조명 설비는 고품질의 화상을 생산에 중요한 역할을하고, 광 투사각은 수중 동물을 이미징하는 중요한 요소이다. 차선의 조명 조건 하에서 물 표면 동물 표면파를 생성 할 때, 특히 화상 추적을 방해 할 수 눈총 및 반사를 형성 할 수있다. 눈부심 및 반사 문제는 탱크의 바닥에서 광원을 투영함으로써 제거 될 수있다. 작은 탱크, LED의 어레이는 탱크 바로 아래에 배치 할 수 있고, 균일 한 광 강도 (38)를 생성하는 확산기 패널을 통해 빛난다. 마찬가지로 큰 탱크, 광원 C이 탱크 아래에 배치하고, 균일 한 광 강도는 39 확산 광에 대한 충분한 거리를 허용함으로써 달성 될 수있다. 우리의 설정에서, 우리는 공간 때문에, 구조적 안정성, 탱크 아래 히터 배치에 탱크 위에서 빛을 투사해야했습니다. 우리는 광원이 천장을 향해 돌출 된 있도록, 간접 조명을 사용하여 눈부심 및 반사 문제를 피했다. 챔버 특색과 매트 화이트의 상단 부분을 렌더링하여, 더 반사 물 표면에서 볼 수 없었다. 이미지로 전체 중앙 무대, 광각 렌즈가 카메라에 장착 할 수 있지만, 일부 렌즈 (어안 렌즈) 중요한 배럴 왜곡을 일으킬 수 있습니다. 배럴 왜곡은 탱크 중심에 볼 그리드 위치의 픽셀 좌표를 측정하기 위해 탱크 아래 보정 그리드 시트를 사용하여 보정 될 수있다. 함께 센치의 해당 그리드 위치와, 변환 행렬은 공동 계산 될 수있다배럴 왜곡 (40)을다는 것을 확인하십시오 rrect. 동물의 크기는 탱크의 크기보다 훨씬 작다, 그래서 화소의 충분한 수가 올바르게 신체 자세를 측정하기 위해 동물로부터 얻어 질 수있는 경우에 고해상도 카메라를 추천합니다.

이미지 추적 및 시간 동기화. 여기서 설명한 이미지 추적 알고리즘 빠르게 상체 위치 자세를 측정하기 위해 관심 영역 (ROI) 연산을 사용한다. ROI 동작은 처리 될 이미지의 크기를 감소시키고, 이전 프레임에서 동물 가까운 위치 추적 범위를 제한한다. 우리는 대신 때때로 잘 정의 된 단일 정중선을 생산하는데 실패 통상 화상 골격 화 작업의 이미지 회전 및 바운딩 박스 연산을 사용하여 몸의 자세 (중심선)을 추출 하였다. 참조의 동물의 구조는 자기 중심적 행동 분석을 허용하는 헤드 경계 상자의 중앙에 위치했다. 이미지 tracki에있는 오류의 주요 원인NG는 다양한 각도로 투사 광학 효과에 기인했다. 이상적으로, 동물의 수직 운동은 2 차원 위치 측정에 영향을 미치지 않습니다 만, 더 멀리 중앙 이​​미징 축에서 수직 차원의 큰 부분은 카메라에 예상된다. 최악의 위치 오차 원형에서 ± 1.4 cm이었다 물 표면에서 굴절 (카메라 높이 = 1.8 m, 수심은 = 10 cm의 탱크 반경이 75cm가) 우리의 영상 설정에서 28 %로 광 투사 효과를 감소 울타리. EOD 및 비디오 녹화 사이의 타이밍은 비디오 신호 디지타이저 클럭 및 다른 녹화 시작 시간 사이의 시간 드리프트를 설명하기 위해 적외선 LED 펄스를 사용하여 동기화 하였다. 비디오 및 EOD 레코딩 간의 시간 동기 예상 불확실성 프레임 캡처 간격에 비례하는, 예를 들어, 초당 15 프레임 수 (fps)의 프레임 캡처 속도는 ± 33 msec의 시간 정렬의 불확실성을 초래할 것이다. 팀의 이러한 정도E 정도 느리게 움직이는 물고기 추적에 적당하지만, 고속 카메라는 동물을 이동 빠른 추적 요구 될 수있다. 센서 노출 시간은 프레임 속도에 반비례하기 때문에 우리는, 증가 된 프레임 레이트에 밝은 광 강도를 추천합니다.

미래의 일. 체류 WEFs 간의 사회적 상호 작용은 EOD 신호와 본체 위치를 추적하여 연구 될 수 있으며, 추적 시스템은 정확하게 동일한 개인의 위치 EOD를 연결한다. 6월 외. 20 사용 비슷한 설정하여 설명 다이폴 지역화 방법에 따르면, 자신의 EOD 신호 유추 동물 명소 여러 전극에서 수신이 제대로 다른 개인으로부터 EOD 펄스를 식별하기위한 카메라 추적 출력에 매칭 될 수있다. 여러 동물의 이미지 추적 ROI 동작을 이용하여 한번에 한 개인을 행할 수있다. 투자 수익 (ROI)은 처음에 개인의 주위에 정의 할 수 있습니다추적 및 투자 수익 (ROI)은 업데이트 된 자세로 모든 프레임에서 위치를 변경할 수 있습니다. 그것은 외부의 투자 수익 (ROI)의 나타날 때 다른 물고기 이미지 추적 분석에서 제외 될 것이다 안에 나타난 경우, 다른 물고기의 이미지가 자동으로 이미지가 ROI 경계를 접촉 여부를 확인하여 제거 할 수 있습니다. 때로는 두 동물은 서로 접촉하고 자신의 이미지를 병합하고, 그렇다면, 마스크를 수동으로 다른 물고기의 이미지를 분리하는 그릴 수 있습니다. 또 다른 흥미로운 미래의 작업은 먹이 캡처 (22) 또는 사회적 상호 작용 동안 복잡한 움직임의 시퀀스를 나타 내기 위해 입체 영상 추적이다. MacIver 외. 22 입체적인 보디 모델을 재구성하기위한 상부 및 측면으로부터 직사각형 수족관 탱크를 위해 두 개의 카메라를 사용 하였다. 그러나,이 방법은 사이드 뷰와 수족관이 깊이보다 훨씬 더 폭이 블록 분할 벽이 있기 때문에, 우리의 경우에 작동하지 않을 것입니다. 대신에, 더 많은 응용 될다른 관점에서 천장에 여러 대의 카메라를 설치하는 케이블 헤드 릭 (41)에 의해 사용 된 설정과 비슷한 각도. 높은 정확도를 들어, 물, 비스듬한 카메라 각도에 의해 도입 굴절 효과를 입체적으로 화상을 보정함으로써 보정되어야 할 것이다. 우리의 시각 추적 방법은 물고기 인근에서 개체를 수영 할 때 물고기의 몸 표면 42, 43에 전기 화상의 흐름을 연구에 적용 할 수 있습니다. 호프만 외. (26)에 의해 연구로서, 피사체 거리, 형상, 크기, 재질에 따라 자유 수영 중에 개체의 화상 전기 흐름을 조사 흥미로울 것이다. 물고기 개체 탐사 또는 사회적 상호 작용에 종사하면서 궁극적으로 자유롭게 물고기 44-46 수영에서 신경 기록과 함께 우리의 방법은 신경 활동의 변화와 EOD 속도의 관찰에 의해 새로운 통찰력을 보여줄 수 있습니다.

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Disclosures

저자가 공개하는 게 없다.

Acknowledgments

이 작품은 넉넉한 캐나다 자연 과학 및 공학 연구위원회 (NSERC) 및 건강 연구의 캐나다 연구소 (CIHR)에 의해 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aquarium Construction
Electrically shielded floor heater ThermoSoft Corp., IL, USA ThermoTile www.thermosoft.com
Tempered glass panel generic 0.5 in thick, used for the aquarium construction
Aquarium grade silicone generic  
Acrylic sheet generic 0.25 in thick, matte white
Natural rubber sheet generic 0.25 in thick
Servomotor HTECHRCD Inc., Korea HS-325HB, 180deg rotation www.servocity.com
Servomotor arm mount HITECHRCD Inc., Korea 56362 Large Spline www.servocity.com
Servomotor controller (6 channels) Sparkfun ROB-09664 Micro Maestro 6-channel USB Servo Controller
Active USB extension cable C2G 38990 12 m USB 2.0 A Male to A Female 4-Port Active Extension Cable
Exhaust fan Nutone ILFK120 www.homedepot.com
Vertical aquarium filter Tetra, Germany Whisper Internal Power Filter - 40i  
Crushed coral Used to increase the pH of the tank water
EOD Recording Setup
Graphite Electrodes Staedtler, Germany Mars Carbon 2-mm type HB Shave the outer coating
Physiological Amplifier/Filter Intronix, Canada 2015F  
Coaxial Cable generic RG174 For electrodes assembly
Coaxial Cable generic RG54 For wiring use
BNC jack connector for RG-174 Amphenol Connex 112160 For electrodes assembly
BNC plug connector for RG-54 Amphenol Connex 112116 For wiring use
Signal digitizer hardware Cambridge Electronic Design, UK Power MKII 1401  
Signal digitizer software Cambridge Electronic Design, UK Spike 2. ver 7  
Visual Tracking Setup
White LED light IKEA, Sweden DIODER 201.194.18 www.ikea.com
Infrared LED light (850 nm) Scene Electronics, China S8100-60-B/C-IR Remove built-in fan
USB webcam Logitech Inc., CA, USA C910 Remove Infrared blocking filter
Motorized camera Logitech Inc., CA, USA Quickcam Orbit Remove Infrared blocking filter
Video recording software Logitech Inc., CA, USA Logitech Quickcam Software Download from www.logitech.com
MATLAB Mathworks, MA, USA 2012a Image processing toolbox

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388, (6645), 882-887 (1997).
  2. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat. Neurosci. 8, (9), 1263-1268 (2005).
  3. Adamantidis, A. R., Zhang, F., Aravanis, A. M., Deisseroth, K., De Lecea, L. Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons. Nature. 450, (7168), 420-424 (2007).
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자유롭게 수영 약하게 전기 생선의 장기 행동 추적
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Jun, J. J., Longtin, A., Maler, L. Long-term Behavioral Tracking of Freely Swimming Weakly Electric Fish. J. Vis. Exp. (85), e50962, doi:10.3791/50962 (2014).More

Jun, J. J., Longtin, A., Maler, L. Long-term Behavioral Tracking of Freely Swimming Weakly Electric Fish. J. Vis. Exp. (85), e50962, doi:10.3791/50962 (2014).

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