Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Longo prazo Behavioral Rastreamento de Livremente Natação fracamente elétrico dos peixes

doi: 10.3791/50962 Published: March 6, 2014

Summary

Descreve-se um conjunto de técnicas para estudar o comportamento espontâneo de nadar livremente peixe fracamente elétrico durante um período prolongado de tempo, de forma síncrona medição de tempo de descarga do órgão elétrico do animal, a posição do corpo e postura tanto precisa e confiável em um tanque do aquário especialmente concebido dentro de um sensorial câmara de isolamento.

Abstract

Rastreamento comportamental a longo prazo pode capturar e quantificar os comportamentos animais naturais, incluindo aquelas que ocorrem com pouca freqüência. Comportamentos como a exploração e as interações sociais podem ser melhor estudados, observando desenfreadas, animais se comportando livremente. Peixe elétrico Fracamente (WEF) de exibição exploratória facilmente observáveis ​​e comportamentos sociais através da emissão de descarga do órgão elétrico (EOD). Aqui, descrevemos três técnicas eficazes para medir de forma síncrona a EOD, a posição do corpo e postura de um WEF livre de natação por um período prolongado de tempo. Em primeiro lugar, descreve-se a construção de um tanque experimental dentro de uma câmara de isolamento concebido para bloquear as fontes externas de estímulos sensoriais, tais como a luz, som e vibrações. O aquário foi dividido para acomodar quatro corpos de prova, e portas automatizadas controlar remotamente o acesso dos animais para a arena central. Em segundo lugar, nós descrevemos um método de medição em tempo real tempo EOD precisa e confiável de nadar livremente WEF. Distorções de sinal causadas por movimentos do corpo do animal são corrigidos pela média espacial e estágios de processamento temporal. Em terceiro lugar, nós descrevemos uma configuração de imagens de infravermelho próximo submarina para observar comportamentos animais noturnos não perturbados. Pulsos de luz de infravermelhos foram usadas para sincronizar o tempo entre o vídeo e o sinal fisiológico sobre uma longa duração de gravação. Nosso software de monitoramento automatizado mede a posição do corpo do animal e postura de forma confiável em uma cena aquática. Em conjunto, estas técnicas permitem a observação a longo prazo do comportamento espontâneo de nadar livremente peixe fracamente elétrico de uma maneira confiável e precisa. Acreditamos que o nosso método pode ser aplicado de forma semelhante ao estudo de outros animais aquáticos, relacionando os sinais fisiológicos com comportamentos exploratório ou sociais.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Fundo. Experimentos quantitativos sobre o comportamento animal (por exemplo, escolha forçada, evitar o choque, T-labirinto, etc.) São normalmente utilizados para investigar hipóteses específicas sobre as habilidades sensório-motoras, aprendizagem e formação da memória. No entanto, estas experiências restritivas perder muito da riqueza do comportamento natural dos animais e são susceptíveis de resultar em modelos simplistas da base neural subjacente de comportamento. Experimentos em condições mais naturalistas são, portanto, um complemento importante pelo qual podemos explorar mais plenamente um repertório comportamental das espécies. Experiments envolvendo animais circulando livremente deve, porém, enfrentar os desafios técnicos exclusivos, como artefatos de gravação induzida pelo movimento. Ao contrário de respostas evocadas por estímulo, o comportamento exploratório de ocorrência espontânea não pode ser previsto, portanto, sujeitos experimentais têm de ser constantemente monitorados e acompanhados durante um período prolongado de tempo. Questões específicas de investigação can ser melhor abordados por organismos cuidadosamente selecionados e instrumentos técnicos disponíveis. Exemplo, gravação e estimulação técnicas ópticas como sensores cálcio geneticamente codificados 1.oe optogenética 2 foram aplicado com sucesso movendo livremente organismos modelo genéticos 3-5. Alternativamente, sistemas de telemetria neural miniaturizados pode gravar e estimular livremente mover pequenos animais 6,7.

Peixe elétrico. Espécies WEF gerar descargas elétricas de órgãos (EODs), que lhes permitem perceber seu entorno imediato ou se comunicar através de distâncias maiores. Padrões temporais de EODS variar em diferentes condições, tais como auto-movimentos, 8,9 estímulos sensoriais 10,11 e interações sociais 12,13. Espécies WEF tipo pulso produzir um trem de pulsos discretos, ao contrário de espécies do tipo de onda para que geram formas de onda quase-senoidal contínua. Em geral, do tipo pulso exposição espécie more taxa de EOD variável em comparação com as espécies do tipo de onda, e as taxas de EOD dos animais refletem intimamente conteúdo da novidade de seu entorno sensoriais 10,14. Espécies do tipo de pulso pode reduzir imediatamente o intervalo inter-pulso (IPI) dentro de um único ciclo de pulso em resposta a uma perturbação sensorial novel (resposta novidade 10,11,14). O comportamento elétrico contínuo desses peixes pode ser perturbado por estímulos sensoriais descontrolados de fontes externas, e diferentes tipos de estímulos, tais como vibração, som, eletricidade e luz são conhecidas respostas novidade gatilho. Portanto, devem ser tomadas precauções especiais para bloquear ou atenuar os estímulos sensoriais externos durante uma observação a longo prazo de livre-natação WEF. Deste modo, as alterações na taxa de EOD e trajectórias de movimento podem ser especificamente atribuído ao estímulo apresentado pelo experimentador.

Tanque do aquário e câmara de isolamento. Nós, portanto, colocado várias camadas de materiais absorventes de vibração under um grande tanque do aquário (2,1 mx 2,1 mx 0,3 m), e cercaram o tanque com um compartimento isolado para bloquear fontes externas de luz, ruídos elétricos, som e fluxo de calor. Taxa EOD depende da temperatura em torno 15,16, assim a temperatura da água foi estritamente regulada em uma faixa tropical (25 ± 1 º C) por espécies sul-americanas WEF. Construímos um tanque grande e raso (10 cm de profundidade de água) para observar comportamentos exploratórios espaciais da WEF principalmente restritas em duas dimensões (Figura 1A). O tanque foi dividido em uma área central para observar o comportamento espacial e quatro compartimentos de canto para alojar separadamente cada peixe (Figura 1B). Cada compartimento foi construído à prova d'água para impedir a comunicação elétrica entre os indivíduos. O acesso dos animais para a arena central foi controlado a partir do exterior por quatro portões motorizados. Os portões foram colocados entre os compartimentos, e tornaram-se estanque quando fechadaspor nylon asa-nozes. Sem partes metálicas foram usados ​​debaixo d'água desde WEF reagir com sensibilidade para os metais.

Gravação EOD. EODS são gerados de forma estereotipada pela ativação de um único (em Mormyrids) ou múltiplos órgãos elétricos espacialmente distribuídos (em gymnotiforms) 17,18. Modulações temporais na taxa EOD pode revelar atividades neurais de nível superior, uma vez que o marcapasso medular recebe entradas neurais diretos a partir de regiões mais elevadas do cérebro, como o núcleo prepacemaker diencefálica, que por sua vez recebe projeções axonais do cérebro anterior 19. No entanto, o momento EOD deve ser cuidadosamente extraído de uma gravação do sinal bruto e não influenciada por distorções induzidas pelo movimento do animal. O campo elétrico gerado por um WEF pode ser aproximado como um dipolo, assim EOD amplitudes de pulso de eletrodos de registro depende das distâncias relativas e orientações entre o animal e os eletrodos 8,20. Auto-movem de Animaisentos alterar a geometria relativa entre o animal e os eléctrodos, assim, fazer com que os movimentos das amplitudes EOD em diferentes eléctrodos para variar ao longo do tempo de uma forma volátil (ver Figura 2B em junho et al. 8). Além disso, a auto-movimentos também mudar a forma de ondas EOD gravadas, porque as contribuições relativas de jogo diferente dos órgãos elétricos dependem de suas posições ao longo do comprimento do corpo e suas curvaturas locais introduzida pela cauda flexão. As distorções induzidas pelo movimento nas amplitudes e formas EOD pode levar a medições imprecisas e não confiáveis ​​de tempo EOD. Nós superamos estes problemas espacialmente média de múltiplas formas de onda EOD gravados em diferentes locais, e pela adição de um filtro de extração de envelope para determinar com precisão o momento de uma EOD WEF livre de natação. Além disso, a técnica também mede as amplitudes EOD, que indicam se um animal está em repouso ou em movimento activa com base na mudança da EODamplitudes ao longo do tempo (ver Figuras 2E e 2F). Gravamos sinais diferencialmente amplificados dos pares de eletrodos de gravação para reduzir o ruído de modo comum. Uma vez que os impulsos são gerados EOD em intervalos de tempo irregulares, o evento de séries temporais EOD tem uma taxa de amostragem variável. As séries de tempo EOD pode ser convertido para uma taxa de amostragem constante, por interpolação, se necessário por uma ferramenta analítica de escolha.

A gravação de vídeo. Embora a gravação EOD pode monitorar uma atividade de movimento bruto de um animal, gravação de vídeo permite que medições diretas de posição do corpo de um animal e postura. Near-infrared (NIR) iluminação (λ = 800 ~ 900 nm) permite a observação visual imperturbável de nadar livremente peixe 21,22, uma vez que WEFs são mais ativos nas trevas e seus olhos não são sensíveis ao espectro NIR 23,24. A maioria dos sensores de imagem digital (por exemplo, CMOS ou CCD) pode capturar espectro NIR com o wavelength intervalo entre 800-900 nm, após a remoção de uma ligação por infravermelhos (IR), o bloqueio do filtro 25. Alguns high-end webcams consumidor da classe oferecem alta definição, amplo ângulo de visão e boa sensibilidade de pouca luz, o que pode produzir uma qualidade de imagem comparável ou superior ao nível profissional câmeras IR disponíveis em muito maiores custos. Além disso, algumas webcams consumidor da classe são empacotados com o software de gravação que permite uma duração de gravação estendida através da compressão de vídeo sem perda de qualidade. A maioria das câmeras de nível profissional oferecer sincronização saídas de pulso TTL de tempo ou entradas de pulso TTL gatilho 26 para alinhar o sincronismo entre o vídeo com os sinais digitalizados, mas esse recurso é geralmente ausente em webcams consumidor da classe. No entanto, o tempo entre a gravação de vídeo e um digitalizador de sinal pode ser combinado com precisão por simultaneamente capturando uma IR piscar periodicamente LED com a câmera eo digitador sinal. O tempo inicial e final de pulso de IR pode ser usado ums dois marcadores de calibração de tempo para converter os números de quadro de vídeo para a unidade de tempo digitalizador de sinal e vice-versa.

Iluminação e fundo. Captura de imagens através da água pode ser tecnicamente desafiadora devido aos reflexos de luz na superfície da água. A superfície da água pode atuar como um espelho para refletir uma cena visual acima da água, e as características visuais obscuros subaquático; assim, a cena acima da água deve ser processado inexpressivo para evitar a interferência visual. A fim de imagem de todo o aquário, uma câmera precisa ser colocado diretamente sobre a água, e ele deve ser escondido atrás do teto ao longo de um pequeno buraco de visão para evitar a sua reflexão sobre a superfície da água. Além disso, a superfície da água pode produzir brilhos e iluminação não uniforme, se as fontes de luz são incorretamente projetada. Iluminação indireta pode alcançar brilho uniforme ao longo de todo o aquário apontando as fontes de luz em direção ao teto, de modo que o teto eo wal circundantels pode refletir e difundir os raios de luz antes de atingir a superfície da água. Escolha um iluminador IR que corresponde a uma resposta espectral da câmera (por exemplo, 850 nm de comprimento de onda de pico). O ruído elétrico das fontes de luz podem ser minimizados usando luzes de LED e colocando suas fontes de alimentação de corrente contínua fora da gaiola de Faraday. Coloque um fundo branco por baixo do tanque, uma vez que os peixes contrasta bem em um fundo branco em comprimentos de onda NIR. Da mesma forma, a utilização de mate cor branca sobre as superfícies internas da câmara de isolamento proporciona uma iluminação de fundo uniforme e brilhante.

Monitoramento de vídeo. Depois de uma gravação de vídeo, um algoritmo automatizado de seguimento de imagem podem medir posições e posturas do corpo do animal ao longo do tempo. O rastreamento de vídeo pode ser realizado automaticamente por qualquer software pronto para uso (ou Ponto de Vista Ethovision), ou software programável pelo usuário (OpenCV ou MATLAB Imagem processamento caixa de ferramentas). Como primeiro passo de rastreamento de imagem,uma área de rastreamento válido precisa ser definido pelo desenho de uma forma geométrica para excluir a área externa (mascarando a operação). Em seguida, a imagem de um animal precisa de ser isolado a partir da base, subtraindo uma imagem de fundo a partir de uma imagem que contém o animal. A imagem subtraída é convertido para um formato binário pela aplicação de um limiar de intensidade, de modo a que o baricentro e o eixo de orientação pode ser calculado a partir de operações morfológicas binários. Em gymnotiforms 27-29 e 30-32 Mormyrids, a densidade electroreceptor é a mais alta perto da região de cabeça, assim, a posição da cabeça a qualquer momento indica uma localização da maior acuidade sensorial. Os locais da cabeça e da cauda pode ser determinado automaticamente pela aplicação das operações de rotação de imagem e da caixa envolvente. A cabeça ea cauda extremidades podem ser distinguidos um do outro, definindo-os manualmente no primeiro quadro, e por manter o controle de seus locais de comparar dois quadros sucessivos.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Este processo satisfaz os requisitos da Universidade de Ottawa Comité Animal Care. Não há conflito de interesse é declarada. Por favor, consulte a Tabela de Materiais e reagentes para as marcas e modelos de equipamentos e materiais listados abaixo. Matlab e Spike2 scripts personalizados escritos e dados de exemplo são fornecidos no arquivo Suplementar.

1. Tanque do aquário e Isolamento Câmara Setup

  1. Anti-v chão ibration. Construir uma superfície anti-vibração (2,1 mx 2,1 m) empilhando almofadas de borracha, isopor acústico, painel de contraplacado marítimo, e almofadas de espuma de poliuretano de baixo para cima (Figura 1A). Lay quatro vigas de madeira (5 cm x 10 cm) no painel de madeira para suportar as extremidades do tanque de aquário.
  2. Aquecedor Floor. Coloque um elemento de aquecimento elétrico blindado sobre enchimento de espuma classificados termicamente (ver figura inferior 1D). Cobrir o elemento de aquecimento com um metallic malha de blindagem elétrica.
  3. Tanque espacial. Construir um aquário largo e raso (1,8 mx 1,8 mx 30 cm) com 1,3 centímetros de espessura temperado painéis de vidro, estrutura de alumínio em forma de L e silicone aquário grau (ver Figura 1A). Cobrir a parte inferior do tanque com uma grande folha de fundo branco a fornecer alto contraste de imagem (ver Protocolo 3).
  4. Divida o tanque do aquário em uma arena central (1,5 m de diâmetro) e quatro compartimentos de canto (ver Figura 1B) através da instalação de paredes (22,5 cm de altura) feita de placas de acrílico (branco fosco, 0,64 cm de espessura).
    1. Dobre quatro placas de acrílico (22,5 cm x 102,7 centímetros) por aplicação de calor para criar quatro seções parede curva, e anexá-los para o fundo do tanque usando calafetar silicone para separar a área central, a partir dos quatro compartimentos de canto. Deixar 20 centímetros espaço entre as secções curvas para a instalação de portão.
    2. Separados compartimentos canto vizinho, instalando quatro paredes duplas wiª 15 centímetros lacunas, que proporcionam isolamento elétrico extra e locais para sensores submarinos, como um hidrofone.
  5. Montar quatro portões motorizados, e instalá-los entre os compartimentos de canto e na arena central.
    1. Montar quatro molduras de portas, como mostrado na Figura 1C. Criar seis poços (0,64 cm de profundidade) em cada moldura da porta, inserir as porcas de nylon bolota (rosca diâmetro 0,64 centímetros) e prenda-os com epóxi.
    2. Cortar quatro painéis de porta a partir de folhas de borracha e acrílico, e criar seis furos (0,64 cm de diâmetro) sobre o acrílico e painéis de borracha para o mecanismo de bloqueio. Junte-se ao acrílico e painéis de borracha usando calafetagem silicone.
    3. Instale acrílico dobradiças para juntar os painéis das portas com as molduras de portas.
    4. Monte balançando os braços em servomotores, e instalá-los no topo dos quadros de porta (ver Figura 1C). Faça laços com abraçadeiras para ligar os braços balançando para os painéis das portas.
    5. Posicione as assembléias portão do gaps criado entre as seções de parede curva, e fixá-los usando calafetar silicone.
    6. Conecte todos os servomotores para um controlador de servo, e conectá-lo a uma fonte de energia e um computador através de um cabo de extensão USB ativa. Teste as portas usando o software de controle fornecido com o controlador servo.
    7. Depois do silicone endurece, verifique se há estanqueidade, bloqueando todas as portas com parafusos de nylon e preenchendo um compartimento de cada vez.
  6. Câmara de isolamento. Construa uma câmara de isolamento ao redor do aquário e bloquear fontes externas de luz, som e ruído elétrico (ver Figura 1D).
    1. Faça três painéis de parede (2 mx 2 mx 5 cm) e quatro painéis de porta (1,9 mx 0,95 mx 5 cm). Para cada painel, molduras de alumínio juntar (5 cm x 2,5 cm) para criar uma moldura retangular e rebite um painel de plástico corrugado branco na armação de alumínio. Preencha chumaços de fibra de vidro acústico nos painéis, e fechar com um painel de plástico preto corrugado.
    2. Instale três painéis de parede no chão anti-vibração, e instalar dobradiças de piano para se juntar aos quatro painéis das portas em painéis de parede.
    3. Cerque a câmara de isolamento com malhas de alumínio e chão malhas de todos os lados para criar uma gaiola de Faraday.
  7. Controle de umidade. Instale um exaustor de baixo ruído (Figura topo 1F) para remover o excesso de umidade build-up de aquecimento. Coloque o exaustor pelo menos 2 m de distância do local de gravação, e instalar um duto de ar entre a câmara de isolamento e do exaustor.
  8. Rotineiramente monitorar e manter as condições da água do tanque e os animais.
    1. Manter as condições da água constante a 10 cm de profundidade, a 100 mS / cm de condutividade e pH 7,0 por adição de água ou uma solução estoque de sal (ver Knudsen 33 para a receita). Adicione um saco de coral esmagado se o pH cai abaixo de 6,5.
    2. Instalar filtros de aquário verticais, que podem operar a partir de águas rasas para a limpeza efins gaseificar (Figura fundo 1F). Desligue os filtros e levá-los para fora da arena central durante as sessões de gravação.
    3. Entregar larvas de farinha ao vivo na parte inferior do tanque, anexando-os em ventosas com elásticos. Evite presas livre flutuação, como blackworms para evitar alimentação descontrolada de presas perdidas durante a gravação.

2. EOD Rastreamento

  1. Instalação eletrodos. Montar oito eletrodos de grafite e espaço-los igualmente na parede curvada da arena central.
    1. Obter desenho leads (15 cm de comprimento; Mars tipo carbono 2 milímetros HB) e raspar o revestimento exterior dos leads.
    2. Corte 10 centímetros oito segmentos de cabo coaxial (RG-174), enrole o núcleo do cabo em torno de uma das extremidades das hastes de grafite, e aplicar a tubulação sobre eles para conexão elétrica forte e estável encolher ao calor. Anexar conectores BNC nas extremidades opostas (Figura 2A esquerda). </ Li>
    3. Posicione os eletrodos na parede gravando, e aplicar finas tiras de fita adesiva sobre a superfície do eletrodo para proteger de silicone. Aplicar calafetar silicone para manter permanentemente os eletrodos, e remover toda a fita antes que os endurece silicone (Figura 2A direita).
  2. Construir oito conjuntos de cabos medindo a distância de cada eletrodo para a unidade de amplificador, e corte de cabos coaxiais (RG-54) em comprimentos. Anexar conectores BNC em ambas as extremidades dos cabos.
  3. Use os conjuntos de cabos para conectar todos os eletrodos para a unidade de amplificador. Diferencialmente amplificar emparelhando dois 90 º eletrodos orientados (ver Figura 2B), e terra todos os fios de blindagem coaxial, ligando-os para a gaiola de Faraday.
  4. Ajustar o ganho do amplificador abaixo do limite de saturação do sinal, e aplica um filtro passa-banda (200 Hz a 5 kHz) para eliminar o ruído. Digitalize os quatro pares de eletrodos de gravação em 40 kS / s.
  5. On-lineprocessamento de sinais. As instruções são escritas para o software Spike2, e os ajustes de parâmetros são otimizados para Gymnotus sp. (Veja a Figura 2C para resumo).
    1. Adicionar um DC remover processo (τ = 0,1 seg) a todos os canais de gravação.
    2. Adicionar um processo de retificar a todos os canais de gravações.
    3. Criar um canal virtual, somando todos os quatro canais de gravação.
    4. Extrair um envelope unimodal por pulso EOD adicionando RMS (root-mean squared, ) Processo (τ = 0,25 ms) para o canal virtual, para gerar um único pico por ciclo EOD para determinar inequivocamente o tempo de pulso.
    5. Criar um canal realmark do canal virtual e registrar o tempo e os valores das amplitudes de pico, depois de definir um limite apropriado para capturar todas EOD pulsos without faltando um pulso, evitando falsos positivos.
    6. Monitorar a taxa de EOD instantânea, em tempo real, configurando a opção do canal realmark exibição do canal para um modo de frequência instantânea.
    7. Monitorar o movimento dos peixes em tempo real através da duplicação do canal realmark e definir a opção de exibição para um modo de forma de onda.
    8. Quantificar um nível de atividade dos RMS da amplitude inclinação EOD, criando um canal virtual do canal realmark (período de amostragem de 0,01 seg), e adicionar inclinação (τ = 0,25 ms) e RMS (τ = 0,5 ms) processos.
    9. Exportar o canal realmark no software Spike2 para o formato MATLAB.

3. Rastreamento de Vídeo Sincronizado

  1. Criar uma cena de fundo.
    1. Esconder qualquer objeto que lança uma reflexão sobre a superfície da água, cobrindo com filme bancada branco fosco.
    2. Instale um branco foscopainel de plástico corrugado 15 centímetros abaixo do teto para esconder a câmera ea entrada de ar.
    3. Imprimir padrões de grade em uma grande folha de papel em branco para calibrar uma câmera, e colocá-lo debaixo do tanque para fornecer um fundo de alto contraste.
  2. Instalar fontes de luz.
    1. Obter IR luzes de LED e, remova fãs internas para reduzir o ruído. Dirija o LED com uma fonte de alimentação DC atual regulada colocado fora da gaiola de Faraday.
    2. Instalar luzes IR para imagens em escuridão, e as luzes LED branco para a condução de um ciclo de luz diurna no peixe teste de LED. Diretos todas as fontes luminosas para o teto para alcançar a iluminação indireta e uniforme (Figura 3A).
    3. Regular o ciclo de luz diurna, conduzindo o branco luzes LED com um interruptor controlado por temporizador (por exemplo, 12 horas on/12 hr off).
  3. Instalar uma câmera diretamente acima do aquário.
    1. Obter uma câmera NIR-sensível, ou remover um bloqueio filte IRr por quebra de uma folha fina de vidro colorido na parte de trás do conjunto de lentes. Certifique-se que o ângulo de visão é grande o suficiente para a imagem toda a arena central.
    2. Faça um pequeno furo no meio de visualização do painel de teto, e coloque a câmera diretamente acima do buraco.
    3. Instale um guarda anel branco ao redor da lente se as fontes de luz geram brilhos.
  4. Faça uma gravação de vídeo sincronizadas em tempo.
    1. Coloque um IR LED em um dos quatro cantos do tanque para gerar pulsos de sincronização de tempo (1 ms de duração de 10 períodos seg). Adicionar um resistor limitador de carga (1 kW) em série, e dirigir o LED de IR a partir de uma porta de saída digital do hardware digitalizador.
    2. Use um software de gravação de vídeo junto com a câmera, se disponível. Escolha a melhor qualidade de gravação (por exemplo, compressão sem perdas) e as resoluções mais altas suportados.
    3. Inicie a gravação de vídeo imediatamente antes de iniciar a gravação do EOD, e parar a gravação de vídeo imediatamente após a gravação EOD.
    4. Depois da gravação, converter os números de quadro de imagem para a unidade de tempo do digitalizador através da interpolação linear entre o primeiro e os últimos pulsos de luz captados pelo digitalizador de sinal e a gravação vídeo.
  5. Rastreamento de imagem automatizado
    As instruções são escritas para a caixa de ferramentas de processamento de imagem MATLAB, e fazer uso de suas funções. Um script MATLAB personalizado é fornecido com este envio para o rastreamento automático de imagem.
    1. Importar vídeo. Importar um arquivo de gravação de vídeo diretamente para o espaço de trabalho MATLAB usando "Videoreader. Ler" função.
    2. Criar uma imagem de fundo composto pela combinação de dois quadros de imagem. Substituir a região de imagem ocupada por um animal com uma imagem desocupado da mesma região da outra moldura (ver Figura 3B).
    3. Especifique uma região de imagem para acompanhar desenhando uma máscara circular ao redor da arena central para excluir a umrea externa (Figura 3B inferior), e multiplicar por uma constante (r int) para definir um limite mínimo para a diferença de intensidade. Por exemplo, a configuração Rint = 0,85 irá suprimir as flutuações de intensidade de 15% = (1 - r int) abaixo do fundo.
    4. Subtração de imagem. Subtraia um quadro de imagem (= k IM) a partir da imagem de fundo (IM = 0) para obter a imagem diferença (= ΔIM k). Use inteiro sem sinal de precisão numérica para armazenar os valores de intensidade de imagem como inteiros não negativos.
    5. Segmento a imagem através da aplicação de uma diferença de limiar de intensidade determinada a partir da função graythresh. Limpe a imagem binária utilizando a função bwmorph e selecione a maior mancha correspondente a um animal depois de calcular todas as áreas blob utilizando a função regionprops.
    6. Determinar o baricentro e principal orientação axis da maior bolha por aplicação da função regionprops, e rodar a imagem para alinhar o eixo maior com o eixo x. Divida a imagem para a cabeça ea cauda partes no baricentro (top Figura 3D).
    7. Determinar o eixo principal da parte de cabeça, e rodar a imagem inteira para se alinhar com o eixo x (Figura 3D inferior esquerdo). Coloque delimitadoras caixas ao redor da cabeça e partes da cauda paralelo aos seus principais eixos utilizando a função regionprops.
    8. Determine as coordenadas y medianos do blob na esquerda, centro e direita bordas verticais das caixas delimitadoras (pontos verdes na parte inferior Figura 3D), e atribuí-los a cinco pontos característicos (cabeça-ponta, no meio da cabeça, meio-corpo , no meio da cauda, ​​ponta da cauda).
    9. Processe quadros sucessivos após a colheita um quadro de imagem centrada no baricentro do animal determinado a partir de sua estrutura anterior.
    10. Atribuir manualmente a orientação de cabeça para o primeiro quadro, e usar um betwe dot-produtoen os vetores de orientação de dois quadros sucessivos para determinar automaticamente a orientação da cabeça. Inspecione o resultado, e virar manualmente a orientação da cabeça se atribuído incorretamente.
  6. Trace uma trajetória animais juntando os cabeça-dicas, e alise usando mediana e filtros médios (n = 3) se ele tem uma aparência nervosa. Sobreponha a trajetória uma imagem de fundo, e interpolar midlines peixes usando os cinco pontos característicos (ver Figura 2E).
  7. Calcule a taxa de EOD média em cada momento de captura de imagem por reamostragem a taxa EOD instantânea (100 taxa de amostragem Hz) e média (janela de tempo 0,0625 seg.) Traçar a trajetória em pseudo-cores determinadas a partir da taxa de EOD pareados por vez, e sobrepor uma imagem de fundo (ver Figura 2F) com.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Resultados de rastreamento EOD

As formas de onda EOD gravadas em diferentes pares de eletrodos variou em amplitudes e formas como se espera de suas posições originais e orientações (figura superior 2C). A utilização de vários pares de eléctrodos assegurada forte recepção de sinal em todas as posições possíveis e as orientações da FEM no interior do tanque. A forma de onda envelope (Figura inferior 2C, traço verde) sempre continha um único pico por ciclo EOD, que serviu como um marcador de tempo confiável para determinar precisamente os intervalos inter-pulso ea taxa EOD instantânea (IPI = -1). Os sucessivos picos EOD se juntaram e interpolados linearmente, em intervalos de tempo constantes (top Figura 2D, traço preto), ea taxa de EOD instantânea foi igualmente interpoladas em intervalos de tempo constantes (de fundo Figura 2D, traço-de-rosa). O procedimento de reamostragem em tempo constante facilita a sincronização de tempo sertre a trajetória de movimento eo sinal EOD, e permite aproveitar de um maior número de ferramentas de análise para dados de séries temporais constantemente amostrados. As amplitudes EOD registrados pelo eletrodos externos manteve-se constante, enquanto um animal estava em repouso (Figura topo 2E), mas variou ao longo do tempo, enquanto o animal se movia devido à mudança de localização e orientação de dipolo (Figura topo 2F). Assim, o movimento de peixes poderia ser inferida a partir da observação da mudança de amplitudes EOD ao longo do tempo. A taxa de EOD base manteve-se baixa, enquanto peixe estava em repouso (Figura 2E inferior), mas a taxa EOD se tornou significativamente mais elevado, enquanto o peixe nadava ativamente (top Figura 2F). A nossa observação é consistente com a correlação positiva entre a taxa de EOD e o movimento dos peixes, como previamente relatado 8,9,34,35.

Resultados de monitoramento de vídeo

Trajectória e linhas medianas do animal são apresentados na Fig. 3E ure com os primeiros e os últimos fotogramas da imagem sobreposta. O curso em tempo de mudança de postura foi capturado enquanto o peixe foi abruptamente transformando por dois segundos, e as linhas médias de peixe são plotados a cada 200 ms. A linha média peixe corretamente começou no cabeça-ponta e termina na ponta da cauda de peixe. As imagens de peixes de perto acordados com os midlines rastreados automaticamente, apesar das sombras fundidas pelo animal. Figura 3F ilustra a taxa variável no tempo médio de EOD (τ = 0,0625 seg) na cor, que é sobreposta com a trajetória acompanhado em tempo de cabeça de peixe -Tip. Durante a duração de 2 segundos de viragem, a taxa média de EOD atingiu o seu pico quando o animal estava no meio da fase de viragem, e a taxa de diminuição para o fim da viragem. Este resultado mostra que o nosso representante método pode ser aplicado com sucesso para estudar a relação entre os movimentos auto-guiadas e modulação taxa EOD durante livre de natação.

t "fo: manter-together.within-page =" always "> Figura 1
Figura 1. Instalação do tanque e câmara de isolamento Aquarium. A) A câmara experimental é composto por um piso anti-vibração, tanque do aquário, e uma câmara de isolamento. B) O aquário foi dividido em arena central para conduzir experimentos e quatro compartimentos de canto para a habitação individual peixes. Cada compartimento foi construído à prova d'água para impedir a comunicação elétrica entre os animais. C) O portão motorizado é ilustrado em vários ângulos de perspectiva. O portão fica estanque quando bloqueado por seis porcas que comprimem o anel de borracha (a folha marrom claro). Uma vez destrancado, o portão pode ser operado remotamente pelo servo-motor no topo. D) A câmara de isolamento foi montado juntando três wtodos os painéis e quatro painéis das portas, que dão acesso ao tanque do aquário de dois lados. O painel inferior mostra os trilhos de madeira para apoiar as bordas do tanque, ea colocação do aquecedor chão. Uma camada de malha de alumínio cobre o aquecedor para proteger seu ruído elétrico. E) As paredes e painéis das portas da câmara de isolamento foram construídos a partir de esquadrias de alumínio para suporte estrutural (3). As superfícies interiores da câmara são cobertos por painéis de plástico de cor branca (5) de modo a reflectir as fontes de luz internos, e os exteriores são cobertos por painéis de plástico preto (2) para bloquear as fontes de luz externas. Uma malha de alumínio (1) cobre as paredes exteriores para bloquear o ruído elétrico externo. A parede é preenchido com chumaços de fibra de vidro acústico (4) F) A foto acima mostra a configuração de ventilação de ar para remover o excesso de umidade gerado a partir de aquecimento;. Ea foto de baixo mostra a configuração de filtragem de água para a limpeza, difundindo e gaseificar a água do tanque entre experimentalsessões. Clique aqui para ver a imagem ampliada .

Figura 2
Figura 2. EOD configuração de gravação e resultados representativos. A) O painel da esquerda ilustra o conjunto de eletrodos que consiste de um eletrodo de grafite fino, um pequeno segmento de cabo coaxial e um Jack BNC. O painel da direita mostra as instruções de fixação de eletrodos. Fita adesiva é usada para posicionar temporariamente o conjunto de eletrodos, e calafetagem de silicone foi aplicado para manter permanentemente o eletrodo. B) O esquema de ligação. Dois eletrodos orientados 90 ° estão emparelhados, diferencialmente amplificado e filtrado. Quatro canais de gravação foram digitalizados fora do Faraday cidade. C) Ilustração das etapas de processamento de sinal do EOD. Os principais traços mostram as formas de onda matérias de quatro pares de eletrodos, que são retificados e somados para produzir o traço cinza abaixo. Envelopes unimodais são extraídos de forma de onda cinza usando o "Root-Mean-Square" (RMS) filtro (traço verde). As amplitudes EOD e IPIs são determinados a partir dos picos do envelope. D) As variáveis ​​no tempo EOD amplitudes (em cima) e da taxa de EOD instantânea (em baixo) são apresentados em uma escala de tempo mais longo do que o C). As amplitudes EOD ea taxa instantânea (IPI = -1) são interpoladas em intervalos regulares de tempo, unindo os picos envelope (traços pretos). E) O mesmo que D) mas plotados em uma escala de tempo mais longo, enquanto peixe estava em repouso. F) Igual ao E) enquanto os peixes estava ativamente nadando. Clique aqui para ver a imagem ampliada .

Figura 3
Figura 3. Configuração do controlo de Vídeo e resultados representativos. A) A instalação de iluminação e câmera é ilustrado. O infravermelho (IR) e fontes de luz visíveis estão ligados nas paredes e apontou em direção ao teto, de modo que a superfície do teto reflete e difunde a luz para projetar uma iluminação uniforme ao longo de todo o tanque. A câmara está escondido cima do painel de tecto para evitar a reflexão sobre a superfície da água. Um diodo emissor de IR é posicionado em um dos quatro cantos do tanque para gerar impulsos de sincronização de tempo. B) Gerar uma imagem de fundo é composta ilustrado. Dois quadros de imagens (imagens no topo) são combinados para formar a imagem de fundo compósita (inferior esquerdo), substituindo a região contendo o animal (de modotampa quadrado vermelho) com a região sem o animal (tracejada quadrado vermelho). Área fora da arena central é mascarado em preto (parte inferior direita). C) Isolar o contorno de peixe. Um quadro de imagem (em cima à esquerda) é subtraída da imagem de fundo (canto superior direito) para produzir a imagem diferença (inferior esquerdo), e convertidos para a imagem binária (em baixo à direita) através da aplicação de um limiar de intensidade. D) As medições da posição do corpo e postura são ilustrados. A imagem binária do animal (blob) foi girada para alinhar o seu eixo principal com o eixo-x (canto superior direito), e centrado no seu centróide. A gota foi separado para a cabeça peças (vermelho) e cauda (azul), e cada parte foi rodado separadamente para determinar a sua caixa delimitadora. A gota foi orientada a estrutura do animal de referência (canto inferior esquerdo) e cinco pontos característicos (head-end, mid-cabeça, meio-corpo, mid-cauda, ​​cauda-end) foram determinados a partir dos pontos médios de delimitadora-box bordas. E) Time-lapse imidade das linhas médias de peixe plotada a cada 200 ms. O primeiro eo último quadros de imagem são sobrepostos durante o período de viragem 2 seg. F) A taxa média EOD é representado em pseudo-cor e sobreposta com a trajetória da cabeça de peixe. As mesmas imagens são utilizadas como em E). Clique aqui para ver a imagem ampliada .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Significado das nossas técnicas. Em resumo, o primeiro a descrever a construção de um grande aquário e uma câmara de isolamento para observar comportamentos exploratórios espontâneas produzidas pelo WEF. Em seguida, demonstrou a técnica de gravação e monitoramento da taxa de EOD e os estados de movimento de peixes desenfreada em tempo real usando vários pares de eletrodos. Finalmente, descreveu a técnica de infravermelho gravação de vídeo através da água de forma sincronizada em tempo, eo algoritmo de rastreamento de imagem para medir a posição do corpo e postura. Como uma preparação experimental, WEF oferece uma importante vantagem para investigar comportamentos sensoriais guiada ativos, demonstrando taxa EOD facilmente quantificáveis, o que equivale à taxa de amostragem electrosensory ativa. A combinação destas técnicas podem permitir a observação precisa e confiável a longo prazo 8 de comportamentos espontâneos de desenfreada WEF. Além disso, a maioria da nossa configuração pode ser construído from amplamente disponíveis materiais de construção e de fácil obtenção componentes eletrônicos. As técnicas descritas aqui foram desenvolvidos e testados para atender às nossas necessidades experimentais nos últimos anos. Portanto, recomendamos estas técnicas para futuros estudos de comportamentos exploratórios espontâneas de livre-natação WEF.

Câmara de isolamento. A câmara de isolamento proporciona condições experimentais bem controlados através do bloqueio de fontes externas de luz, vibração, som e ruído elétrico com diferentes graus de eficácia. O desempenho de bloqueio de luz foi testado, colocando uma câmera motorizada interior da câmara de isolamento escuro, e sem vazamento de luz externo foi observada a partir da câmara depois de digitalizar todos os locais usando o controle remoto pan. O amortecimento de vibrações superfície instalada sob o tanque fornecido atenuação contra vibrações externas canalizadas a partir do chão, e empilhamento de múltiplas camadas de borracha e espuma foi eficaz para o bloqueio maiseventos de vibrações externas. No entanto, os eventos de vibrações intermitentes, tais como fechamento de porta voz alta em locais próximos fez desencadear respostas novidade em raras ocasiões. Apesar de uma mesa de ar anti-vibração pode oferecer um desempenho superior de isolamento das vibrações fundo, seria proibitivamente caro para comprar uma mesa de ar grande o suficiente para o nosso tanque do aquário. Por isso, colocou um hidrofone subaquático para detectar e excluir eventos quando grandes vibrações externas desencadeadas respostas novidade. Para minimizar ainda mais a influência do ruído do lado de fora do laboratório, nossos experimentos foram realizados durante o horário de pico (após 18:00). Da mesma forma, o ruído acústico no ar externo foi atenuada através das paredes da câmara de isolamento de fibra de vidro cheias de mantas de isolamento. Apesar de não quantificar objetivamente o desempenho atenuação do som, a maior parte do som de fundo em um ambiente de laboratório não desencadear as respostas novidade. Em raras ocasiões, um som alto repentino do gatilho foraed uma resposta novidade, mas um evento como esse foi detectada pela gravação hidrofone, e raramente ocorreu durante o horário de pico. O tanque do aquário, desde área suficientemente grande para os nossos animais para nadar livremente e explorar. O tamanho do tanque foi escolhido em proporção com o comprimento das espécies que utilizado (até 30 cm), mas o tamanho do tanque pode ser reduzida, se foram utilizados animais pequenos. Escolhemos Gymnotus sp. entre diferentes espécies do tipo de pulso para o seu tamanho crânio grande para facilitar registros eletrofisiológicos durante livre de natação 36. A qualidade da gravação elétrica pode melhorar de usar malhas de cobre mais caros, e protegendo o exaustor usado para o controle de umidade.

Técnica de medição EOD. Nosso multi-canal técnica de gravação EOD permitida medição EOD tempo exato e confiável de nadar livremente peixe. Usando a nossa técnica, todos os pulsos gerados pelo EOD nadando livremente WEF foram detectados, sem falta ou a adição de um pecadogle impulsos durante um tempo de gravação de seis horas (ver Figura 12, em junho et al. 8). As medidas de gravação EOD não só a taxa de EOD, mas também o nível de atividade a partir do momento que varia EOD amplitudes de pico registrados pelo eletrodos externos. As amplitudes EOD gravadas são determinadas pela geometria relativa entre um animal e os eléctrodos de registo, assim, as deslocações dos animais induzem alterações nas amplitudes EOD (Figura 2F). O nível de actividade foi calculada a partir da variabilidade (RMS) da amplitude declive EOD dentro de uma janela deslizante (0,5 seg). Usando este método, a gravação de vídeo não seria necessário para a medição do nível de actividade durante um período longo de tempo, e a gravação do EOD sozinho pode ser suficiente. Em vez de usar uma gravação de vídeo, a posição do corpo e postura de FEM pode ser inferida a partir da gravação do EOD só com base nos locais de eléctrodos, da geometria de um tanque, e um modelo teórico de um dipolo de corrente. Usando um recordi semelhanteconfiguração ng, Jun et al. 20 propostas em tempo real método de controle elétrico para acompanhar vários WEFs em presença de um objeto, que compara as intensidades de sinais medidos em vários pares de eletrodos de gravação com entradas de tabela de pesquisa contendo intensidades de sinais previstos a conhecidos locais de dipolo atuais. O método de controle elétrico oferece maior confiabilidade de rastreamento em um ambiente visualmente confuso onde os animais muitas vezes são impedidos de vista, ou durante o acompanhamento de vários animais. Habitats naturalistas do WEF conter muitos obstáculos visuais, tais como plantas aquáticas e raízes, onde o método de controle elétrico poderiam fornecer um controle mais confiável, com requisitos de configuração mais simples do que de rastreamento visual. Em princípio, o nosso método é directamente aplicável à espécie WEF tipo de onda após a mudança constante de tempo do filtro. A etapa de retificação irá apresentar dois modos por ciclo EOD, uma vez que a forma de onda EOD é de aproximadamente sinusoidal em espécies do tipo de onda. Neste caso, A taxa de EOD instantânea pode ser determinado por cada ignorando outros marcadores de tempo EOD para ignorar a fase de EOD negativo. WEF pode detectar os eletrodos de registro quando eles nadam nas proximidades, assim evitamos usando eletrodos grandes ou metálicos que podem ser detectados a uma distância maior de 37, e em vez disso usou eletrodos de grafite finas (2 mm de diâmetro). Cabos coaxiais mais finos (RG-174) foram utilizados com os conjuntos de eletrodos para a flexibilidade, mas mais grossos cabos coaxiais (RG-54) foram utilizados para a fiação em longas distâncias para blindagem elétrica superior. Maior duração da gravação EOD pode ser conseguido através da redução da taxa de amostragem, mas em uma resolução temporal inferior, como um trade-off. A média e a variabilidade da taxa de EOD varia entre espécies, assim, a janela de tempo para alisar a taxa EOD instantâneo deve ser ajustado apropriadamente. Uma janela de tempo mais curto é recomendado para espécies com média mais curto e menor variabilidade na IPIs (por exemplo gymnotiforms), e uma hora mais window é recomendado para as espécies que têm mais significativo e maior variabilidade na IPIs (por exemplo Mormyrids).

Iluminação e configuração da câmera. As gravações de vídeo fornecer observações comportamentais quantitativos e qualitativos, e aqui descrevemos os procedimentos para a criação, gravação e processamento dos dados da imagem. Instalação de iluminação desempenha um papel importante na produção de imagens de alta qualidade, eo ângulo de projeção de luz é um fator importante para geração de imagens de animais submarinos. Sob condições de iluminação abaixo do ideal, a superfície da água pode formar brilhos e reflexos, que podem interferir com o rastreamento de imagem especialmente quando os animais gerar ondas de superfície. Os problemas de brilho e reflexo pode ser eliminado por fontes de luz que se projecta a partir do fundo de um tanque. Para um pequeno tanque, matrizes de LED pode ser colocado diretamente sob o tanque e brilhar através de um painel difusor para gerar intensidade de luz uniforme 38. Da mesma forma para um tanque maior, uma fonte de luz cum ser colocado por baixo do depósito, e a intensidade de luz uniforme pode ser conseguido ao permitir que uma distância suficiente para que a luz difusa 39. Em nossa configuração, fomos forçados a projetar a luz de cima do tanque, devido a limitações de espaço, estabilidade estrutural, bem como a colocação de aquecimento debaixo do tanque. Evitamos os problemas de brilho e reflexão por meio de iluminação indireta, de forma que as fontes de luz foram projetados para o teto. Ao tornar a porção de topo da câmara de branco neutro e fosca, sem reflexões eram visíveis sobre a superfície da água. Para imagem toda a arena central, uma lente grande angular pode ser montado na câmera, mas algumas lentes (lente olho de peixe) podem causar distorção de barril significativo. A distorção em barril pode ser corrigido utilizando uma folha de rede de calibração por baixo do tanque para medir as coordenadas de pixel dos locais de grade vista no centro do tanque. Juntamente com os locais de grelha correspondentes na centímetros, uma matriz de transformação pode ser calculado para o correct a distorção barril 40. Recomendamos câmaras de alta resolução, se um tamanho de animal é muito menor do que o tamanho do reservatório, de modo que um número suficiente de pixels pode ser obtido a partir do animal para medir correctamente a sua postura corporal.

Rastreamento de imagem e sincronização de tempo. O algoritmo de rastreamento de imagem descrito aqui faz uso da operação de região de interesse (ROI) para medir rapidamente a posição do corpo e postura. A operação ROI reduz o tamanho da imagem a ser processada, e restringe a gama de seguimento perto da localização dos animais a partir da estrutura anterior. Extraímos a postura corporal (linha média) usando a rotação de imagem e as operações da caixa envolvente em vez do habitual operação imagem esqueletização, o que, por vezes, não conseguiu produzir uma única linha média bem definida. Quadro do animal de referência foi localizado no meio da caixa delimitadora da cabeça, que permite a análise do comportamento egocêntrico. A principal fonte de erro na tracki imagemng deveu-se ao efeito de projeção óptica a uma grande angular. Idealmente, os movimentos verticais do animal não deve afetar a medição de posição 2D, mas quanto mais longe do eixo de imagens centrais, a maior parte da dimensão vertical é projetada para a câmera. A refração na superfície da água reduziu o efeito de projeção ótica de 28% em nossa configuração de imagem (câmera altura = 1,8 m, a profundidade da água = 10 cm, raio tanque = 75 cm), e o pior erro de posição foi ± 1,4 cm na circular cerca. O sincronismo entre o EOD e gravações de vídeo foram sincronizados usando pulsos de LED infravermelho para explicar o desvio de tempo entre diferentes tempos de inicialização de gravação os relógios digitalizador de sinal de vídeo e, e. A incerteza esperado na sincronização de tempo entre a EOD gravações de vídeo e é proporcional ao intervalo de quadro de captura, por exemplo, 15 quadros por segundo de taxa de captura (fps) moldura vai resultar em tempo de incerteza de alinhamento de ± 33 mseg. Tal grau de time precisão é adequada para o rastreamento mais lento peixes em movimento, mas uma câmera de alta velocidade podem ser necessários para o rastreamento mais rápido em movimento animais. Sugerimos que a intensidade de luz brilhante com uma maior taxa de quadro, uma vez que o tempo de exposição do sensor é inversamente proporcional à taxa de quadros.

O trabalho futuro. Interacções sociais entre os vários WEFs pode ser estudada por rastreando os sinais EOD e locais do corpo, e o sistema de seguimento deve associar correctamente a EOD com a localização do mesmo indivíduo. De acordo com o método descrito por dipolo localização junho et al. 20 uma configuração semelhante a utilizar, os locais de origem animal inferidas por seus sinais EOD recebeu em vários eletrodos podem ser combinados com a saída de rastreamento visual para identificar corretamente os pulsos EOD de indivíduos diferentes. Imagem de rastreamento de vários animais pode ser realizada uma pessoa de cada vez usando a operação de ROI. Um ROI pode ser inicialmente definido em torno de um indivíduoser monitorado, eo ROI serão reposicionados em cada quadro com uma posição do corpo atualizado. Os outros peixes serão excluídos da análise de monitoramento de imagem quando ele aparece fora do ROI, e se apareceu dentro, a imagem da outra peixes podem ser removidos automaticamente, verificando se a sua imagem toca o limite ROI. Às vezes, dois animais contacto entre si, e as suas imagens de fusão, e se assim for, a máscara pode ser tirado manualmente para separar a imagem do outro peixe. Outro trabalho interessante futuro é o rastreamento de vídeo tridimensional para revelar seqüências de movimentos complicados durante a captura de presas 22 ou interações sociais. MacIver et al. 22 usou duas câmeras para ver um tanque do aquário retangular a partir do topo e do lado para reconstruir um modelo de corpo tridimensional. No entanto, esta abordagem não funciona no nosso caso, uma vez que existem paredes divisórias que bloqueiam vistas laterais e do aquário tem muito maior largura de profundidade. Em vez disso, seria mais aplicabo para instalar várias câmeras no teto em perspectiva diferente ângulos semelhante à configuração usada por Hedrick 41. Para uma maior precisão, o efeito de refracção introduzida pela água e o ângulo da câmara oblíqua teria de ser corrigida por calibrar as imagens em três dimensões. Nosso método acompanhamento visual poderia ser aplicado para estudar o fluxo de imagem elétrica no corpo da superfície do peixe 42,43 quando peixe nada perto de um objeto. Conforme estudado por 26 Hofmann et al., Seria interessante para investigar o fluxo eléctrico imagem do objecto durante a natação livre em função da distância do objecto, forma, tamanho, e materiais. Em última análise, os nossos métodos combinados com gravações neurais de nadar livremente peixe 44-46 pode revelar novas percepções por observações de mudanças na atividade neural e taxa EOD, enquanto o peixe se engaja em exploração objeto ou interações sociais.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Este trabalho foi generosamente apoiado pelas Ciências Naturais e Engenharia do Conselho de Pesquisa do Canadá (NSERC) e os Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (CIHR).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aquarium Construction
Electrically shielded floor heater ThermoSoft Corp., IL, USA ThermoTile www.thermosoft.com
Tempered glass panel generic 0.5 in thick, used for the aquarium construction
Aquarium grade silicone generic  
Acrylic sheet generic 0.25 in thick, matte white
Natural rubber sheet generic 0.25 in thick
Servomotor HTECHRCD Inc., Korea HS-325HB, 180deg rotation www.servocity.com
Servomotor arm mount HITECHRCD Inc., Korea 56362 Large Spline www.servocity.com
Servomotor controller (6 channels) Sparkfun ROB-09664 Micro Maestro 6-channel USB Servo Controller
Active USB extension cable C2G 38990 12 m USB 2.0 A Male to A Female 4-Port Active Extension Cable
Exhaust fan Nutone ILFK120 www.homedepot.com
Vertical aquarium filter Tetra, Germany Whisper Internal Power Filter - 40i  
Crushed coral Used to increase the pH of the tank water
EOD Recording Setup
Graphite Electrodes Staedtler, Germany Mars Carbon 2-mm type HB Shave the outer coating
Physiological Amplifier/Filter Intronix, Canada 2015F  
Coaxial Cable generic RG174 For electrodes assembly
Coaxial Cable generic RG54 For wiring use
BNC jack connector for RG-174 Amphenol Connex 112160 For electrodes assembly
BNC plug connector for RG-54 Amphenol Connex 112116 For wiring use
Signal digitizer hardware Cambridge Electronic Design, UK Power MKII 1401  
Signal digitizer software Cambridge Electronic Design, UK Spike 2. ver 7  
Visual Tracking Setup
White LED light IKEA, Sweden DIODER 201.194.18 www.ikea.com
Infrared LED light (850 nm) Scene Electronics, China S8100-60-B/C-IR Remove built-in fan
USB webcam Logitech Inc., CA, USA C910 Remove Infrared blocking filter
Motorized camera Logitech Inc., CA, USA Quickcam Orbit Remove Infrared blocking filter
Video recording software Logitech Inc., CA, USA Logitech Quickcam Software Download from www.logitech.com
MATLAB Mathworks, MA, USA 2012a Image processing toolbox

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388, (6645), 882-887 (1997).
  2. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat. Neurosci. 8, (9), 1263-1268 (2005).
  3. Adamantidis, A. R., Zhang, F., Aravanis, A. M., Deisseroth, K., De Lecea, L. Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons. Nature. 450, (7168), 420-424 (2007).
  4. Naumann, E. A., Kampff, A. R., Prober, D. A., Schier, A. F., Engert, F. Monitoring neural activity with bioluminescence during natural behavior. Nat. Neurosci. 13, (4), 513-520 (2010).
  5. Leifer, A. M., Fang-Yen, C., Gershow, M., Alkema, M. J., Samuel, A. D. Optogenetic manipulation of neural activity in freely moving Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 8, (2), 147-152 (2011).
  6. Mavoori, J., Millard, B., Longnion, J., Daniel, T., Diorio, C. A miniature implantable computer for functional electrical stimulation and recording of neuromuscular activity. In IEEE international workshop on biomedical circuits and systems (BioCAS) 2004; Session: Functional Electrical Stimulators and Related Sensing Techniques. (2004).
  7. Harrison, R. R., Fotowat, H., Chan, R., Kier, R. J., Olberg, R., Leonardo, A., Gabbiani, F. Wireless neural/EMG telemetry systems for small freely moving animals. IEEE TBioCAS. 5, (2), 103-111 (2011).
  8. Jun, J. J., Longtin, A., Maler, L. Precision measurement of electric organ discharge timing from freely moving weakly electric fish. J. Neurophys. 107, (7), 1996-2007 (2012).
  9. Forlim, C. G., Pinto, R. D. Noninvasive Realistic Stimulation/Recording of Freely Swimming Weakly Electric Fish: Movement Detection and Discharge Entropy to Infer Fish Behavior. (2012).
  10. Caputi, A. A., Aguilera, P. A., Castelló, M. E. Probability and amplitude of novelty responses as a function of the change in contrast of the reafferent image in G. carapo. J. Exp. Biol. 206, (6), 999-1010 (2003).
  11. Pluta, S. R., Kawasaki, M. Multisensory enhancement of electromotor responses to a single moving object. J. Exp. Biol. 211, (18), 2919-2930 (2008).
  12. Heiligenberg, W. Electrolocation and jamming avoidance in a Hypopygus (Rhamphichthyidae, Gymnotoidei), an electric fish with pulse-type discharges. J. Comp. Phys. A. 91, (3), 223-240 (1974).
  13. Capurro, A., Malta, C. P. Noise autocorrelation and jamming avoidance performance in pulse type electric fish. Bull. Math. Biol. 66, (4), 885-905 (2004).
  14. Post, N., von der Emde, G. The "novelty response" in an electric fish: response properties and habituation. Phys. Behav. 68, (1), 115-128 (1999).
  15. Toerring, M. J., Serrier, J. Influence of water temperature on the electric organ discharge (EOD) of the weakly electric fish Marcusenius cyprinoides (Mormyridae). J. Exp. Biol. 74, (1), 133-150 (1978).
  16. Ardanaz, J. L., Silva, A., Macadar, O. Temperature sensitivity of the electric organ discharge waveform in Gymnotus carapo. J. Comp. Phys. A. 187, (11), 853-864 (2001).
  17. Rodríguez-Cattaneo, A., Pereira, A. C., Aguilera, P. A., Crampton, W. G., Caputi, A. A. Species-specific diversity of a fixed motor pattern: the electric organ discharge of Gymnotus. PLoS One. 3, (5), (2008).
  18. Bennett, M. V. L. Fish physiology. Hoar, W. S., Randall, D. J. Academic Press. NY. 493-574 (1971).
  19. Wong, C. J. Afferent and efferent connections of the diencephalic prepacemaker nucleus in the weakly electric fish, Eigenmannia virescens: interactions between the electromotor system and the neuroendocrine axis. J. Comp. Neurol. 383, (1), 18-41 (1997).
  20. Jun, J. J., Longtin, A., Maler, L. Real-time localization of moving dipole sources for tracking multiple free-swimming weakly electric fish. PLoS One. 8, (6), (2013).
  21. Rasnow, B., Assad, C., Hartmann, M. J., Bower, J. M. Applications of multimedia computers and video mixing to neuroethology. J. Neuro. Methods. 76, (1), 83-91 (1997).
  22. MacIver, M. A., Nelson, M. E. Body modeling and model-based tracking for neuroethology. J. Neuro. Methods. 95, (2), 133-143 (2000).
  23. Douglas, R. H., Hawryshyn, C. W. Behavioral studies of fish vision: an analysis of visual capabilities. In The Visual System of Fish. Douglas, R., Djamgoz, M. Chapman & Hall. London. 373-418 (1990).
  24. Ciali, S., Gordon, J., Moller, P. Spectral sensitivity of the weakly discharging electric fish Gnathonemus petersi using its electric organ discharges as the response measure. J. Fish Biol. 50, (5), 1074-1087 (1997).
  25. Ratledge, D. An Introduction to Webcam Imaging. Digital Astrophotography: The State of the Art. 31-44 (2005).
  26. Hofmann, V., Sanguinetti-Scheck, J. I., Gómez-Sena, L., Engelmann, J. From static electric images to electric flow: Towards dynamic perceptual cues in active electroreception. J. Phys. Paris. 107, 95-106 (2013).
  27. Castelló, M. E., Aguilera, P. A., Trujillo-Cenóz, O., Caputi, A. A. Electroreception in Gymnotus carapo: pre-receptor processing and the distribution of electroreceptor types. J. Exp. Biol. 203, (21), 3279-3287 (2000).
  28. Caputi, A. A., Castelló, M. E., Aguilera, P., Trujillo-Cenóz, O. Electrolocation and electrocommunication in pulse gymnotids: signal carriers, pre-receptor mechanisms and the electrosensory mosaic. J. Phys. 96, (5), 493-505 (2002).
  29. Pusch, R., et al. Active sensing in a mormyrid fish: electric images and peripheral modifications of the signal carrier. J. Exp. Biol. 211, (6), 921-934 (2008).
  30. Harder, W. Die beziehungen zwischen elektrorezeptoren, elektrischem organ, seitenlinienorganen und nervensystem bei den Mormyridae (Teleostei, Pisces). Z. Vgl. Physiol. 59, (3), 272-318 (1968).
  31. Bacelo, J., Engelmann, J., Hollmann, M., Gvonder Emde,, Grant, K. Functional foveae in an electrosensory system. J. Comp. Neurol. 511, (3), 342-359 (2008).
  32. Hollmann, M., Engelmann, J., Von Der Emde, G. Distribution, density and morphology of electroreceptor organs in mormyrid weakly electric fish: anatomical investigations of a receptor mosaic. J. Zool. 276, (2), 1469-7998 (2008).
  33. Knudsen, E. I. Spatial aspects of electric fields generated by weakly electric fish. J. Comp. Phys. 99, (2), 103-118 (1975).
  34. Kramer, B. Spontaneous discharge rhythms and social signalling in the weakly electric fish Pollimyrus isidori (Cuvier et Valenciennes) (Mormyridae, Teleostei). Behav. Ecol. Sociobiol. 4, (1), 66-74 (1978).
  35. Stoddard, P. K., Markham, M. R., Salazar, V. L., Allee, S. Circadian rhythms in electric waveform structure and rate in the electric fish Brachyhypopomus pinnicaudatus. Physiol. Behav. 90, (1), 11-20 (2007).
  36. Canfield, J. G. Methods for chronic neural recording in the telencephalon of freely behaving fish. J. Neurosci. Methods. 133, (1-2), 127-134 (2004).
  37. Chen, L., House, J. L., Krahe, R., Nelson, M. E. Modeling signal and background components of electrosensory scenes. J. Comp. Physiol. A. 191, (4), 331-345 (2005).
  38. Emran, F., Rihel, J., Dowling, J. E. A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities. J. Vis. Exp. (20), (2008).
  39. Windsor, S. P., Tan, D., Montgomery, J. C. Swimming kinematics and hydrodynamic imaging in the blind Mexican cave fish (Astyanax fasciatus). J. Exp. Biol. 211, (18), 2950-2959 (2008).
  40. Shapiro, L. G., Stockman, G. C. Computer vision. Prentice Hall. Upper Saddle River, NJ. 367-368 (2001).
  41. Hedrick, T. L. Software techniques for two- and three-dimensional kinematic measurements of biological and biomimetic systems. Bioinsp. Biomim. 3, (3), 034001 (2001).
  42. Babineau, D., Lewis, J. E., Longtin, A. Spatial acuity and prey detection in weakly electric fish. PLoS Comp. Biol. 3, (3), (2007).
  43. Sanguinetti-Scheck, J. I., Pedraja, E. F., Cilleruelo, E., Migliaro, A., Aguilera, P., Caputi, A. A., Budelli, R. Fish geometry and electric organ discharge determine functional organization of the electrosensory epithelium. PLoS One. 6, (11), (2011).
  44. Castello, M. E., Caputi, A., Trujillo‐Cenóz, O. Structural and functional aspects of the fast electrosensory pathway in the electrosensory lateral line lobe of the pulse fish Gymnotus carapo. J. Comp. Neurol. 401, (4), 549-563 (1998).
  45. Canfield, J. G., Mizumori, S. J. Y. Methods for chronic neural recording in the telencephalon of freely behaving fish. J. Neurosci. Methods. 133, (1), 127-134 (2004).
  46. Pereira, A. C., Centurión, V., Caputi, A. A. Contextual effects of small environments on the electric images of objects and their brain evoked responses in weakly electric fish. J. Exp. Biol. 208, (5), 961-972 (2005).
Longo prazo Behavioral Rastreamento de Livremente Natação fracamente elétrico dos peixes
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jun, J. J., Longtin, A., Maler, L. Long-term Behavioral Tracking of Freely Swimming Weakly Electric Fish. J. Vis. Exp. (85), e50962, doi:10.3791/50962 (2014).More

Jun, J. J., Longtin, A., Maler, L. Long-term Behavioral Tracking of Freely Swimming Weakly Electric Fish. J. Vis. Exp. (85), e50962, doi:10.3791/50962 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter