Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Langsiktig Behavioral Sporing av frittsvømmende Weakly Electric Fish

doi: 10.3791/50962 Published: March 6, 2014

Summary

Vi beskriver et sett med teknikker for å studere spontan oppførsel av frittsvømmende svakt elektrisk fisk over en lengre tidsperiode, ved synkront å måle dyrets elektriske organ utladning timing, kroppsstilling og sittestilling både nøyaktig og pålitelig i et spesielt konstruert akvarium tanken i en sensorisk isolasjonskammer.

Abstract

Langsiktig atferds sporing kan fange opp og kvantifisere naturlige dyreatferd, inkludert de som forekommer sjelden. Atferd som leting og sosiale interaksjoner kan best studeres ved å observere hemningsløs, fritt oppfører dyr. Svakt elektrisk fisk (WEF) skjerm lett observerutforskende og sosial atferd ved å sende ut elektrisk orgel utladning (EOD). Her beskriver vi tre effektive teknikker for å måle synkront EOD, kroppsstilling, og holdning av en frittsvømmende WEF i en lengre tidsperiode. Først beskrives konstruksjonen av en eksperimentell tank inne i en isolert kammer utformet for å hindre eksterne kilder til sensoriske stimuli slik som lys, lyd og vibrasjon. Akvariet ble partisjonert å huse fire testprøver, og automatiserte porter fjernstyre dyrenes tilgang til den sentrale arena. Deretter beskriver vi en presis og pålitelig sanntids EOD timing målemetode fra frittsvømmende WEF. Signal forvrengninger forårsaket av dyrets kroppsbevegelser blir korrigert av rommessig gjennomsnittsføring og tidsprosesseringstrinn. Tredje, beskriver vi en undersjøisk nær-infrarød bildeoppsettet for å observere uaffisert nattlige dyreatferd. Infrarøde lyspulser ble brukt til å synkronisere tidsberegningen mellom video-og fysiologisk signal over et langt opptak varighet. Vår automatisert sporing måler dyrets kropp posisjon og holdning pålitelig i et vann scene. Sammen er disse teknikkene muliggjøre langvarig observasjon av spontan oppførsel av frittsvømmende svakt elektrisk fisk på en pålitelig og nøyaktig måte. Vi tror at vår metode kan være like anvendes i studiet av andre akvatiske dyr ved å knytte sine fysiologiske signaler med utforskende eller sosial atferd.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bakgrunn. Kvantitative eksperimenter på dyrs atferd (f.eks tvunget valg, sjokk unngåelse, T-labyrint, etc.) Er vanligvis brukt til å undersøke spesifikke hypoteser om sensorisk-motoriske ferdigheter, læring og hukommelse formasjon. Men disse restriktive eksperimenter gå glipp av mye av den rikdom av naturlige dyrs atferd og vil trolig føre til forenklede modeller av den underliggende nevrale grunnlaget for atferd. Eksperimenter under mer naturalistiske forholdene er derfor et viktig supplement som vi kan utforske mer fullstendig en art atferdsrepertoar. Forsøk med fritt bevegelige dyr må imidlertid ta unike tekniske utfordringer som bevegelsesutløst innspilling gjenstander. I motsetning til tiltaks-fremkalt respons, kan spontant forekommende utforskende atferd ikke forutsies, og dermed eksperimentelle fag må være konstant overvåket og spores over en lengre periode. Konkrete problemstillinger can være best ivaretatt av nøye utvalgte organismer og tilgjengelige tekniske verktøy. For eksempel, har optisk opptak og stimuleringsteknikker som for eksempel genetisk kodet kalsium sensorer 1 og optogenetics to blitt brukt til fritt å bevege genetiske modellorganismer 3-5. Alternativt kan miniatyriserte nevrale telemetrisystemer ta opp og stimulere fritt bevegelige smådyr 6,7.

Elektrisk fisk. WEF arter generere elektrisk orgel utslipp (EODs), som tillater dem å oppfatte sine umiddelbare omgivelser eller for å kommunisere over større avstander. Temporale mønstre av EODs variere under ulike forhold, for eksempel selv bevegelser 8,9, sensoriske stimuli 10,11 og sosiale interaksjoner 12,13. Puls-type WEF arter produserer et tog av diskrete pulser, i motsetning til bølgelignende art som genererer kontinuerlige kvasi-sinusformet bølgeformer. Generelt puls-typen arter utstillings more variabel EOD hastighet i forhold til bølgelignende arter, og dyrenes EOD priser tett reflektere nyhet innholdet i sine sanse omgivelser 10,14. Puls-type arter kan umiddelbart forkorte inter-puls intervall (IPI) innenfor en enkelt puls syklus I reagere på en roman sensorisk forstyrrelse (nyhet respons 10,11,14). Den pågående elektriske oppførselen til disse fiskene kan bli opprørt av ukontrollerte sensoriske stimuli fra eksterne kilder, og ulike typer stimuli som for eksempel vibrasjoner, lyd, elektrisitet, og lys er kjent trigger nyhet svar. Derfor må det tas spesielle forholdsregler for å blokkere eller dempe eksterne sensoriske stimuli under en langsiktig observasjon av frittsvømmende WEF. På denne måten kan endringer i EOD hastighet og bevegelsesbaner oppføres som stimuli presentert av eksperimentator.

Akvarium tank og isolasjon kammeret. Vi la derfor flere lag med vibrasjonsdempende materiale under et stort akvarium tank (2,1 mx 2,1 mx 0,3 m), og omgitt tanken med en isolert kabinett for å blokkere eksterne lyskilder, elektrisk støy, lyd og varme flux. EOD frekvens avhenger av den omliggende temperatur 15,16, slik at vanntemperaturen er strengt regulert på en tropisk område (25 ± 1 ° C) for South American WEF arter. Vi bygget en stor og grunn (10 cm vanndybde) tank å observere romlige utforskende atferd av WEF hovedsak begrenset i to dimensjoner (Figur 1a). Tanken ble delt opp i en sentral arena for å observere romlige atferd, og fire hjørnelommer for å huse hver enkelt fisk (figur 1B). Hver rommet ble bygget vanntett for å hindre elektrisk kommunikasjon mellom individer. Dyr adgang til den sentrale arena ble kontrollert fra utsiden ved hjelp av fire motoriserte porter. Portene ble plassert mellom avdelingene, og de ble vanntett når den er låstav nylon vingemuttere. Ingen metalldeler ble brukt under vann siden WEF reagerer følsomt til metaller.

EOD-opptak. EODs er generert på en stereotyp måte ved aktivering av single (i Mormyrids) eller flere romlig distribuerte elektriske organer (i Gymnotiforms) 17,18. Temporale modulasjoner i EOD hastigheten kan avsløre høyere nivå nevrale aktiviteter, siden den medullary pacemaker mottar direkte nevrale innspill fra høyere hjerneregioner som den diencephalic prepacemaker kjernen, som igjen får aksonale anslag fra brain 19. Imidlertid må den EOD timing nøye hentet fra en rå bølgeform opptak og ikke partisk av dyrets bevegelsesutløst forvrengninger. Det elektriske felt som genereres av en WEF kan tilnærmes som en dipol, og dermed EOD puls amplituder ved opptakselektroder er avhengig av de relative avstander og orienteringer mellom dyret og elektrodene 8,20. Animal selv movements endre den relative geometri mellom dyret og elektrodene, og dermed bevegelser føre de EOD amplituder på forskjellige elektroder til å variere med tiden i et flyktig måte (se figur 2B i juni et al. 8). Videre selv bevegelser også endre formen på innspilte EOD bølgeformer, fordi relative bidrag fra ulike sett av de elektriske organene er avhengige av sine steder langs kroppslengde og deres lokale kurva introdusert av halen bøying. Bevegelses-indusert forvrengninger i EOD amplituder og former kan føre til unøyaktige og upålitelige EOD timing målinger. Vi overvant disse problemene ved romlig gjennomsnitt flere EOD-bølgeformer registrert på forskjellige steder, og ved å legge en konvolutt utvinning filter for å nøyaktig fastslå EOD timing fra et frittsvømmende WEF. I tillegg er våre teknikken måler også de EOD amplituder, som viser om et dyr hviler eller aktivt flytting basert på endringen av EODamplituder over tid (se figurene 2E og 2F). Vi registrerte ulikt forsterkede signaler fra innspillingen elektrode parene å redusere common-mode støy. Siden EOD pulser er generert med ujevne mellomrom, EOD hendelsestidsserien har en variabel samplingsfrekvens. EOD tidsserier kan konverteres til en konstant samplingsfrekvens ved interpolering hvis det kreves av en analytisk verktøy av valget.

Videoopptak. Selv EOD opptak kan overvåke en grov bevegelsesaktivitet hos et dyr, tillater videoopptak direkte målinger av dyrets kroppsstilling og sittestilling. Nær-infrarødt (NIR) belysning (λ = 800 ~ 900 nm) tillater uaffisert visuell observasjon av frittsvømmende fisk 21,22, ettersom WEFs er mest aktive i mørke og deres øyne er ikke følsomme for NIR spekteret 23,24. De fleste digitale bildesensorer (f.eks CMOS eller CCD) kan fange NIR spekteret med wavelength range mellom 800-900 nm, etter å ha fjernet en infrarød (IR) blokkerer filteret 25. Enkelte high-end forbruker-grade webkameraer tilbyr high-definition, bred visningsvinkel og god lav-lysfølsomhet, noe som kan gi en bildekvalitet sammenlignes med, eller bedre enn profesjonelt nivå IR-kameraer som er tilgjengelige på langt større kostnader. I tillegg er enkelte forbruker-grade webkameraer buntet med innspillingen programvare som tillater en lengre opptakstid ved å komprimere video uten tap av kvalitet. De fleste profesjonelle-klasse kameraer tilbyr tidssynkronisering TTL pulsutganger eller trigger TTL pulsinnganger 26 for å justere timingen mellom videoen med de digitaliserte signaler, men denne funksjonen er vanligvis fraværende i forbruker-grade webkameraer. Men, kan timingen mellom en videoinnspilling og et signal digitaliserer være nøyaktig matchet ved samtidig å fange en blinkende jevne IR LED med kameraet og signalet digitaliserer. Den første og den siste puls IR timing kan benyttes ens to markører tidskalibrerings for omforming av videorammenummer til signal digitaliserer tidsenhet, og omvendt.

Lighting & bakgrunn. Ta bilder gjennom vann kan være teknisk utfordrende på grunn av lysrefleksjoner på vannoverflaten. Vannflaten kan fungere som et speil for å reflektere en visuell scene over vann, og obskure visuelle funksjoner under vann, og dermed scenen over vann må gjengis særpreg for å hindre visuell forstyrrelse. For å avbilde hele akvarium, må et kamera for å bli plassert direkte over vannet, og det bør være skjult bak taket over et lite visning hullet for å hindre at dens refleksjon på vannflaten. Videre kan vannoverflaten produsere stirrer og nonuniform belysning hvis lyskilder er feil anslått. Indirekte belysning kan oppnå en jevn lyshet over hele akvariet ved å sikte lyskildene mot taket, slik at den omkringliggende wal taket ogls kan reflektere og diffuse lyset stråler før den når vannflaten. Velg en IR-lys som passer til en spektral respons på kameraet (f.eks 850 nm peak bølgelengde). Elektrisk støy fra lyskildene kan reduseres ved å bruke LED-lys og plassere sine DC strømforsyning utenfor Faraday bur. Plasser en hvit bakgrunn under tanken, siden fisken kontraster godt i en hvit bakgrunn på NIR bølgelengder. Tilsvarende bruk av matt hvit farge på den indre overflaten av isolasjonskammeret gir ensartet og sterkt bakgrunnsbelysningen.

Video sporing. Når en video-opptak, kan en automatisert bildesporingsalgoritme måle dyrets kroppsposisjoner og stillinger over tid. Videoen sporing kan utføres automatisk ved enten klar til bruk programvare (Viewpoint eller Ethovision), eller bruker-programmerbar programvare (OpenCV eller MATLAB Bildebehandling verktøykasse). Som første skritt i bilde sporing,et gyldig sporings området må defineres ved å tegne en geometrisk form å ekskludere området utenfor (maskeringsoperasjon). Deretter må en dyrets bilde som skal isoleres fra bakgrunnen ved å subtrahere bakgrunnsbilde fra et bilde inneholdende dyret. Den subtrahert bilde blir omdannet til et binært format ved å bruke et intensitetsterskel, slik at det geometriske tyngdepunkt og retningen aksen kan beregnes fra binære morfologiske operasjoner. I Gymnotiforms 27-29 og Mormyrids 30-32, er den electroreceptor tettheten størst i nærheten av hoderegionen, og dermed hodeposisjonen til enhver tid angir en plassering av den høyeste sanseskarphet. Hodet og halen steder kan bestemmes automatisk ved å bruke bilderote og markerings-box drift. De fremre og bakre ender kan skilles fra hverandre ved manuelt å definere dem i den første ramme, og ved å holde rede på sine steder fra å sammenligne to suksessive rammer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Denne prosedyren oppfyller kravene i University of Ottawa Animal Care Committee. Ingen interessekonflikt er deklarert. Vennligst referer til Table of Materials og reagenser for fabrikater og modeller av utstyr og materialer som er oppgitt nedenfor. Custom skrevet Spike2 og MATLAB skript, og eksempeldata er gitt i brev fil.

En. Aquarium Tank og Isolasjon Kammer Setup

  1. Anti-v ibration gulvet. Konstruer en anti-vibrasjonsflate (2,1 mx 2,1 m) ved å stable gummiputer, akustisk Styrofoam, marine kryssfiner panel, og polyuretan skumputer fra bunnen til toppen (figur 1A). Lå fire tre stendere (5 cm x 10 cm) på kryssfinér-panelet for å understøtte kantene av akvariet.
  2. Gulv varmeapparat. Lå en elektrisk skjermet varmeelement enn termisk gradert skum padding (se figur 1D nederst). Dekk varmeelement med en metalllic mesh for elektrisk skjerming.
  3. Spatial tank. Konstruer et bredt og grunt akvarium tank (1,8 mx 1,8 mx 30 cm) med 1,3 cm tykk herdet glass paneler, L-formet aluminiumsramme og akvarium-grade silikon (se figur 1A). Dekk til undersiden av tanken med et stort ark av hvit bakgrunn til å gi høy bildekontrast (se protokoll 3).
  4. Dele akvariet tank inn i en sentral arena (1,5 m diameter) og fire hjørne avdelinger (se figur 1B) ved å installere vegger (22,5 cm høye) laget av akrylplater (matt hvit, 0,64 cm tykk).
    1. Bend fire akrylplater (22,5 cm x 102,7 cm) ved å bruke varme for å lage fire buede veggseksjoner, og feste dem til bunnen av tanken ved hjelp av silikon caulk å skille den sentrale arenaen fra de fire hjørne avdelinger. La 20 cm mellomrom mellom de buede seksjoner for porten installasjon.
    2. Separate nabohjørne avdelinger ved å installere fire doble vegger with 15 cm hull, som gir ekstra elektrisk isolasjon og steder for undervannssensorer som en hydrofon.
  5. Monter fire motoriserte porter, og installere dem mellom hjørne avdelinger og den sentrale arena.
    1. Monter fire dørkarmer, som vist i figur 1C. Lag seks brønner (0,64 cm dyp) på hver dørkarm, embed nylon eikenøtt nøtter (0,64 cm diameter tråd) og fest dem med epoxy.
    2. Skjær fire dørpaneler fra akryl og gummi ark, og opprette seks hull (0,64 cm diameter) på akryl og gummiplater for låsemekanismen. Bli med akryl og gummi paneler med silikondrivning.
    3. Installer akryl hengsler å delta dørpanelene med dørkarmer.
    4. Mount svingende armene på servomotorer, og installere dem på toppen av dørkarmer (se figur 1C). Gjør looper med kabelbånd til å knytte de svingende armer til dørpanelene.
    5. Plasser gate forsamlinger på GAps opprettet mellom de buede veggseksjoner, og fest dem ved hjelp av silikon drivning.
    6. Koble alle servomotorer til en servo controller, og koble den til en strømkilde og en datamaskin via en aktiv USB-skjøteledning. Test portene ved hjelp av kontrollprogramvare som leveres med servoomformeren.
    7. Etter at silikon stivner, sjekk for vanntetthet ved å låse alle porter med nylonskruer og fylle et kammer om gangen.
  6. Isolasjon kammer. Konstruer en isolert kammer å omgi akvariet og blokkere eksterne kilder til lys, lyd og elektrisk støy (se figur 1D).
    1. Lag tre veggpaneler (2 mx 2 mx 5 cm) og fire dørpaneler (1,9 mx 0,95 mx 5 cm). For hvert panel, bli aluminiumslister (5 cm x 2,5 cm) for å skape en rektangulær ramme, og klinke et hvitt korrugert plastpanel på aluminiumsramme. Fyll akustiske glassfiber batts i panelene, og tett med en svart bølgeplast panel.
    2. Sett tre veggpaneler på anti-vibrasjons gulvet, og installere piano hengsler å bli med de fire dørpanelene på veggpanelene.
    3. Omgir isolasjonskammeret med aluminium maskene, og jord maskene på alle sider for å skape et Faradays bur.
  7. Fuktighet kontroll. Installer en støysvak vifte (figur 1F øverst) for å fjerne overflødig fuktighet oppbygging fra oppvarming. Plasser avtrekksvifte minst 2 m borte fra registreringsstedet og installeres i en luftkanal mellom isoleringskammeret og utblåsningsvifte.
  8. Rutinemessig overvåke og opprettholde betingelsene i tank vann og dyr.
    1. Oppretthold konstant vannforhold på 10 cm dybde, 100 mS / cm konduktivitet og pH 7,0 ved å tilsette vann eller salt stamløsning (se Knudsen 33 for oppskriften). Til en pose med knust korall hvis pH faller under 6,5.
    2. Installer vertikale akvarium filtre som kan operere fra grunt vann for rengjøring ogaerering formål (figur 1F nederst). Koble filtrene og ta dem ut av den sentrale arenaen under innspillingene.
    3. Lever levende melormer på bunnen av tanken ved å feste dem på sugekopper med elastikk. Unngå frittflytende jakter som blackworms å hindre ukontrollert fôring av forvillede jakter under opptak.

2. EOD Tracking

  1. Installasjon elektroder. Monter åtte grafittelektroder, og fordeler dem likt på den buede vegg av den sentrale arena.
    1. Skaffe tegning fører (15 cm i lengde, Mars Carbon 2 mm typen HB) og rake av det ytre belegg av ledningene.
    2. Skjær åtte 10 cm segmenter av koaksialkabel (RG-174), vikle kabelen kjernen rundt den ene enden av grafitt stenger, og gjelder varmekrymperør over dem for sterk og stabil elektrisk tilkobling. Fest BNC jack kontakter på motsatt ende (Figur 2A venstre). </ Li>
    3. Plasser elektrodene på veggen ved taping, og anvende tynne strimler av maskeringstape på elektrodeflatene for å beskytte mot silikon. Påfør silikon drivning for å holde permanent elektrodene, og fjerne all tape før silikon stivner (Figur 2A høyre).
  2. Bygge åtte kabelkonfeksjon ved å måle avstanden fra hver elektrode i forsterkerenheten, og kutte koaksialkabler (RG-54) i lengder. Fest BNC plug-kontakter i begge ender av kablene.
  3. Bruk kabel forsamlinger til å koble alle elektroder til forsterkeren enheten. Differentially forsterke ved sammenkobling to 90 ° orienterte elektroder (se figur 2B), og bakken alle koaksial skjerming ledninger ved å koble dem til Faraday bur.
  4. Sett forsterkningen under signalmetningsgrensen, og anvende et båndpassfilter (200 Hz-5 kHz) for å fjerne støy. Digital fire opptaks elektrode-parene ved 40 kS / sek.
  5. Onlinesignalbehandling. Instruksjonene er skrevet for Spike2 programvare, og parameterinnstillingene er optimalisert for Gymnotus sp. (Se Figur 2C for oppsummering).
    1. Legg en DC fjerne prosess (τ = 0,1 sek) til alle registreringskanaler.
    2. Legg en Utbedre prosessen til alle innspillinger kanaler.
    3. Lag en virtuell kanal ved å summere alle fire opptakskanaler.
    4. Pakk en unimodal konvolutt per EOD pulsen ved å legge til et RMS (root-betyr-squared, ) Prosess (τ = 0,25 msec) til den virtuelle kanal, for å generere en enkelt topp EOD per syklus for å entydig å bestemme puls timing.
    5. Lag en realmark kanal fra den virtuelle kanalen og registrere tid og verdier av peak amplituder, etter å sette en passende terskel for å fange opp alle EOD pulser without mangler en puls, og samtidig unngå falske positiver.
    6. Overvåk momentant EOD rate i sanntid ved å sette kanalvisning av realmark kanal til en øyeblikkelig frekvensmodus.
    7. Overvåke fisken bevegelse i sanntid ved å duplisere realmark kanal, og sette alternativet skjermen til en bølgeform modus.
    8. Kvantifisere et aktivitetsnivå fra RMS av EOD amplitude skråningen ved å opprette en virtuell kanal fra realmark kanal (0,01 sek sampling periode), og legge skråningen (τ = 0,25 msek) og RMS (τ = 0,5 ms) prosesser.
    9. Eksportere realmark kanal i Spike2 programvare til MATLAB format.

Tre. Synkronisert Video Tracking

  1. Lag en bakgrunn scene.
    1. Skjul alle objekt som kaster en refleksjon på vannoverflaten ved å dekke med matt hvit benkeplate film.
    2. Installer en matt hvitbølge plast panel 15 cm under taket for å skjule kameraet og luftventilen.
    3. Skriv ut rutenettet mønstre på et stort ark med hvitt papir for å kalibrere et kamera, og legg den under tanken å gi en høy kontrast bakgrunn.
  2. Installer lyskilder.
    1. Skaff IR LED lys og, fjerne innebygde vifter for å redusere støy. Kjør LED med et strøm regulert DC strømforsyning plassert utenfor Faraday bur.
    2. Install IR LED lys for bildebehandling i mørket, og hvite LED lys for å kjøre en dagaktive lys syklus i forsøksfisken. Direkte alle lyskilder mot taket for å oppnå indirekte og jevn belysning (figur 3A).
    3. Regulere dagaktive lys syklus ved å kjøre den hvite LED-lys med en tidsstyrt bryter (f.eks 12 timers on/12 hr off).
  3. Installer et kamera rett over akvariet.
    1. Skaff en NIR-sensitive kamera, eller fjerne en IR blokkering filter ved å bryte et tynt ark av farget glass på baksiden av linseenheten. Kontroller at synsvinkelen er bred nok til å avbilde hele sentral arena.
    2. Lag en liten visning hull i midten av taket panel, og plassere kameraet direkte over hullet.
    3. Installer en hvit ring vakt rundt objektivet hvis lyskildene generere stirrer.
  4. Lag en tids synkronisert video-opptak.
    1. Legg inn en IR LED på en av de fire tank hjørner for å generere tidssynkronisering pulser (1 msek varighet, 10 sek periode). Legg en last begrensende motstand (1 kW) i serien, og drive IR LED fra en digital utgang av digitaliseringsmaskinvaren.
    2. Bruk video-opptak programvare sammen med kameraet hvis tilgjengelig. Velg det høyeste opptakskvalitet (f.eks tapsfri komprimering) og de ​​høyeste oppløsningene som støttes.
    3. Start videoopptak umiddelbart før du starter EOD-opptak, og stoppe videoopptak umiddelbart etter EOD opptaket.
    4. Etter at opptaket, konvertere bildet rammenummer til digitaliserings tidsenhet ved lineært å interpolere mellom den første og den siste lyspulser fanget opp av digitalisereren signal og video-opptak.
  5. Automatisert bildesporing
    Instruksjonene er skrevet for MATLAB Bildebehandling verktøykasse, og gjøre bruk av sine funksjoner. En tilpasset MATLAB skript er utstyrt med dette brevet for automatisert bilde sporing.
    1. Importere video. Importer en videoinnspilling fil direkte til MATLAB arbeidsområdet ved hjelp av "Videoreader. Lese"-funksjonen.
    2. Lag en sammensatt bakgrunnsbilde ved å kombinere to bilderammer. Skifte bilde regionen okkupert av et dyr med et ledig bilde av samme region fra en annen ramme (se figur 3B).
    3. Angi et bilde regionen for å spore ved å tegne en sirkulær maske rundt den sentrale arena for å utelukke enrea utenfor (Figur 3B nederst), og multipliser med en konstant (r int) å sette en minimumsterskel for intensitet forskjell. For eksempel angir rint = 0,85 undertrykker intensitetsvariasjoner 15% = (1 - r int) under bakgrunnen.
    4. Bilde subtraksjon. Trekk fra en bilderammen (= IM k) fra bakgrunnsbildet (IM = 0) for å oppnå differansen bilde (= ΔIM k). Bruk usignert heltall numerisk presisjon til å lagre bildeintensitetsverdier som ikke-negative heltall.
    5. Segment forskjellen bilde ved påføring av en intensitetsterskel bestemmes fra graythresh funksjon. Rengjør det binære bildet med bwmorph funksjon, og velg den største blob tilsvarer et dyr etter beregne alle blob områder bruker regionprops funksjon.
    6. Bestem tyngdepunktet og store orientering enXis av de største blob ved å påføre regionprops funksjon, og rotere bildet for å justere hovedakse med x-aksen. Deler bildet til hode og hale deler på Tyngdepunktet (Figur 3D øverst).
    7. Bestem den store akse av hodet delen, og rotere hele bildet for å justere i forhold til x-aksen (figur 3D nederst til venstre). Monter markerings-bokser rundt hodet og halen deler parallelt med sine store akser bruker regionprops funksjon.
    8. Bestem median y-koordinatene til blob på venstre, midtre og høyre vertikale kantene av markeringsrammene (grønne prikker i Figur 3D bunn), og tilordne dem til fem funksjonen poeng (hode-tip, mid-head, mid-body , mid-tail, tail-tip).
    9. Behandle etterfølgende bilder etter bildeskjæring ramme sentrert på dyrets Tyngdepunktet bestemmes fra sin tidligere rammen.
    10. Tildele manuelt hodet orientering for det første bildet, og bruk en prikk-produktet between orienterings vektorer fra to suksessive rammer for å bestemme hovedretningen automatisk. Inspisere resultatet, og manuelt snu hodet orientering ved feilaktig tildelt.
  6. Plott et dyr bane ved å delta i head-tips, og glatt å bruke median og gjennomsnittlig filtre (n = 3) hvis den har en nervøs utseende. Legg over banen med et bakgrunnsbilde, og interpolere fiske midlines å bruke de fem funksjonspunkter (se figur 2E).
  7. Beregn den gjennomsnittlige EOD sats på hvert bilde fangst tid ved resampling momentant EOD rate (100 Hz samplingsfrekvens) og gjennomsnitt (0,0625 sek tidsvinduet). Plott banen i pseudo-farger bestemmes fra den tid-matchet EOD rente, og sammenligne med med et bakgrunnsbilde (se figur 2F).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

EOD sporingsresultatene

De registrerte EOD bølgeformer fra forskjellige elektrode parene variert i amplituder og former som forventet fra sine unike posisjoner og orienteringer (Figur 2C øverst). Bruken av flere elektrode parene sikres sterkt signalmottak til alle mulige posisjoner og orienteringer av WEF i tanken. Konvolutten bølgeform (Figur 2C bunnen, grønne kurven) alltid inneholdt en enkel topp per EOD syklus, som fungerte som en pålitelig tidsmarkør for nøyaktig bestemmelse av inter-puls intervaller og momentant EOD rate (= IPI -1). De påfølgende EOD-toppene fikk med seg og lineært interpolert i faste tidsintervaller (figur 2D topp, svart spor), og den øyeblikke EOD frekvensen var tilsvarende interpolert i faste tidsintervaller (figur 2D bunn, rosa spor). Den konstante tid resampling fremgangsmåten muliggjør tidssynkroniseringen blilom bevegelse Mønster og EOD-signal, og gjør det mulig å utnytte fra et større antall analytiske verktøy for stadig samplede tidsrekkedata. EOD amplituder innspilt på eksterne elektroder holdt seg konstant mens et dyr var i ro (figur 2E topp), men det varierte over tid, mens dyret flyttet på grunn av skiftende dipol plassering og orientering (Figur 2F øverst). Således kan fisken bevegelse utledes fra å observere endringen i EOD amplituder over tid. Grunnlinjen EOD holdt seg lav, mens fisken var i ro (figur 2E nederst), men den EOD hastigheten ble betydelig høyere, mens fisken aktivt svømte (figur 2F øverst). Vår observasjon er forenlig med den positive korrelasjonen mellom EOD rente og fisken bevegelsen som tidligere rapportert 8,9,34,35.

Video sporingsresultatene

Dyrets bane og midlines er vist i Fig ure 3E med de første og siste bilde rammer oppå. Den tids løpet av holdning endringen ble fanget mens fisken ble brått snu i to sekunder, og fisken midlines er plottet hver 200 msek. Fisken midtlinjen riktig startet på hodet-tip og avsluttet på halen-spissen av fisk. Fiskebilder tett avtalt med automatisk belte midlines tross av skyggene støpt ved dyret. Figur 3F illustrerer tidsvarierende gjennomsnittlig EOD rate (τ = 0,0625 sek) i farger, noe som er overlagret med tids matchet banen fiskens hode -tip. I løpet av 2 sek vende varighet, den gjennomsnittlige EOD hastigheten nådde sitt høydepunkt mens dyret var i midten av dreiefasen, og hastigheten ble redusert mot slutten av svinge. Denne representanten Resultatet illustrerer at vår metode kan med hell brukes til å studere sammenhengen mellom selvstyrte bevegelser og EOD rente module under frittsvømmende.

t "fo: keep-together.within-page =" always "> Figur 1
Figur 1. Akvarium tank og isolasjon kammeret oppsett. A) Forsøkskammeret består av en anti-vibrasjons gulv, akvarium tank, og et isolasjonskammer. B) Den akvarium tank ble delt inn i den sentrale arena for løpende eksperimenter, og fire hjørnelommer for bolig-individuelle fisk. Hvert kammer ble bygget vanntett for å hindre elektrisk forbindelse mellom dyrene. C) Den motoriserte porten er illustrert ved flere perspektiv vinkler. Porten blir vanntett når den er låst av seks vingemuttere som komprimerer gummipakningen (den lysebrune arket). Når ulåst, kan porten være fjernstyrt ved hjelp av servomotoren på toppen. D) Dette isolasjonskammer ble satt sammen ved å bli tre walle paneler og fire dørpaneler, som gir adgang til akvariet tank fra to sider. Den nederste panelet illustrerer de tre rails for å støtte tanken kanter, og gulvet varmeapparat plassering. Et lag av aluminium mesh dekker varmeapparatet for å skjerme den elektriske støy. E) Veggene og dørpaneler av isoleringskammeret ble konstruert fra aluminiumsrammer for strukturell støtte (3). De indre overflater av kammeret er dekket av hvite plastplater (5) for å reflektere innvendige lyskilder, og yttersiden dekkes av sort plast-paneler (2) for å hindre ytre lyskilder. En aluminium mesh (1) dekker de ytre veggene for å hindre ekstern elektrisk støy. Veggen er fylt med akustiske glassfiber batts (4) f) Det øverste bildet viser luftventilasjon oppsett for å fjerne overflødig fuktighet dannes ved oppvarming av;., Og den nederste bilde viser vannfiltreringsoppsett for rengjøring, spre, og lufting av tank vann mellom eksperimentelløkter. Klikk her for å se større bilde .

Fig. 2
Figur 2. EOD opptak oppsett og representative resultater. A) Det venstre panel illustrerer elektrodesammenstillingen som består av en tynn grafittelektrode, en kort segment av koaksial-kabelen, og en BNC Jack. Panelet til høyre viser elektrodefeste instruksjoner. Maskeringstape brukes til midlertidig å plassere elektrodeenheten, og silikon-drivning ble anvendt for å holde elektroden. B) Koblingsskjemaet permanent. To 90 ° orienterte elektroder er koblet opp, differensielt forsterket og filtrert. Fire opptakskanaler ble digitalisert utsiden av Faraday calder. C) illustrasjon av de EOD signalbehandlingstrinn. Den øverste spor rå viser bølgeformer fra fire elektroder parene, som er rettet og summert for å frembringe den grå spor nedenfor. Unimodal konvolutter er hentet fra den grå bølgeform ved hjelp av "Root-Mean-Square" (RMS) filter (grønne kurven). EOD amplituder og Ipís bestemmes fra konvolutt toppene. D) tidsvarierende EOD amplituder (øverst) og momentant EOD rate (nederst) er vist på en lengre tidsskala enn C). EOD amplituder og momentant rate (= IPI -1) blir interpolert med jevne mellomrom ved å bli konvolutt topper (svart spor). E) Samme som D) men plottet på en lengre tidsskala, mens fisken var i ro. F) Samme som E) mens fisken var aktivt svømming. Klikk her for å se større bilde .

Figur 3
Figur 3. Video sporing og representative resultater. A) belysning og kameraoppsettet er illustrert. Den infrarøde (IR) og synlige lyskilder er festet på veggene og pekte mot taket, slik at taket flaten reflekterer og sprer lyset for projisering av jevn belysning over hele tanken. Kameraet er skjult over taket panelet for å hindre refleksjon på vannflaten. En IR LED er posisjonert på en av de fire hjørner tank for å generere tidssynkroniseringsimpulser. B) å generere et sammensatt bakgrunnsbilde er illustrert. To bilderammer (bilder på toppen) er kombinert for å danne den sammensatte bakgrunnsbildet (nederst til venstre) ved å erstatte-region som omfatter dyr (sålokk rød firkant) med regionen uten at dyret (stiplet rød firkant). Området utenfor den sentrale arena er maskert ut i svart (nederst til høyre). C) Isolere fisken disposisjon. En bilderammen (øverst til venstre) subtraheres fra bakgrunnsbildet (øverst til høyre) for å frembringe forskjellen bilde (nederst til venstre), og omdannet til det binære bildet (nederst til høyre) ved å påføre et intensitetsterskel. D) Målinger av kroppsstilling og holdning er illustrert. Den binære bilde av dyret (dråpe) ble rotert for å justere dens hovedakse med x-aksen (øverst til høyre), og er sentrert på det geometriske tyngdepunkt. Den blob ble skilt i hodet (rød) og hale (blå) deler, og hver del ble separat roteres for å bestemme sin markerings-boksen. Den blob ble orientert til dyrets referanseramme (nederst til venstre), og fem funksjonen poeng (head-end, mid-head, midten av kroppen, mid-tail, tail-end) ble bestemt fra midtpunktene av markerings-box kanter. E) Time-lapse imalder av fiske midlines plottet hver 200 msek. Den første og siste bilde rammer blir overlagret i løpet av 2 sek varighet vende. F) Den gjennomsnittlige EOD frekvensen er representert ved pseudo-farge og overlagret med banen til fiskehodet. De samme bildene brukes som i E). Klikk her for å se større bilde .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Betydningen av våre teknikker. Oppsummert vi først beskrevet byggingen av et stort akvarium tank og et isolert kammer å observere spontane utforskende atferd produsert av WEF. Deretter viste vi teknikken med å samle inn og spore EOD hastigheten og bevegelsen statene fra uhemmet fisk i sanntid ved hjelp av flere elektrode parene. Endelig beskrev vi den infrarøde videoopptak teknikk gjennom vannet i en tid-synkronisert måte, og bildet sporingsalgoritme for å måle kroppsstilling og sittestilling. Som en eksperimentell forberedelse WEF, tilbyr en viktig fordel for å undersøke aktive sensoriske styrt atferd ved å demonstrere lett kvantifiserbare EOD rate, noe som tilsvarer den aktive electrosensory samplingsfrekvens. Kombinasjon av disse teknikkene kan muliggjøre en nøyaktig og pålitelig langsiktig observasjon 8 av spontane atferd fra hemningsløs WEF. Dessuten kan de fleste av våre oppsettet være konstruert frOM allment tilgjengelige byggematerialer og lett oppnåelig elektroniske komponenter. Teknikkene som beskrives her har blitt utviklet og testet for å møte våre eksperimentelle krav enn de siste årene. Derfor anbefaler vi disse teknikkene for fremtidige studier av spontane utforskende atferd fra frittsvømmende WEF.

Isolasjon kammer. Isolasjonen kammer gir godt kontrollerte eksperimentelle forhold ved å blokkere eksterne lyskilder, vibrasjon, lyd og elektrisk støy med varierende grad av effektivitet. Lyset blokkering ytelse ble testet ved å plassere en motorisert kamera inne i den mørke isolasjonskammer, og ingen ekstern lyslekkasje ble observert fra kameraet etter å ha skannet alle steder ved hjelp av fjern pan kontroll. Den vibrasjonsdempende underlag installert under tanken gitt demping mot ytre vibrasjoner kanalisert fra gulvet, og stabling av flere gummi og skum lag var effektive for å blokkere de flesteeksterne vibrasjons hendelser. Men intermitterende vibrasjons arrangementer som høyt dør stenger på nærliggende steder gjorde utløse nyheten reaksjoner i sjeldne tilfeller. Selv om en anti-vibrasjons luft bord kunne levere overlegen isolasjon ytelse fra bakgrunns vibrasjoner, ville det være uoverkommelig dyrt å kjøpe en luft bord stort nok for vår akvarium tank. Derfor har vi plassert en hydrofon under vann for å oppdage og inkluderer hendelser når store eksterne vibrasjoner utløste nyheten svar. For ytterligere å redusere påvirkning av støy utenfor laboratoriet, ble våre eksperimenter utført i løpet av off-peak timer (etter 18:00). Tilsvarende ble ekstern luftbåren akustisk støy dempes via isolasjon kammer vegger fylt med glassfiber batts isolasjon. Selv om vi ikke objektivt kvantifisere lyddemping ytelse, det meste av bakgrunnslyd i en lab miljø ikke utløse den nyheten svar. I sjeldne tilfeller, en plutselig høy lyd fra utsiden triggered en nyhet respons, men en slik hendelse ble oppdaget av hydrofon innspillingen, og de sjelden skjedde under off-peak timer. Akvariet tank gitt tilstrekkelig stort område for våre dyr til fritt å svømme og utforske. Tankens størrelse er valgt i forhold til lengden av arten vi brukte (opp til 30 cm), men størrelsen tanken kan skaleres ned hvis mindre dyr ble anvendt. Vi valgte Gymnotus sp. blant ulike puls-type arter for sin store skallen størrelse for å legge til rette for elektrofysiologiske opptak under frittsvømmende 36. Den elektriske opptakskvalitet kan bedre fra å bruke mer kostbare kobber maskene, og skjerming av avtrekksvifte brukes for fuktighetskontroll.

EOD måleteknikken. Vår flerkanals EOD opptaksteknikk tillatt nøyaktig og pålitelig EOD timing måling fra frittsvømmende fisk. Ved hjelp av vår teknikk, ble alle EOD pulser generert av frittsvømmende WEF oppdaget uten mangler eller legge til en syndgle puls for en seks timers lang opptakstid (se Figur 12 i juni et al. 8). EOD opptaks måler ikke bare EOD rente, men også aktivitetsnivået fra tidsvarierende EOD peak amplituder innspilt på eksterne elektroder. De registrerte EOD amplituder er bestemt av den relative geometri mellom et dyr, og opptakselektroder, og dermed dyr bevegelser indusere endringer i EOD amplituder (figur 2f). Aktivitetsnivået ble beregnet fra variabilitet (RMS) av EOD amplitude skråningen i et vindu i bevegelse (0,5 sek.) Ved hjelp av denne fremgangsmåte, vil video-opptak ikke være nødvendig for å måle aktivitetsnivået i løpet av en lang tidsperiode, og den EOD opptak alene kan være nok. I stedet for ved hjelp av en video-opptak, kan legemet posisjon og holdning av WEF utledes fra EOD opptak alene basert på elektrodene steder, geometrien av en tank, og en teoretisk modell av en strøm dipol. Ved hjelp av en lignende recording oppsett, Jun et al. 20 foreslått en real-time elektrisk sporing metode for å spore flere WEFs i nærvær av et objekt, som sammenligner målte signalintensitet på flere opptak elektrode parene med oppslagstabelloppføringer som inneholder spådd signalintensitet på kjente nåværende dipol steder. Den elektriske sporing metoden gir bedre sporing pålitelighet i et visuelt rotete miljø der dyr ofte blir hindret fra visningen, eller under sporing av flere dyr. WEF er naturalis habitater inneholder mange visuelle hindringer som vannplanter og røtter, hvor den elektriske sporing metoden kan gi mer pålitelig sporing med enklere oppsett krav enn visuell sporing. I prinsippet, er vår metode som gjelder direkte til wave-type WEF arter etter Endre filter tidskonstanter. Utbedring trinnet vil introdusere to moduser per EOD syklus, siden EOD-kurven er tilnærmet sinusformet i bølge-type arter. I dette tilfellet, Kan den momentant EOD frekvensen bestemmes ved å hoppe over annenhver EOD gang markører for å ignorere den negative EOD fasen. WEF kan oppdage opptaks elektrodene når de svømmer i nærheten, derfor vi unngått å bruke store eller metalliske elektroder som kan sanses fra lenger unna 37, og i stedet brukt tynne grafitt elektroder (2 mm diameter). Tynnere koaksialkabler (RG-174) ble brukt med elektrodemontasjene for fleksibilitet, men tykkere koaksialkabler (RG-54) ble brukt til kabling over lengre avstander for overlegen elektrisk skjerming. Lengre EOD opptakstid kan oppnås ved å senke samplingsfrekvens, men på et lavere tidsmessig oppløsning som en trade-off. Middelverdien og variasjon av EOD Frekvensen varierer mellom artene, og dermed tidsvinduet for å jevne den momentant EOD raten må være riktig innstilt. En kortere tidsvindu er anbefalt for specier som har kortere midlere og mindre variasjon i Ipís (f.eks Gymnotiforms), og en lengre tid window er anbefalt for arter som har lengre gjennomsnittlig og høyere variabilitet i Ipís (f.eks Mormyrids).

Belysning og kameraoppsettet. Videoopptak gi kvantitative og kvalitative atferdsobservasjoner, og her vi beskrevet prosedyrer for å sette opp, innspilling og bearbeiding av bildedata. Belysning oppsett spiller en viktig rolle i å produsere bilder av høy kvalitet, og lyset projeksjonsvinkel er en viktig faktor for imaging undervanns dyr. Under suboptimale lysforhold, kan vannoverflaten danner stirrer og refleksjoner, som kan forstyrre bildet sporing spesielt når dyrene generere overflatebølger. De blending og refleksjon problemer kan elimineres ved å projisere lys kilder fra bunnen av en tank. For en liten tank, kan matriser med LED plasseres rett under tanken og skinne gjennom en diffuser panel for å generere jevn lysintensitet 38. Tilsvarende for en større tank, en lyskilde cen bli plassert under tanken, og ensartet lysintensitet kan oppnås ved å tillate tilstrekkelig avstand for lett å diffundere 39.. I vårt oppsett, ble vi tvunget til å projisere lys fra over tanken på grunn av plassbegrensninger, strukturell stabilitet, og varmeapparatet plassering under tanken. Vi unngikk skinn og reflekser problemer ved hjelp av indirekte belysning, slik at lyskildene ble projisert mot taket. Ved å gjengi den øvre delen av kammeret særpreg og matt hvit, ingen refleksjoner var synlige på vannoverflaten. Til bilde hele sentral arena, en vidvinkel linse kan monteres på kameraet, men noen objektiver (fisheye-objektiv) kan forårsake betydelig tønnefortegning. Sylinderen forvrengning kan korrigeres ved hjelp av en kalibreringsnett ark under tanken for å måle pikselkoordinater av gitter steder sett i tankens sentrum. Sammen med de tilsvarende grid steder i centimeter, kan en transformasjonsmatrise beregnes å correct den tønnefortegning 40. Det anbefales høyoppløselige kamera hvis et dyr størrelse er mye mindre enn størrelsen på tanken, slik at det kan oppnås at tilstrekkelig antall piksler fra dyret for å måle kroppsholdning fullstendig.

Bilde sporing og tidssynkronisering. Bildet sporingsalgoritme som er beskrevet her gjør bruk av den region av interesse (ROI) operasjon for å raskt måle kroppsstilling og sittestilling. Den avkastningen handlingen reduserer bildestørrelsen som skal behandles, og begrenser sporingskjeden nær dyret plassering fra forrige rammen. Vi hentet den kroppsholdning (midtlinjen) ved hjelp av bilderotasjon og markerings-box operasjoner i stedet for den vanlige bilde skeletonization drift, som noen ganger ikke klarte å produsere en veldefinert enkelt midtlinjen. Dyrets referanseramme var plassert på midten av hodet markerings-boks, som tillater egocentric adferdsanalysen. Den viktigste kilden til feil i bildet tracking var på grunn av den optiske projeksjons virkning på et bredt vinkel. Ideelt sett bør dyrets vertikale bevegelser ikke påvirker 2D posisjonsmåling, men lengre bort fra den sentrale bildeaksen, er større del av den vertikale dimensjonen anslått til kameraet. Den brytning ved vannoverflaten reduseres den optiske projeksjons effekt ved 28% i vårt bildeoppsettet (kamerahøyden = 1,8 m, vanndybden på 10 cm, tank radius = 75 cm), og det verste posisjonsfeilen var ± 1,4 cm i sirkulære gjerde. Timingen mellom EOD-og videoopptak ble synkroniseres ved hjelp av infrarøde LED-pulser til å gjøre rede for tid drift mellom video og signal digitaliserings-klokker, og ulike opptaksoppstartstider. Den forventede usikkerhet i tidssynkroniseringen mellom video-og EOD opptak er proporsjonal med ramme fangst intervall, for eksempel 15 bilder per sekund (fps) rammeopptakshastighet vil resultere i at tidsjustering usikkerhet på ± 33 msek. En slik grad av time presisjon er tilstrekkelig for å spore langsommere bevegende fisk, men et høyhastighetskamera kan kreves for å spore raskere bevegelige dyr. Det anbefales å lysere lysintensitet med en økt frame rate, siden sensoren eksponeringstiden er omvendt proporsjonal med bildefrekvens.

Fremtidig arbeid. Sosiale interaksjoner mellom flere WEFs kan studeres ved å spore sine EOD-signaler og kropps steder, og sporingssystemet må riktig knytte EOD med plasseringen av den samme personen. I henhold til dipol lokaliseringsmetoden som er beskrevet av Jun et al. 20. ved hjelp av en tilsvarende installasjon, dyre steder utledet av sine EOD signaler som mottas på flere elektroder kan være tilpasset til den visuelle sporings utgang for på riktig måte å identifisere de EOD pulser fra forskjellige individer. Bilde sporing av flere dyr kan utføres én person om gangen ved hjelp av ROI drift. En ROI kan i utgangspunktet definert rundt en person tilspores, og avkastningen vil bli omplassert på hver ramme med en oppdatert kroppsstilling. De andre fiskene vil bli ekskludert fra bildet sporing analyse når det vises utenfor ROI, og hvis dukket opp inne, kan den andre fisken image automatisk bli fjernet ved å sjekke om sitt image berører ROI grensen. Noen ganger, to dyr i kontakt med hverandre og sine bilder fusjonere, og hvis så, kan en maske manuelt trukket for å skille de andre fiskene image. En annen interessant fremtidig arbeid er den tredimensjonale video sporing å avsløre intrikate bevegelsessekvenser under byttedyr fangst 22 eller sosiale interaksjoner. MacIver et al. 22 brukte to kameraer for å vise et rektangulært akvarium tank fra toppen og på siden for å rekonstruere en tredimensjonal kropp modell. Men denne tilnærmingen ville ikke fungere i vårt tilfelle, siden det er skillevegger som blokkerer sidevisninger og akvariet har mye større bredde enn dybde. I stedet vil det være flere søkerekabel for å installere flere kameraer på taket på annet perspektiv vinkler lik oppsettet som brukes av Hedrick 41. For større nøyaktighet, vil brytningseffekten introdusert av vannet og den skrå kameravinkel må korrigeres ved å kalibrere bilder i tre dimensjoner. Vår visuelle sporing metoden kan brukes til å studere den elektriske bildeflyt på fiskens kroppsoverflaten 42,43 når fisken svømmer i nærheten et objekt. Som studert av Hofmann et al. 26, ville det være av interesse å undersøke gjenstandens elektriske bildestrømmen under frittsvømmende avhengig av objektavstanden, form, størrelse og materiale. Til syvende og sist, kan våre metoder kombinert med nevrale opptak fra frittsvømmende fisk 44-46 avslører ny innsikt ved observasjoner av endringer i nevral aktivitet og EOD sats mens fisken engasjerer seg i objekt leting eller sosiale interaksjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble sjenerøst støttet av naturvitenskap og Engineering Research Council of Canada (NSERC) og den kanadiske Institutes of Health Research (CIHR).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aquarium Construction
Electrically shielded floor heater ThermoSoft Corp., IL, USA ThermoTile www.thermosoft.com
Tempered glass panel generic 0.5 in thick, used for the aquarium construction
Aquarium grade silicone generic  
Acrylic sheet generic 0.25 in thick, matte white
Natural rubber sheet generic 0.25 in thick
Servomotor HTECHRCD Inc., Korea HS-325HB, 180deg rotation www.servocity.com
Servomotor arm mount HITECHRCD Inc., Korea 56362 Large Spline www.servocity.com
Servomotor controller (6 channels) Sparkfun ROB-09664 Micro Maestro 6-channel USB Servo Controller
Active USB extension cable C2G 38990 12 m USB 2.0 A Male to A Female 4-Port Active Extension Cable
Exhaust fan Nutone ILFK120 www.homedepot.com
Vertical aquarium filter Tetra, Germany Whisper Internal Power Filter - 40i  
Crushed coral Used to increase the pH of the tank water
EOD Recording Setup
Graphite Electrodes Staedtler, Germany Mars Carbon 2-mm type HB Shave the outer coating
Physiological Amplifier/Filter Intronix, Canada 2015F  
Coaxial Cable generic RG174 For electrodes assembly
Coaxial Cable generic RG54 For wiring use
BNC jack connector for RG-174 Amphenol Connex 112160 For electrodes assembly
BNC plug connector for RG-54 Amphenol Connex 112116 For wiring use
Signal digitizer hardware Cambridge Electronic Design, UK Power MKII 1401  
Signal digitizer software Cambridge Electronic Design, UK Spike 2. ver 7  
Visual Tracking Setup
White LED light IKEA, Sweden DIODER 201.194.18 www.ikea.com
Infrared LED light (850 nm) Scene Electronics, China S8100-60-B/C-IR Remove built-in fan
USB webcam Logitech Inc., CA, USA C910 Remove Infrared blocking filter
Motorized camera Logitech Inc., CA, USA Quickcam Orbit Remove Infrared blocking filter
Video recording software Logitech Inc., CA, USA Logitech Quickcam Software Download from www.logitech.com
MATLAB Mathworks, MA, USA 2012a Image processing toolbox

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388, (6645), 882-887 (1997).
  2. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat. Neurosci. 8, (9), 1263-1268 (2005).
  3. Adamantidis, A. R., Zhang, F., Aravanis, A. M., Deisseroth, K., De Lecea, L. Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons. Nature. 450, (7168), 420-424 (2007).
  4. Naumann, E. A., Kampff, A. R., Prober, D. A., Schier, A. F., Engert, F. Monitoring neural activity with bioluminescence during natural behavior. Nat. Neurosci. 13, (4), 513-520 (2010).
  5. Leifer, A. M., Fang-Yen, C., Gershow, M., Alkema, M. J., Samuel, A. D. Optogenetic manipulation of neural activity in freely moving Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 8, (2), 147-152 (2011).
  6. Mavoori, J., Millard, B., Longnion, J., Daniel, T., Diorio, C. A miniature implantable computer for functional electrical stimulation and recording of neuromuscular activity. In IEEE international workshop on biomedical circuits and systems (BioCAS) 2004; Session: Functional Electrical Stimulators and Related Sensing Techniques. (2004).
  7. Harrison, R. R., Fotowat, H., Chan, R., Kier, R. J., Olberg, R., Leonardo, A., Gabbiani, F. Wireless neural/EMG telemetry systems for small freely moving animals. IEEE TBioCAS. 5, (2), 103-111 (2011).
  8. Jun, J. J., Longtin, A., Maler, L. Precision measurement of electric organ discharge timing from freely moving weakly electric fish. J. Neurophys. 107, (7), 1996-2007 (2012).
  9. Forlim, C. G., Pinto, R. D. Noninvasive Realistic Stimulation/Recording of Freely Swimming Weakly Electric Fish: Movement Detection and Discharge Entropy to Infer Fish Behavior. (2012).
  10. Caputi, A. A., Aguilera, P. A., Castelló, M. E. Probability and amplitude of novelty responses as a function of the change in contrast of the reafferent image in G. carapo. J. Exp. Biol. 206, (6), 999-1010 (2003).
  11. Pluta, S. R., Kawasaki, M. Multisensory enhancement of electromotor responses to a single moving object. J. Exp. Biol. 211, (18), 2919-2930 (2008).
  12. Heiligenberg, W. Electrolocation and jamming avoidance in a Hypopygus (Rhamphichthyidae, Gymnotoidei), an electric fish with pulse-type discharges. J. Comp. Phys. A. 91, (3), 223-240 (1974).
  13. Capurro, A., Malta, C. P. Noise autocorrelation and jamming avoidance performance in pulse type electric fish. Bull. Math. Biol. 66, (4), 885-905 (2004).
  14. Post, N., von der Emde, G. The "novelty response" in an electric fish: response properties and habituation. Phys. Behav. 68, (1), 115-128 (1999).
  15. Toerring, M. J., Serrier, J. Influence of water temperature on the electric organ discharge (EOD) of the weakly electric fish Marcusenius cyprinoides (Mormyridae). J. Exp. Biol. 74, (1), 133-150 (1978).
  16. Ardanaz, J. L., Silva, A., Macadar, O. Temperature sensitivity of the electric organ discharge waveform in Gymnotus carapo. J. Comp. Phys. A. 187, (11), 853-864 (2001).
  17. Rodríguez-Cattaneo, A., Pereira, A. C., Aguilera, P. A., Crampton, W. G., Caputi, A. A. Species-specific diversity of a fixed motor pattern: the electric organ discharge of Gymnotus. PLoS One. 3, (5), (2008).
  18. Bennett, M. V. L. Fish physiology. Hoar, W. S., Randall, D. J. Academic Press. NY. 493-574 (1971).
  19. Wong, C. J. Afferent and efferent connections of the diencephalic prepacemaker nucleus in the weakly electric fish, Eigenmannia virescens: interactions between the electromotor system and the neuroendocrine axis. J. Comp. Neurol. 383, (1), 18-41 (1997).
  20. Jun, J. J., Longtin, A., Maler, L. Real-time localization of moving dipole sources for tracking multiple free-swimming weakly electric fish. PLoS One. 8, (6), (2013).
  21. Rasnow, B., Assad, C., Hartmann, M. J., Bower, J. M. Applications of multimedia computers and video mixing to neuroethology. J. Neuro. Methods. 76, (1), 83-91 (1997).
  22. MacIver, M. A., Nelson, M. E. Body modeling and model-based tracking for neuroethology. J. Neuro. Methods. 95, (2), 133-143 (2000).
  23. Douglas, R. H., Hawryshyn, C. W. Behavioral studies of fish vision: an analysis of visual capabilities. In The Visual System of Fish. Douglas, R., Djamgoz, M. Chapman & Hall. London. 373-418 (1990).
  24. Ciali, S., Gordon, J., Moller, P. Spectral sensitivity of the weakly discharging electric fish Gnathonemus petersi using its electric organ discharges as the response measure. J. Fish Biol. 50, (5), 1074-1087 (1997).
  25. Ratledge, D. An Introduction to Webcam Imaging. Digital Astrophotography: The State of the Art. 31-44 (2005).
  26. Hofmann, V., Sanguinetti-Scheck, J. I., Gómez-Sena, L., Engelmann, J. From static electric images to electric flow: Towards dynamic perceptual cues in active electroreception. J. Phys. Paris. 107, 95-106 (2013).
  27. Castelló, M. E., Aguilera, P. A., Trujillo-Cenóz, O., Caputi, A. A. Electroreception in Gymnotus carapo: pre-receptor processing and the distribution of electroreceptor types. J. Exp. Biol. 203, (21), 3279-3287 (2000).
  28. Caputi, A. A., Castelló, M. E., Aguilera, P., Trujillo-Cenóz, O. Electrolocation and electrocommunication in pulse gymnotids: signal carriers, pre-receptor mechanisms and the electrosensory mosaic. J. Phys. 96, (5), 493-505 (2002).
  29. Pusch, R., et al. Active sensing in a mormyrid fish: electric images and peripheral modifications of the signal carrier. J. Exp. Biol. 211, (6), 921-934 (2008).
  30. Harder, W. Die beziehungen zwischen elektrorezeptoren, elektrischem organ, seitenlinienorganen und nervensystem bei den Mormyridae (Teleostei, Pisces). Z. Vgl. Physiol. 59, (3), 272-318 (1968).
  31. Bacelo, J., Engelmann, J., Hollmann, M., Gvonder Emde,, Grant, K. Functional foveae in an electrosensory system. J. Comp. Neurol. 511, (3), 342-359 (2008).
  32. Hollmann, M., Engelmann, J., Von Der Emde, G. Distribution, density and morphology of electroreceptor organs in mormyrid weakly electric fish: anatomical investigations of a receptor mosaic. J. Zool. 276, (2), 1469-7998 (2008).
  33. Knudsen, E. I. Spatial aspects of electric fields generated by weakly electric fish. J. Comp. Phys. 99, (2), 103-118 (1975).
  34. Kramer, B. Spontaneous discharge rhythms and social signalling in the weakly electric fish Pollimyrus isidori (Cuvier et Valenciennes) (Mormyridae, Teleostei). Behav. Ecol. Sociobiol. 4, (1), 66-74 (1978).
  35. Stoddard, P. K., Markham, M. R., Salazar, V. L., Allee, S. Circadian rhythms in electric waveform structure and rate in the electric fish Brachyhypopomus pinnicaudatus. Physiol. Behav. 90, (1), 11-20 (2007).
  36. Canfield, J. G. Methods for chronic neural recording in the telencephalon of freely behaving fish. J. Neurosci. Methods. 133, (1-2), 127-134 (2004).
  37. Chen, L., House, J. L., Krahe, R., Nelson, M. E. Modeling signal and background components of electrosensory scenes. J. Comp. Physiol. A. 191, (4), 331-345 (2005).
  38. Emran, F., Rihel, J., Dowling, J. E. A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities. J. Vis. Exp. (20), (2008).
  39. Windsor, S. P., Tan, D., Montgomery, J. C. Swimming kinematics and hydrodynamic imaging in the blind Mexican cave fish (Astyanax fasciatus). J. Exp. Biol. 211, (18), 2950-2959 (2008).
  40. Shapiro, L. G., Stockman, G. C. Computer vision. Prentice Hall. Upper Saddle River, NJ. 367-368 (2001).
  41. Hedrick, T. L. Software techniques for two- and three-dimensional kinematic measurements of biological and biomimetic systems. Bioinsp. Biomim. 3, (3), 034001 (2001).
  42. Babineau, D., Lewis, J. E., Longtin, A. Spatial acuity and prey detection in weakly electric fish. PLoS Comp. Biol. 3, (3), (2007).
  43. Sanguinetti-Scheck, J. I., Pedraja, E. F., Cilleruelo, E., Migliaro, A., Aguilera, P., Caputi, A. A., Budelli, R. Fish geometry and electric organ discharge determine functional organization of the electrosensory epithelium. PLoS One. 6, (11), (2011).
  44. Castello, M. E., Caputi, A., Trujillo‐Cenóz, O. Structural and functional aspects of the fast electrosensory pathway in the electrosensory lateral line lobe of the pulse fish Gymnotus carapo. J. Comp. Neurol. 401, (4), 549-563 (1998).
  45. Canfield, J. G., Mizumori, S. J. Y. Methods for chronic neural recording in the telencephalon of freely behaving fish. J. Neurosci. Methods. 133, (1), 127-134 (2004).
  46. Pereira, A. C., Centurión, V., Caputi, A. A. Contextual effects of small environments on the electric images of objects and their brain evoked responses in weakly electric fish. J. Exp. Biol. 208, (5), 961-972 (2005).
Langsiktig Behavioral Sporing av frittsvømmende Weakly Electric Fish
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jun, J. J., Longtin, A., Maler, L. Long-term Behavioral Tracking of Freely Swimming Weakly Electric Fish. J. Vis. Exp. (85), e50962, doi:10.3791/50962 (2014).More

Jun, J. J., Longtin, A., Maler, L. Long-term Behavioral Tracking of Freely Swimming Weakly Electric Fish. J. Vis. Exp. (85), e50962, doi:10.3791/50962 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter